Biológia molecular tema 9, Ejercicios de Biología

¡Descarga Biológia molecular tema 9 y más Ejercicios en PDF de Biología solo en Docsity! ANA DE LOS SANTOS 1.- Define: a.- PCR: Es una técnica in vitro de ampliación de adn, que permite obtener millones de copias iguales de fragmentos concretos de adn, partiendo de una mínima cantidad de adn. b.- Cebadores: Son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria de las regiones qué flanquean el fragmento que se quiere amplificar. c.- ADN polimerasas termoestables: Son enzimas aisladas de un grupo especial de arqueo bacterias extremófilas, con actividad polimerasa a temperaturas elevadas. 3.- Enumera al menos 7 aplicaciones de la PCR. ● Diagnóstico y pronóstico de enfermedades ● Evolución y respuesta a tratamientos ● Estudios de expresión génica ● Mutagénesis ● Estudio filogenéticos ● Genotipado ● Medicina forense 4.- ¿Qué permiten realizar los cebadores? Los cebadores fijan la especificidad de la reacción, haciendo posible la amplificación exclusiva de un fragmento concreto de ADN de entre una mezcla compleja de moléculas 5.- ¿El cebador forward a qué hebra molde se une? ¿Y el reverse? En cebador forward o F: se une a la hebra 3’-5 ’ En el cebador reverse: se une a la hebra 5’-3’ 6.- ¿A qué puede dar lugar la presencia de secuencias complementarias intramoleculares en los cebadores? La presencia de secuencia intramoleculares dan lugar a la formación de estructuras secundarias en el cebador (horquillas) que impiden su unión al ADN molde 7.- ¿Cuál es el tamaño mínimo que debe tener un cebador? ¿Cuál es el rango de longitud más frecuente? El tamaño mínimo de un cebador es de 16 bases. El rango de longitud frecuente es de entre 18-30 bases 8.- Enumera los tipos de ADN polimerasas termoestables e indica sus características. ● Actividad exonucleasa 5’-3’ sin actividad exonucleasa 3’-5’: no es capaz de corregir errores. Tasa de error = 1 por cada 100.000. ● Actividad exonucleasa 5´-3´ y actividad exonucleasa 3´-5´ : presenta actividad correctora. Tasa de error = 1 por cada millón de nucleótidos incorporados. ● Actividad transcriptasa inversa en presencia de iones manganeso 9.- Enumera las fases de un ciclo básico de PCR. ¿Qué ocurre en cada una de ellas? Fase 1. Desnaturalización: debe de ser lo suficientemente larga y a una temperatura elevada para garantizar la desnaturalización completa, sin prolongarse excesivamente para evitar la inactivación de la ADN polimerasa y se realiza a 94-95ºC durante 15-30 segundas Fase 2. hibridación: Se realiza a una temperatura de entre 50ºC- 65ºC, dependiendo de la ™ de los cebadores. ➔ Temperatura de hibridación más elevada que la ™ de los cebadores implican mayor rigurosidad, por tanto mayor especificidad ➔ Temperatura de hibridación más baja que la ™ de los cebadores. Implican un mayor rendimiento de la hibridación, pero posible aparición de productos no deseados por la hibridación inespecífica. ➔ Fase 3. Extensión: Se realiza a 72ºC. El tiempo está condicionado por la velocidad de polimerización de la encina y la longitud del fragmento que se va a amplificar. Para fragmentos de ˂ 1kb = 30-45 sg Fragmentos 1-1,5 kb = 1 minuto. fragmentos de 1,5 – 3 kb = 2 minutos. Para enzimas con actividad correctora = 2 minutos para kb. 10.- ¿A partir de qué ciclo comenzamos a obtener los amplicones? Los amplicones comienzan a aparecer a partir del ciclo tres 11.- Enumera la composición de la mezcla de reacción: ● Cloruro magnésico ● Desoxinucleótidos trifosfato ● Cebadores ● ADN polimerasa ● ADN molde (calidad del ADN molde y cantidad de ADN molde ● Aditivos o potenciadores 22.- Describe o realiza un esquema del protocolo de programación del termociclador para una PCR estándar. 23.- Si la calle uno es el marcador de peso molecular y la calle dos un paciente control positivo indicativo de que presenta mutación en la banda de 203 pares de base, analiza los resultados en la calle tres y en la calle 4. La calle tres pertenece a un paciente que también posee la mutación en la banda de 203 pares de bases pues presenta un resultado positivo, ya que podemos ver que las bandas se corresponden con la del control positivo. Sin embargo, la calle cuatro se trata de un paciente con resultado negativo en la mutación en la banda 203 pares de bases ya que no se aprecia una banda específica en dicha zona. 24.- Si la calle uno es el marcador de peso molecular, la calle dos un paciente control positivo indicativo de que presenta mutación, la calle tres un paciente control que no presenta mutación, analiza los resultados de la calle cuatro y cinco. La calle cuatro pertenece a un paciente que posee la mutación pues presenta un resultado positivo, ya que podemos ver que las bandas se corresponden con la del control positivo. Sin embargo, la calle cinco se trata de un paciente con resultado negativo ya que no se aprecia una banda específica en dicha zona 25.- Enumera las modalidades de la PCR estándar. Las modalidades de la PCR estándar son: ● PCR con inicio en caliente. ● PCR de grandes fragmentos. ● PCR de alta fidelidad. 26.- ¿Cuáles son las estrategias que se realizan en la PCR con inicio en caliente para evitar la actividad de la enzima a bajas temperaturas? Las estrategias que se realizan son: - Preparar la mezcla de reacción sin ADN polimerasa: Es la forma más sencilla. La enzima se añade a cada tubo ya colocados en el termociclador una vez que la temperatura está por encima de los 65ºC. Es engorroso y aumenta la posibilidad de contaminación. - Aislar el ADN polimerasa del resto de los componentes de la mezcla: Consiste en mantener la enzima aislada hasta que se alcance una temperatura elevada. El aislamiento se consigue incluyendo a la enzima en esferas de cera, la cual se fundirá a temperaturas elevadas. - Suministrando la ADN polimerasa inactiva: bloqueándola con un anticuerpo o bien modificando químicamente mediante unión termolábil a un grupo bloqueante. Al alcanzar la temperatura se desnaturaliza el anticuerpo o se rompe la unión termolábil. 27.- ¿Cuáles son las variaciones de las condiciones estándares de la composición de la mezcla de reacción en la PCR de alta fidelidad? En estos casos conviene realizar variaciones en las condiciones estándar de la composición de la mezcla de reacción. Estas son: - Utilización de ADN polimerasas termoestables con actividad correctora. - Favorecer las condiciones óptimas de mayor fidelidad de la enzima, ajustando: o PH: algunas enzimas presentan mayor fidelidad a PH más bajo del habitual y otras a PH más alto. La concentración de Mg2 +: un exceso disminuye la fidelidad de las polimerasas. 28.- ¿En qué consiste la PCR anidada? ¿Cómo son sus cebadores? La PCR anidada o nested-PCR consiste en la realización de dos reacciones de PCR acopladas, de manera que la segunda PCR utiliza como ADN molde los productos de amplificación de la primera. 29.- ¿Cómo se consigue realizar la PCR múltiple? La PCR múltiple consiste en la amplificación de varias secuencias diana simultáneamente en el mismo tubo, en una sola reacción de PCR. 30.- ¿Qué requisitos tienen que cumplir los cebadores de la PCR múltiple? Los requisitos que tienen que cumplir los cebadores de la PCR múltiple son: - La temperatura óptima de todos los cebadores para hibridar con su diana debe ser similar ya que se usa un único programa. - Los amplicones generados por cada pareja de cebadores tienen que tener un tamaño suficientemente diferente para poder separarse en la electroforesis y visualizarse como bandas individuales. - Deben diseñarse de manera que no pueden hibridar unos con otros formando dímeros u oligómeros . 31.- ¿Qué pasos se realizan en la RT-PCR? Como la ADN polimerasa termoestable utilizan ADN como molde, es necesario realizar: 1) Un paso previo de síntesis de ADNc mediante una retrotranscriptasa (RT) o transcriptasa inversa. 2) Un segundo paso en el que una ADN polimerasa termoestable utiliza el ADNc como molde y lo amplifica. 32.- Enumera las ventajas de la PCR a tiempo real: Las ventajas de esta técnica son: ● Proporciona mayor rapidez en la detección cualitativa de secuencias diana en una muestra, el resultado se puede obtener antes de que termine la PCR. ● Resultados más fidedignos (muy fieles) ya que la tinción instrumental con fluorescencia es más objetiva. ● Minimiza los problemas de contaminación ya que la amplificación y la detección se realizan en el mismo tubo. ● Dado que la intensidad de fluorescencia va a ser proporcional al ADN sintetizado, permite la cuantificación tanto de amplicones producidos, como del ADN diana inicial presente en la muestra 33.- ¿Qué son los agentes fluorescentes intercalantes? ¿Qué inconvenientes tienen? Son productos que emiten fluorescencia cuando se intercalan con la molécula de ADN en forma de doble hélice 34.- Enumera los sistemas de detección específicos de secuencia: ● Sondas de hidrólisis ● Baliza moleculares ● Sondas fret 35.- ¿Qué etapas incluye la programación del termociclador? a.- Cuatro principales y una de mantenimiento. b.- Una principal y tres de mantenimiento. c.- Tres principales y una de mantenimiento. d.- Dos principales y una de mantenimiento.