cromosomas genetica, Apuntes de Biología

¡Descarga cromosomas genetica y más Apuntes en PDF de Biología solo en Docsity! 1 Tema 14 El cromosoma vehicle de l’herència Novembre 2010 Un problema fonamental, amb el que s'enfronta qualsevol cèl·lula o genoma acel·lular, consisteix en l'organització del seu material hereditari a l'objecte d'aconseguir que la molècula d'àcid nucleic, en principi relativament rígida i lineal, puga ser plegada i estructurada de manera que es possibilite la seva inclusió dins de l'espai cel·lular o la càpside vírica. A més a més, en la majoria dels casos aquest plegament de l'àcid nucleic es du a terme amb l'ajut de proteïnes, amb la qual cosa s'obté un segon benefici, la protecció del material hereditari front a les agressions del medi. També cal tenir en compte que aquest compactament no pot ser fet de qualsevol manera, com quan posem desordenadament la roba dins d'una borsa per portar-la a la bugaderia, sinó que cal fer-lo de manera extremadament precisa i ordenada, més be recordant com disposem la roba (els gens) a les maletes (els cromosomes) quan preparem un viatge. Així, igual que al llarg del viatge una bona ordenació ens permet agafar en qualsevol moment la peça desitjada sense veure'ns obligats a desfer completament l'equipatge, una bona i ordenada compactació del material hereditari permet que un gen determinat esdevinga funcional en el moment corresponent sense pertorbar excessivament la compactació de les regions veïnes. A les ampliacions del tema podeu veure com afronten aquest problema de compactació i protecció del material hereditari els virus, viroides, plasmidis i cromosomes bacterians. Entre aquest tema i el següent ens centrarem en com ho resolen els eucariotes. Com tantes vegades en biologia, front a un problema general trobem moltes estratègies diferents que el solucionen més o menys acuradament. En aquest cas, la complexitat de l'organisme juga un paper fonamental, i així, a menor complexitat més senzilla i directa, sense participació de proteïnes, és la manera en que s'estructura el genoma en qüestió. Quan s’analitza el DNA de qualsevol cèl·lula eucariota, un tret diferencial es fa evident: està unit a proteïnes, fonamentalment histones, constituint el que anomenem cromatina. Tant és així que fins i tot el DNA de virus que infecten aquestes cèl·lules es presenta en aquestes associacions nucleoprotèiques. Sols el DNA pertanyent a cloroplasts i mitocondris es veu lliure de l’associació a histones. Altres dos components importants de la cromatina són RNA i proteïnes de tipus no histònic. Com a components secundaris de la cromatina i els cromosomes podem trobar lípids, polisacàrids i alguns ions (Ca++ , Mg++ i Fe++ ). Una anàlisi química dels cromosomes també permet trobar altres components com ara DNApolimerases, transcriptases, 2 etc però és evident que no es tracta de parts integrants de l’estructura dels cromosomes. Els quatre components químics majoritaris del cromosoma es troben en les següents proporcions en pes: 1 DNA : 1,5-2,5 proteïnes : 0,05 RNA La part proteica es pot separar en 1,0 histones : 0,5-1-5 no histones. El DNA i les histones estan constituint el que denominem una DNP o desoxiribonucleoproteïna que pot ser separada de la resta de components cromosòmics per tractament amb ClNa 1M i representa entre el 60 i 90% de la massa cromosòmica total. Les histones són unes proteïnes bàsiques, amb gran quantitat relativa dels aminoàcids lisina i arginina (entre el 20 i el 30%) que solen estar situats majoritàriament a l’extrem aminoterminal de la molècula el que li confereix càrrega positiva a pH fisiològic. La proporció entre la quantitat de proteïnes histones i DNA està perfectament controlada al llarg del cicle cel·lular degut a un estricte acoblament entre la síntesi d’histones i la replicació del DNA (tots dos fenòmens tenen lloc a la fase S). Existeixen cinc tipus fonamentals d’histones comuns a tots els cromosomes eucariotes: H1, H2A, H2B, H3 i H4, totes presents en quantitats equimoleculars tret de la histona H1 la qual es presenta en quantitat menor, concretament la meitat, Taula 15.1. Es tracta de proteïnes relativament xicotetes, entre 11 i 23KDa. Els gens que les codifiquen careixen d’introns i es presenten repetits al genoma, amb la qual cosa s’aconsegueix la síntesi de gran quantitat de producte en un curt espai de temps. També pot ser destacat el conservadurisme evolutiu que presenten, especialment les histones H3 i H4. Així per exemple les histones de tipus H4 del pèsol i del tim de vedella tan sols difereixen en dos aminoàcids. Açò reflecteix, sense dubte, la similitud de les interaccions DNA-histones en la cromatina independentment del seu origen. La histona menys conservada és la H1. El paper fonamental de les histones és l’empaquetament del DNA dintre del nucli de la cèl·lula si bé als últims anys se’ls està atorgant també un paper en la regulació de l’expressió gènica vista, in vitro, la seva capacitat per a competir amb els factors bassals de transcripció per tal d’unir-se a les caixes TATA dels promotors. La presència d’histones i l’empaquetament del DNA en nucleosomes són característics dels organismes eucariotes. 5 uns 200pb de DNA. Si es permet que l’acció enzimàtica dure més temps en primer lloc obtenim, com no, una acumulació de DNA corresponent a la banda de 200pb (mononucleosomes), però poc a poc podem observar que la longitud d’aquestos fragments es redueix, en ser digerits per l’enzim, donant pas a fragments d’aproximadament 165pb que per a alguns autors constitueixen els anomenats cromatosomes i finalment d’aproximadament 145pb, DNA que entra a formar part de l’anomenat nucli nucleosòmic, Figura 14.1(A). D’altra banda, l’anàlisi bioquímic, tant del nucleosoma com del cromatosoma, indica que estan constituïts per una molècula d’histona H1 i un octàmer on es troben dues molècules de les histones H2A, H2B, H3 i H4. El nucli nucleosòmic el formen aquest octàmer d’histones junt als 145pb als que s’associen, estant absent per tant la histona H1. En concret aquest nucli està constituït per un tetràmer H3-H4 flanquejat per dos dímers de proteïnes H2A-H2B. Aquestes proteïnes històniques projecten cap a l’exterior de l’octàmer els seus extrems aminoterminals, els quals presenten, en condicions fisiològiques, càrrega positiva degut a la presència dels aminoàcids bàsics. Aquestes càrregues positives són les que possibiliten la interacció entre el nucli proteic i el filament de DNA, el qual es disposa al seu voltant donant quasi dues voltes a esquerres i originant l’aparició de superenrotllament de tipus negatiu (recordem que la doble hèlix s’enrotlla cap a la dreta el que es considera enrotllament positiu). La histona H1 sembla jugar un important paper en facilitar l’ancoratge del DNA a la partícula nucli així com per ajudar la cromatina a enrotllar-se en fibres de 30 nanòmetres, Figura 14.1(B). La diferència en grandària entre el DNA descrit com constituent del nucleosoma i del cromatosoma, posa de relleu l’existència d’un DNA d’unió entre les diferents partícules nucleosòmiques. Segons siga l’origen de la cromatina la longitud d’aquest ADN d’unió pot variar entre 0 i 80pb. FIGURA 14.1. (A)Estructura arrosariada de la cromatina i efecte de la digestió enzimàtica de la mateixa. (B) Estructura del nucleosoma. 6 L’anàlisi de la cromatina d’organismes diversos ha posat de manifest l’existència d’una gran variabilitat en la quantitat total de DNA per nucleosoma – des de 154 pb en Aspergillus fins 214 pb en l’eriçó de mar- inclús es pot donar variació entre cèl·lules i teixits d’un mateix organisme. Aquesta variabilitat s’atribueix més a la regió del DNA lligador que a la del nucli del nucleosoma. En resum (Wolffe, 1994) l’organització del nucleosoma és tripartita: el tetràmer (H3-H4)2 organitza els 120 parells de bases centrals del DNA i una vegada que el DNA s’ha enrotllat sobre el tetràmer s’agrupen a cada extrem els dímers H2A-H2B, estenent-se a 160 pb el contacte histona-DNA. En darrer terme s’afegeix la histona H1 que interacciona amb el lligador en la regió que dista entre 20 i 30 parells del DNA del nucli. nucleosoma Del nucleosoma al cromosoma metafàsic. Però l’estructura del nucleosoma no es rígida sinó que permet adaptar-se a estructures d’ordre superior. A concentracions salines moderades, semblants a les fisiològiques (100mM de NaCl) la cromatina no es presenta en aquesta disposició en filaments de 10nm sinó com fibres de 25-30nm. Aquesta estructura es similar a la que s’observa en nuclis preparats de maneres diferents, per això es parla indistintament de fibra de cromatina i fibra de 30nm. S’accepta que la major part de la cromatina dels nuclis de cèl·lules d’eucariotes superiors se troba en aquesta configuració. Sembla que la histona H1 juga un important paper en aquest canvi estructural des del filament a la fibra la qual es forma en disposar-se el filament de 10nm en una estructura cilíndrica semblant a un moll, amb uns sis nucleosomes per volta (entre cinc i set), i en la qual algunes de les histones H1 queden disposades a l’interior de la fibra. Aquesta fibra de 30nm rep el nom de solenoide i constitueix la unitat estructural fonamental de la cromatina al nucli en interfase. Amb la seva formació la longitud del DNA disminueix per un factor de cinc respecte al filament de 10nm i per tant s’assoleix una raó d’empaquetament de 50:1 respecte de la doble hèlix nua. 7 Si considerem que diverses aproximacions proposen una raó d’empaquetament total del DNA en el cromosoma metafàsic propera al 10.000:1, ens adonem de seguida que aquesta estructura encara estem molt lluny d’aconseguir-la. I el pitjor és que segons augmenten els nivells de compactació de la cromatina, més indirecta i fragmentada és la informació que sobre ells tenim. Hi ha molta discussió sobre quina és realment l’estructura de les fibres plegades de cromatina. Així per exemple en el model de solenoide, per tal de construir l’hèlix senzilla de nucleosomes, cal que el DNA d’unió entre nucleosomes consecutius es plegue. En canvi altres autors han trobat que el diàmetre de les fibres depèn de la longitud del DNA d’unió i han proposat que això es perquè els nucleosomes consecutius es posen en posicions oposades respecte a l’eix de la fibra. El solenoide experimenta plegaments posteriors donant lloc a la fibra de 400-500 nm dels cromosomes metafàsics que constitueixen l’últim nivell d’enrotllament. Les imatges de cromosomes metafàsics de mamífers obtingudes per microscòpia electrònica semblen estar d’acord amb un model de compactació de la fibra de cromatina – mitjançant varios tipus de plegament- per a reduir la longitud de la cromatina fins la longitud del cromosoma metafàsic. Part d’aquesta compactació s’explica per la formació del solenoide que dona una taxa de compactació de 40. Per als següents nivells d’empaquetament s’han proposat varios models que poden ser agrupats en dos: enrotllament helicoidal de la fibra de 30nm i formació de llaçades tansversals i longitudinals. No existeixen raons per a eliminar un model i acceptar l’altre ja que, depenent dels observadors, tots dos tipus estan recolzats per observacions directes de preparacions de cromosomes metafàsics. Laemmli i col. (1977) proposaren que la fibra de 30nm –el solenoide- s’estructura en una sèrie de llaços cadascú de 0.5m de longitud units a una estructura fibrilar que rep el nom de matriu nuclear arribant-se a la denominada fibra de llaços radials d’aproximadament un micròmetre de diàmetre, la qual és conseqüència de la disposició espacial que presenten estos llaços de 0.5m, Figura 14.2. 10 Centròmers, telòmers i organitzadors nucleolars. No es pot parlar de l'estructura del cromosoma eucariota sense analitzar, encara que siga breument, dues regions del mateix amb funcions molt específiques com són el centròmer i les regions telomèriques. El centròmer és directament responsable del comportament del cromosoma en mitosi i meiosi en ser el lloc on s'uneixen les fibres del fus i en conseqüència possibilitar el posterior arrossegament de les cromàtides cap als pols corresponents. Es per tant responsable de la correcta segregació de les mateixes. Al microscopi, es presenta com una regió constreta, fixa i característica per cada cromosoma, i defineix l'existència de dos braços cromosòmics permetent així el càlcul de la proporció entre la longitud dels mateixos. La posició relativa del centròmer dóna peu a que els cromosomes puguen ser classificats com telocèntrics, quan el centròmer apareix a l'extrem, acrocèntrics, si es troba més o menys desplaçat del centre del cromosoma però no a l'extrem, submetacèntrics si es presenta en una localització pròxima al centre, i metacèntrics quan es situa en el centre presentant els dos braços amb la mateixa llargaria. Quan un fragment cromosòmic perd el centròmer rep el nom d'acèntric o acentromèric, perd la capacitat d'unir-se a les fibres de l'ús, i en conseqüència, migra per la cèl·lula a l'atzar, no segrega correctament a una de les cèl·lules filles i acaba sent degradat. El DNA centromèric pot considerar-se, junt al telomèric, com els constituents fonamentals del DNA estructural d'eucariotes i junt al minisatèl·lit tots tres formen el nomenat DNA de seqüència simple en estar formats per repeticions de seqüències curtes. Dintre de la regió centromèrica hi ha el cinetòcor, estructura proteica a la que s'uneixen físicament les fibres del fus. Es suposa que hi ha una seqüència específica que determina d'alguna manera el lloc exacte on ha de formar-se el cinetòcor. En la majoria d'eucariotes a aquesta regió s'uneixen varies fibres però al llevat, organisme on millor s'ha caracteritzat la seva estructura i que ens servirà d'exemple, sols s'uneix una. Els centròmers del llevat es distingueixen dels de la resta d'eucariotes en dos aspectes més, no hi ha una constricció centromèrica visible en els cromosomes ni sembla que el DNA de llevat tinga heterocromatina centromèrica. És per tant, molt més simple que el d'eucariotes superiors. Han estat analitzades més de 10 seqüències de DNA de diferents centròmers de llevat, regions CEN, podent-se observar un nucli comú de la regió constituït per tres dominis. L'anomenat element I, que és la seqüència conservada PuTCACPuTG; l'element II, regió de 78 a 86 pb amb més del 90% del tipus AT; i la regió III, una seqüència conservada de 26 pb també rica en parells AT. Cal dir que aquestes seqüències conservades entre els centròmers del llevat varien en gran mesura de les trobades en altres organismes. Aquestos tres dominis es troben 11 en una regió de 220-250pb protegida front a la digestió per part de nucleases i flanquejada per llocs molt sensitius a l'acció de les mateixes, Figura 14.4. La cromatina centromèrica està formada per DNA, histones i altres proteïnes específiques del centròmer. La molècula de DNA de cada cromosoma és contínua d'un extrem a l'altre del cromosoma, però l'organització molecular de la regió centromèrica és diferent de la de la resta de la cromatina. A més, els centròmers contenen seqüències de DNA que no es troben en altres zones del cromosoma. TAULA 14.2 Seqüències nucleotídiques de quatre centròmers del llevat. Element I Element II Element III CEN 3 CEN11 CEN 4 CEN 6 ATAAGTCACATGAT ATAAGTCACATGAT AAAGGTCACATGCT TTTCATCACGTGCT 88 pb (93% A+T) 89 pb (94% A+T) 82 pb (93% A+T) 89 pb (94% A+T) TGATTTCCGAA TGATTTCCGAA TGATTACCGAA TGTTTTCCGAA FIGURA 14.4. Esquema d'una regió centromèrica del llevat. Per últim digam que les seqüències repetitives de DNA satèl·lit presents als centròmers, poden ser de diferents tipus dintre de la mateixa espècie. Per exemple en l'home han estat descrites més de deu diferents, repeticions de les quals constitueixen fins al 10% del seu genoma. Com ja hem dit, el llevat és l'excepció en presentar una seqüència única no repetida d'uns 200pb. Als mamífers s'han aïllat proteïnes, almenys cinc, les quals apareixen unides al centròmer i són necessàries per a la funció del cinetòcor. 12 Respecte a les regions telomèriques, com ja hem dit són regions de DNA situades al final del cromosoma lineal i necessàries tant per a la correcta replicació del mateix, ja que permeten solventar el problema de la replicació de l'extrem d'un DNA lineal, com per a la seva estabilitat, ja que disminueixen la tendència a adherir-se amb altres extrems cromosòmics que presenten els cromosomes trencats. Els telòmers també protegeixen als extrems cromosòmics de la degradació per l'acció de les nucleases. General, però no necessàriament, són regions heterocromàtiques que solen disposar- se situades sota la membrana nuclear, de vegades associades amb aquesta. Estan formades per desenes de milers de repeticions en tàndem d'una seqüència molt curta (entre 6 i 10 pb segons espècies). La primera en ser determinada va estar la de Tetrahymena i més recentment ho ha estat la humana, que sembla comú a tots els vertebrats (5'TTAGGG3'). (Als eucariotes inferiors el DNA telomèric està constituït per varies seqüències de menys de sis parells de bases, totes riques en guanina però no idèntiques, Taula 14.3. En tots els casos el nombre de repeticions és variable i generalment augmenta en condicions de proliferació cel·lular, amb l'edat o el tipus cel·lular. Possiblement la longitud dels telòmers siga un compromís entre processos de síntesi que els allarguen i altres de tipus exonucleàsics que els acurten. El DNA telomèric es troba formant complexes amb proteïnes específiques. L'aïllament del DNA telomèric d'eucariotes inferiors com a ciliats, flagel·lats, llevats, etc. va demostrar que cada telòmer consta de diversos centenars de parells de bases originats per la repetició d'una seqüència de tipus 5’ (T\A)m Gn 3’ \ 3’(A\T)m Cn 5’ on m = 1 – 4 i n = 1 – 8, amb la particularitat que hi ha un extrem 3’ monocatenari de 12 – 16 bases, ric en G perquè hi ha diverses còpies de la seqüència 5’ (T\A)m Gn 3’ sense les bases complementàries corresponents (Blackburn i Szostak, 1984). Posteriorment, es va comprovar que el dit model s'ajustava també als telòmers d'eucariotes superiors, tant animals com vegetals. Per exemple en l'espècie humana es va demostrar que la seqüència que es repetix en la cadena rica en G del DNA telomèric és 5’ TTAGGG 3’. La longitud total del DNA telomèric en els cromosomes de vertebrats és major que la dels eucariotes inferiors (milers de parells de bases enfront de diversos centenars), però a nivell de seqüència la similitud entre el DNA telomèric d'espècies molt diverses és molt gran, la qual cosa és lògic donada la igualtat en la funció que realitzen, Taula 14.3. 15 Segons qual siga la posició del centròmer els cromosomes es classifiquen en: metacèntrics: el centròmer divideix al cromosoma en dos braços iguals submetacèntrics: hi ha diferència de longitud entre els dos braços del cromosoma però esta no és molt gran subtelocèntrics: anomenats també acrocèntrics, un dels braços és molt més curt que l'altre telocèntrics: el centròmer se situa en un extrem del cromosoma de manera que aquest té un sol braç. Pot ocórrer que un cromosoma considerat telocèntric a nivell citològic presente DNA telomèric unit a la zona pericentromèrica, un exemple d'això són els cromosomes telocèntrics de ratolí domèstic (Mus musculus) en els que hi ha unes 150kb de DNA telomèric, que constitueixen la terminació física del cromosoma, unides al centròmer. La terminologia abans mencionada és la més utilitzada encara que no siga totalment precisa ja que la posició del centròmer varia de forma gradual. A partir de la longitud del cromosoma i de la posició del centròmer poden calcular-se dos paràmetres per a caracteritzar als cromosomes de forma més precisa: índex centromèric: relació entre la longitud del braç curt del cromosoma i la longitud total del mateix. Índex centromèric = (longitud braç curt / longitud total) x 100 (Taula 14.4) índex de braços: relació entre les longituds dels braços curt i llarg del cromosoma. (0 = telocèntric, 1 = metacèntric). Índex de braços = (long. braç curt / long. braç llarg) x 100 16 Un tercer índex que permet una mesura quantitativa dels cromosomes és la longitud relativa o relació entre la longitud d'un cromosoma concret i la longitud del complement haploide. Taula 14.4. Classificació dels cromosomes per la posició del centròmer. Posició del centròmer Terminologia alternativa Símbol cromosòmic Rang d’índex centromèric Aproximadament en mig Metacèntric m 46 a 50 Submitjana Submetacèntric sm 26 a 45 Subterminal Acrocèntric/ Subtelocèntric st 15 a 25 Terminal Telocèntric t < 15 En la metafase els cromosomes apareixen formats per dues cromàtides, de manera que la seua forma canvia. Un cromosoma metacèntric o submetacèntric tindrà forma de X, amb les cromàtides unides pels seus centròmers, mentre que un telocèntric tindrà forma de V invertida. Pel que fa la GRANDÀRIA dels cromosomes, és difícil determinar-la ja que sofreix moltes modificacions al llarg del cicle cel·lular. Normalment, al fer referència al tamany es considera la metafase mitòtica, però sempre cal tenir en compte que la tècnica utilitzada per a preparar els cromosomes pot influir molt en la longitud del cromosoma. El tamany dels cromosomes varia dins d'uns límits molt amplis. Figura 14.5. Conjunts cromosòmics de Triturus cristatus (tritó crestat), l’home (al centre) i la Drosophila melanogaster (a la dreta) tots tres mostrats a la mateixa escala. 17 Intentant generalitzar podríem classificar els cromosomes en llargs (>10m) i curts (<10m). Cromosomes llargs tenen les monocotiledònies (Trillium, 30m; Lilium i Allium de 10m a 20m) i els Ortòpters i Amfibis entre els animals. Cromosomes curts tenen els fongs i les dicotiledònies (amb excepcions com les Ranunculàcies) i la majoria d'animals on, per exemple, els de Drosophila mesuren 3,5μm i els d'humans 5μm com a terme mitjà encara que també hi ha variabilitat entre els cromosomes d'un organisme. També el NOMBRE de cromosomes presents en les cèl·lules és molt variable. La majoria de les espècies es caracteritzen perquè en les cèl·lules somàtiques presenten dos jocs idèntics de cromosomes, de manera que el nombre de cromosomes es representa per 2n i es denomina nombre diploide (n parelles de cromosomes homòlegs). A vegades es fa referència tan sols al valor n o nombre haploide, que és el que està present en les cèl·lules germinals. Com a regla general s'admet la constància en la forma, tamany i nombre dels cromosomes en totes les cèl·lules somàtiques d'un individu i en tots els individus de cada espècie, encara que hi ha nombroses excepcions (variacions cromosòmiques estructurals i numèriques, mecanismes citogenètics de diferenciació, etc.). Un cas interessant de variació numèrica entre cèl·lules o teixits d'un organisme, entre individus d'una població i entre poblacions d'una espècie el constitueixen els anomenats cromosomes accessoris o cromosomes B que s'han trobat tant en el regne animal com en el vegetal. En relació amb el nombre cromosòmic de les espècies, es troba un enorme rang de variació. Així en espècies animals s'han trobat nombres tan baixos com a 2n = 2 en alguns nemàtodes, àcars i insectes; en l'extrem oposat el lepidòpter Lysandra té n = 217; i entre els mamífers els nombres cromosòmics més alts s'han descrit entre els rosegadores d'Amèrica del Sud com Tympanatomys (2n = 102) o Ichthyomys (2n = 92). En vegetals també es troben nombres cromosòmics baixos (la composta Brachycoma n = 2) i molt alts com en les falagueres del gènere Ophioglossum que tenen nombres haploides de 500, 600 i inclús superiors a 700. És important tenir en compte que ni hi ha una correlació directa entre el nombre de cromosomes i el contingut en DNA, ni el nombre cromosòmic té un significat evolutiu directe. 20 Tinció de cromosomes. Fins a 1968 les tècniques citològiques no permetien detectar més que les constriccions primàries (centròmer) i a vegades les secundàries, dels cromosomes metafàsics de la mitosi, per la qual cosa resultava difícil diferenciar entre si els cromosomes amb longituds relatives i índexs centromèrics semblants (figures anteriors). En 1968 Caspersson i col. van realitzar per primera vegada el bandeig transversal dels cromosomes per mitjà de fluorescència utilitzant com fluorocroms la mostassa de quinacrina i els seus derivats. A partir de llavors s'han desenrotllat distintes tècniques de bandeig que donen lloc a distints patrons de bandeig. Per patró de bandeig cromosòmic s'entén el conjunt de bandes transversals, de mida i intensitat de tinció variables, que apareixen sobre cromosomes determinats segons un model de distribució que depèn de la tècnica de tinció utilitzada. Com a norma general, el patró de bandejat és el mateix per a qualsevol teixit dins d'una mateixa espècie i no canvies durant el desenvolupament de l'organisme. Les tècniques experimentals per realitzar el bandejat cromosomic són molt nombroses, tenint totes elles en comú la fixació amb fluids que contenen àcid acètic. Un resum de les mateixes apareix a la taula 14.7. Podeu trobar més informació en l'ampliació del tema: tècniques de bandeig cromosòmic. Taula 14.7. Diferents tipus de bandeig cromosòmic. Tipus de bandeig colorant utilitzat característiques tipus de DNA detectat bandeig Q fluorocroms detecció de zones fluorescents, sobretot del cromosoma Y regions riques en A-T bandeig G tractament suau amb tripsina (optatiu) seguit de tinció amb Giemsa bandes fluctuants, augmenta la senyal segons avança la mitosi. No funciona en vegetals regions riques en G-C bandeig C solució alcalina calenta seguida de tinció amb Giemsa regions d’heterocromatina constitutiva. Sobretot centròmers regions riques en A-T bandeig R covar en tampó calent i tinció amb Giemsa patró revers al de les bandes Q regions riques en G-C bandeig de replicació addició de 5,bromodesoxiuridina i tinció amb Giemsa Es diferencies zones de replicació primerenca o tardana --------- 21 La hibridació “in situ” com a tècnica d'identificació cromosòmica. Inicialment, les tècniques d'hibridació “in situ” (ISH) d'àcids nucleics es van utilitzar per a localitzar sobre els cromosomes la informació genètica (gen o fragment de gen) continguda en l'àcid nucleic (DNA o RNA) que s'utilitzava com a sonda marcada radioactivament. Esta tècnica es pot utilitzar de forma recíproca, és a dir, utilitzant una sonda de localització coneguda es pot identificar el cromosoma o regió cromosòmica corresponent en una “placa metafàsica”. Durant les dècades dels 70 i els 80 es va utilitzar la ISH isotòpica; posteriorment el marcatge radioactiu de la sonda va ser substituït per un marcatge no radioactiu com la biotina o la digoxigenina i més modernament es va arribar a la hibridació “in situ” amb fluorescència (FISH). Aquesta tècnica permet, amb la utilització de dues o més sondes marcades amb sengles fluorocroms, Figura 14.7, que emeten fluorescència de colors diferents, analitzar anomalies cromosòmiques (translocacions, inversions,...) tant en cèl·lules metafàsiques com en interfase. La tècnica de FISH s'utilitza de manera rutinària en l'anàlisi prenatal d'anomalies cromosòmiques. No necessita del cultiu de cèl·lules sinó que es realitza directament amb les cèl·lules contingudes en el líquid amniòtic obtingut mitjançant amniocentesi. Són suficients 2ml del mateix per a aplicar la tècnica mentre que la resta (fins als 15-20ml extrets) pot utilitzar-se per a l'anàlisi citogenètica clàssica del cariotip (elaboració de l'idiograma i anàlisi morfològica dels cromosomes). Figura 14.7. Marcatge amb distints fluorocroms de sondes específiques de determinats loci de distintes combinacions de cromosomes, per exemple X, Y i 18 o 13 i 21. 22 Les sondes fluorescents es fixaran en el nucli de les cèl·lules a les regions concretes dels cromosomes corresponents (recordeu que en el nucli es troben tots els cromosomes entremesclats). L'emissió fluorescent és de colors distints segons el fluorocrom utilitzat i “marca” el cromosoma amb que hibrida. Observats amb un microscopi de fluorescència els cromosomes apareixen davall la forma de taques de colors. Es pot així comptar el nombre dels mateixos i diagnosticar les trisomies o monosomies en funció de la presència en excés o dèficit dels mateixos, Figura 14.8. Figura 14.8. Cèl·lules amb dotacions normals hibridades amb les combinacions de sondes fluorescents de la figura 14.7. S'observa que es tracta d'un baró normal, sense trisomies per als cromosomes 18, 13 i 21 No totes les anomalies cromosòmiques tenen la mateixa freqüència. De fet, les trisomies per als autosomes 21, 13 i 18 junt amb anomalies en la dotació de cromosomes sexuals (X e Y) representen el 70% del total. Actualment l'anàlisi FISH s'aplica a aquests cromosomes. Ja que amb ella no s'abracen totes les possibles anomalies també és convenient realitzar les anàlisis clàssiques. D'altra banda, quan la sonda s'obté a partir del DNA total d'un cromosoma aïllat per citometria de flux s'obté la denominada pintura cromosòmica o cariotip espectral (anàlisi de translocacions), Figura 14.9. La pintura cromosòmica pot estendre's a tots els cromosomes procedents d'un dels parentals en híbrids interespecífics vegetals i els seus derivats dient-se llavors hibridació “in situ” genómica ja que les sondes utilitzades procedixen del DNA genòmic d’una de les espècies parentals. 25 Les cèl·lules en interfase presenten dues classes diferents d’heterocromatina, cadascuna amb diferents tipus de seqüències, però que no són transcrites; una d’elles és l’heterocromatina constitutiva (Brown, 1966), aquella que sempre és inactiva, de la qual la que es localitza a les regions centromèriques i telomèriques és un exemple, i l’altra és l’heterocromatina facultativa, definida com heterocromatina que pot esdevenir funcional o millor com cromatina que pot esdevenir heterocromàtica i en conseqüència, els gens que inclou perden la seva capacitat funcional. Un exemple d’aquest tipus d’heterocromatina són els corpuscles de Barr presents en les cèl·lules de les femelles de mamífers i que corresponen a cromosomes X inactivats com estratègia per afrontar i resoldre el problema de la descompensació de dosi gènica. Per tant, la condensació del material genètic està associada a la inactivitat; però el contrari no és cert, en un moment determinat sols es transcriuen una minoria dels gens que es troben situats en les regions eucromàtiques. La localització en l’eucromatina és una condició generalment necessària però no suficient per a l’expressió gènica. La conseqüència més comunament reconeguda de la formació d’heterocromatina en una determinada zona és la repressió de la transcripció, tant de la pròpia heterocromatina com en les regions d’eucromatina adjacents al domini heterocromàtic. A la variabilitat de l’expressió gènica en els límits de l’heterocromatina se la denomina “variegació per efecte de posició”. Aquest fenomen de variegació per efecte de posició moltes vegades ve propiciat per l’efecte de translocacions o inversions que situen gens que haurien d’expressar-se fenotípicament en l’individu en regions gèniques properes a heterocromatina veient-se afectat el seu nivell d’expressió. Per exemple, suposem que una translocació situa l’extrem d’un cromosoma X que porta l’al·lel w+ en la regió heterocromàtica d’un autosoma. En les mosques heterozigotes per a la translocació que porten l’al·lel recessiu al seu lloc en el cromosoma X es podrà observar variegació en el color dels ulls. Així, tot i que caldria esperar un fenotip de color d’ulls normal en tractar-se d’heterozigots amb un al·lel dominant, el fet de que aquest no s’expresse en algunes facetes oculars dona com resultat una barreja de facetes roges i blanques. Açò es degut a que en algunes cèl·lules no s’expressa l’al·lel w+ en quedar atrapat i inactiu prop de l’heterocromatina deixant que s’expresse el fenotip de l’al·lel recessiu. Aquest fenomen pot ser empleat en estudis dels efectes reguladors de l’heterocromatina i de la condensació dels cromosomes, Figura 14.11. 26 Figura 14.7. Aspecte d’un ull de Drosophila amb variegació per efecte de posició. Per a més informació: - Cromosomes especials: politènics i plomosos - El genòfor de virus i viroides - Organització del genoma bacterià - Tècniques de bandeig cromosòmic - Inactivació del cromosoma X. - Cromosomes sexuals i la compensació de dosi.