BIOQUÍMICA I inacabado, Apuntes de Bioquímica

¡Descarga BIOQUÍMICA I inacabado y más Apuntes en PDF de Bioquímica solo en Docsity! Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -1- BIOQUÍMICA I Entendemos por bioquímica a la ciencia que trata de explicar el comportamiento de un ser vivo a nivel molecular. Esta ciencia tratará de descomponer a los seres vivos en sus elementos más simples, es decir, en los complejos de macromoléculas y, en última instancia, en complejos macromoleculares como por ejemplo la cromatina que se compone de ácidos nucleicos y de proteínas. TEMA 1: INTRODUCCIÓN. 11/09/13 De este modo, a nivel macroscópico, los diferentes seres vivos somos diferentes mientras que a nivel molecular somos iguales ya que partimos de un origen común y estamos construidos de una manera modular. Así, los tres tipos de macromoléculas presentes en los seres vivos están constituidos por monómeros: - Las proteínas están formadas por 20 aminoácidos fundamentales. - Los ácidos nucleicos están formados por 8 nucleótidos (4 ribosas y 4 desoxirribosas). - Los polisacáridos están formados por monosacáridos, es decir, entre 8-12 azúcares. El origen de la bioquímica se sitúa a inicios del siglo XIX como resultado de la interacción de tres ciencias: La genética, la biología molecular y la biología celular. Áreas de la bioquímica: - Búsqueda de la relación estructura-función: Un órgano será capaz de tener una función debido a su estructura. - Técnicas de clonaje con la diferenciación y desarrollo: In vivo: en el animal/ la célula/ el organismo completo. In vitro: en el tubo de ensayo. In silico: por simulaciones en el ordenador. BIOQUÍMICA I Las proteínas son las macromoléculas más abundantes de los seres vivos ya que juegan un papel muy importante en la vida celular. Entre sus funciones se encuentran el transporte, el almacenamiento (ferritina), la defensa (inmunoglobulina), el movimiento, la formación de estructuras (colágeno) y la comunicación entre células y tejidos. Estructuralmente, las proteínas son polímeros lineales, no ramificados, formadas por unidades de aminoácidos. TEMAS 2 y 3: PROTEÍNAS. Estructura y función. 13/09/13 Aminoácidos. Los aminoácidos son un conjunto de moléculas químicas formadas por un grupo amino y por un grupo carboxilo unidos a un Carbono además de un cuarto sustituyente que constituirá el grupo funcional del aminoácido y que dará lugar a los 20 -aminoácidos estándar que van a constituir todas las proteínas. Salvo la Glicina, el resto de los aminoácidos van a ser asimétricos ya que el va a ser un Carbono quiral, es decir, va a ser un Carbono con 4 sustituyentes diferentes por lo que cada uno de los aminoácidos va a tener dos Carbonos diferentes tratándose de moléculas isómeras, también llamadas isómeros ópticos o enantiómeros. Estas moléculas son imágenes especulares una de la otra pero no son superponibles entre sí, es decir, estas moléculas son física y químicamente prácticamente idénticas entre ellas con la salvedad de que físicamente presentan una pequeña diferencia, que el plano de la luz polarizada en una disolución de la molécula se desvía en un sentido o en otro: Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -2- - Si el plano se desvía a la izquierda el aminoácido es levorotatorio. - Si el plano de desvía a la derecha el aminoácido es dexorotatorio. Todos los aminoácidos presentes en las proteínas son de la serie l-aminoácidos. Para determinar el sentido de giro del plano de la luz polarizada en una disolución compararemos el aminoácido con una molécula base, el gliceraldehido (3C), la cual tendrá un único Carbono asimétrico con el grupo hidroxilo a la izquierda en la serie levorotatoria por lo que si el grupo amino de aminoácido está a la izquierda este también será levorotatorio. Fisiológicamente, la carga neta y el estado de ionización de los aminoácidos dependerán del pH. Suponiendo una constante de acidez básica para el grupo amino y una constante de acidez alcalina para el grupo carboxilo: - En el caso de que el sea ácido el grupo amino estará desprotonado y el grupo carboxilo estará protonado ya que aceptará al encontrarse en un medio ácido por lo que la carga neta del aminoácido será +1. - En el caso de que el el grupo amino estará protonado ya que se encuentra en un ambiente básico y el grupo carboxilo estará desprotonado por lo que la carga neta del aminoácido será -1. - En el caso del pHfisiológico el grupo amino estará protonado ya que se encuentra en un ambiente neutro y el grupo carboxilo estará protonado ya que se encuentra en un ambiente neutro por lo que la carga neta del aminoácido será 0. El punto isoeléctrico de los aminoácidos se refiere a cuando su carga neta es igual a cero, lo cual, no quiere decir que el aminoácido tenga cargas. Aminoácidos estándar presentes en las proteínas. Los aminoácidos también se pueden clasificar en esenciales, si no los produce el organismo, y en no esenciales, si los produce el propio organismo. Otra posible clasificación los dividiría en aminoácidos hidrofobicos o aa no polares y en aminoácidos polares que, a su vez, se dividen en polares con carga y en polares sin carga, dependiendo de que en la cadena lateral haya un grupo ionizable o no. Una tercera clasificación dividiría a los aminoácidos según su cadena lateral en: - Aminoácidos con cadena lateral alfipática. - Con cadena aromática. - Con grupos sulfuro. - Con grupos alcohol. - Ácidos. - Bases. - Amidas. La formación de los enlaces de los puentes disulfuro es reversible y se produce por la oxidación de dos moléculas siendo de vital importancia. En el caso de que haya dos moléculas de cisteína estas reaccionan a través de su cadena lateral para formar la molécula cistina mediante puentes disulfuro. Aminoácidos modificados presentes en las proteínas. Los aminoácidos modificados son aminoácidos estándares que han sufrido alguna modificación en sus cadenas estándar. Todas estas modificaciones ocurren después de la síntesis proteica. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -5- 2. Estructura secundaria. La estructura secundaria se refiere a la forma, es decir, a la estructura o disposición localizada de los aminoácidos. Así, cualquier estructura secundaria debe cumplir que: - Sea estable y que forme interacciones que estabilicen a la estructura. - No tenga impedimentos estéricos. En los años 50, Pauling y Corey, realizaron un estudio de difracción de rayos X sobre unos cristales de proteínas. Ambos fueron capaces de proponer dos modelos de estructuras secundarias para las proteínas que cumpliesen con las dos condiciones anteriores: 1) - hélice. Estructura en la que el esqueleto polipeptidico se enrolla alrededor de un eje quedando las cadenas hacia el exterior de la hélice que se forma. -Características de la hélice (3,613):  La hélice que se forma es dextrógira, es decir, gira a la derecha.  Que sea dextrógira se debe a que todos los aminoácidos que la conforman son L.  El paso de rosca, lo que asciende la hélice por cada vuelta, es decir, la distancia entre dos puntos equivalentes, mide 0,54 nm,  El avance o el ascenso de la hélice, lo que asciende la hélice por cada aminoácido, es de 0,15 nm.  La rotación, es decir, cuanto se separa un aminoácido del siguiente es de 100º.  Al dividir el paso de rosca entre el avance nos da 3,6 aminoácidos por vuelta.  El diámetro es de unos 0,5 nm.  Los ángulos de torsión, y , nos muestran que la hélice está plegada y que gira a la derecha.  En el caso de que formásemos D-aminoácidos la hélice resultante sería una hélice especular con la diferencia de que los ángulos de torsión son positivos.  Un aminoácido que no aparece nunca en la hélice es la prolina ya que se puede considerar como un inminoácido porque al forma el enlace peptídico puede adoptar la configuración trans en vez la cis. Como consecuencia, aparecerá en la hélice un bucle por lo que la prolina sólo aparecerá al final de las hélices. -Interacciones de la - hélice para incrementar su estabilidad:  Puentes de Hidrógeno entre los enlcaces peptídicos ya que el oxígeno es un aceptor de Hidrógenos y el Nitrógenos un dador formándose un puente peptídico de Hidrógeno entre un grupo carboxílico y un grupo amino. Cuanto más alineados estén los aminoácidos más estables serán los puentes de Hidrógeno estando separados por cuatro posiciones a lo largo de la estructura. Tenemos que tener en cuenta, que los puentes de Hidrógeno son enlaces muy débiles comparados con los enlaces covalentes del enlace peptídico, pero, también, tenemos que tener en cuenta, que hay muchos enlaces de Hidrógeno a lo largo de la hélice y que, además, al ser débiles, van a permitir que la estructura sea estable y flexible, es decir, que pueda cambiar ligeramente de forma, y que no sea rígida.  Otras interacciones: Las cadenas laterales de los aminoácidos también pueden interaccionar entre sí pero sólo las más cercanas entre sí, es decir, podrán interaccionar aquellas cadenas laterales con una separación de cuatro aminoácidos. Estas cadenas pueden interaccionar entre sí de tres formas posibles: Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -6- - Pueden formas puentes de Hidrógeno ya que también tienen dadores y aceptores de Hidrógeno. - Pueden interaccionar entre sí mediante interacciones iónicas e hidrofóbicas. Estos 3 tipos de interacciones también van a ser débiles pero también van a ser muy numerosas por lo que también le proporcionarán estabilidad y flexibilidad a la hélice. La hélice también se denomina muchas veces hélice 3,613. 3,6 por el número de aminoácidos por vuelta y 13 por el número de átomos que forman un bucle al formarse los puentes de Hidrógeno. Hay otros dos tipos de estructuras helicoidales implicadas en este tipo de polipéptidos: - 310: 3 aminoácidos por vuelta. 10 aminoácidos implicados en el bucle que cierra el puente de Hidrógeno. En esta estructura y cadenas laterales están en la misma posición por lo que será una hélice dextrógira más delgada que la hélice por los ángulos de torsión. Es una hélice rara pero esta está presente en las proteínas. - 4,416: Hélice . 4,4 aminoácidos por vuelta. 16 aminoácidos implicados en el bucle que cierra el puente de Hidrógeno. Por los ángulos de torsión es dextrógira siendo una hélice más ancha que la . No se encentra en proteína pero es estéricamente posible. 2) La hoja plegada . Estructura en la que la cadena polipeptídica está muy extendida y forma una especie de zig- zag en el que el enlace peptídico tiene una configuración trans ya que no presenta impedimentos estéricos (sus cadenas laterales están dispuestas a un lado y a otro de la hoja). Hay dos tipos de hojas plegadas - Paralela: Las hebras de la cadena van en la misma dirección. - Antiparalela: Las hebras toman direcciones opuestas. La estructura paralela tiene interferencias laterales mientras que la antiparalela no las tendrá estando más extendida y siendo sus ángulos de torsión mayores. Las interacciones que mantienen estas estructuras son puentes de Hidrógeno estando todos los carbonos implicados en el enlace por lo que se formarán el máximo número de puentes de hidrógeno posibles. Así, la forma antiparalela será la más estable porque sus puentes de Hidrógeno estarán totalmente alineados. -Características de la hoja plegada :  Tamaño medio: 6 hebras por hoja (2-15 hebras).  Número de aminoácidos que forman la hebra: 6 (hasta 15)  Tamaño: 2,1 nm.  Aa que forman la hoja plegasa: Val, ile, Thr… Cuando representamos las hojas las representamos como una hélice plana. -Cómo se conectan las hebras de la hoja : Las hojas antiparalelas se conectan mediante un giro . Hay dos tipos de giros (Tipo I y tipo II). El giro presenta dos aminoácidos comunes: Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -7- 1.- La prolina porque adopta la configuración trans. 2.- La glicina porque es el aminoácido más pequelo y no puede formar enlaces de Hidrógeno. La prolina puede cambiar su configuración en el enlace dando lugar a los dos tipos de giros. De este modo, la prolínisomerasa transforma un isómero en otro. 23/09/13 Estructuras 2as permitidas estéricamente: La representación de Ramachandram. En el diagrama de Ramachandran se representan los valores de los ángulos de torsión y de tal forma que cualquier punto localizado en la gráfica representa una estructura posible del enlace peptídico definida por los ángulos de torsión. Los valores permitidos son muy pocos, como, por ejemplo, la - hélice levógira que no se da en las proteína pero cuya estructura está permitida estéricamente. 2. a. Estructuras supersecundarias. El siguiente nivel estructural se basa en la forma que tienen las proteínas nativas en el espacio, pero, antes, existen otros niveles intermedios entre las estructura secundaria y las terciarias que se les denomina estructuras supersecundarias. Estas estructuras son disposiciones estables de elementos de la estructura secundaria siendo una combinación entre la secundaria y la terciaria por lo que son estructuras más complejas que la secundaria pero no tanto como la terciaria: a) hélice-bucle-hélice. b) unidad c) silla , barril . c) giro . 3. Estructura terciaria. Este tipo de organización se refiere al plegamiento de todas las estructuras secundarias y de todas las cadenas secundarias, es decir, al pliegue de toda la proteína en el espacio para dar lugar a su estructura nativa, la cual, será la responsable de la función de la proteína. El plegamiento se produce para estabilizar la proteína. A la hora de plegar la proteína, se consideran los aminoácidos polares y apolares en un medio acuoso, de tal forma, que los aminoácidos polares intenten ponerse en contacto con el agua y los hidrofóbicos alejarse de ella. Así, los aminoácidos se van a plegar de manera que los polares se queden en la superficie de la proteína y, los hidrofóbicos, la mayor parte, en el interior. De este modo, cada proteína se va a plegar de una forma diferente ya que va a tener una estructura primaria diferente. Por lo tanto, tendremos que la estructura terciaria va a ser la responsable de la función de la proteínas, la cual, va a estar dictada por la estructura primaria siendo la estrcutura terciara el nivel máximo de muchas proteínas. Al plegarse, dos aminoácidos alejados de la estructura primaria, pueden interaccionar el uno con el otro plegándose la proteína de una forma o de otra al ser más estable. La proteína es una estructura muy compacta por lo que habrá muchas interacciones débiles no sólo entre enlaces peptídicos, sino también entre las cadenas laterales, para incrementar la estabilidad la estrucutura: - Interacciones iónicas, hidrofóbicas o de Van der Waals ya que lo átomos están muy próximos. - Puentes de Hidrógeno. - Interacciones covalentes entre puentes disulfuro. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -10- Como la estructura consta de tres aminoácidos por vuelta, la glicina siempre va a estar orientada hacia el frente, sin este aminoácido no se podría crear la cadena ya que la estructura se estabiliza por los puentes de Hidrógeno. Por otra parte, prolina e hidroxiprolina, dan rigidez a la estructura debido a la fuerza de su enlace peptídico. Es grupo inmino de la prolina no puede formar puentes de Hidrógeno porque no es un dador de Hidrógenos por lo que tiene que utilizar el grupo carboxílico. Los enlaces covalentes que mantiene mayoritariamente la estructura del colágeno son los puentes de lisina que se forman por una aminación oxidativa de la lisina por lo que el residuo de alisina reacciona con un aldehído (disina) para formar una base se Schiff. -Síntesis del colágeno: El colágeno es una proteína extracelular que se sintetiza en el RE rugoso. Una vez sintetizada, se modifican los aminoácidos purificándose al producirse una hidroxilación, es decir, una adición de azúcares y polisacáridos, a las serinas y a las prolinas. Posteriormente 3 cadenas se alinean unas con otras mediante la formación de enlaces disulfuro en el extremo carboxilo terminal formando la cadena con la diferenciación del extremo C-N. Esta cadena se denominará procolágeno, la cual, pasará al aparato de Golgi donde se glicosila, es decir, se la añaden azúcares. Después, se forma una vesícula que, por exocitosis, sale al espacio extracelular. Dos enzimas peptidasas van a cortar los dos extremos pasando a ser lo que se denomina tropocolágeno. Los extremos se llaman dominios no colágenos. Las fibrillas (tropo) de colágeno se asocian entre sí mediante puentes de alisina. La falta de vitamina C produce el escorbuto. Esta enfermedad se desarrolla porqué muchos aminoácidos son hidroxilados por la polihidroxilasa, una enzima que no se produce al faltar Vitamina C, por lo que el colágeno no se sintetiza correctamente. PROCESO DE PLEGADO DE LAS PROTEÍNAS. Una proteína entre cientos de miles de estructuras posibles va a escoger una única estructura, la estructura nativa, es decir, la estructura biológicamente activa. Sólo conocemos el proceso final e inicial del plegamiento, el cual es un proceso termodinámicamente favorecido (espontáneo) y cooperativo. Si tenemos los ángulos de torsión, y , vamos a suponer que vamos a obtener tres configuraciones estables y que el número de estructuras va a ser al no tener en cuenta la conformación de las cadenas laterales. Al mismo tiempo, suponemos que una proteína es capaz de probar estructuras en un segundo por lo que tendremos que estructuras posibles. De esta manera, la edad estimada del universo es de años constituyéndose la paradoja de Levinlhal. Afinsen, en un experimento, utilizó una proteína llamada ribonucleasa que es una pequeña enzima que tiene 124 aminoácidos. Para ello, la desnaturalizó, es la decir, la desplegó destruyendo su estructura secundaria y terciaria mediante la urea, que es un agente caotrópico que permite que el agua entre dentro del interior hidrofóbico de la proteína. Con esto, re reducen los puentes disulfuro mediante el oxígeno del aire por lo que la proteína se pliega en la configuración activa (nativa). Para plegarse en la conformación correcta, la proteína dependerá de la secuencia de aa de la secuencia primaria ya que, como dijimos, es la responsable de todas las demás estructuras. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -11- El proceso de plegado es un proceso espontáneo por lo que teniendo en cuenta que . No obstante, en el proceso de plegado pasamos de una estructura libre a otra estructura ordenada, es decir, con pocos grados de libertad, constituyendo lo que se llama la entropía conformacional, la cual disminuye respecto a la de la conformación anterior. Esta entropía trabaja en contra del plegado ya que . Si el plegado está favorecido termodinámicamente, el proceso tiene que estar contrarrestado por la entalpia y entropía de otros cambios. Así, la mayor fuente de entalpía negativa se da lugar cuando se producen interacciones al plegarse la proteína. En la estructura primaria, cuando la secuencia está en contacto con el agua, no se producen interacciones, pero sí cuando se pliega la proteína al producirse interacciones débiles de Hidrógeno y de Van der Waals disminuyendo la entalpía ( ). Otro factor que influye otra vez es la entropía. En este caso se da con un aa hidrofóbico que evita el contacto con el agua y viceversa dando lugar a que el agua forme una especie de jaula que rodee al núcleo hidrofóbico (clatrato) estando las moléculas ordenadas ya que están formando una estructura ordenada. Cuando esta estructura en forma de jaula desaparece, al plegarse la proteína, las moléculas de agua aumentan su entropía. Por lo tanto, ambos cambios tiene como resultado la disminución de la energía libre de la proteína. Los puentes disulfuro no intervienen en el plegado de las proteínas ya que sólo colaboran en la estabilidad de estas por lo que primero se plegará la proteína y, una vez plegada, se formará el puente disulfuro. Es más común encontrarse puentes disulfuro en el exterior celular ya que en este medio las condiciones van a ser más duras. Existen dos teorías sobre el plegamiento de las proteínas: - Una en la que el proceso de plegado es un proceso jerárquico donde la proteína se pliega poco a poco, es decir, primero se forman las estructuras secundarias, supersecundarias, dominios y, entonces, se pliega. - Teoría del glóbulo fundido: La proteína desplegada va a sufrir un colapso hidrofóbico que no deparará directamente en la estructura final, sino que darán lugar a un glóbulo fundido y, mediante unos ajustes, llegará al plegado final. De esta manera, el proceso de plegado lo podemos ver como un embudo energético en el que en la parte superior hay una alta energía que va descendiendo hasta la parte más estrecha, donde la energía y la entropía van disminuyendo cada vez más porque cada vez habrá menos configuraciones posibles, hasta llegar a la estructura más estable con menor energía y menor entropía, que es la estructura nativa. El proceso de plegado es un proceso complejo por lo que tiene que haber otras proteínas capaces de colaborar en el plegamiento de otras proteínas. La proteín disulfuro isomerasa, por ejemplo, corrige los puentes disulfuro, formándolos y rompiéndolos, que se originan prematuramente durante la síntesis de las proteínas. De esta forma, primero rompe los puentes disulfuro durante la síntesis proteica, para, después, volverlos a formar, cuando la proteína termina de sintetizarse y de plegarse totalmente, donde les corresponden. La peptidil propil isomerasa, por su parte, cataliza el cambio de conformación de la prolina de cis a trans cambiando los bucles que puedan aparecer en las proteínas. Finalmente, las chaperonas moleculares, impiden interacciones no permitidas en la proteínas que se sintetizan y salen del ribosoma mediante su interacción con regiones hidrofóbicas de las proteínas por lo que estas regiones no interaccionarán entre sí. Únicamente cuando se sintetiza totalmente la proteína se desprende la chaperona y la proteína se pliega. DESNATURALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -12- Hablamos de desnaturalización proteica cuando la proteína pierde su estructura secundaria, terciaria y su funcionalidad mediante cualquier factor que modifique sus interacciones débiles. La desnaturalización puede ser reversible o irreversible. Un ejemplo de un factor que cause la desnaturalización irreversible de la proteína es el pH. Si cambiamos el pH podrá verse modificada la carga de la proteína produciéndose interacciones iónicas. Otro factor irreversible es la temperatura. Con elevada temperatura (60- 65ºC) se da energía al sistema. Esta energía puede ser mayor que las interacciones débiles desplegándose la proteína y haciéndose insoluble. 30/09/13 Como factores de desnaturalización reversibles tenemos a los detergentes que interaccionan con el resto hidrofóbico de la proteína interaccionando los aminoácidos hidrofóbicos con el detergente en vez de interaccionar entre ellos. Un ejemplo de detergente es el SDS o dodecil sulfato sódico (una cadena alifática larga). . Otros factores reversibles son los agentes caotrópicos. Estos mejoran la solubilidad de la molécula hidrofóbica en el agua y permiten la desnaturalización de las proteínas gracias a la entrada de agua a su interior ya que rompen las interacciones hidrofóbicas. Como ejemplo de agente caotrópico tenemos la urea o el cloruro de guanidinio. . BIOQUÍMICA I Purificar una proteína significa poder separar a una proteína de todos los elementos de la célula en la que se encuentra, lo cual, es un proceso bastante trabajoso necesario para secuenciar y conocer la estructura primaria de una proteína, necesario para el estudio de sus mecanismos catalíticos, necesario para la obtención de anticuerpos, etc. TEMA 4: PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS. Etapas básicas en el proceso de purificación de una proteína. Antes de purificar la proteína tendremos que seguir unos pasos previos: 1) Elección del material biológico: Tenemos que escoger el material biológico a partir del cual vamos a purificar nuestra proteína. Si hay flexibilidad en cuanto al material biológico de partida se facilitará la purificación por lo que tendremos que tener en cuenta la riqueza de un tejido en esa proteína y tendremos que tener en cuenta las propiedades de la proteína que se van a purificar. 2) Preparación del extracto molecular o inicial: Las proteínas están dentro de las células, las cuales, tendremos que romper para que las proteínas pasen a la solución, es decir, pasen a formar el extracto crudo. 3) Purificación: Una vez llegado a este punto se realiza el proceso de purificación. Para ello, nos basaremos en diferentes criterios. El primer problema que va a aparecer es que vamos a tener que extraer una proteína del interior de una célula, por lo que, en el momento en el que la proteína salga de la célula, va a estar sometida a diversos agentes que van a atacarla. Por lo tanto, tendremos que estabilizar a la proteína. -Factores a tener en cuenta:  El pH: Se establece un pH neutro ligeramente alcalino o un pH con el que sea estable la proteína. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -15- Cuando mezclamos agua con un solvente orgánico miscible como el etanol o la acetona ocurre que, como el solvente va a ser menos polar que el agua, la mezcla resultante va a ser menos polar disminuyendo la constante eléctrica del medio. También va a ocurrir que, como el solvente es miscible en el agua, este también se va a solvatar, es decir, va a secuestrar la capacidad de solvatación de las proteínas reduciendo la disponibilidad de las moléculas de agua para la solvatación de moléculas de agua. Como consecuencia de estos dos procesos, las proteínas interaccionarán entre sí hasta que se forme un agragado y precipiten a altas concentraciones de solventes orgánicos. Otras proteínas, en cambio, permanecerán estables por lo que se podrán separar unas de otras. TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS. Van a existir diferentes tipos de cromatografías pero todas van a estar compuestas por una columna que funciona mediante:  Una fase móvil: una solución de las proteínas que queremos estudiar con un tampón determinado, es decir, el solvente que fluye a través de la columna arrastrando a la muestra.  Una fase estacionaria o matriz sólida porosa que rellena a las columnas.  Elución: Flujo de componentes a través de la columna.  Un volumen de elución: Volumen de fase móvil que debe fluir a través de la columna para eluir una determinada proteína presente en la muestra a fraccionar. Con esto, hacemos que la fase móvil interaccione con la estacionaria al atravesarla haciendo que se retrasen unas proteínas respecto a otras desplazándose en un orden determinado. Se pueden clasificar según la naturaleza de las fases en cromatografías líquido-líquido, gas líquido, etc. pero nosotros las clasificaremos en función de la interacción entre las dos fases: 1) Cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel. La fase estacionaria está formada por unas bolas hechas de un polímero inerte, el dextrano (cadenas largas de glucosa), cuyas cadenas estarán muy o poco entrecruzadas. Son polímeros de dextrano la poliacrilamina, el sephadez y la sephauosa. El grado de entrecruzamiento controlará el tamaño del poro que formarán los polímeros. El tamaño del poro es el tamaño de exclusión del gel, es decir, a tamaño o masa molecular menos, la molécula, podrá traspasar mejor el gel. De este modo, pasaremos la fase móvil por este polímero de manera que las proteínas más grandes pasarán entre las bolas del polímero mientras que las más pequeñas lo atravesarán recorriendo un camino más largo y retrasándose por lo que se separará a las proteínas en función de su tamaño molecular. Así, el volumen de elución será el volumen del solvente necesario para eluir una proteína de la columna y el volumen de vacio será el volumen de solvente que ocupará el espacio exterior del gel. Esta cromatografía también sirve para calcular el peso molecular de una proteína en su estado nativo pasando una proteína de volumen conocido por la columna y, mediante el volumen de elución, interpolando. A mayor PM, menos volumen de elución. -DIÁLISIS. Una variación de la cromatografía de exclusión es la diálisis. En la diálisis se separan por difusión las proteínas en función de su tamaño mediante una bolsa de diálisis con poros de un diámetro determinado. Este tipo de técnica sirve para eliminar el exceso de sales de una disolución. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -16- Bolsa Exterior 10 ml 1L 1M concentración final: 0,01M 2) Cromatografía de intercambio iónico. Con esta cromatografía vamos a separar las moléculas en función de su carga. Así, la fase móvil seguirán siendo las proteínas con una carga positiva y negativa, según el pH y el pKa del medio, y, la fase estacionaria, los polímeros se dextrano. A esta matriz inerte de dextrano le vamos a añadir covalentemente grupos con una carga eléctrica definida produciéndose un intercambio catiónico si se le añade una carga negativa y un intercambio aniónico si se le añade una carga positiva. Así, cuando la mezcla de proteínas atraviesa la fase en un intercambio catiónico la proteínas con cargas negativas van a ser eluidas de la columna mientras que la proteínas con cargas con signo opuesto (positivas) van a ser retenidas por interacciones electroestáticas de la columna. Con esta técnica, como hemos dicho, separamos las proteínas con carga positiva y negativa, es decir, las separamos de acuerdo con su carga eléctrica. Por último, se eluyen las proteínas que quedan retenidas en las columnas cambiando el pH y, por lo tanto, cambiando la carga de los aminoácidos retenidos. También se pueden eluir mediante soluciones salinas (NaCl 0,2M; Cl- y Na+) haciendo que atraviesen la columna. Así lo iones Cl- pasan directamente, en este caso, mientras que los Na+ van a competir con las proteínas retenidas por unirse con el dextrano cargado negativamente. No todas las proteínas estarán retenidas con la misma fuerza por lo que para separar todas las proteínas se aumentan las concentraciones de la sal. El intercambio aniónico se produce igual pero con todas las moléculas cambiadas de signo. 3) Cromatografía de afinidad. En esta técnica, nos vamos a aprovechar de la capacidad de ciertas proteínas de unirse con otras moléculas (ligandos). Lo que vamos a tener en la columna va a ser la misma fase estacionaria, es decir, polímeros de dextrámeros, a los que les vamos a unir covalentemente el ligando y a los que les vamos a pasar las proteínas que se podrán unir, pasando una solución que separará a las proteínas que se han unido al ligando de las que no se han unido. Las proteínas que se han unido al ligando se eluyen añadiendo una concentración de ligando muy concentrada para que compita por la proteína. Este tipo de cromatografía es la más específica porque está basada en una propiedad específica de la proteína por lo que a mayor especificidad de unión más específico es el proceso. -Otros tipos de cromatografía. C. en fase reserva. C. de interacción hidrofóbica. C. líquida de alta resolución. 04/10/13 TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS. La electroforesis es el movimiento de moléculas cargadas, en este caso proteínas, por un campo eléctrico. Este movimiento dependerá de la carga, positiva o negativa, de la molécula y, por lo tanto, del pH y del pKa del medio en el que se encuentre. De esta manera, las proteínas cargadas positivamente se desplazarán al ánodo y las negativas al cátodo del campo eléctrico. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -17- La velocidad de desplazamiento depende de tres criterios:  La carga: A mayor carga eléctrica más rápido se desplaza la proteína.  La masa: Cuanto más pequeña es la proteína más rápida será.  La forma: Si la forma de la proteína es esferoidal se desplaza más rápido mientras que si es fribosa es más lenta ya que se tiene que orientar. Podemos decir que la proteína se mueve de acuerdo a su relación carga/ masa. Además, a la hora de separar proteínas tendremos que utilizar sólo uno de los tres criterios. 1) Electroforesis en geles de poliacrilamina. La electroforesis se puede realizar sobre diferentes soportes como en el papel de celulosa, el de almidón, sobre la agarosa, pero con proteína vamos a utilizar geles de poliacrilamida dependeiendo, por lo tanto, del tamaño del poro del gel ya que tiene grandes poros para las proteínas filamentosas. La poliacrilamida es un polímero formado por dos monómeros solubles, la acrilamina y el metileno bisacrilamida, que se preparan en una disolución con un catalizador sulfato de radical libre que produce una reacción de polimerización en la que se entrelazan ambos monómeros. A mayor proporción de monómeros mas entrelazados estarán unas cadenas con otras siendo el tamaño del poro menor. Por ejemplo, un poro del 4% es grande mientras que uno del 20% es pequeño. La electroforesis en este gel se prepara entre dos placas de cristal formándose un recipiente estanco donde se prepara el gel y donde se añade el catalizador. A continuación, se le añade un peine para que polimerice y, cuando polimeriza, en lo que queda libre en la parte superior una vez retirado el peine, se carga de muestra. En el momento en el que tenemos el gel preparado tenemos que eliminar dos criterios de la velocidad del desplazamiento para quedarnos con uno. Para ello, tratamos a la proteína con un detergente, el dodecilsulfato sódico (SDS), de carga negativa que despliega a las proteínas y que se une a ellas en una determinada posición de tal forma que la proteína va a quedar rodeada por una nube de carga negativa por lo que la carga intrínseca de la proteína va a ser insignificante. Por el SDS, todas las proteínas van a tener una relación carga/ masa muy parecida por lo que ya hemos eliminado el criterio de carga. Por otro lado, el SDS desnaturaliza a las proteínas haciendo que tengan la misma forma aproximada (ovoide) por lo que el criterio de forma también se elimina. Ya sólo queda que las proteínas se dividan en función de su peso molecular, es decir, según su tamaño. El problema de esta electroforesis radica en que, al cargar el gel, dos proteínas diferentes situadas a distintas distancias del gel, no van a pasar al mismo tiempo por este. Este problema se elimina con la electroforesis discontinua en la que el gel va a tener dos partes, un gel de concentración y un gel de resolución. El gel de concentración tiene un bajo porcentaje de acrilamina, presenta un poro grande, y un pH ácido, mientras que, el gel de resolución presenta un poro menor y un pH alcalino por lo que una vez que polimeriza el gel de concentración se le añade el gel de resolución y, por último, se le añade el peine. El gel de concentración concentra la muestra conforme esta lo atraviesa por lo que toda la muestra estará congregada en una fina banda de forma de que cuando llegan al otro gel todas las proteínas parten del mismo puesto. Todo esto se lleva a cabo en un tampón de glicina con un pH de 8,5 parecido al de los geles ya que los recubrirá. El glicerol, por su parte, aumenta la densidad de la muestra ya que el pocillo estará lleno de un tampón con parecida densidad a esta para que pueda descender. También se utilizará el  mercapto etanol para reducir los puentes disulfuro y el azul de bromogenol, un colorante azul con carga negativa y con un pequeño tamaño que tendrá mucha velocidad deteniendo la muetra al final del gel y que, además, tiñe a la muestra para que se pueda ver. Otro colorante que se utiliza es el azul de Coomasi que se une inespecíficamente a las proteínas Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -20- - Los orgánicos que pueden ser coenzimas que se unen débilmente (coenzimas o sustratos) o unidas mediante enlaces covalentes (grupos prostéticos). La holoenzima es la enzima completa, es decir, la enzima propiamente dicha (apoenzima) más el cofactor. CLASES DE ENZIMAS. Se establece un sistema de clasificación que clasifica a las enzimas en 6 clases diferentes en función de tipo de reacción que cataliza y que van a estar identificadas por un dígito de cuatro números (EC). Cada clase de enzima viene identificada por el número y el nombre de cada clase: Clase 1.- Oxido-reductasa: Catalizan reacciones de transferencia de electrones entre diferentes moléculas. Clase 2.- Transferasas: Transfieren grupos funcionales desde una molécula dadora a otra aceptora. Clase 3.- Hidrolasa: Catalizan reacciones en las que se rompen enlaces mediante su transferencia a una molécula de agua. Clase4.- Liasa: Catalizan la rotura de enlaces mediante las reacciones de eliminación. También catalizan las reacciones inversas al añadir un grupo a un doble enlace. Clase 5.- Isomerasas: Catalizan cambios de configuraciones espaciales o geométricos. Clase 6.- Ligasas (sintetasas): Catalizan reacciones de formación de enlaces acopladas a la síntesis de moléculas energéticas. EJEMPLO: EC (1. 1. 1. 1). El primer número identifica la clase (pe., todas las oxido-reducciones empiezan por el 1). El segundo número identifica la subclase (quién es el dador de electrones o que grupo de transfiere). El tercer número identifica quién recibe los electrones. Dentro de la clase y la subclase puede haber diez tipos de enzimas diferentes lo que sería el cuarto número. Una enzima se identifica por primera vez mediante su clase y número y mediante su nombre sistemático. El nombre sistemático incluye al sustrato, al producto y, si intervienen coenzimas, el tipo de reacción. La lactato-piruvato-NAD-oxido-reductasa es un ejemplo de nombre sistemático. Este es demasiado largo como para utilizarlo repetidamente por lo que se utilizan los nombres comunes de las enzimas (los cuales no hay que confundirlos con las clases) que dan cierta información sobre la enzima como es el caso de la láctico deshidrogenasa o la LDH al ser muy común. Nombres vulgares de enzimas. Difieren en el aceptor de electrones. Deshidrogenasas. Oxigenasas. Fosfatasas. Oxidasas. Kinasas. Hexoquinasas (tranfiere un grupo fostato a una hexosas.). Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -21- CINÉTICA ENZIMÁTICA. La cinética enzimática trata de que factores modifican la velocidad de una reacción enzimática. Hay cuatro factores: - La concentración de sustrato [S]. - La concentración de enzimas [enzimas]. - La temperatura de reacción. - El pH. Para estudiar la cinética, modificamos el parámetro que queremos estudiar. Los otros tres tienen que ser constantes y no limitantes. El único factor limitante es el que se tiene que estudiar. 10/10/13 1. Efecto de la concentración de sustratos. Ecuación de Michaelis-Menten. Si medimos la velocidad de reacción enzimática frente a la concentración de sustrato tendremos que: - Primero, cuando aumenta la concentración de sustrato, aumenta la velocidad de manera proporcional siendo una reacción de primer orden. - Segundo, se llega a un punto en el que la velocidad es independiente de la concentración de sustrato siendo una reacción de orden 0 hasta que se alcanza la velocidad máxima de reacción. Cálculo de la concentración del complejo enzima-sustrato [ES]. En las reacciones enzimáticas hay dos pasos, la unión del enzima con el sustrato y la transformación de sustrato en producto al descomponerse el complejo formado, por lo que tendremos que tener en cuenta que la concentración de las enzimas es fija. Así, aunque las concentraciones del sustrato sean muy altas, la velocidad no se incrementará por que la enzima estará saturada por el sustrato. El paso limitante de la reacción será aquel que sea el más lento. Aunque los dos pasos de la reacción enzimática son muy rápidos, en el segundo paso, en el que se transforma el sustrato para dar lugar al producto, es menos rápido que el primero. Si el paso limitante es el segundo, esto quiere decir que la velocidad de reacción enzimática dependerá de la segunda reacción por lo que su velocidad será . Ecuación de Michaelis-Menten. No obstante, nos interesa una ecuación que nos relacione la velocidad de reacción con la concentración de sustrato porque calcular la concentración del complejo enzima-sustrato es muy difícil, para lo que: - [S] >>> [E]; Vamos a suponer que la concentración del sustrato es muy superior a la concentración del enzima trabajando con la velocidad máxima de reacción. - [P] ; Vamos a medir la velocidad de reacción en los momentos iniciales, es decir, en los momentos en los que las concentraciones de producto son muy bajas. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -22- - ; Tendremos dos formas de enzimas, la que va a formar el complejo enzima sustrato [E+S] y la que está formando el complejo [ES], por lo que la concentración de la enzima será la suma de ambas concentraciones. Para ello, también, vamos a medir con qué velocidad se va a formar y se va a descomponer el complejo: - Velocidad de formación: - Velocidad de descomposición: - En condiciones de estados estacionario, en el que [ES] permanece aproximadamente constante con el tiempo, la velocidad es prácticamente constante ya que la formación y la descomposición del complejo se produce a la misma velocidad. 1º De esta relación de las constantes de velocidad de una reacción resulta la definición matemática de la constante de Michaelis (KM): 2º Cuando la enzima está saturada la velocidad máxima se expresa como y obtenemos la deseada ecuación que relaciona [S] con la velocidad de reacción, es decir, la ecuación de Michaelis-Menten: DEFINICIÓN: La KM es la [S] a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. 3º Con la KM podemos cuantificar la medida de la afinidad de la enzima por el sustrato mediante la constante de equilibrio (KS): A mayor KM, K1 < K-1 por lo que la reacción favorecida es la descomposición del complejo. La afinidad del enzima por el sustrato es baja. A menor KM, K-1 > K1 por lo que se favorece la unión del enzima con el sustrato. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -25- Estas unidades no se suelen utilizar porque requieren unas condiciones no apropiadas (pH=7 y tª=22ºC) y porque es una unidad muy grande. - Otra forma de expresar las unidades es mediante la actividad específica que se define como: - Otro parámetro es el número de recambio de la enzima o la constante catalítica que se define como: Tenemos que tener en cuenta que, para medir la actividad, el único factor limitante va a ser la concentración de enzimas mientras que los demás factores van a ser constante y no limitantes como van a serlo el pH óptimo y las temperaturas óptimas o estándar (por esto ambas se indican). Las concentración de sustrato no es constante porque se transforma en producto por lo que se trabaja a altas concentraciones de sustrato en las que la velocidad sea independiente del sustrato dependiendo únicamente de la enzima. Se puede medir la actividad de una enzima de dos maneras: - Midiendo cómo desparece el sustrato. - Midiendo como aparece el producto. Se utilizará la forma que sea más sencilla según las condiciones del ensayo. Se mida lo que se mida, la actividad siempre se expresará en moles de sustrato transformado por minuto. Por ejemplo: Las unidades que aparecen primero son unidades de velocidad pero no de actividad. Para que sean unidades de actividad, se transforma el producto al sustrato mediante los coeficientes estequiométricos. La actividad de las enzimas que utilicen una coenzima determinada son más fáciles de medir, como por ejemplo: Lactato Piruvato Las coenzimas, el y el , tienen diferentes absorbancias en su estado oxidado y reducido: Abs A340 260 nm 340 nm t Para medir la actividad, el coenzima tiene que estar a elevadas concentraciones por lo que se producirá un cambio progresivo se la absorbancia aumentando progresivamente en la longitud de onda conforme aparece el NADH. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -26- De este modo, la concentración de calcula mediante la ley de Lambert-Beer por lo que nos queda la velocidad mediante la que se consigue la actividad por estiquiometría (mol a mol). Si las enzimas no presentan una coenzima determinado también se le pueden acoplar reacciones auxiliares para que sea fácilmente medible. Por ejemplo, dentro de las kinasas de la clase 2 transferasa, que transfieren grupos fosfatos está la siguiente enzima que interviene en la siguiente reacción: A esta reacción se le acoplan otras dos reacciones auxiliares, las cuales, deben de cumplir que: - Un sustrato sea auxiliar. - Uno de los sustratos sea el producto de la reacción principal. La velocidad de la reacción principal controla la velocidad de las otras dependiendo, en última instancia, del único factor limitante, la enzima (CK). 16/10/13 MECANISMO DE LAS REACCIONES BISUSTRATO-BIPRDUCTO (bi-bi). Normalmente las reacciones enzimáticas parten de un sustrato para dar un producto determinado pero en las células ocurre de manera diferente. En las células, los tipos de reacciones más comunes son aquellas en las que intervienen dos sustratos para dar dos productos (A + B P + Q) y las que van a transcurrir mediante una serie limitada de mecanismos: 1. Mecanismo de doble desplazamiento (ping-pong). Al principio, entra un sustrato (A) para modificar el enzima (EA PE*) saliendo un producto (P). El enzima modificado (E*) produce una segunda reacción (E*B EQ) con un sustrato que entra (B) saliendo un segundo producto (Q) y regenerando el enzima. A P B Q E EA PE* E* E*B EQ E - Características:  Se forman compuestos binarios.  La enzima se modifica temporalmente (E*). Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -27- - Ejemplo: La reacción transaminasa cuya enzima transfiere el grupo amino. E Aspartato Oxalacetato Cetoglutarato Glutamato E E (aspartato) (E-NH3) (Oxalacetat o) (E-NH3) (E-NH3) (Cetoglutarato) E (glutamato) - Para distinguir cualquier reacción que ocurra mediante el mecanismo de doble desplazamiento se representa la reacción manteniendo la concentración de B fija de modo que para cada concentración de B tengamos una cinética: [B] (Ej: 1 molar, 10 molar, 15 molar) 1/v Tres cinéticas 1/[A] 2. Mecanismo de desplazamiento simple (mecanismos secuenciales). Estos pueden ser: A) Mecanismo de desplazamiento simple ordenado. Se denomina así porque hay un orden en la entrada de los sustratos y en la salida de los productos. Primero, el enzima se une al primer sustrato conductor (A) formando el complejo conductor (AE). Después, se le une el sustrato acompañante (B) y se forma el complejo ternario (AEB) produciéndose la reacción AEB PEQ. Entonces, le libera el primer producto (P) y, posteriormente el segundo (Q) regenerando el enzima. A B P Q E EA AEB PEQ EQ E - Características:  Si el sustrato conductor no se une el sustrato acompañante tampoco.  El sustrato conductor suele ser una enzima.  El primer sustrato que entra, el conductor, es el primero que sale.  Se forman compuestos ternarios.  Hay un orden en la entrada de los sustratos y en la salida de los productos. - Ejemplo: La reacciones catalizadas por deshidrogenasa: PIRUVATO (A) + NADH (B) + H+ LACTATO + NAD+ - Para distinguir cualquier reacción que ocurra mediante el mecanismo simple ordenado se representa la reacción manteniendo la concentración de B fija de modo que para cada concentración de B tengamos unas cinéticas que se cortan en un punto: Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -30- 1. Factor de proximidad y orientación. Para que se lleve a cabo una reacción las moléculas tienen que chocar entre sí aproximándose con una orientación adecuada por lo que no todos los choques son efectivos. En una enzima que va a catalizar una reacción, como los sustratos tienen afinidad por el centro activo, los sustratos se van a unir al centro activo, es decir, se van a aproximar equivaliendo a la colisión de tal manera que los grupos catalíticos y los grupos de la enzima estén orientados de manera que se lleve a cabo la reacción. Resumiendo, la enzima aproxima los sustratos al unirse estos al centro activo, y los orienta en la posición más adecuada para que se lleve a cabo la reacción. Así, todas las reacciones son productivas. Por un lado, la entropía del sistema disminuye por lo que pasamos a un sistema en el que los tres componentes pierden grados de libertad por lo que el sistema está más ordenado. Esta entropía está compensada por un descenso de la entalpía muy grande debido a las interacciones de los sustratos entre sí y con la enzima. Imidazol + p-nitrofenilacetato N-acetilimidazolio + p-nitrofenolato El progreso de la reacción se controla de manera conveniente mediante la aparición del ión p- nitrofenolato de color amarillo intenso. En el caso de de que los dos productos (Imidazol y p- nitrofenilacetato) fuesen una única molécula, la reacción transcurriría 25 veces más rápido porque, en el primer caso, los productos se tienen que encontrar y orientar mientras que en el segundo caso ya estarían unidos. Esto es lo que hacen las enzimas, primero unen a los sustratos y, una vez que están unidos, ya están orientados por lo que la reacción catalítica transcurrirá más rápido. 2. Factor de distorsión y desestabilización. Fijación del estado de transición. Por una parte, la enzima va a distorsionar al sustrato ya que la unión del sustrato al centro activo provoca su distorsión. Para ello, la enzima lleva al sustrato al estado de transición ya que se trata de la barrera energética que tiene que sobrepasar el sustrato para romperse por lo que las moléculas y el sustrato van a estar sometidos a estrés. En el modelo de ajuste inducido, en el que la enzima es complementaria al estado de transición, el sustrato se une al centro activo por lo que el sustrato y el centro activo se ajustan llevando la enzima al sustrato al estado de transición, lo que quiere decir, que el sustrato se deforma ya que sus enlaces estarán sometido a tensión por lo que serán más fácil de romper. En el caso de que en el sustrato tenga sustituyentes en los que intervengan fuerzas estéricas también será más fácil de romper por la tensión que en el caso de que no los tenga. La enzima presenta más afinidad por el sustrato en el estado de transición, no por lo análogos del sustrato, sino por los análogos del sustrato en el estado de transición, que por el sustrato en su estado nativo siendo unos inhibidores muy potentes ya que, a bajas concentraciones, producen la inhibición del sustrato porque compiten por la enzima al tener mayor afinidad. Esto es interesante para el diseño de fármacos ya que los análogos del sustrato en el estado de transición tienen un efecto más específico y más potente. El sustrato es estable en solución pero no lo es al entrar en el centro activo (entorno hidrofóbico) ya que pierde el agua de solvatación, lo que provoca su desestabilización obteniendo un sustrato inestable. 3. Catálisis por iónes metálicos (catálisis electrófila). Hay enzimas que necesitan de la presencia de iones metálicos bivalentes para llevar a cabo la catálisis enzimática (Mg2+, Mn2+, Fe2+, Co2+, Zn2+). -Funciones de los iones metálicos en la catálisis enzimática: Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -31-  Tenemos que considerar que los iones metálicos tienen carga eléctrica por lo que van a colaborar en la unión y orientación del sustrato en el centro activo.  Estos iones son capaces de ceder y captar electrones por lo que facilitan las reacciones de óxido-reducción en las enzimas mediante el cambio reversible del estado de oxidación del ión metálico. Ej: Fe2+ Fe3+ + e-.  Apantallan las cargas negativas del sustrato. Por ejemplo en la reacción: El ATP tiene cuatro cargas negativas debido a los grupos fosfato por lo que no puede entrar en el centro activo de la enzima. El ATP podrá entrar al centro activo gracias a los iones metálicos, como por ejemplo el Mg2+, que tienen dos cargas positivas que apantallan parte de la carga negativa del ATP. De esta manera, el verdadero sustrato de la reacción es el complejo formado por el ión y el ATP (ATP-Mg2+). 4. Catálisis covalente (catálisis nucleófila). Cuando el sustrato se une a una enzima, generalmente, se hace mediante interacciones débiles pero, en algunos casos, se unen por enlaces covalentes ya que algunas enzimas tienen en el centro activo aminoácidos con cadenas laterales compuestas por grupos nucleófilos, es decir, compuestas por grupos con exceso de electrones como son los grupos hidroxilos, los grupos amino de la lisina, los grupos imidazol de las histidina, los grupos sulfidrilo, los cuales ceden electrones desapareados para formar enlaces covalentes con el centro activo. El enlace covalente es fuerte pero, al mismo tiempo, no lo suficientemente fuerte de manera que se puede romper fácilmente ya que no todos los enlaces covalente son iguales. Por ejemplo, una enzima con un grupo nucleófilo hidroxilo de la serina es capaz de atacar al sustrato para romper sus enlaces y para que se una temporalmente el sustrato a ella mediante la formación de un enlace covalente. 5. Catálisis general ácido-base. - Catálisis específica ácida o básica. En esta catálisis la velocidad de reacción depende de la concentración de protones (H+) o de la concentración de hidroxilos (OH-) de modo que, para acelerar la velocidad de reacción, se va a trabajar a un pH ácido (con alta concentración de H+) o a un pH básico (con baja concentración de H+). Por ejemplo, en la catálisis alcalina específica básica el catalizador es un ión hidroxilo. Las enzimas no son capaces de llevar a cabo esta catálisis porque a pHs extremos se desnaturalizan pero sí que van a llevar a cabo la catálisis general ácida o básica la cual se lleva a cabo en condiciones de neutralidad y en la que los aminoácidos del centro activo son ácidos o bases de Lewis. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -32- - Catálisis general ácida o básica. La velocidad de reacción depende de la concentración de compuestos que se comportan como ácidos o como bases, y de su capacidad para ceder o aceptar protones. En la catálisis general básica el centro activo de la enzima tiene un grupo básico que acepta protones del sustrato que es, en este caso, una molécula de agua que produce una serie de desplazamientos electrónicos en un compuesto intermediario obteniéndose la enzima y el producto. La enzima (B-) para llevar a cabo la catálisis específica tendría que trabajar a un pH de 13 mientras que en la catálisis general se lleva a cabo en un pH neutro. En la catálisis general ácida el grupo ácido cede protones al sustrato por lo que la enzima se modifica ya que pierde su protón al cederlo y al ser un ácido de Lewis provocando una serie de desplazamientos electrónicos en el producto intermedio obteniéndose los productos y el enzima. Todos estos factores explican por qué se lleva a cabo la reacción enzimática y no hay que confundirlos con los factores que condicionan las velocidades de reacción. Estos últimos se dan cuando la reacción ya está produciéndose. REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. Entre las ventajas de las enzimas frente a la catálisis química se encuentra que una enzima va a ser capaz de acelerar o ralentizar una reacción dependiendo de lo que le haga falta a la célula en un momento determinado. Las células controlan a las enzimas que llevan a cabo sus reacciones y lo pueden hacer de diferentes maneras. Una de ellas es elevando la concentración de las enzimas. De este modo, la velocidad de reacción será más rápida. Es un mecanismo que lleva cierto tiempo ya que se tiene que codificar, transcribir y traducir el gen de la enzima en cuestión lo que es muy costoso porque se tiene que sintetizar. Una manera más sencilla es que la enzima esté siempre presente en la célula y se active o se desactive según se necesite lo cual es menos costoso y más rápido ya que sólo se unirá un activador o un inhibidor que regularán la velocidad de reacción regulando la actividad de la enzima. La actividad de las enzimas se regula de muchas maneras:  Activación enzimática.  Inhibición enzimática.  Modificación de la enzima de manera covalente en la que se va a modificar la cadena lateral de un aminoácido de la enzima para que sea más o menos activa.  Activación por cimógenos.  Regulación por isoenzimas.  Enzimas alostéricas. 1. Inhibición enzimática. Un inhibidor es cualquier molécula que, al estar presente en la reacción, hacer que disminuya la velocidad de esa reacción. En el caso más sencillo con una enzima, con un sustrato y con un inhibidor, hay dos tipos de inhibidores dependiendo de cómo se unan al enzima: - Reversible: El inhibidor se une de manera reversible. - Irreversible: El inhibidor se une de manera iireversible. 21/10/13 1.1. Inhibición enzimática reversible. El inhibidor se une de manera rápida y reversible al enzima o al complejo sustrato-enzima. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -35- El inhibidor no competitivo también se distingue en una reacción catalítica mediante una representación de Lineweaber-Burk en la que crea una familia de rectas que se cortan en un punto: 1/v [I] 0 [I] = 0 -1/KM 1/[S] 1/vmáx ap 1/KI vmáx 1/vmáx d -KI [I] 1.1.3. Inhibición acompetitiva. El inhibidor se une únicamente al complejo enzima-sustrato. El inhibidor no se une a la enzima libre porque surge un sitio de unión. SEI: Complejo ternario inactivo. Características. - Velocidad máxima en presencia del inhibidor. Nunca se alcanzará la velocidad máxima. La velocidad máxima disminuye ya que habrá siempre parte de la enzima que forme el complejo ternario por lo que el equilibrio se desplazará primero hacia abajo y se desplazará el horizontal hacia la derecha al aumentar las concentración de sustrato,. - Afinidad del enzima por el sustrato en presencia del inhibidor. El aumento de la afinidad con el descenso de KM es un aumento aparente. Aumenta la afinidad porque el equilibrio se desplaza a la derecha como consecuencia del desplazamiento del otro equilibrio. 1/vmáx 1/vmáx ap Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -36- De este modo: ; . El inhibidor acompetitivo también se distingue en una reacción catalítica mediante una representación de Lineweaber-Burk en la que crea una familia de rectas paralelas y tienen la misma pendiente por lo que la pendiente no viene afectada por [I]: [I] 0 1/v [I] = 0 -1/KM 1/KMap 1/[S] 1.1.4. Inhibición mixta. Mezcla de los casos extremos de la inhibición competitiva (la unión del sustrato afecta a la unión del inhibidor y viceversa) y de la no competitiva (la unión del sustrato e inhibidor es independiente). La unión del sustrato o del inhibidor al enzima no es independiente, la unión del sustrato modifica la unión del inhibidor y viceversa, es decir, la unión de uno condiciona la unión del otro. Características. - Velocidad máxima en presencia del inhibidor. La velocidad máxima disminuye ya que habrá siempre parte de la enzima que forme el complejo ternario disminuyendo la velocidad máxima de la reacción por lo que el equilibrio de abajo se desplazarán a la derecha y nunca se podrá alcanzar la velocidad máxima. - Afinidad del enzima por el sustrato en presencia del inhibidor. KM aumenta disminuyendo la afinidad. Esto se debe a que KS > KS por lo que aumenta KM. 1/vmáx 1/vmáx ap KS: cuando el sustrato se une al EI, el I dificulta la unión del sustrato Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -37- El inhibidor mixto también se distingue en una reacción catalítica mediante una representación de Lineweaber-Burk en la que crea una familia de rectas que se cortan en un punto: 1/v [I] 0 [I] = 0 -1/KM -1/KMap 1/[S] 25/10/13 1.2. Inhibición enzimática irreversible. El inhibidor se va a unir de manera irreversible a la enzima, de tal manera que, la enzima, queda inactivada permanentemente. Características. - Velocidad máxima en presencia del inhibidor. La velocidad máxima disminuye porque siempre va a estar secuestrada la enzima. - Afinidad del enzima por el sustrato en presencia del inhibidor. La KM aumenta no varía es constante ya que el aumento de sustrato hará Distinción entre la inhibición reversible y la inhibición irreversible. Este tipo de inhibición se puede confundir con la inhibición reversible no competitiva ya que presentan las mismas características. Se distingue: A) Mediante una diálisis: Al añadirle el inhibidor a la enzima (E + I) estos se unen (EI) de forma que la enzima después de la diálisis la enzima puede ser activa, tratándose de una inhibición reversible no competitiva porque el inhibidor es una molécula pequeña, o inactiva, tratándose de una inhibición irreversible ya que el inhibidor no se separa de la enzima. I E + S P No competitiva E + I EI diálisis EI + S ≠> Irreversible 1/vmáx 1/vmáx ap KI: Afinidad del enzima por el inhibidor. KS: Afinidad del enzima por el sustrato. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -40- - Características de las enzimas alostéricas: 1. Son proteínas oligoméricas, es decir, son proteínas formadas por dos o más subunidades diferentes (protómeros). 2. Presentan cinéticas sismoides (en forma de S) a diferencia de las cinéticas de Michaelis- Menten por lo que no se puede hablar de KM si no de K0,5. No obstante, el concepto sigue siendo el mismo (la velocidad a la cual la reacción es la mitad de la velocidad máxima) y sigue siendo una medida de la afinidad pero que no sigue la cinética de Michaelis. 3. Además del centro activo (centro catabólico donde se une el sustrato), presentan uno o varios sitios alostéricos. 4. Las moléculas que se unen a los sitios alostéricos se denominan efectores y su unión reversible modula la actividad de la enzima. Así, la unión se regula por la unión no covalente y reversible de efectores. 5. El efector, al unirse al sitio activo, puede aumentar la actividad de la enzima, siendo un efector positivo o activador alostérico, o puede disminuirla, siendo un efector negativo o un inhibidor alostérico. 6. El efector, a su vez, puede ser cualquier molécula siendo un efector heterotrópico o puede ser el sustrato, siendo un efector homotrópico, presentando dos sitios de unión, el centro activo donde se lleva a cabo la catálisis y el sitio activo donde actúa como efector. 7. Presentan cooperatividad ya que los sitios de unión no son independientes. En cuanto a las cinéticas tenemos: Enzima alostérica Enzima de Michaelis-Menten v v vmáx vmáx vmáx/2 vmáx/2 K0,5 [S] KM [S] En la cinética de Michaelis-Menten por muy poco que aumente [S] aumentará la velocidad de la reacción de manera proporcional por lo que la enzima de Michaelis-Menten no permite que se acumule el sustrato. En la otra cinética, a [S] bajas la velocidad de reacción será lenta hasta que la concentración de sustrato pase de un valor en el que la enzima lo transforme. La enzima alostérica permitirá que el sustrato se acumule hasta esa concentración de tal manera que las concentración de sustrato va a ser constante. - Tipos de enzimas alostéricas según el efecto del efector sobre la enzima: 1.- Enzimas tipo K. La unión del efector modifica la K0,5 (afinidad) sin modificar la vmáx. 2.- Enzimas tipo V. La unión del efector modifica la vmáx sin modificar la K0,5 (afinidad). Ambos tipos de enzimas aparecerén en las células pero la más importante es la tipo K. 30/10/13 Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -41- Cinética de una enzima alostérica. Ecuación de Hill. S S S S S S S S S S Como ejemplo tenemos una enzima alostérica con cuatro sitios de unión. Los sitios de unión no son independientes ya que la unión de un sustrato modifica la afinidad de los demás sitios de unión. Por ello, cada sitio de unión tendrá una afinidad. La primera afinidad aumenta teniendo una cooperatividad positiva y la segunda afinidad disminuye teniendo una cooperatividad negativa habiendo un efecto acumulativo. La ecuación que describe un sistema como es: Suponiendo que la cooperatividad es positiva y perfecta, es decir, infinita, cuando se une el primer sustrato la afinidad es tan grande que los otros sustratos se unen rápidamente. De este modo, la ecuación queda simplificada a: 4 se refiere a los cuatro sitios de unión y se refiere a cómo varían sus afinidades. En caso de cooperatividad perfecta (cooperatividad infinita), todos los sitios de unión están ocupados y sólo se considera la enzima libre y la enzima con los cuatro sitios ocupados. En el caso más general de una proteína con n sitios de unión, suponiendo cooperatividad perfecta obtenemos la ecuación de Hill: ; ; Si n=1 resultará la ecuacuón de Michaelis-Menten en cuyo caso la enzima alostérica no presentará cooperatividad. - Representación de Hill. Despejando y modificando la ecuación de Hill obtenemos su representación: n log[S] -log KS’ log[S]0,5 Por ejemplo, si la enzima no tiene una cooperatividad perfecta. En estos casos, n se convierte en el coeficiente de Hill (nH) que indica la porción de sitios de Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -42- unión. Los números enteros como n=4 se utilizan para cooperatividades perfectas aunque, en la naturaleza, la cooperatividad perfecta no existe. Si se aplica la ecuación de Hill a una proteína real, n no es un número entero, ni es el nº de sitios de unión, sino es, como hemos dicho, el coeficiente de Hill. 1. Si el nH = 1 se trata una enzima de Michaelis-Menten que no presentan cooperatividad. 2. Si nH > 1 se trata de un enzima alostérico con cooperatividad positiva. 3. Si nH < 1 (no puede ser menor que cero) se trata de un enzima alostérico con cooperatividad negativa. El coeficiente de Hill también indica el número mínimo de sitios de unión de una enzima. Este se trata del número entero mayor y más próximo al coeficiente de Hill. Cuanto más se acerce el coeficiente al número mínimo de sitios más cooperativa será la enzima. nH mínimo nº de sitios cooperatividad 5,9 6 Cooperatividad positiva. Es muy buena. ++++++++++++++ 5,5 6 Cooperatividad positiva. No está mal. +++++++ 5,1 6 Cooperatividad positiva. Muy mala. + 1 6 Enzima de Michaelis-Menten. Sitios de unión independientes. No cooperativa. El coeficiente de Hill se aplica tanto a enzimas como a proteínas alostéricas como es el caso de la Hemoglobina cuyo nH = 2,8 y cuyo número mínimo es 3. La Hemoglobina tiene cuatro sitios de unión lo que nos indica que, cinéticamente, esta molécula tiene tres sitios de unión con alta cooperatividad. Muchas veces es difícil determinar que una cinética sea sismoidea ya que la concentración de sustrato puede ser baja. Para poder distinguirlas se realiza una representación en la que se observa que las enzimas alostéricas pierden la lineabilidad. Cooperatividad negativa (-) 1/v M-M Cooperatividad positiva (+) 1/[S] Otra forma es mediante el índice de cooperatividad con el que vamos a calcular la concentración de sustrato para alcanzar dos fracciones de la velocidad máxima (el 90% y el 10%). Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -45- 04/11/13 COENZIMAS. Algunas enzimas, para catalizar una reacción, necesitan de la presencia de otras moléculas llamadas cofactores, las cuales, pueden ser iones metálicos o moléculas orgánicas más o menos complejas conocidas como coenzimas que , a su vez, pueden estar unidas permanentemente a la enzima mediante un enlace covalente tratándose de un grupo prostético o estar unidas temporalmente tratándose de un cosustrato. CLASIFICACIÓN FUNCIONAL DE LAS COENZIMAS. Una forma de clasificar a las coenzimas es según su función en: 1) Coenzimas que intervienen en reacciones de transferencia de electrones. 2) Coenzimas que intervienen en reacciones de transferencia de otros grupos. Función Origen Coenzima Vitamina Grupo tansferido Enfermedad por deficiencia Transporte electrónico Vitamínicos Nucleótidos de piridina: NAD(H) y NADP(H) Nicacina, vit B3, vit. PP, nicotinamida Pelagra Nucleotidos de flavina: FAD(H) y FMN(H)2 Riboflavina, Vit. B2 Ascorbato Vit. C Escorbuto No vitamínicos Ubiquinona (Coenzima Q) Tetrahidrobiopterina Lipoamida (Lípido) Transporte de grupo Vitamínicos Coencima A (CoA) Pantotenato, Vit. B5 Acilo Biocitina Biotina, vit. H Carboxilo Pirofosfato de tiamina Tiamina, vit. B1 Aldehido activado Beri-beri Fosfato de piridixal Piridoxamina, vit. B6 Amino Desoxiadenosilcobalami na Metilcobalamina Hidroxicobala mina, vit. B12 Metilo y otros Anemia perniciosa Tetrahidrofolato Folato, vit. Bc, B10, Vit. M, folacina Grupos monocarb onados Anemia megaloblástica No vitamínicos Lipoamida (Lipoato) Acilo S-adenosilmetionina Metilo En toda coenzima hay que conocer su nombre, su estructura (nociones básicas) y, si procede, su cosustrato (grupo prostético), tipo de vitamina y reacciones en las que participa. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -46- 1. NUCLEÓTIDOS DE ADENINA Y NICONINAMIDA. NAD+(H) y NADP+(H). En primer lugar, los nucleótidos están formados por una base nitrogenada, un azúcar (la ribosa) y un grupo fosfato, pero, en el caso del NAD, se trata de un dinucleótido de adenina y de nicotínamida y, además, en el caso del NADP, el hidroxilo de la posición 2 de la adenina está fosfolirado. Ambos son cosustratos ya que se unen temporalmente a las enzimas y son la vitamina B3 (niacina) cuya deficiencia produce la pelagra (una especie de dermatitis). También, participan en reacciones de óxido-reducción por lo que, tanto NAD+ como NADP+, están en su forma oxidada y sirven para el transporte de electrones siendo, cada molécula, transportadora de un electrón. 2. NUCLEÓTIDOS DE FLAVINA Y ADENINA. FMN(H2) Y FAD(H2). Mientras que la FMN tiene como base nitrogenada un anillo nitrogenado y como azúcar el D-Ribitol, el FAD es un dinucleótido de flavina y de adenina. Se tratan de grupos prostéticos ya que están unidos fuertemente unidos a la enzima por lo que se conocen como flavoproteínas y también es una vitamina, la B2, riboflavina. Interviene en reacciones de óxido-reducción ya que los electrones se transportan en los Nitrógenos del anillo pudiendo estar oxidados o reducidos. En este caso, se pueden transportar hasta dos electrones siendo una semiquinona si transporta un sólo electrón y una hidroquinona si transporta dos electrones. 3. ÁCIDO ASCÓRBICO. Va a participar en reacciones de óxido-reducción pero también van a participar en reacciones de hidroxilación como en la síntesis del colágeno en la que la prolina y la serina se hidroxilan. Actúa como cosustrato y se trata de la vitamina C produciendo el escorbuto si se carece de ella. 4. COENCIMA A. Formada por restos de ADP, ácido pantoterico y mercaptometilamina, es un cosustrato y es la vitamina B5, pantotenato. Interviene en la reacciones de acetilación participando en reacciones de transferencia de grupos acilo en forma de acetil CoA (R- CH2 – S – CO- CH3) transportándolos unidos al sulfidrilo (acetilo activo). 5. ÁCIDO LIPOICO. Es un grupo prostético que se une covalentemente a las enzimas. Es un ácido orgánico de ocho carbonos con un grupo hidroxilo y sulfidrilo en los enlaces 6 y 8. No es una vitamina e interviene en reacciones de óxido-reducción y en transferencia de grupos acilo con los grupos sulfidrilo. 6. PIROFOSFATO DE TIAMINA. Formado por un anillo de pirimidina y anillo de tiafolio con un fosfato. Grupo prostético siento la vitamina B1 cuya deficiencia provoca el beri-beri. Esta coenzima va a participar en la descarboxilación oxidativa y no oxidativa de -cetoácidos y en la transferencia de aldehído activo. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -47- Como ejemplo de la primera reacción tendriamos la descarboxilación oxidativa del piruvato ( ). En esta reacción tan simple intervienen 3 enzimas y 5 coenzimas diferentes en las que el grupo acetilo se transfiere de un enzima a otro. 7. BIOTINA. A. condensado con un anillo de tiofena. Es un grupo prostético y es la vitamina H que es sintetizada también por la flora intestinal por lo que no provoca enfermedades. No obstante, en el huevo crudo, la avidina se une a la biotina provocando de la vitamina H no pueda ser absorbida. Participa en reacciones de carboxilación. 8. FOSFATO DE PIRIDOXAL. Se trata de un grupo prostético fuertemente unido a la enzima por un enlace NO covalente. El fosfato de piridoxal es la vitamina B6 con tres formas posibles (piridoxina, piridoxal y piridoxamina). La forma activa del coenzima es en forma de fosfato. Interviene en muchas reacciones del organismo como en la transferencia de grupos amino de un aminoácido a un cetoácido (transaminasas). 9. S-ADENOSIL METIONINA (SAM). Metionina unida a un resto de adenosin a través del azufre del aminoácido. Es un cosustrato que es un donador de grupos metilos, es decir, que interviene en reacciones de metilación. 10. COENZIMAS DE COBALAMINA. Pueden tener una estructura simple, en la que presentan un anillo de corrina parecido a un anillo hemo, o compleja, en la que un átomo de Cobalto está coordinado con 5 Nitrógenos y que en la sexta posición tiene diferentes sustituyentes los cuales darán lugar a los diferentes tipos de coenzimas de cobalamina. Es la vitamina B12, la cual no es sintetizada por vegetales, e interviene en dos reacciones, como dador de grupos Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -50- - Si es el grupo C6 el que se oxida se producen los ácidos urónicos. Por ejemplo, si se oxidase el C6 de la galactosa se produciría ácido galacturónico. Derivados por reduccción: - Si se reduce el carbonilo obtenemos polialcoholes llamados alditoles. - A los desoxiazúcares les falta un grupo hidroxilo. El que más importancia tiene de los desoxiazúcares es el 2-desoxirribosa del DNA. Aminoazúcares y derivados. Glucosidos. Los aminoazúcares son azúcares en los cuales un grupo hidroxilo está sustituido por un grupo amino generalmente acetilado. Los glucósidos, por su parte, son azúcares unidos a otras moléculas. OLIGOSACÁRIDOS. Se trata de dos o más monosacáridos unidos por un enlace covalente (enlace glucosídico) siendo los más importante los disacáridos. Existen dos tipos de enlaces glucosídicos: - Enlace O-glucosídico en el que reacciona el carbono anomérico del anillo de piranosa o de furanosa con el grupo grupo alcohólico de otro azúcar dando lugar a los isómeros y . - Enlace N-glucosídico en el que el carbono anomérico de los anillos de furanosa o piranosa reacciona con un grupo amino como, por ejemplo, cuando reacciona una ribosa con una base nitrogenada. Un ejemplo de enlace O-glucosídico sería la lactosa que se forma a partir de la galactosa y de la glucosa que, a su vez, se unen mediante el enlace glucosídico entre el carbono anomérico de la glucosa y el C4 de la glucosa. En cualquiera de los dos enlaces siempre estará implicado un carbono anomércio (el C1). De este modo, cuando se habla de disacáridos se incluye: 1º Los azúcares que los componen. 2º El tipo de anillos que los forman (furano/pirano). 3º Los isómeros: si son o . 4º Carbonos implicados en la formación del enlace glucosídico. Así, la lactosa se nombraría como -D-galactopiranosa-(1 )--D-glucopiranosa. Como norma general podemos establecer que si, al menos un carbono anomérico está libre el azúcar será reductor. De esta manera, la sacarosa es el único disacárido no reductor ya que el carbono anomérico de la fructosa (C2) está formando el enlace glucosídico. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -51- POLISACÁRIDOS O GLUCANOS. Cadenas largas de monosacáridos unidos por enlace glucosidico que pueden ser: - Homopolisacáridos: Formados por un único tipo de azúcar. - Heteropolisacáridos: Formados por dos o más tipos de azúcares. A diferencia de otros polímeros, los polisacáridos, pueden ser polímeros lineales o ramificados. Por otra parte, estos tienen diferentes papeles en la naturaleza: 1.- Reserva energética: En los animales esta función la cumple el colágeno. El colágeno es un homopolisacárido de glucosa unidas por enlaces  1,4 y, además, es un ploímero ramificado de entre 8-12 polímeros. Aparece una ramificación cuando dos cadenas de glucosa se unen por enlaces  1,6. En las plantas esta función la desempeña el almidón, formado por la -amilosa y amilopeptina. En este caso, la -amilosa trata de un polímero homopolisacárido lineal y soluble en agua con enlaces  1,4. La amilopeptina, por su lado, es un polímero igual que el glucógeno pero que está menos ramificado que este y está presente en las plantas. Las ramificaciones las presenta cada 24-30 residuos mediante enlaces  1,6. Todos estos polímeros tienen extremo reductor. 2.- Estructural: La celulosa realiza esta función en los vegetales ya que se trata de un polímero lineal de glucosa que, a diferencia de los polímeros de reserva, poseen enlaces  1,4, además de que las cadenas que forman están interconectadas por muchísimos puentes de Hidrógeno. Este polímero es insoluble en agua y tiene una estructura rígida y fuerte. La quitina es el polímero que aparece en los animales. También es un homopolisacárido lineal de N-acetilglucosamina (derivado de la glucosa) unidos por enlaces  1,4 el cual forma exoesqueletos rígidos e insolubles. GLICOPROTEÍNAS. Hay muchas proteínas que tienen azúcares unidos covalentemente. Estos azúcares se van a unir, covalentemente, al aminoácido de la cadena lateral de una proteína mediante un enlace N-glucosídico (si se une al grupo amino) u O-glucosídico (si se une al grupo alcohol). Como papeles fundamentales destacan los procesos de reconocimiento celular como en el caso del óvulo y el esperma y de diferenciación celular. GLUCOSAMINOGLUCANOS (mucopolisacáridos). Polímeros de unidades repetidas de un disacárido que contiene un aminoazúcar. Al menos uno de los azúcares tiene un grupo carboxilo o sulfato cargado negativamente. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -52- Ejemplos:Ácido hialurónico, heparina (3 grupos sulfato, 1 amino y un carboxílico) que es un anticoagulante. PROTEOGLICANOS. Glucoproteínas con un alto contenido en polisacáridos (hay más azúcares que proteínas). Como núcleo tienen moléculas de ácido hialurónico unida de manera covalente a las proteínas de enlace y de manera no covalente a las proteínas centrales. Los proteoglicanos están altamente hidratados. Así, los cartílagos están formados por fibras unidas por proteoglicanos por lo que es cartílago estará hidratado. BIOQUÍMICA I Los lípidos no son polímeros. Como papeles fundamentales en la vida destacan el de reserva de energía, el de aislamiento térmico, el de protección y también tienen un papel estructural muy importante en la membrana plasmática. Los lípidos los dividiremos en derivados del isopreno y en derivados de los ácidos grasos. TEMA 9: ESTRUCTURA DE LÍPIDOS. ÁCIDOS GRASOS. Los ácidos grasos se componen por un ácido carboxílico con una cadena carbonatada con un número par de carbonos. Los ácidos grasos pueden ser saturados o insaturados (con dobles enlaces siempre con configuración “cis”). De este modo, conforme aumenta el número de átomos de carbono aumenta el punto de fusión del ácido graso mientras que, conforme aumenta el número de dobles enlaces, baja el punto de fusión, lo que se puede apreciar entre el ácido esteárico (saturado 18:0) y el oleico (18:1n-9) con 69,1 y 13,2 ºC. DERIVADOS: - ELICOSINOIDES. Derivados oxigenados de ácidos grasos poliinsaturados con 20 carbonos, como el araquinódico. Biológicamente los más importantes son las prostaglandinas que producen la constricción de los vasos sanguíneos, los tromboxanos que forman los trombos y los leukotrieno que es un mediador en la contracción muscular. - TRIACILGLICEROLES (triglicéridos). Se tratan de ésteres de glicerol y ácidos grasos iguales o diferentes. Los triacilgliceroles son uno de los componentes del aceite y son lípidos de reserva. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -55- NUCLEÓTIDOS MODIFICADOS. - Metilcitidina: grupo metilo añadido a una Citina. - Metiladenosina: grupo metilo añadido a una Adenosina. Estos nucleótidos modificados regulan la expresión génica por la metilación de estos grupos. DERIVADOS DE NUCLEÓTIDOS. Los derivados cíclicos se producen cuando el grupo fosfato esterifica al grupo hidroxilo del C3 y C5 de un anillo de furanosa: - AMPc (Adenina). - GMPc (Guanina). El UDP-glucosa es un nucleótido difosfato de uridina en el que un fosfato esterifica al un monosacárido. ESTRUCTURA PRIMARIA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. La estructura primaria de los ácidos nucleicos es la secuencia de nucleótidos undios mediante enlaces fosfodiester fromando los di, tri, tetra, oligo y polinuclótidos (RNA) o polidesoxinucleótidos (DNA). De este modo, los ácidos nucleicos son polímeros linealas que forman cadenas de polinucleótidos con dirección 5’ 3’. Siempre que se escribe la secuencia en esta dirección es porque se sintetizan así. Las cadenas de azúcar-fosfato alternantes son muy polares en ambos tipos de ácido nucleico. El extremo 5’ de la macromlécula carece de nucleótido en la posición 5’ y el extremo 3’ carece de nucleótido en la posición 3’. Extremo 5’ Extremo 3’ 5’ 3’ Disoxinucleótidos pApCpGpTpT ACGTT Así, tenemos que, entre la características de los polinucleótidos, el extremo 5’ siempre tiene un grupo fosfato libre y que el extremo 3’ siempre tiene un grupo hidroxilo libre. También se puede formar el esqueleto azúcar-fosfato sin tener en cuenta las bases nitrogenadas. La carencia o la presencia de un grupo hidroxilo hace que la molécula de RNA pueda sufrir una hidrólisis básica siendo el DNA resistente a esta hidrólisis por lo que este último será mucho más estable. ESTRUCTURA SECUNDARIA: LA DOBLE HÉLICE. Antes de Watson y Crick se sabía del DNA en cuanto a composición. Por ello, Chargaff, posteriormente, formuló sus leyes en las que la cantidad de Adenina era la misma que la de Timina, en la que la cantidad de Guanina era la misma que la cantidad de Citosina y en la que, por lo tanto, la cantidad de bases púricas son las mismas que las de bases pirimidínicas en todos los órganos y tejidos de un organismo, es decir, que tiene la misma composición de bases y que esta composición no varía nunca. [A] = [T] [C] = [G] [A] + [G]= [T] + [C] Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -56- Características de la doble hélice. Esta forma del DNA es la descrita por Watson y Crick: - Dos hélices dextrógiras de modo que la dos hebras son antiparalelas. La doble hélice consiste en dos cadenas de polinucleótidos que se enrollan alrededor de un mismo eje. Debido a este enrollamiento, se trata de dos hélices dextrógiras de modo que las dos cadenas son antipalares (una tiene dirección 5’ 3’ y la otra 3’ 5’). - Las bases se apilan en el centro de la hélice y el plano de estas bases es casi perpendicular al eje de la hélice. El esqueleto azúcar- fosfato se localiza en el exterior de la hélice evitando posibles repulsiones de cargas iónicas mientras que las bases se encuentran en el centro de la hélice siendo, el plano de las bases, prácticamente perpendicular al eje de la hélice. - 10,5 bp/vuelta con un diámetro de 2nm. Para hablar de tamaño, se utiliza el número de BN por vuelta por lo que la doble hélice, como tamaño, tienen 10,5 pares de bases por vuelta y un diámetro de 2 nm. - Paso de rosca 3,6 nm. - Apareamiento complementario de las bases con las que se utilizan formas ceto y amino. A=T con dos puentes de Hidrógeno; G≡C con tres puentes de Hidrógeno aunque las parejas tienen el mismo tamaño por que la estructura de doble hélice es una estructura regular. De esta forma, no hay espacios en el interior de la doble hélice del DNA y , por los puente de Hidrógenos, las interacciones hidrofóbicas y el apilamiento la doble hélice se vuelve en una estructura muy estable. Todo esto tiene su importancia en el mecacnismo de replicación de la molécula del DNA, es decir, de la replicación del material genético ya que las BN son complementarias y se pueden aparear. 11/11/13 DESNATURALIZACIÓN DEL DNA. El DNA es un molécula muy estable con un elevado número de puentes de Hidrógeno entre BN y que presenta diversas interacciones hidrofóbicas pero, si se calienta una disolución de DNA, llega un momento que las dos hebras que forman la doble hélice se separan pasando a formar el DNA monocatenario. Esto, se produce en un rango pequeño de temperatura y, en el momento en el que una parte de la estructura se rompe, el resto se colapsa ya que es un proceso cooperativo reversible por lo que, si se calienta lentamente, las bases se van a volver a aparear. Este proceso se sigue fácilmente porque cuando el DNA se desnaturaliza volviéndose monocatenario pasa a tener una absorbancia mayor a 260 nm (A260nm) dándose un efecto Hipercrómico. El punto medio de la curva es la curva de fusión del DNA, es decir, es la temperatura a la que se desnaturaliza. En la gráfica se observa que, cuando aumenta la temperatura, no pasa nada pero cuando llega a un límite se desnaturaliza la proteína en un espacio corto de temperatura. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -57- La temperatura de fusión depende de la fuerza iónica del medio así como de su pH pero, sobre todo, depende del tamaño y la composición en bases del DNA. Si medimos diferentes DNA aumentará su punto de fusión cuando aumente su proporción de bases complementarias C-G porque estas están apareadas por tres puentes de Hidrógeno por lo que hace falta más energía para separarlas. - (OTRAS) ESTRUCTURAS SECUNDARIAS DEL ADN. ESTRUCTURA B. La forma del DNA de Watson y Crick es la estructura mayoritaria en las células. Se podría decir que es una hélice ideal porque se estudiado que la estructura depende de la secuencia por lo que la estrctura se desvía en presencia de humedad, en presencia de iones alcalinos, etc. De este modo, se han estudiado otras posiblesestructuras de ADN: FORMA A. Aparece en condiciones de baja humedad en la que la humedad desciende un 75 %. Esta estructura sigue siendo una doble hélice dextrógira pero tiene más pares de Bases Nitrogenadas por vuelta por lo que esta doble hélice será más ancha. Esta forma se produce se genera un híbrido de DNA-RNA. Por su parte, eh híbrido de ADN-ARN, se forma al desnaturalizar un doble hélice B de DNA y añadiéndole una molécula de RNA complementaria de algunas de las dos hebras que se han dado lugar con la desnaturalización formándose una doble hélice híbrida con configuración A. Esto se debe a que el RNA tiene como azúcar a la ribosa que tiene un grupo hidróxilo en el Carcono 2’ para lo que adopta la forma A para evitar interferencias estéricas. k 1. B-DNA C G + G A 2. 5’ Región 1 Región 2 3’ ARN Estructura A La forma A también está presente, por el mismo motivo, cuando el ARN forma una doble hélice. Ambas regiones del ARN poseen secuencias complementarias que se van a aparear al ser la doble hélice más estable. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -60- Relación entre el cambio de energía libre y la constante de equilibrio de la reacción. Esta ecuación tiene dos términos, uno que depende del proceso en cuestión, y otro variable de la temperatura y la Keq a la que se llevan a cabo el proceso de la reacción. El primer término, la energía libre estándar , se debe porque el proceso se lleva a cabo en unas condiciones determinadas: T = 298 K, P = 1 atm, [R] = 1M y pH = 0,0. En un sistema bioquímico no se van a cumplir pero si que va a estar en condiciones estándar bioquímicas: [H+] = 10-7 M o pH = 7,0, [H2O] = 55,5M  constante. A su vez, en el equilibrio , ergo: por lo que: La reacción está en equilibrio. La reacción es exergónica. La reacción es endoergónica. Cambio de energía en condiciones reales. Por definición, todo proceso bioquímico tiene que ser exergónico. Aun así, en la célula, si se calculan ciertos procesos, estos, van a ser endergónicos y se van a seguir llevando a cabo porque, verdaderamente, se utiliza el segundo término que es más negativo ya que, aunque el primer término sea positivo , el otro es más negativo (que es el que estudia las condiciones reales). En la energía libre estándar, se comparan dos reacciones en las mismas condiciones. Hay veces que, con estas condiciones, se llevan a cabo procesos endergónicos que no se pueden explicar por el segundo término. De esta manera, los seres vivos son capaces de acoplar reacciones endergónicas y exergónicas porque los cambios son aditivos. Las reacciones exergónicas que se acoplan presentan cambios muy negativos de energía libre soliendo ser reacciones de hidrólisis de compuestos derivados del fosfato de alta energía. Reacciones acompladas. , , ------------------------------------- , Como hemos dicho, a un proceso endergónico se le puede acoplar un proceso exergónico. En primer lugar, hay unos organismos (los vegetales) que son capaces de producir macromoléculas a partir de CO2 y H2O. Macromoléculas O2 Para llevarlo a cabo utilizan la luz del Sol. Endergónico *Nosotros igual Energía química CO2 y H2O Trabajo químico de síntesis. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -61- *Nosotros tenemos que mantenernos organizados por lo que vamos a utilizar esta energía química para sintetizar ATP. ADP + Pi ATP Acoplamos la hidrólisis de una molécula como es el caso de un compuesto de alta energía ( ) como el ATP con un camcio de muy negativo a reacciones o procesos endergónicos. Los enlaces de ATP fósforo-fósforo no son enlaces de alta energía. Son sólo enlaces de fosfato que no tienen nada en particular. 13/11/13 Las reacciones exorgónicas acopladas que ocurren con cambios muy negativos de energía libre y que suelen ser reacciones de hidrolisis de compuestos derivados de los fosfatos de alta energía suelen ser: Por lo que la reacción estará completamente a la derecha. Antiguamente, como dijimos, se consideraba que, en la reacción, se rompían enlaces de alta energía, lo cual, está mal designado porque los enlaces no tienen nada de particular pero lo que si tiene algo de particular son los reacctivos y los productos de la reacción. Las propiedades que hacen que estas reacciones sean tan exergónicas son las siguientes: 1.- Lo que se obvia en la reacción es que el ATP tiene cuatro cargas negativas con mucha repulsión electroestática. Cuando se lleva a cabo la reacción, parte de la repulsión desaparece favoreciéndose la hidrólisis. 2.- Un producto de la reacción, el fosfato, está estabilizado por resonancia siendo un híbrido de resonancia, el cual, contribuye a la estabilización del fosfato. El híbrido de resonancia no es una representación real del grupo fosfato ya que el doble enlace y el protón están deslocalizados favoreciendo la reacción de hidrólisis. 3.- Las reacciones de hidrólisis se llevan a cabo a pH neutro (pH=7) donde la concentración de protones es muy baja por lo que se disminuye la reacción de ionización de los productos de la reacción favoreciéndose la reacción de hidrólisis, es decir, el ATP cede un protón al medio desplazando la reacción a la ionización. 4.- La hidratación de productos y reactantes por sus esferas de solvatación siendo mayor la de los productos que la de los reactantes haciendo que la reacción sea exergónica. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -62- En estos potenciales de transferencia del grupo fostato se encuentra la importancia de que el ATP se encuentre en la mitad de la tabla. Esto hecho significa que el ATP no es tán exoergónico ya que los compuestos que están por encima fosfoliran a los que están por debajo traduciéndose en que si se necesitan, por ejemplo, 13’8 kJ/mol para fosfolirar la glucosa-6-fosfato no se van a utilizar los 62 del piruvato. El ATP no es un reservorio de energía ya que los auténticos reservorios son los lípidos y polisacáridos que se degradan para sintetizar ATP siendo, este último, una moneda energética. El cambio de energía libre puede ser diferente en condiciones estándar (25ºC, pH=7, etc.) que en condiciones reales (30ºC, pH variable, etc.) cambiando la hidrolización del ATP. Por otra parte, el ATP en sí no es el sustrato reaccionante sino que es un complejo ATP-Mg. Al mismo tiempo, el Magnesio, va a apantallar cargas y va a someter los enlaces del ATP a estrés siendo más fácil y más rápido el romperlos. A su vez, el cambio de energía libre real puede variar de -50 a -60 kJ/mol, es decir, a valores más altos que en condiciones estándar, existiendo una carga energética de la célula (Adenylate energy change), de tal forma, que el ATP pueda variar para llevar a cabo todas las reacciones del organismo. Reacciones acopladas. A. Síntesis G-6-P Semireacción orgánica 1 Pi + glucosa Glucosa-6-P + H2O +13,8 Semireacción orgánica 2 ATP + H2O ADP + Pi -30,5 Reacción global completa ATP + glucosa ADP + Glucosa-6-P -16,7 La primera semireacción es endorgónica y se trata de la transferencia de un grupo fosfato teniendo como resultado una reacción exergónica. B. Última reacción de la glucólisis Semireacción orgánica 1 Fosfoenolpiruvato + H2O Piruvato + Pi -61,9 Semireacción orgánica 2 ADP + Pi ATP + H2O +30,5 Reacción global completa Fosfoenolpiruvato + ADP Piruvato + ATP -31,4 Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -65- TERMODINÁMICA DEL EQUILIBRIO o TERMODINÁMICA CLÁSICA TERMODINÁMICA DEL ESTADO ESTACIONARIO Estado inicial Estado inicial En el equilibrio Estado estacionario Incorporación Eliminación Se refiere a procesos reversibles en sistemas cerrados. En estos sistemas tenemos como procesos unos procesos que hacen que todo sistema cerrado pueda llegar al equilibrio. 15/11/13 Los sistemas abiertos pueden alejarse del equilibrio, si pueden, obteniendo energía del entorno. Como se trata de un sistema abierto, va a haber una incorporación de sustratos (nutrientes del entorno) y una eliminación de productos de desecho, por lo que, el flujo y la concentración del estado intermedio serán constantes produciéndose un estado estacionario termodinámicamente más favorecido. Por último, una ser vivo utiliza el cambio de energía libre para mantener su organización. De hecho, si un organismo vivo alcanza el equilibrio se muere por lo que varía el flujo hasta que vuelve al estado estacionario. En conclusión, los seres vivos toman productos del ambiente altos en entalpía y bajos en entropía para producir desecho bajos en entalpía y altos en entropía mediante su degradación. Este proceso de degradación va a ser exergónico y se emplea para sintetizar las macromoléculas propias de cada organismo y para mantener un estado de baja entropía para lo que se desordena el ambiente Lo que llamamos metabolismo es básicamente ese proceso en el que obtenemos energía libre del entorno para utilizarla y mantener el estado de baja entropía. El proceso en sí lo hacemos a través de unas vías metabólicas que se definen como reacciones consec. Enzimáticas que van a producir un producto determinado mediante metabolitos. GRUPOS: 1. Vías metabólicas catabólicas. Se tratan de vías de degradación en las que vamos a degradar los nutrientes (macromoléculas ordenadas) para producir productos de desecho. Es un proceso exergónico en el que la energía asociada se va a invertir en formar energía química en forma de ATP y en forma de transportadores electrónicos reducidos como el NADH. 2. Vías metabólicas anabólicas. Se tratan de vías de biosíntesis endergónicas en las que, a partir de moléculas pequeñas (precursoras), se van a sintetizar moléculas celulares utilizándose la energía de los procesos catabólicos. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -66- Para poder definir las características de las vías metabólicas tenemos que tener en cuenta que las vías catabólicas son aquellas en las que se degradan unos nutrientes. Así, a partir de diferentes nutrientes vamos a sintetizar un número pequeño de moléculas (piruvato, acetil- Coenzima A y algunos intermediarios que intervienen en el ciclo del ácido cítrico) por lo que las vías catabólicas son unas vías convergentes. Por otro lado, las vías anabólicas son divergentes porque a partir de un número pequeño de moléculas de metabolitos intermedios se van a sintetizar un mayor número de moléculas. 1º característica: Las vías metabólicas son irreversibles, es decir, se producen en una única dirección, están en estado estacionario, es decir, el flujo a través de la vía y la concentración de los productos intermedios son constantes y, además, son exergónicas. Que se produzcan en una única dirección S  P no significa que las vías anabólicas y catabólicas sean iguales ya que pueden compartir algunas reacciones pero, otras tantas, serán diferentes, por lo que las vías anabólicas y catabólicas son diferentes. 2º característica: Algunas reacciones están cerca del equlibrio por lo que algunas vías son reversibles. Aun así, el total es irreversible porque en la vía hay una reacción que es irreversible, de tal modo, que marca la dirección de la vía. Todas las vías metabólicas tienen una reacción decisiva de modo que la mayor parte de las reacciones de ellas son reversibles (se encargan de la transmisión del flujo mediante enzimas generadoras del flujo) y alguna de las primeras reacciones es irreversible (se encarga de la generación del flujo mediante enzimas generadoras del flujo). Flujo metabólico: J = Vd - Vi; Reacción reversible: Vi = Vd; J = 0 A (reacción exergónica) Reacción irreversible: Vi = 0; J = Vd B C D E En el esquema, como en las vías con la concentración, si se varía la altura de un tanque el flujo aumenta o disminuye, lo que vendrían a ser las reacciones reversibles que transmiten el flujo. Por otra parte, la reacción irreversible hace que el flujo vaya a la derecha convirtiéndose en el paso limitante. 3º característica: Todas las vías metabólicas están reguladas. Tipos de regulación: Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -67- - Control alostérico (retroinhibición). La primera enzima es alostérica y el propio producto final va a inhibir su propia síntesis. Si la reacción fuese ramificada, se conseguiría que los productos finales que se sintetizan, se sinteticen a la misma velocidad como, por ejemplo, ocurre en la síntesis del ADN. Inhibe las dos rutas - Modificación covalente de las enzimas. Las enzimas aumentan o disminuyen su actividad mediante modificaciones covalentes de los aminoácidos de sus cadenas laterales. - Ciclos de sustrato. Por ejemplo, en una vía metabólica cualquiera: La primera enzima que cataliza la reacción es diferente a la segunda. Por ello, ambas enzimas se regulan de manera diferente. Cualquier factor que aumente la actividad de la primera enzima disminuirá la actividad de la segunda y viceversa. - Control genético. En este caso, no se regula la actividad de la enzima si no que se regula la cantidad de la enzima. Podemos decir que los tres primeros sistemas son tres sistemas de regulación a corto plazo mientras que también podemos decir que el último sistema es un sistema de regulación a largo plazo ya que se tiene que manifestar un determinado gen (transcribirse, traducirse, formarse la proteína, etc.). 4º característica: En las células eucariotas las vías metabólicas poseen una localización celular, muchas de ellas en compartimentos, específica. Por ejemplo, los ácidos grasos en el anabolismo se sintetizan en el citosol mientras que, en el catabolismo, se degradan en las mitocondrias. Esto añade un nuevo nivel de regulación ya que ácidos grasos en sí y sus componentes se tienen que transportar y, ese transporte, también estará regulado. VISIÓN GENERAL DEL METABOLISMO. En las células, se llevan a cabo cientos de reacciones diferentes al mismo tiempo en el metabolismo por lo que se tendrán que llevar a cabo mediante vías ordenadas. Por ejemplo, en el NIVEL 1 se encuentran los polímeros y, en el primer paso, se degradan a los monómeros del NIVEL 2, que, a su vez se degradan en un tercer paso al NIVEL 3 a unos pocos intermediarios metabólicos. Por último, mediante el paso final, son completamente oxidados (degradados) y, mediante este metabolismo oxidativo, se obtiene la mayor parte de energía. Las vías metabólicas se representan mediante flechas, que se pueden comparar con un mapa de carretera, de modo que, las vías de ida y las vías de vuelta (anabolismo y catabolismo) son diferentes. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -70- El sistema de esta transducción funciona de la siguiente manera: La hormona se une al receptor provocando un cambio conformacional en el dominio citosólico. Esto hace que el receptor se active y se una a una proteína G activándola también. Esta proteína G lo que hace es unirse a una enzima efectora activándola. Esta enzima, a su vez, sintetiza un segundo mensajero. Hormona Receptor serpentina* Proteína G* Enz efectora* síntesis del 2º mensajero A.1. Vía de la adenil ciclasa – proteín kinasa A. En este caso, la enzima efectora será la adenil ciclasa. En un primer momento, el sistema señal (receptor, proteína G y enzima efectora) está inactivo porque no hay ninguna hormona unida al receptor. Posteriormente, al activarse la proteína G mediante los procesos descritos anteriormente, se intercambia el GDP por GTP lo que provoca que la subunidad  se separe de la y de la  aunque después sigan unidas a la membrana plasmática por los lípidos. Una vez activada la proteína G, activa a la adenil ciclasa uniéndose a ella por lo que esta enzima efectora sintetiza segundos mensajeros, es decir, a partir de, por ejemplo, ATP sintetiza AMPc. La subunidad  también es una enzima ya que hidroliza GTP y se activa cuando intercambia GDP por GTP. Esto ocurre en muy poco tiempo porque se hidroliza ya que estos circuitos funcionan en un tiempo muy corto. Ciclo activación/ inactivación de la proteína G. El ciclo de la activación y la inactivación de la proteína G está asistido por un factor de intercambio de nucleótido de guanina (activación de la proteína G intercambiándose GDP por GTP separarándose la subunidad ) y un factor activador de la GAP, es decir, una proteína activadora de la GTPasa (inactivación pasando el GTP a GDP uniéndose las subunidades). Si este circuito de activación e inactivación funciona continuamente como, por ejemplo, cuando un organismo está infectado por el cólera, se producirá la deshidratación de este porque la toxina colérica inhibe la acción de la GTPasa por lo que se producirán segundos mensajeros continuamente vertiéndose agua al intestino. Receptor serpentina Enzima efectora Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -71- Adenil ciclasa, síntesis y degradación del c-AMP y activación de la proteín kinasa A por el c-AMP. La adenil ciclasa es una proteína que actúa como una enzima efectora que está anclada a la membrana plasmática formada por un dominio transmembrana y un dominio catalítico. Por otro lado, la vida del segundo mensajero que sintetiza la adenil ciclasa es muy corta porque hay una fofsfodiesterasa (dominio catalítico) que transforma el c-AMP a AMP por lo que se vuelve a parar dejando de actuar como segundo mensajero. El segundo mensajero activa una proteín kinasa, en este caso, la proteín kinasa A porque es activada por el c-AMP. La proteín kinasa A, a su vez, en ausencia de c-AMP, está inactivada ya que tiene cuatro subunidades (2 catalíticas y 2 reguladoras). Esto hace que la parte de la cadena polipeptídica esté dentro del centro activo de la proteín kinasa estando ocupado y estando, la proteín kinasa A, inactiva. La unión de dos moléculas de c-AMP a las subunidades reguladoras provocan un cambio conformacional que separa a las unidades catalíticas quedando el centro activo libre y convirtiéndose, las proteína kinasas, en activas. Las proteín kinasas, al mismo tiempo, fosforilan a otras proteínas diana, responsables de la respuesta fisiológica, cambiando su actividad activándolas o desactivándolas. Las proteínas diana también se revierten teniendo un tiempo de vida muy corto por las proteín fosfatasas. La actividad de las proteínas diana están condicionadas por la fosfoliración. Por otra parte, también puede ocurrir la inhibición de la enzima efectora ya que la proteína G estimulante es diferente a la proteína G inhibitoria ya que difirieren en sus unidades . (Gs Gi). Por lo demás, ocurre un proceso similar a la activación de la enzima efectora uniéndose una hormona a un receptor específico, activándose una proteína G que inhibe a las adenil ciclasas disminuyendo el nivel de segundos mensajeros, es decir, disminuyendo los niveles de c- AMP. ALGUNAS HORMANAS QUE UTILIZAN c-AMP COMO 2ºMENSAJERO (Adrenalina, glucagón, serotonina y dopamina). Cada una de las hormonas tienen su receptor específico aunque el resultado va a ser el mismo para todas, es decir, van a aumentar los niveles de c-AMP. La diferencia va a radicar en que cada una de las hormonas van a inducir diferentes estímulos. Dependiendo del tejido la respuesta va a ser diferente. RESPUESTA ESPECÍFICA DE CADA TEJIDO. Tejido adiposo Activa la hidrolisis de triacilglicéridos. Activa la oxidación de ácidos grasos. Hígado. Activa la degradación de glucógeno a glucosa. Unhibe la síntesis de glucógeno. Inhibe la glucólisis. Activa la gluconeogénesis. Músculo. Activa la degradación de glucógeno a glucosa. Activa la glucólisis. Intestino Activa la secreción de fluido. centro activo libre cadena polipeptídica Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -72- A.2. Vía de la fosfolipasa C – fosfatidilinositol 4,5-bifosfato. Se trata de una vía de señalización medida por proteína receptoras a proteínas G. Varía con respecto a la anterior en la enzima efectora, en este caso una fosfolipasa, y en los segundos mensajeros. Los primero pasos son iguales a la vía de la adenil ciclasa, es decir, la subunidad  se activa y se une a un enzima efector que sintetiza dos segundos mensajeros, ya que la enzima efectora hidroliza el enlace ester del PIP2 dando lugar a dos segundos mensajeros. Por su parte, el PIP2 está unido a la membrana plasmática por dos restos de ácidos grasos. El InsP3 producido se une a una proteína canal del retículo endoplasmático para que se abra y aumente la concentración de Ca2+ en el citosol (por ello se dice que el Ca2+ es un tercer mensajero). Entre los efectos del Calcio se encuentran que se une a una protéina, la calmodulina que va a activar una proteín kinasa C dependiente de calmodulina fosfolirando a la proteína diana, cambiando su actividad y produciendo una respuesta celular, y que se une con otro segundo mensajero, producido a partir del PIP3, el diacilglicerol activándose la proteín kinasa C dependiente de Ca 2+. La proteín kinasa C fosfolira la proteína diana. Así, cada proteín kinasa tiene diferentes proteínas dianas activando una respuesta celular u otra. 22/11/13 A.3. Canales iónicos. La llegada de la hormona va a provocar la apertura de un canal iónico. Canales muscarínicos de la membrana plasmática del músculo cardiaco. El receptor une la hormona señalizadora (acetilcolina) por lo que se activa la proteína G de la misma manera que con las otras vías pero, ahora, lo que ocurre es que la subunidad que producen la activación son las subunidades  y  que se unen a la proteína del canal iónico produciendo su apertura. Los canales muscarínicos transportan el K+ al exterior de la membrana por lo que la membrana se hiperpolariza disminuyendo la contracción de la célula muscular. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -75- por la kinasa que fosforila el PIP3, un fosfolípido de la membrana descrito anteriormente, el cual, activa otras proteín kinasas produciéndose la respues celular. 4. Hormonas que actúan a través de receptores intracelulares. Hasta ahora hemos estudiado receptores localizados en la membrana plasmática. Otras hormonas, tienen que entrar en las células para lo que deben de tener carácter lipídico por lo que circulan por el plasma unidas a proteínas plasmáticas. Estas hormonas, tienen los receptores en el interior de las células, es decir, en el citosol (glucocorticoides, mineralcorticoides, etc.) o en el núcleo (vitamina B3, progesterona, etc.). En ausencia de la hormona, el receptor está inactivo porque el sitio de unión al DNA está bloqueado por una proteína. Por ello, se produce una identificación del sitio de unión con el DNA para lo que hay unas protéinas coordinadas con Zinc (dedos de Zinc) las cuales reconocen una secuencia de DNA intercalándose en la doble hélice. Cuando la hormona se une al receptor se separa la proteína produciéndose un choque térmico y quedándose expuesto el sitio de unión del DNA. El HRE (Elemento de Respuesta a la Hormona) hace que cada receptor reconozca una secuencia específica de DNA y, como consecuencia, se exprese el gen transcribiéndose. Lo mismo ocurre con el receptor en el núcleo tratándose, en ambos casos, de una regulación o respuesta a largo plazo. Hay un caso especial en el que el receptor de la hormona tiroidea en el núcleo y en el DNA bloquean la transcripción del gen asociado por lo que, cuando llega la hormona tiroidea a la célula y se une al receptor, este sufre un cambio de conformación desbloqueándose la transcripción. Esto hace que pase de ser un inhibidor a un activador de la transcripción. Respuesta celular Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -76- BIOQUÍMICA I La glucólisis se trata de la fase anaeróbica del metabolismo de los hidratos de carbono y del primer paso del metabolismo de los azúcares. Va a ocurrir que un azúcar de 6 Carbonos se va a convertir en otro compuesto de seis carbonos (piruvato). La energía almacenada en los azúcares va a ser utilizada para sintetizar ATP por lo que no hay oxidación neta. La importancia de la glucólisis es que es casi universal ya que es la misma prácticamente en todos los seres vivos y porque su regulación se conoce muy bien al tener un papel fundamental en la obtención de energía para los organismos. Aunque las células pueden utilizar muchos combustibles el que más se va a utilizar va a ser la glucosa, sobre todo por algunos tejidos, como, por ejemplo, el cerebro que sólo va a utilizar glucosa porque es la única molécula capaz de atravesar la barrera hematoencefálica. Por último, cabe destacar, que en el hombre, los niveles de glucosa son de 4 mM a 10 mM ya que el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa en sangre es muy importante. TEMA 14: GLUCÓLISIS. 25/11/13 La glucosa puede tener tres orígenes distintitos: - La hidrólisis del glucógeno (un polisacárido de reserva). - Gluconeogénesis. En esta vía se va a sintetizar glucosa a partir de precursores más pequeños. - Azúcares de la dieta, es decir, disacáridos o polisacáridos (como el almidón). Por un lado, la saliva, con la enzima -amilasa, va a producir la degradación de los polisacáridos. Por otro lado, los disacáridos no pueden ser absorbidos por las células intestinales por lo que tendrán que ser degradados a monosacáridos. El principal disacárido es la sacarosa y se degrada por la sacarasa o invertasa a sus monómeros, es decir, la glucosa y la fructosa. Otro dímero de la dieta es la lactosa que es la azúcar de la leche que se degrada, mediante la enzima lactasa o -galactosidasa, a glucosa y galactosa. Finalmente, la maltosa, que proviene de la degradación del glucógeno, mediante la maltasa, se hidroliza en dos moléculas de glucosa. Transportadores de glucosa. Así, el siguiente paso es que los monosacáridos entren en las células. Para ello, utilizan transportadores específicos de glucosa de la familia GLUT. Estos transportadores son proteínas bastante grandes (de 450 a 500 aa) con la característica estructural de que forman una serie de 12 hélices  que, a su vez, constituyen un dominio transmembrana. Se tratan de transportadores pasivos, es decir, siguen el gradiente de concentración y funcionan mediante un poro controlado o poro con puerta en el que los fragmentos de hélice  forman el canal de modo que, cuando no transportan glucosa, tienen la puerta cerrada y, de modo que, si se une glucosa, la puerta de abajo se abre y, la de arriba, se cierra volviéndose a abrirse y cerrarse, ambas, después. En los mamíferos hay de 12 a 15 transportadores específicos de glucosa diferentes. Estos, se van a diferenciar en el hecho de que diferentes tejidos van a tener diferentes transportadores. Por otro lado, otra diferencia va a ser su KM por la glucosa. El transporte no es una reacción enzimática pero en él sí que se puede hablar de la velocidad de transporte. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -77- Por ejemplo, la GLUT 1 y la GLUT 3 están presentes en todos los tejidos de los mamíferos por lo que su KM es muy baja. Si la KM es 1 mM quiere decir que con la concentración de glucosa en sangre, estos transportadores, están saturados, es decir, trabajan a velocidad máxima ya que el transporte es independiente de la concentración de glucosa en sangre, lo cual, es importante en el caso del cerebro ya que necesita un aporte continuo de glucosa. vtransporte GLUT 1 y 3 GLUT 4 vmáx/2 GLUT 2 a 1 4 5 10 15 20 [glucosa] mM La GLUT 2, por otra parte, es una célula del hígado con una KM de 15-20 mM de modo que la velocidad de transporte de la GLUT 2 dependerá de la concentración de glucosa ya que la KM está muy por encima de la concentración de glucosa en sangre. De esta forma, si disminuye la concentración de glucosa en sangre, determinados tejidos tienen asegurada la glucosa por los transportadores saturados GLUT 1 y GLUT 3. El hígado, por ejemplo, con el transportador GLUT 2 no compite con otros tejidos como, por ejemplo, con el cerebro ya que, únicamente, cuando los niveles de glucosa son lo suficientemente altos, los transportadores GLUT 2 transportan glucosa al interior del hígado y, además, el hígado puede utilizar lípidos por lo que no competirá con el cerebro. Esto también ocurre con las células - pancreáticas ya que tiene el mismo transportador que el hígado aunque, en este caso, la insulina es la señal para que aumente la captación de glucosa por los órganos periféricos desempeñando un papel de regulación de la insulina. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -80- - 7ª reacción: Primera fosfoliración a nivel de sustrato para la síntesis de ATP. Es una reacción reversible y en realidad, como recordaremos, se sintetizan dos moléculas de ATP. Hasta este punto el balance es neutro, es decir, se gasta lo mismo que se gana. 25/11/13 - 8ª reacción: Es una reacción en la que el fosfato se cambia de la posición 2 a la pasándose del del 3-fosfoglicerato al 2-fosfoglicerato. La enzima que cataliza esta reacción es la fosfoglicerato mutasa y, como mecanismo, tiene una histidina forforilada en el centro activo por lo que, lo que va a ocurrir, es que entra el sustrato formándose el complejo enzima sustrato y se intercambian los fosfato de 3 a 2 fosfogliceratoo separándose el P. - 9ª reacción: Esta reacción es necesaria para sintetizar el fosofenolpiruvato (compuesto de alta energía) mediante la enzima enolasa al perder una molécula de agua. Esta reacción de simple deshidratación convierte el fosfoenolpiruvato con un potencial de transferencia del grupo fosfato de -60 kJ/mol por lo que también se utiliza para realizar la 10ª reacción ,mediante piruvato kinasas, es decir, se utiliza para la síntesis de ATP produciéndose la segunda fosforilazión a nivel de sustrato convirtiéndose, el fosfoenolpiruvato, en piruvato (producto final) en la 10ª reacción. De este modo, se acaba la etapa anaerobia del metabolismo de los Hidratos de Carbono. Perfil energético y electrónico de la glucólisis anaerobia. En el perfil energético se representa los pasos de la ruta frente a la energía libre real del proceso. En él, se observa que la mayoría de reacciones están próximas al equilibrio pero, por otra parte, tres reacciones son irreversibles: la 1ª catalizada por la hexokinasa, la 3º catalizada por la PFK 1 y la 10ª catalizada por la piruvato kinasa. El flujo de la vía lo genera la 1ª y la 3ª. Por ello, es un proceso exergónico y siempre va en la dirección de glucosa a piruvato. De piruvato a glucosa las primeras reacc son las mismas pero los pasos irreversibles toman, como dijimos, otros caminos. REGULACIÓN DE LA GLICÓLISIS. 1. HEXOKINASA Y GLUKOKINASA (Hexokinasa IV). La primera reacción de la glicolisis es, como hemos visto, catalizada por la hexokinasa. En esta reacción lo que va a ocurrir es una transferencia de un grupo fosfato del ATP al Carbono. La enzima hexokinasa va estar en todos los tejidos de los organismos que producen la glicólisis. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -81- ¿Por qué el ATP transfiere el grupo fosfato a la glucosa y no al agua? A priori, la fosforilazión del agua está más favorecida ya que esta es la reacción de hidrolisis del ATP. - Hidrólisis del ATP: ATP +H2O ADP + P Gº= -390kj/mol - Glucosa G-6P + ADP Gº= -164 kj/mol A priori, al mismo tiempo, la concentración de agua es 55,5 mM mientras que la de glucosa es de 5-10 mM por lo que en lo referente a la concentración de reactantes está favorecía la hidrolisis. Finalmente, ¿por qué se transfiere el grupo fosfato a la glucosa? Esto se debe al hecho de que la hexokinasa esté formada por una única cadena polipeptídica con dos dominios. La hexokinasa presenta un hueco el cual está su centro activo. Por ello, lo que ocurre es que, cuando la glucosa y el ATP se unen en el centro activo, se va inducir un ajuste en la molécula de la enzima de manera que los dominios se cierran sobre los sustratos. Esto produce un cambio de proximidad y orientación por lo que la enzima aproxima los dos sustratos y los orienta de forma de que los grupos del ATP y de la glucosa queden juntos, es decir, de modo que el grupo fosfato del ATP quede próximo al grupo hidroxilo de la glucosa. Además, como el centro activo es un sitio hidrófobo el agua no entra en él por lo que el ATP no le podrá ceder su grupo fosfato a esta molécula. Características de la Hexokinasa: - La Hexokinasa presente una afinidad muy alta para la glucosa (KM<0,1mM) por lo que siempre estará funcionando a velocidad máxima ya que está saturada por el sustrato. - Además de fosforilar glucosa, la Hexokinasa, fosforila otras hexosas, como la fructosa y la manosa. - También está inhibida por el producto de la reacción (glucosa-6-P) Por otro lado, como hemos visto, en el hígado de los vertebrados hay una isoenzima de la Hexokinasa que cataliza la misma reacción. Es la denominada Glucokinasa o Hexokinasa IV. Características de la Glucokinasa. - De primeras, es una enzima diferente a la Hexokinasa porque es una enzima holostérica, a pesar de que esta formada por una única cadena polipeptídica, que presenta cinetica sismoide. - Presenta una alta especificidad por la glucosa, es decir, no fosforila otras hexosas pero, por el contrario, presenta una baja afinidad pro la glucosa. - La K0,5 para la glucosa es alta (7 mM). Esto es lo que quiere decir que tiene menos afinidad por la glucosa. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -82- - Esta enzima está inhibida por la unión de una proteína inhibidora que está en el núcleo de la célula. Así, cuando la enzima se encuentra en el citosol de la célula, desde el núcleo, se secuestra o se libera la glucokinasa. De este modo, la proteína inhibidora secuestra a la enzima cuando la concentración de glucokinasa es alta. CITOSOL NÚCLEO CELULAR [GLUCOSA] G6P PORO Glucokinasa libre Proteína inhibidora-Glucokinasa secuestrada F6P - En el hígado la GLUT 1 (1mmM) trabaja con la Hexokinasa (KM=0,1mM) y la GLUT 2 (15- 20mM) con la Glucokinasa (K0,5=7mM). La GK funciona a niveles más bajos por lo que el hígado no compite con otros tejidos. Si los niveles glucosa aumenta el GLUT 1 trabaja al máximo y el GLUT 2 retira el exceso aumentando la concentración de glucosa en las células hepáticas por lo que Glucokinasa sale de estar secuestrada del núcleo. De esta manera, el hígado es un órgano fundamental en la homeóstasis de la glucosa. Por otro lado, si la Fructosa-6-P aumenta se retira Glucokinasa al núcleo y la Glucosa-6-P se va a convertir en glucógeno en vez de en Fructosa-6-P. 2. FOSFOFRUCTOKINASA I (PFK I). Fructosa-6-p Fructosa-1,6-bisfosfato + ADP La PFK I es una enzima halostérica tetrámerica que tiene una serie de efectores positivos y negativos. Entre los efectores negativos se encuentran el ATP, el cual es uno de los sustratos de la reacción, por lo que es un efector negativo holotrópico. De hecho, el centro activo es un sitio con alta afinidad por el ATP mientras que el sitio alostérico es un sitio con baja afinidad por el ATP por lo que, cuando la concentración de ATP es baja, este se une al centro activo sólamente pero, cuando la concentración de ATP es alta, se une al centro activo uniéndose también al sitio alostérico e inhibiéndose la enzima. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -85- 29/11/13 Regulación de la PFK I en el hígado (2). Cuando las concentraciones de glucosa son altas, lo que ocurre, es que se aumentan los niveles en sangre de insulina mediante el páncreas disminuyendo la concentración de glucagón. De este modo, la insulina llega a su receptor en el hígado. Este receptor tiene diversas vías de señalización, de forma, que va a activar la proteín fosfatasa inhibiendo, por otro lado, la Proteínkinasa A. Si la proteínkinasa A no es la que funciona, será la fosfatasa con la serina 32 desfoforilada la que funcione, por lo que su actividad kinasa estará activa por lo que se va a sintetizar Fructosa-2,6-biP aumentando sus niveles y aumentando el flujo de la vía glucolítica produciéndose la glucolisis en el hígado. Regulación de la PFK I en el músculo cardiaco. En las células del músculo cardiaco hay otra enzima bifuncional isoenzima de la PFK. La estructura es la misma aunque es un poco más grande ya que está constituida por 530 aa. Por otro lado, la actividad también va a depender de la fosforilación de la serina de la protéina. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -86- En este caso, se trata de una serina que está en el extremo carboxilo terminal (posición 466), la cual, puede estar fosforilada o no teniendo un efecto opuesto al del hígado. ¿Por qué en el hígado se activa y en el músculo se inactiva la glucólisis? En una situación de estrés hay una descarga de adrenalina. Así, en el hígado, como respuesta a la adrenalina, se activa la proteínkinasa A y se activa la enzima responsable de la hidrolisis del glucógeno produciéndose glucosa y, también, produciéndose la inhibición de la glicolisis, de modo que tenemos que, el hígado, produce glucosa que no utiliza para que la utilice el músculo ante una situación de estrés ya que la glucosa queda disponible para otros tejidos. De esta forma, al músculo llega su hormona produciéndose el efecto contrario, es decir, activándose la glucolisis. 3. PIRUVATO KINASA. La Piruvato Kinasa cataliza la última reacción irreversible de la glucólisis. Esta última reacción, a su vez, consta de dos pasos, es decir, de una transferencia endergónica de fosfato desde el fosfoenolpiruvato a un ADP y, segunda reacción muy exergónica, en la que el enolpiruvato se tautomeriza en el producto final, el piruvato. Por último, tenemos que el cambio de enegia libre estándar total de la reacción es de -31,4 kJ/mol. La Piruvato Kinasa también presenta isenzimas. Por un lado, presenta una primera isoenzima en el hígado, la cual, se denomina PK-L y, por otro, también presenta una segunda isoenzima denominada PK-A presente en el resto de los tejidos. Las dos catalizan la misma reacción pero son dos proteínas diferentes. Las dos enzimas son holostéricas y, tanto la una como la otra, presentan efectores negativos y positivos comunes. Como efectores negativos tenemos la concentración de [ATP] la cual dependerá de la carga energética de la célula por lo que, si esta es alta, la célula no necesita ATP por la vía glucolítica. Otro efector negativo es la alanina (aa). La alanina se va a sintetizar a partir piruvato por lo que niveles altos de esta significará que no hará falta más piruvato. El último efector negativo es el AcetilCoencima A (AcCo A) ya que, uno de los destinos del piruvato, es la descarboxilación oxidativa con AcCoen A por lo que esta molécula, en cantidades altas, quiere decir que la célula no necesita mas piruvato porque tiene suficiente AcetilCoenzima A. Como efectores positivos nos encontramos la Fructosa-1,6-P. La Piruvato Kinasa es la última reacción de la glicolisis. Por ello, un metabolito intermedio, la F- 1,6-P, de la vía metabólica activa otro metabolito que está más delante de esta (activación hacia delante). Esto se produce porque una vez que el “carbón” pasa a través de esta etapa irreversible de la glucólisis tiene que acabar como piruvato, lo cual, se consigue haciendo que un metabolito active una enzima del final de la glicolisis, es decir, la F-1,6-P tira de la glucolisis para que no se acumulen metabolitos en el centro de la ruta. Regulación de la Piruvato Kinada hepática (PK-L). La enzima Piruvato Kinasa fosforilarada es menos activa y la desfosforilada es activa. Todo esto ocurre en el hígado por lo que, esto, va a producir la regulación de la glucolisis volviendo a los casos anteriores. De esta forma, la glucólisis se ve regulada a dos niveles (por la PFK I y la PK- L) pero, con la diferencia, de que, esta última, no le va a importar al musculo.Así, como resumen, la glicolisis va a ser importante, aparte de para la obtención Energía, para producir metabolitos intermediarios que se van a utilizar en otras vías. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -87- METABOLISMO DE OTRAS HEXOSAS. La glucosa puede provenir, por un lado, de la degradación de polisacáridos de reserva (glucógeno), de la gluconeogénesis y, a partir de la dieta, sobre todo de los disacáridos como la maltosa (de la degradación gluconeno), la lactosa (el azúcar de la leche) y la sacarosa (el azúcar común). Estos disacáridos tienen que ser hidrolizados para que el intestino pueda absorberlos por lo que que las células intestinales presentan unas enzimas capaces de degradar estos disacáridos. La glucosa entra directamente a la via glucolitica. Los otros van a entrar por otros niveles por lo que se podrán utilizar en la vía metabólica. Metabolismo de la fructosa. El metabolismo de la fructosa depende del tejido. En los músculos la fructosa es fosforilada por la hexokinasa para dar Glucosa-6-P (molécula apta para realizar la glicolisis). En el hígado, mientras, la fructosa va a ser fosforilada por la Fructokinasa (especifica) dándose lugar a la Fructosa-1-P (abierta). Esta fructosa fosforilada va a ser rota por una Aldolasa hasta que, por último, una parte, la dihidroxiacetona fosfato, se convierte en Gliceraldehido-3-P (G3P) que va a la glucolisis, mientras que la otra parte de la molécula puede fosforilarse directamente a G3P o puede seguir otro camino hasta que se oxida a dihidroxiacetona fosfato para acabar también en la glicolisis como G3P. La fructosemia aparece cuando aparece una deficiencia en la aldolasa. REGULACIÓN DE LA GLUCÓLISIS Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -90- 25/11/13 B) Fermentación alcoholica. La fermentación alcohólica se produce fundamentalmente en levaduras y se va a llevar a cabo en dos reacciones. En la primera el piruvato se va a descarboxilar de una manera no oxidativa mediante la enzima piruvato descarboxilasa mientras que en la segunda reacción el acetaldehído va a ser reducido a etanol mediante la acción de la enzima alcohol deshidrogenasa y mediante de la oxidación del NADH a NAD+. Así tenemos que, mientras que la primera reacción es irreversible, la segunda es reversible por lo que si se consume alcohol, es decir, etanol, la célula va a consumir el NAD+ acabándose la glucólisis y gastándose energía, además de que, el acetaldehído es tóxico siendo lo que provoca la “resaca”. Por otro lado, si se consumiese etanol se produciría formaldehido, el cual es mucho más tóxico que el acetaldehído (ya que produce ceguera y muerte), se podría proceder suministrando etanol ya que, este último, produciría una inhibición competitiva con el metanol ya que el etanol competiría por la enzima. Por último, cabe recordar que la finalidad de las fermentaciones es oxidar NAD+ a NADH. Balance energético de la fase anaeróbica de la glicolisis. - Oxidación completa de la glucosa: - Fermentación homoláctica: - Fermentación alcohólica: En las fermentaciones no hay oxidación neta porque no aparecen ni el NAD+ ni el NADH, además de que, las fórmulas de la glucosa y lactato (C6H12O6 y C3H6O3), tienen el mismo número de Hidrógenos y de Oxígenos por lo que no hay oxidación neta, así como si comparamos glucosa y etanol. Estas vías son energéticamente deficientes por lo que los organismos anaeróbicos son pequeños. De hecho, el metabolismo aeróbico ha hecho posible que aparezcan organismos más complejos. Aun así, entre las ventajas de la fermentación de encuentra que el músculo puede utilizarla para obtener energía rápidamente ya que es una reacción más rápida que la oxidación de la glucosa por lo que, tal cual, no es un desperdicio de energía. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -91- C) Metabolismo oxidativo. En los organismos aeróbicos el piruvato proveniente de la glucosa se va a convertir en Acetil Coenzima A en el metabolismo oxidativo. En la primera reacción se va a dar lugar a la descarboxilación oxidativa del piruvato. El piruvato se va a descarboxilar de manera oxidativa para convertirse en acetato activo, es decir, en forma de Acetil Coenzima A por lo que vamos a tener un complejo enzimático, es decir, el complejo Piruvato Deshidrogensa y dos coenzimas. De este modo, esta reacción va a requerir tres enzimas diferentes (cada una con su grupo prostético) más las dos coenzimas resultando un total de cinco coenzimas. El complejo Piruvato Deshidrogenasa. Este complejo presenta tres enzimas diferentes Deshidrogenasa de piruvato (E1), transacetilasa de dihidrolipoilo (E2) y deshidrogenasa de dihidrolipoilo (E3). Como hemos ticho, a su vez, cada una de estas enzimas presenta un grupo prostético diferente. Para la enzima E1 es el pirofosfato de tiamina (TPP), para la E2 es el ácido lipoico y para la E3 es el NAD + y FAD. aEl núcleo del complejo es la enzima E2 (Transacetilasa dihidrolipoilo). Esta enzima está formada por ocho trímeros (24 cadenas polipeptidicas). Por otro lado, la E1 en el complejo está formada por 12 dímeros mientras que la E3 por 12 (en total sesenta cadenas polipeptidicas en la E-coli). En mamíferos este complejo es más grande. Tiene alrededor de 112 cadenas polipeptídicas que forman el complejo anterior pero, además, hay una kinasa y una fosfatasa. Bioquímica I. Curso 2013/14. Javier Jesús Pacheco Moya 2ºB -92- Reacciones del complejo Piruvato Deshidrogenasa. s Lo que va a ocurrir es que las enzimas van a ser el sustrato del piruvato. En la primera reacción, el piruvato se descarboxila produciéndose CO2 mientras que el grupo hidroxietil se queda unido a la enzima E1 tratándose de una reacción irreversible. En la segunda reacción el piruvato le tranfiere el grupo hidroxietil, el cual, se oxida a acetilo por lo que pasa del grupo prostético de la E1 a la E2 tratándose de una reacción reversible. A continuación, la transacetilasa dihidrolipoilo le tranfiere el grupo acetato a la Coencima A y el acido lipoico queda en su forma reducida acabando la descarboxilación oxidatica del piruvato. Técnicamente, este sería el primer paso de la oxidación de la glucosa porque dos de sus carbonos se oxidan a CO2). Paralelamente, la tercera enzima, la que presenta el FAD, el cual se reduce, es decir, la enzima dihidrolipoilo deshidrogenasa, se reduce por los puentes dislfuro y se regenera por el NAD+ a NADH. Por esto, la tercera enzima regenera, al acoplarse, el grupo prostético de la E2. En otras palabras, la transacetilasa al acabar la descarboxilación queda con su grupo prostético reducido. Para reutilizarse, se tiene que tratar por la deshidrogenasa dihidrolipoilo (FAD con puente disulfuro). El puente disulfuro se va a reducir en la deshidrogenasa y los sulfidrilos se oxidan en la transacetilasa. De esta forma, la transacetilasa ya está preparada para otro ciclo de reacciones. Al mismo tiempo, el FAD vuelve a formar el puente disulfuro y con la NAD+ se pasa, por último, de FADH2 a FAD.