¡Descarga Procesos de Immortalización en Cultivos Celulares: Virus, Telomerasa y Fusión y más Apuntes en PDF de Bioquímica solo en Docsity! Grau de Bioquímica. Cultius cel·lulars 1 TEMA 11. Immortalització 1. Immortalització amb virus o gens vírics: La immortalització és un procés que, en cultius cel·lulars llargs, pot esdevenir de manera espontà- nia, tot i que amb una probabilitat molt baixa, a partir d’haver-se realitzat un nombre determinat de divisions cel·lulars. Per tant, en determinades ocasions, hi ha cèl·lules que aconsegueixen escapar del procés de senescència i, conseqüentment, estableixen una línia cel·lular immortalitzada, és a dir, que és possible mantenir-la indefinidament. És considerada un dels canvis produïts en el procés de transformació cel·lular, malgrat que les cèl·lules immortalitzades no han d’esdevenir obligatòriament en transformades. En canvi, totes les cèl·lules transformades sí que són immortalitzades. De fet, les cèl·lules transformades, a més a més, presenten altres característiques com, per exemple, que no tenen inhibició per contacte. Tanmateix, és possible intentar induir la immortalització de les cèl·lules a partir, bàsicament, de tres tècniques: mitjançant virus o gens vírics, transfectant el gen de la telomerasa i/o per fusió amb de cèl·lules normals amb cèl·lules immortalitzades. Les cèl·lules, doncs, es poden immortalitzar infectant-les amb determinats virus o transfectant-les amb determinats gens vírics, tant es tracti de línies hematopoiètiques com de cèl·lules adherents. En el cas de les cèl·lules hematopoiètiques, la tècnica més utilitzada és mitjançant el virus Eps- tein Barr, que infecta aquest tipus de cèl·lules, sobretot els limfòcits. Es tracta, també, del virus causant de la mononucleosi. Això no obstant, en cultiu, aquest virus permet que la capacitat d’immortalització de les cèl·lules infectades incrementi. Pel que fa a les cèl·lules adherents, el virus Epstein Barr no és capaç d’infectar-les, de manera que cal recórrer a altres estratègies que permetin, igualment, que aquestes adquireixin immortali-tat. Un exemple d’aquestes tècniques és l’ús del gen SV40LT, utilitzat sobretot en cèl·lules adhe-rents, com ara els fibroblasts, els queratinòcits i/o les cèl·lules endotelials. Aquests mecanismes, tot i ser processos lents, inhibeixen l’expressió de gens implicats en el con- trol negatiu del cicle cel·lular, incrementant la supervivència cel·lular. Habitualment, les cèl·lules són transfectades o infectades retrovíricament 20 o 30 generacions abans d’entrar en fase senes- cent, període que pot durar mesos. Les cèl·lules, però, que superen la senescència, es conver- teixen en immortalitzades. 2. Immortalització amb el gen de la telomerasa (hTERT): Aquesta tècnica d’immortalització es basa principalment en la integració dels gens actius de la telo- merasa a les cèl·lules, per mitjà de virus o per processos de transducció, de tal manera que els cromosomes puguin mantenir la seva longitud (no s’escurcin). Aleshores, s’aconsegueix evitar el procés de senescència i les cèl·lules es poden dividir indefinidament. Segons l’ATCC (American Type Culture Collection), l’expressió de cèl·lules immortalitzades per mitjà del gen de la telomerasa (hTERT) presenta diversos avantatges respecte de les cèl·lules Grau de Bioquímica. Cultius cel·lulars 2 normals. Principalment, la immortalització cel·lular és un procés no maligne ni perjudicial per a aquestes, ja que no es transformen les cèl·lules. - Control del cicle cel·lular normal, p53 funcional i punts de control pRB: responen als mateixos processos del cicle cel·lular que les cèl·lules no immortalitzades; - Inhibició per contacte; - Dependència d’ancoratge per a l’adhesió cel·lular; - Conservació de les respostes normals de creixement en els sèrums; - Requeriment de factors de creixement per a la proliferació cel·lular: moltes d’elles, però, tenen la capacitat de segregar factors que permetin la seva autoestimulació, de manera que no depenen de l’addició/aportació d’aquests factors i elements tròfics i/o de creixement de manera externa; - Possessió i conservació de cariotips normals: majoritàriament, les cèl·lules mantenen el seu cariotip diploide, malgrat que algunes d’elles presenten haploïdia, o altres canvis/altera- cions en el nombre cromosòmic; - No presenten canvis associats a processos de transformació, com ara la tumorige- nicitat o creixement en agar tou. 3. Immortalització per fusió cel·lular: Malgrat no ser una tècnica tan utilitzada actualment, la immortalització per fusió cel·lular és pròpia de determinades línies cel·lulars. Es tracta de la fusió de cèl·lules immortalitzades amb cèl·lules no immortalitzades, que en la majoria de casos permet l’obtenició de cèl·lules filles immortalitzades. Això no obstant, no sempre s’obtenen aquests resultats. Tanmateix, per tal que les cèl·lules es fusi- onin les unes amb les altres, és necessari que les seves membranes corresponents siguin engan-xoses, fenomen que s’aconsegueix principalment amb l’addició de polietilenglicol (PEG) al cultiu, o en presència del virus Sendai inactivat. Així doncs, les membranes es tornen adhesives, fent que la
