BLOQUE 3. Tema 7. Técnicas de observación microscópica., Apuntes de Microbiología

¡Descarga BLOQUE 3. Tema 7. Técnicas de observación microscópica. y más Apuntes en PDF de Microbiología solo en Docsity! TEMA 7. Técnicas de observación microscópica La microbiología esta indudablemente unida al progreso de los microscopios. Un microscopio es un conjunto de lentes que concentran y enfocan la luz sobre una muestra para formar imágenes visuales. El concepto de microscopio se basa en una propiedad física de la luz: la difracción. Cuando un rayo de luz pasa por dos superficies distintas, se que produce una desviación que produce un retraso en la velocidad conocido como índice de refracción, producido entre dos medios cuando la luz pasa a través de ellos. 1. Observación de microorganismos 1.1. Propiedades de los microscopios - Ampliación o aumento. Número de veces que aparece resaltado el tamaño de un objeto y que es el producto de la lente ocular por la objetiva. - Contraste. Diferencia de intensidad lumínica que hay entre la muestra y el medio. Para aumentar el contraste se recurre a medios de tinción. - Poder de resolución o límite de resolución. Ecuación de Abbe. λ = Longitud de onda (que emite la fuente de luz) AN= Apertura numérica AN= N.senα N= Índice de refracción entre dos medios (entre el medio de la muestra y el aire). El límite de resolución (N) es la capacidad que tiene un microscopio para distinguir por separado dos puntos que están muy próximos en la imagen. Cuando más bajo es el nivel de d, mayor será el límite de resolución. En el aire N=1 Si se le añade aceite de inmersión hace que la N aumente; N(con aceite)=1.25 Si λ= 450nm y α= 55º la resolución del microscopio es entre 100-200nm. Con los microscopios normales no se puede observar a menos de 100nm. 1.2. Tipos de microscopios - Microscopio de campo claro. Las muestras se visualizan al destacar sobre un fondo iluminado. Se puede aumentar el contraste sin necesidad de teñir. El contraste entre muestra y medio es muy pobre. - Microscopio de fondo oscuro. Normalmente en las muestras el contraste entre la célula viva y el agua es muy difícil de resolver con un microscopio de campo claro. Pero este microscopio cambia las condiciones. Se coloca un condensador especial que impide el acceso de luz a la muestra directamente y sólo los rayos oblicuos que inciden son reflejados. Se observa una imagen con un fondo oscuro y los rayos oblicuos hacen que la muestra se vea iluminada o brillante. Se usa para visualizar microorganismos que son difíciles de teñir por sus características o no se ven con el microscopio normal. Organismos frágiles o que se tiñen muy mal. Ej.: La bacteria de la sífilis (Treponema palium) o las espiroquetas que son muy delgadas. - Microscopía de contraste de fases. Consiste en que a lo largo del microscopio se intercalan uno o más anillos de fase, que hacen pequeños retrasos en la refracción de la luz cuando pasa de un medio a otro, y los amplifica. Hay dos tipos de luz: la directa y la en fase (retardada). Cuando los dos tipos se integran en el ocular, forman una imagen muy contrastada con áreas muy iluminadas (en fase) y otras muy oscuras (fuera de fase), que va a permitir visualizar la morfología y tamaño de células y composición citoplasmática, Phb, gránulos de volutina, si hay endosporas en formación. Estos componentes no se observan de ninguna otra manera. - Microscopio de luz UV. Utiliza una longitud de onda que está en el ultra violeta (200-300nm). - Microscopio confocal. Usa como fuente de luz los rayos láser. - Microscopía de fluorescencia. Consiste en detectar en la muestra qué emite luz, ya que ciertas moléculas y estructuras son fluorescentes y se excitan con energía radiante. Parte de esa energía que emiten es detectada por el microscopio (Ej.: clorofila, que tienen sustancias fluorescentes naturales). En otras ocasiones se necesita marcar dichas estructuras o moléculas con fluorocromos, tales como la rodamina B o isotiocianato de fluoresceína para poder localizarlas. - Microscopía electrónica. Usa una corriente de electrones que se desplaazan a través de unos lentes electromagnéticos y se van a proyectar sobre una muestra extremadamente fina que tiene que estar en condiciones de vacio extremo. 2. Colorantes Para mejorar el contraste entre los microorganismos y el medio lo que hacemos es recurrir a las tinciones, tratando las muestras celulares mediante colorantes que son sustancias con una afinidad especial por determinados componentes o estructuras celulares. Como resultado de la tinción lo que vamos a observar son muestras de microorganismos teñidas mas contrastadas sobre un medio difuso (no teñido). En microbiología vamos a utilizar siempre preparaciones fijadas, es decir, muestras de células muertas, y para las tinciones se utilizan colorantes (no tintes). Todo colorante lleva dos partes. - Grupo cromóforo. Parte de la molécula responsable del color, es el radical cromóforo. Se trata de moléculas alifáticas que suelen llevar un doble enlace conjugado (N=N) o un grupo sulfo (SO2). - Grupo auxocromo. Región de la molécula que no tiñe pero que facilita la interacción del radical cromóforo con la molécula que va a teñir. Suelen ser radicales iónicos (OH-, COO-, NH2 +) muy activos con capacidad para interactuar. Los colorantes se van a clasificar en función del grupo auxocromo: + Grupo auxocromo ácido. El grupo auxocromo es un anión y va a interaccionar con componentes celulares básicos de la célula, como el citoplasma y estructuras con carga positiva. Ejemplos: eosina, rojo-congo, fucsina.