Analisis cualitativo de proteinas, Guías, Proyectos, Investigaciones de Bioquímica

¡Descarga Analisis cualitativo de proteinas y más Guías, Proyectos, Investigaciones en PDF de Bioquímica solo en Docsity! Universidad de San Carlos de Guatemala Centro Universitario del Norte -CUNOR- Bioquímica Practica 3 – Estudio cuantitativo de proteínas por espectrofotometría. Ludvin Efrén Pacay Macz 202247701 I. INTRODUCCION Las proteínas son polímeros lineales en los que las unidades monoméricas son los aminoácidos que se pliegan en formas tridimensionales otorgando una gran variedad de funciones y se encuentran unidos entre sí por enlaces peptídicos. Existen varios métodos para determinar la concentración de proteínas en una muestra, uno de ellos es la espectrofotometría, este método cuantifica cuanta luz absorbe una sustancia química, emitiendo la intensidad de la luz cuando un haz luminoso pasa a través de la solución muestra. (Duhalt,2002) Dentro de los resultados más importantes de la práctica se destaca la realización de tres experimentos, el primero y segundo se llevaron a cabo con un simulador virtual de espectrofotometría mediante el reactivo Para-nitrofenol (pNF) y el método Bradford y el tercer experimento se llevó a cabo dentro del laboratorio del centro universitario donde se analizó a través del color, transmitancia y absorción la presencia de proteínas en extracto salino, extracto acuoso, agua destilada (concentración desconocida), albúmina (concentración conocida) y un reactivo blanco que contenía sulfato de sodio y Biuret La práctica concluyo determinando la absorción y transmitancia de los 4 ensayos, así como el análisis a través del color de cada sustancia a través del método de Biuret como reactivo indicador. II. OBJETIVOS GENERAL  Recopilar las principales variables cuantitativas (absorción, concentración y transmitancia) y cualitativas (color) a través del estudio espectrofotométrico de extracto acuoso y salino de lenteja, así como la simulación virtual de espectrofotometría con reactivos pNF y método de Bradford. ESPECIFICOS  Establecer una gráfica que determine la concentración y absorción, de las practicas virtuales.  Conocer la relación entre absorbancia y concentración.  Definir que es el método Bradford III. MARCO TEORICO 3.1. ¿Qué es la espectrofotometría? La espectrofotometría es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. (Díaz et al., 2017). 3.2. La transmitancia Es la relación entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz que incidió sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io x 100. La transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relación entre %T y la concentración no es lineal, pero asume una relación logarítmica inversa. (Díaz et al., 2017). 5.1.Actividad 1: Relación entre absorbancia y concentración con para-nitrofenol (pNF) - Paso 1 Se calibro el espectrofotómetro virtual con 3 ml agua, ajustando la longitud de onda a 405 nm. - Paso 2 Se prepararon 3 muestras, en 3 cubetas con distintas concentraciones de pNF y agua. Paso 3 Se introdujeron uno por uno cada cubeta y se determinó su absorbancia - Paso 4 Se realizó un análisis cualitativo de la relación entre el color de las cubetas y el valor de absorbancia y un análisis cuantitativo calculando la concentración de pNF en la mezcla final de cada cubeta, sabiendo que la concentración en la botella es de 80 µM pNF. - Paso 5 Como último paso se trasladaron los datos de concentración y absorbancia a una tabla de Excel para poder establecer una gráfica de los resultados. 5.2.Actividad 2: estudio espectrofotométrico de extracto de lenteja utilizando Biuret como reactivo indicador - Paso 1 Se utilizaron 4 tubos de ensayo los cuales se identificaron con las letras A, B, C y D. luego a cada uno se le agrego 9.5 ml de sulfato de sodio - Paso 2 En el A ensayo se agregó 0.5 ml de extracto acuoso de lenteja, en el B se agregó 0.5 ml de extracto salino de lenteja, en el C se agregó 0.5 ml de agua destilada y en el D se agregó 0.5 ml de albúmina y se agitaron - Paso 3 Se prepararon otros 5 tubos de ensayo identificados como E, F, G, H e I Universidad de San Carlos de Guatemala Centro Universitario del Norte -CUNOR- Bioquímica Practica 3 – Estudio cuantitativo de proteínas por espectrofotometría. Ludvin Efrén Pacay Macz 202247701 I. INTRODUCCION Las proteínas son polímeros lineales en los que las unidades monoméricas son los aminoácidos que se pliegan en formas tridimensionales otorgando una gran variedad de funciones y se encuentran unidos entre sí por enlaces peptídicos. Existen varios métodos para determinar la concentración de proteínas en una muestra, uno de ellos es la espectrofotometría, este método cuantifica cuanta luz absorbe una sustancia química, emitiendo la intensidad de la luz cuando un haz luminoso pasa a través de la solución muestra. (Duhalt,2002) Dentro de los resultados más importantes de la práctica se destaca la realización de tres experimentos, el primero y segundo se llevaron a cabo con un simulador virtual de espectrofotometría mediante el reactivo Para-nitrofenol (pNF) y el método Bradford y el tercer experimento se llevó a cabo dentro del laboratorio del centro universitario donde se analizó a través del color, transmitancia y absorción la presencia de proteínas en extracto salino, extracto acuoso, agua destilada (concentración desconocida), albúmina (concentración conocida) y un reactivo blanco que contenía sulfato de sodio y Biuret La práctica concluyo determinando la absorción y transmitancia de los 4 ensayos, así como el análisis a través del color de cada sustancia a través del método de Biuret como reactivo indicador. II. OBJETIVOS GENERAL  Recopilar las principales variables cuantitativas (absorción, concentración y transmitancia) y cualitativas (color) a través del estudio espectrofotométrico de extracto acuoso y salino de lenteja, así como la simulación virtual de espectrofotometría con reactivos pNF y método de Bradford. ESPECIFICOS  Establecer una gráfica que determine la concentración y absorción, de las practicas virtuales.  Conocer la relación entre absorbancia y concentración.  Definir que es el método Bradford III. MARCO TEORICO 3.1. ¿Qué es la espectrofotometría? La espectrofotometría es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. (Díaz et al., 2017). 3.2. La transmitancia Es la relación entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz que incidió sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io x 100. La transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relación entre %T y la concentración no es lineal, pero asume una relación logarítmica inversa. (Díaz et al., 2017). 5.1.Actividad 1: Relación entre absorbancia y concentración con para-nitrofenol (pNF) - Paso 1 Se calibro el espectrofotómetro virtual con 3 ml agua, ajustando la longitud de onda a 405 nm. - Paso 2 Se prepararon 3 muestras, en 3 cubetas con distintas concentraciones de pNF y agua. Paso 3 Se introdujeron uno por uno cada cubeta y se determinó su absorbancia - Paso 4 Se realizó un análisis cualitativo de la relación entre el color de las cubetas y el valor de absorbancia y un análisis cuantitativo calculando la concentración de pNF en la mezcla final de cada cubeta, sabiendo que la concentración en la botella es de 80 µM pNF. - Paso 5 Como último paso se trasladaron los datos de concentración y absorbancia a una tabla de Excel para poder establecer una gráfica de los resultados. 5.2.Actividad 2: estudio espectrofotométrico de extracto de lenteja utilizando Biuret como reactivo indicador - Paso 1 Se utilizaron 4 tubos de ensayo los cuales se identificaron con las letras A, B, C y D. luego a cada uno se le agrego 9.5 ml de sulfato de sodio - Paso 2 En el A ensayo se agregó 0.5 ml de extracto acuoso de lenteja, en el B se agregó 0.5 ml de extracto salino de lenteja, en el C se agregó 0.5 ml de agua destilada y en el D se agregó 0.5 ml de albúmina y se agitaron - Paso 3 Se prepararon otros 5 tubos de ensayo identificados como E, F, G, H e I - Paso 4 Al E se le agrego 2 ml de sulfato de sodio, al F se le agregó 2 ml de solución del D, al G se agregó 2 ml de solución del C, al H se le agregó 2 ml de solución del B y al I se le agrego 2 ml de solución del A, luego a todos los tubos se les agrego 8 ml de reactivo Biuret. 5.3.Actividad 3: Ensayo de cuantificación de proteínas por el método de Bradford - Paso 1 Se calibro el espectrofotómetro virtual con 3 ml de reactivo Bradford, ajustando la longitud de onda a 595 nm. - Paso 2 Se prepararon 3 muestras, en 3 cubetas con distintas concentraciones de Bradford y proteína de Bradford - Paso 3 Se introdujeron uno por uno cada cubeta y se determinó su absorbancia - Paso 4 Se realizó un análisis cualitativo de la relación entre el color de las cubetas y el valor de absorbancia y un análisis cuantitativo calculando la concentración de reactivo Bradford en la mezcla final de cada cubeta, sabiendo que la concentración en la botella es de 800 mg/L. - Paso 5 Como último paso se trasladaron los datos de concentración y absorbancia a una tabla de Excel para poder establecer una gráfica de los resultados. VI. RESULTADOS 6.1.Actividad 1: Relación entre absorbancia y concentración con para-nitrofenol (pNF) Tabla 1: volumenes de pNF y agua utilizados como diseño experimental Fuente: elaboracion propia 2023 Análisis: la tabla representada muestra, los volumenes que se utilizaron en cada cubeta para poder definir la mezcla y concentracion entre el pNF y el agua, previo a la lectura en el espectrofotometro virtual. Tabla 2: medidas de absorvancia obtenidas en el espectrofotometro Fuente: elaboracion propia 2023 Análisis: La tabla muestra la absorcion obtenida de cada una de las cubetas que se introdujeron al espectrofotometro virtual, definiendo que la aboscion depende de la concentracion (relacion directa) Tabla 3: analisis cuantitativo de resultados comparando concentracion contra absorcion. Cubeta C (µM) A405 1 80 1,619 2 53,33 1,065 3 26.66 0.537 Fuente: elaboración propia 2023 Análisis: La tabla muestra los resultados de concentración de cada cubeta, sabiendo que la concentración en una botella es de 80 µM pNF. Cubeta 1 (ml) 2 (ml) 3 (ml) Volumen de pNF 3 2 1 Volumen de agua 0 1 2 Cubeta 1 2 3 A405 1.619 1.065 0.537 6.3. Actividad 3: estudio espectrofotométrico de extracto de lenteja utilizando Biuret como reactivo indicado Tabla 7: contenido de cada ensayo de extracto de lenteja Fuente: elaboración propia 2023 Análisis: La tabla muestra la cantidad y contenido de cada uno de los ensayos con extracto salino y acoso de lenteja, para el ensayo C se utilizó solo agua destilada como muestra de concentración desconocida y el ensayo D contenía muestra estándar de albúmina. Figura 1: distribución e identificación de las muestras. La figura que se presenta no aun contenía el reactivo Biuret para poder realizar la lectura en el espectrofotómetro. Ensayo Contenido Reactivo A 0.5 ml de extracto acuoso 9.5 ml de Na2SO4 al 26.6 % B 0.5 ml de extracto salino 9.5 ml de Na2SO4 al 26.6 % C 0.5 ml de agua destilada 9.5 ml de Na2SO4 al 26.6 % D 0.5 ml de albúmina 9.5 ml de Na2SO4 al 26.6 % A B C D Figura 2: soluciones e identificación de muestras para el análisis por el método de Biuret. A través de la figura se visualiza la agregación de los ensayos de la tabla 7 Tabla 8: contenido de cada ensayo con reactivo Biuret Fuente: elaboración propia 2023 Análisis: La tabla muestra la cantidad de reactivos utilizados y el contenido de cada ensayo. Es importante aclarar que el ensayo E solo contiene Na2SO4 y Biuret, ya que este ensayo sirvió para la calibración del espectrofotómetro, aunque también se midió su absorbancia y transmitancia. Ensayo Color Contenido Reactivo E Celeste Blanco de reactivo 9.5 ml de Na2SO4 al 26.6 % + 8 ml de Biuret F Violeta 2 ml del ensayo D 8 ml de Biuret G Celeste 2 ml del ensayo C 8 ml de Biuret H Celeste 2 ml del ensayo B 8 ml de Biuret I Celeste 2 ml del ensayo A 8 ml de Biuret E F H I G Tabla 9: resultados de absorbancia y transmitancia del extracto acuoso y salino de lenteja. Fuente: elaboración propia 2023. Análisis: La tabla indica la lectura y los datos arrojados por el espectrofotómetro de absorbancia y transmitancia, así como también los ensayos evaluados y el contenido de cada ensayo. I. DISCUSION DE RESULTADOS Al estudiar los fenómenos de absorción y concentración se definió que para la prueba con para-nitrofenol (pNF) se utilizaron 3 cubetas. La cubeta 1 tuvo un volumen de 3ml de pNF y 0 ml de agua, la cubeta 2 contenía 2 ml de pNF y 1 ml de agua y la cubeta 3 contenía 1 ml de pNF y 2 ml de agua. Las cubetas fueron trasladadas al espectrofotómetro virtual donde a través de la tabla 2 se logra observar los resultados obtenidos de absorbancia de cada una de las cubetas. Con los resultados obtenidos se define que cualitativamente el color de las cubetas y el valor de la absorbancia mantiene una relación directa, ya que a mayor concentración de pNF como la cubeta 1 (3 ml) mayor será la absorción de la sustancia (1.619) a través de una longitud de onda de 405 nanómetros. El contraste de colores de las cubetas se puede observar en el apartado de anexos en la figura 6. Para el análisis cuantitativo se calculó la concentración de pNF en la mezcla final de cada cubeta, donde su utilizó la siguiente formula: (𝑎)(𝑏) 3 = 𝑐 Donde: La tabla 3 presenta los resultados obtenidos en cuanto a concentración de las cubetas y se logra expresar a través de la gráfica 1. La mayor concentración es de la cubeta 1 con un Transmitancia Absorbancia Ensayo Contenido 65 % 1.9 F Albúmina 0 % 100 E Blanco de reactivo 95 % 0.2 H Extracto salino 100 % 0 I Extracto acuoso 96.5 % 0.015 G Agua destilada a 80 µM pNF b ml de agua aplicados a la cubeta 3 Cantidad de ml que tiene la cubeta c Concentración III. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Amador, S. A. S. (2021, marzo 29). Método de Bradford: qué es y cómo funciona. Psicologiaymente.com. https://psicologiaymente.com/cultura/metodo-bradford Di Prisco, J. (1988). ONDAS ELECTROMAGNETICAS ENERGIA RADIANTE (II parte). Dermatología Venezolana, 26(3 y 4). Díaz, N. A., Antonio Bárcena Ruiz, J., Reyes, E. F., Cejudo, A. G., Novo, J. J., Peinado, J. P., Meléndez-Valdés, F. T., & Fiñana, I. T. (2017). 8. Espectrometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas. Uco.es. Recuperado el 29 de agosto de 2023, de https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol- mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.pdf Duhalt, R. V. (2002) Cuantificación de proteínas: una revisión. PATEIRO-LÓPEZ, B., & GONZÁLEZ-MANTEIGA, W. (2017). TOTAL PROTEIN OF CRUDE EXTRACTS AND QUANTIFICATION THE NATIVE Bacillus thuringiensis STRAINS ISOLATED FROM BOYACÁ AND CUNDINAMARCA. https://www.academia.edu/32921448/TOTAL_PROTEIN_OF_CRUDE_EXTRAC TS_AND_QUANTIFICATION_THE_NATIVE_Bacillus_thuringiensis_STRAINS _ISOLATED_FROM_BOYAC%C3%81_AND_CUNDINAMARCA IV. ANEXOS 4.1.Actividad 1: Relación entre absorbancia y concentración con para-nitrofenol (pNF) Figura 3: se muestra la absorbancia obtenida de la cubeta 1 que contenía 3 ml de pNF, el cual arrojo un valor de 1.619 de absorbancia a 405 nm. Figura 4: absorbancia obtenida de la cubeta 2 con un valor de 1.065 de absorbancia a 405 nm. Figura 5: absorbancia obtenida de la cubeta 3 con un valor de 0.537 de absorbancia a 405 nm. Figura 6: Análisis de color de cubetas de la prueba con pNF. Figura 7: Análisis de color de cubetas con el método Bradford