Cálculo de constantes catalíticas de fosfatasa alcalina mediante prácticas experimentales, Diapositivas de Bioquímica

¡Descarga Cálculo de constantes catalíticas de fosfatasa alcalina mediante prácticas experimentales y más Diapositivas en PDF de Bioquímica solo en Docsity! UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFÍA ACT DEPARTAMENTO DE CIENCIAS CELULARES Y MOLECULARES SECCIÓN BIOQUÍMICA, BIOLOGÍA MOLECULAR Y FARMACOLOGÍA BIOQUÍMICA C0551 2022 2 PRÁCTICA 2: CINÉTICA ENZIMÁTICA Integrantes: Diaz Aparcana, Maria Garrido Lavado, Stefanny Surco Quispe, Angie Docentes: Mirko Zimic Teresa Barreto Carlos Flores Dina Patilla Grupo: 2 Subgrupo: 2.07 Septiembre, 2022 PRÁCTICA 2: CINÉTICA ENZIMÁTICA I. OBJETIVOS Estudiar la cinética de la enzima fosfatasa alcalina: Determinación de las constantes catalíticas Km y Vmáx de la enzima. II. INTRODUCCIÓN Los seres vivos realizamos procesos químicos, como el simple hecho de consumir alimentos para posteriormente transformarlos y liberar energía que nos permita realizar diferentes tipos de actividades, algunos de estos procesos son demasiado lentos, por lo que es necesario el uso de la catálisis para que nuestro organismo realice sus actividades en tiempo útil para que la vida siga existiendo. Los catalizadores de las reacciones bioquímicas que se realizan en nuestro organismo se dan mediante las enzimas que son proteínas, a excepción de unas pocas moléculas de ARN. Las enzimas son conocidas como el centro de todos los procesos bioquímicos, además de presentar una alta especificidad por el sustrato con el que se unirá mediante enlaces débiles. [1] En el presente trabajo se trabajará con la enzima fosfatasa alcalina, una metaloenzima no específica que se encuentra en huesos, hígado, riñón, placenta e intestino; que es usado para diagnosticar diversos trastornos óseos o enfermedades hepáticas obstructivas. [2] Para determinar la actividad de la enzima utilizada, la fosfatasa alcalina, se utilizará como sustrato al p-nitrofenilfosfato (p-NFF) de aspecto incoloro, que por reacción de hidrólisis se obtiene el producto al p-nitrofenol de aspecto amarillo. De esta manera, medir la absorción por espectrofotometría a 405 nm de longitud de onda. III. PROCEDIMIENTO (flujograma) Tabla 1: Volúmenes de los reactivos por tubos Volúmenes en microlitros (μL) 𝑉 0 (µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠/𝑚𝑖𝑛) = 1.03×10−3µ𝑚𝑜𝑙 5 𝑚𝑖𝑛 = 2. 06 × 10−4 µ𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑖𝑛 Tubo 3: a. Cálculo de la concentración de sustrato: Hallar Cf usandola ecuación Ci x Vi = Cf x Vf Ci = 2 mg/mL Vf = 1250 µL Vi = 50 µL 2 𝑚𝑔 𝑚𝐿 × 50µ𝐿 = 𝐶𝑓 𝑇3 × 1250µ𝐿 𝐶𝑓 𝑇3 = 0. 08 𝑚𝑔 𝑚𝐿 = 0. 08 𝑔 𝐿 Hallar la molaridad (M) Usando la ecuación 𝑀 = [𝑆] 𝑔 𝐿 𝑃𝑀 𝑃𝑀 = 371. 1 𝑔 𝑚𝑜𝑙 𝑀 𝑇3 = 0.08 𝑔 𝐿 371.1 𝑔 𝑚𝑜𝑙 ⇒ 𝑀 𝑇3 = 2. 15 × 10−4𝑀 = 2. 15 × 10−1𝑚𝑀 b. Cálculo de la velocidad de la reacción: Usando la ecuación 𝑐 = 𝐴 𝑎×𝑙 = [𝑃]𝑀 𝑎 = 18300𝑀−1𝑐𝑚−1 𝑙 = 1 𝑐𝑚 𝐴 = 0. 195 [𝑃] 𝑇3 𝑀 = 0.195 18300𝑀−1𝑐𝑚−1×1𝑐𝑚 = 1. 065 × 10−5𝑀 Hallar las moles del producto formado con la ecuación 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑃 = [𝑃]𝑀 × 𝑉𝑜𝑙. 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 (𝐿 ) 𝑉𝑜𝑙. 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 (𝐿 ) = 1450 × 10−6𝐿 [𝑃]𝑀 = 1. 065 × 10−5 𝑚𝑜𝑙 𝐿 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑃 𝑇3 = 1. 065 × 10−5 𝑚𝑜𝑙 𝐿 × 1450 × 10−6𝐿 = 1. 54 × 10−8𝑚𝑜𝑙 Convertir a µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 1. 54 × 10−8𝑚𝑜𝑙 × 106 = 1. 54 × 10−2µ𝑚𝑜𝑙 Finalmente usar la ecuación 𝑉𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑(µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠/𝑚𝑖𝑛) = µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑃 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 (𝑚𝑖𝑛) 𝑉 0 (µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠/𝑚𝑖𝑛) = 1.54×10−2µ𝑚𝑜𝑙 5 𝑚𝑖𝑛 = 3. 08 × 10−3 µ𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑖𝑛 Tubo 4: a. Cálculo de la concentración de sustrato: Hallar Cf usando la ecuación Ci x Vi = Cf x Vf Ci = 2 mg/mL Vf = 1250 µL Vi = 75 µL 2 𝑚𝑔 𝑚𝐿 × 75µ𝐿 = 𝐶𝑓 𝑇4 × 1250µ𝐿 𝐶𝑓 𝑇4 = 0. 12 𝑚𝑔 𝑚𝐿 = 0. 12 𝑔 𝐿 Hallar la molaridad (M) Usando la ecuación 𝑀 = [𝑆] 𝑔 𝐿 𝑃𝑀 𝑃𝑀 = 371. 1 𝑔 𝑚𝑜𝑙 𝑀 𝑇4 = 0.12 𝑔 𝐿 371.1 𝑔 𝑚𝑜𝑙 ⇒ 𝑀 𝑇4 = 3. 23 × 10−4𝑀 = 3. 23 × 10−1𝑚𝑀 b. Cálculo de la velocidad de la reacción: Usando la ecuación 𝑐 = 𝐴 𝑎×𝑙 = [𝑃]𝑀 𝑎 = 18300𝑀−1𝑐𝑚−1 𝑙 = 1 𝑐𝑚 𝐴 = 0. 336 [𝑃] 𝑇4 𝑀 = 0.336 18300𝑀−1𝑐𝑚−1×1𝑐𝑚 = 1. 836 × 10−5𝑀 Hallar las moles del producto formado con la ecuación 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑃 = [𝑃]𝑀 × 𝑉𝑜𝑙. 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 (𝐿 ) 𝑉𝑜𝑙. 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 (𝐿 ) = 1450 × 10−6𝐿 [𝑃]𝑀 = 1. 836 × 10−5 𝑚𝑜𝑙 𝐿 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑃 𝑇4 = 1. 836 × 10−5 𝑚𝑜𝑙 𝐿 × 1450 × 10−6𝐿 = 2. 66 × 10−8𝑚𝑜𝑙 Convertir a µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 2. 66 × 10−8𝑚𝑜𝑙 × 106 = 2. 66 × 10−2µ𝑚𝑜𝑙 Finalmente usar la ecuación 𝑉𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑(µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠/𝑚𝑖𝑛) = µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑃 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 (𝑚𝑖𝑛) 𝑉 0 (µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠/𝑚𝑖𝑛) = 2.66×10−2µ𝑚𝑜𝑙 5 𝑚𝑖𝑛 = 5. 32 × 10−3 µ𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑖𝑛 Tubo 5: a. Cálculo de la concentración de sustrato: Hallar Cf usando la ecuación Ci x Vi = Cf x Vf Ci = 2 mg/mL Vf = 1250 µL Vi = 100 µL 2 𝑚𝑔 𝑚𝐿 × 100µ𝐿 = 𝐶𝑓 𝑇5 × 1250µ𝐿 𝐶𝑓 𝑇5 = 0. 16 𝑚𝑔 𝑚𝐿 = 0. 16 𝑔 𝐿 Hallar la molaridad (M) Usando la ecuación 𝑀 = [𝑆] 𝑔 𝐿 𝑃𝑀 𝑃𝑀 = 371. 1 𝑔 𝑚𝑜𝑙 𝑀 𝑇5 = 0.16 𝑔 𝐿 371.1 𝑔 𝑚𝑜𝑙 ⇒ 𝑀 𝑇5 = 4. 31 × 10−4𝑀 = 4. 31 × 10−1𝑚𝑀 b. Cálculo de la velocidad de la reacción: Usando la ecuación 𝑐 = 𝐴 𝑎×𝑙 = [𝑃]𝑀 𝑎 = 18300𝑀−1𝑐𝑚−1 𝑙 = 1 𝑐𝑚 𝐴 = 0. 383 [𝑃] 𝑇5 𝑀 = 0.383 18300𝑀−1𝑐𝑚−1×1𝑐𝑚 = 2. 092 × 10−5𝑀 Hallar las moles del producto formado con la ecuación 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑃 = [𝑃]𝑀 × 𝑉𝑜𝑙. 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 (𝐿 ) 𝑉𝑜𝑙. 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 (𝐿 ) = 1450 × 10−6𝐿 [𝑃]𝑀 = 2. 092 × 10−5 𝑚𝑜𝑙 𝐿 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑃 𝑇5 = 2. 092 × 10−5 𝑚𝑜𝑙 𝐿 × 1450 × 10−6𝐿 = 3. 03 × 10−8𝑚𝑜𝑙 Convertir a µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 3. 03 × 10−8𝑚𝑜𝑙 × 106 = 3. 03 × 10−2µ𝑚𝑜𝑙 Finalmente usar la ecuación 𝑉𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑(µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠/𝑚𝑖𝑛) = µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑃 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 (𝑚𝑖𝑛) 𝑉 0 (µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠/𝑚𝑖𝑛) = 3.03×10−2µ𝑚𝑜𝑙 5 𝑚𝑖𝑛 = 6. 06 × 10−3 µ𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑖𝑛 Tubo 6: a. Cálculo de la concentración de sustrato: Hallar Cf usando la ecuación Ci x Vi = Cf x Vf Ci = 2 mg/mL Vf = 1250 µL Vi = 200 µL 2 𝑚𝑔 𝑚𝐿 × 200µ𝐿 = 𝐶𝑓 𝑇6 × 1250µ𝐿 𝐶𝑓 𝑇6 = 0. 32 𝑚𝑔 𝑚𝐿 = 0. 32 𝑔 𝐿 Hallar la molaridad (M) Usando la ecuación 𝑀 = [𝑆] 𝑔 𝐿 𝑃𝑀 Gráfico 2: Con los 5 tubos (excluyendo el T2 y T6) que contienen errores ¿Cómo se denomina esta gráfica?, ¿Qué tipo de curva es? ● Se denomina la gráfica de Michaelis-Menten ( Velocidad vs. Concentración de Sustrato). ● Se llama curva de avance de la reacción o cinética de reacción, donde se adquiere una hipérbola que nos muestra el grado de saturación de la fosfatasa alcalina limitando con su velocidad en la reacción, ya que está tiende a aproximarse a un valor infinito.[3] b) Gráfico 3: Plot de Lineweaver-Burk Determine el Km y Vmáx de la fosfatasa alcalina mediante el gráfico de Lineweaver Burk ● Vmáx = = = 1 𝑉𝑚𝑎𝑥 1 107.04 9. 34 × 10−3 ● Km = = = 0.29531. 603 × 𝑉𝑚𝑎𝑥 31. 603 × (9. 34 × 10−3) V. CUESTIONARIO a. ¿Cómo se interpreta y qué importancia tiene el valor de Km? La constante de Michaelis (Km) nos indica la concentración de sustrato y la afinidad de una enzima por el sustrato, cuando el valor de Km sea menor, la afinidad de la enzima por el sustrato será mayor. Cuanto menor sea la Km menor será la cantidad de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima, por lo que mayor será la afinidad del enzima hacia ese sustrato. [4] Conociendo Km se pueden acomodar las condiciones necesarias para el ensayo, de tal forma que [s] > Km y así determinar Vm, que es proporcional a la cantidad total de enzima {Vm= K2 [E]t}. Esta tiene un aplicación para la determinación de las actividades séricas de enzimas que se utilizan en bioquímica como marcadores de ciertas patologías (fosfatasas, transaminasas, lactato DH, etc). [5] b. ¿Qué utilidad tiene la determinación de los parámetros cinéticos de las enzimas? El estudio en cinética enzimática de la velocidad de las reacciones catalizadas por las enzimas, brindan una información directa sobre los procesos de reacciones catalíticas y la particularidad de la enzima que son utilizados para comparar las actividades enzimáticas. c. Explique la importancia fisiológica de la fosfatasa alcalina en los diferentes tejidos. La fosfatasa alcalina es una glicoproteína ubicua pegada a la membrana que se encarga de catalizar la hidrólisis de los monoésteres a un pH alcalino.[6] La importancia que tiene esta enzima es que está ampliamente distribuido en las células de mamíferos (por ejemplo, el hígado, conductos biliares, intestino, hueso, riñón, placenta y leucocitos). En algunos sitios la fosfatasa puede facilitar el movimiento de las moléculas a través de las membranas celulares.[7] Además participa en la detección de diferentes enfermedades, la actividad de la fosfatasa alcalina es que actúa como indicador bioquímico sérico muy útil para las enfermedades hepáticas; por otro lado el aumento de la fosfatasa alcalina en el suero y otros fluidos indica cambios fisiológicos o patológicos que van más allá del origen hepático, como los aumentos de la actividad de la fosfatasa alcalina en hembras embarazadas o lactantes (como enfermedades óseas, neoplasias, endocrinas y otros trastornos estimulan el aumento de fosfatasa alcalina).[8] VI. DISCUSIÓN En este laboratorio tuvimos la oportunidad de observar y demostrar la cinética de la enzima fosfatasa alcalina mediante la creación de gráficas como la de Michaelis-Menten y Lineweaver Burk. Durante nuestro procedimiento usamos 7 tubos como muestra y uno blanco, ya que posteriormente medimos la absorbancia de cada uno a 405 nm. Sin embargo, a lo largo de nuestro experimento, en el momento de obtener la absorbancias de nuestras muestras nos encontramos con el problema de que estas no tenían una absorbancia fija, sino que estas avanzaban, como en el caso de T2 y T6, además que al realizar una comparación entre todas nuestras absorbancias obtenidas, aquellas nos brindaban un número muy alejado a la tendencia que teníamos. El error que tuvimos al medir las absorbancias de nuestras muestras fue el hecho de no mover las muestras al momento de agregar el NaOH, ya que este compuesto se agregaba con el propósito de detener la reacción, lo que ocasionó una