Determinación del perfil lipídico, Apuntes de Bioquímica

¡Descarga Determinación del perfil lipídico y más Apuntes en PDF de Bioquímica solo en Docsity! Metabolismo de los Lípidos 1 Tercera Unidad - DETERMINACION DEL PERFIL LIPIDICO -- INTRODUCCION: La determinación del perfil lipídico incluye la medición sérica de colesterol total, triglicéridos, HDL colesterol y LDL colesterol. Estas pruebas tienen utilidad para el despistaje, diagnóstico y monitoreo de las dislipidemias; las que se definen como alteraciones del perfil lipídico ya sea en aumento o disminución de alguno de sus componentes. La etiología para estas alteraciones puede ser primarias (como la hipercolesterolemia familiar, hiperlipidemia familiar combinada, etc) o secundarias a obesidad, diabetes, etc. La hipercolesterolemia, la hipertrigliceridemia, el aumento de LDL y la disminución de HDL se asocian a mayor riesgo coronario. FINALIDAD: ▪ Realizar la medición sérica de colesterol, triglicéridos, colesterol LDL por el método enzimático y la determinación de HDL, previa precipitación de las otras lipoproteínas. MATERIAL Y EQUIPOS ▪ Material de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimétricas. ▪ Equipo de extracción de muestra: guantes, alcohol, algodón, agujas N° 20, jeringas x 5 cc. ▪ Equipos: centrífuga, micropipetas x 10 ul, baño maría, espectrofotómetro. PROCEDIMIENTO 1: Determinación de Colesterol. 1) Introducción: El colesterol es una molécula lipídica, base de síntesis de los demás esteroides como las hormonas masculinas, femeninas, gluco y mineralocorticoides, así como las sales biliares y la vitamina D, con ellas comparte el núcleo ciclopentano perhidrofenantreno. Forma parte de las biomembranas regulando su fluidez. Tiene origen endógeno por síntesis a nivel hepático, intestino y otros tejidos; y exógeno de la dieta (de origen animal como la yema de huevo, carnes etc.). Se considera importante su participación en la aterogénesis unida a la Lipoproteína de baja densidad o LDL, por ello su determinación aislada o como parte del perfil lipídico es muy importante para evaluar el riesgo coronario. 2) Fundamento de la Técnica: La secuencia de recciones que se emplean en esta determinación es la siguiente: Esteres de Colesterol Colesterol + ácidos grasos; Colesterol + O2 Colesten-3-ona + H2O2 H2O2 + 4-AF + aceptor quinonimina roja 3) Muestra y Reactivos a emplear: ▪ Muestra: suero sanguíneo. ▪ S. Estándar: solución de colesterol = 200 mg/dl (2 g/l). ▪ A. Reactivo A: solución conteniendo colesterol esterasa (CHE), colesterol oxidasa (CHOD), peroxidasa (POD), 4- aminofenazona (4-AF) y buffer Good (conteniendo fenol y colato de sodio). 4) Procedimiento: ▪ Extracción de muestras: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de sangre de la flexura del codo con jeringa hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20, de dos pacientes en ayunas. ▪ Una vez obtenidas las muestras, colocarlas en tubos de ensayo y dejarlas reposar durante 10 minutos. ▪ Terminado el reposo, contrapesar los tubos conteniendo las muestras y centrifugarlos a 3000 RPM durante 10 minutos. ▪ Finalizado el centrifugado separar el suero para trabajar la determinación. ▪ Para la determinación de colesterol total: En 3 tubos de ensayo marcados con B (Blanco), S (estándar) y D (Desconocido), se debe colocar: COMPONENTES TUBOS DE ENSAYO B S D Muestra (suero / ul) -- -- 10 Estándar (ul) -- 10 -- Reactivo A (ml) 1.0 1.0 1.0 Mezclar e incubar por 5 minutos a 37 °C o 20 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). Leer en espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el Blanco. Colesterol esterasa Colesterol oxidasa POD Metabolismo de los Lípidos 2 Tercera Unidad 5) Resultados: ▪ Luego de la incubación de las muestras: ▪ Lecturas de las muestras en el espectrofotómetro: 6) Actividades a desarrollar por el alumno: - Cálculos de resultados: ▪ Cálculo del factor: 𝐅 = 𝟐 𝐠/𝐥 𝐒 ▪ Cálculo de la concentración de Colesterol. (de cada una de las muestras). Colesterol (g/l) = D x F Conversión: Colesterol (g/l) = 0,01 x Colesterol (mg/dl) - Interpretación de los resultados. ▪ Valores Referenciales: [ATP III, NCEP] • Deseable: < 2,0 g/l • Moderadamente alto: 2,00 a 2,39 g/l • Alto: ≥ 2,40 g/l - Explique bioquímicamente lo encontrado. 7) Preguntas de aplicación: a) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica. b) Identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus principales características. c) ¿Cuál es la importancia del colesterol en nuestro organismo? d) ¿Cuál es la enzima clave en la regulación de la síntesis del colesterol? e) ¿Cuál es la base molecular del tratamiento de la hipercolesterolemia? f) Esquematice la estructura del colesterol. g) Elabore un esquema y explique la síntesis de colesterol. B S D Metabolismo de los Lípidos 5 Tercera Unidad ▪ Terminado el reposo, contrapesar los tubos conteniendo las muestras y centrifugarlos a 3000 RPM durante 10 minutos. ▪ Finalizado el centrifugado separar el suero para trabajar la determinación. ▪ Para la determinación se realizará lo siguiente: En un tubo de vidrio colocar: Muestra (suero / ul) 500 Reactivo Precipitante (ul) 50 Homogeneizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos. Dejar 30 a 40 minutos en refrigerador (2-10 °C) o 15 minutos en baño de agua a la misma temperatura. No colocar en el congelador. Centrifugar 15 minutos a 3000 r.p.m. Usar el sobrenadante límpido como muestra. En 3 tubos marcados B, S y D; armar lo siguiente: COMPONENTES TUBOS DE ENSAYO B S D Sobrenadante (ul) -- -- 100 Estándar (ul) -- 20 -- Reactivo de Trabajo (ml) 2.0 2.0 2.0 Mezclar e incubar por 5 minutos a 37°C si se usa el reactivo de trabajo de Colestat enzimático AA/líquida o 15 minutos a 37°C cuando se usa el Colestat enzimático. Retirar del baño y enfriar. Leer a 505 nm en espectrofotómetro, llevando a cero con el blanco. 5) Resultados: ▪ Luego de la incubación de las muestras: ▪ Lecturas de las muestras en el espectrofotómetro: 6) Actividades a desarrollar por el alumno: - Cálculos de resultados: B S D Metabolismo de los Lípidos 6 Tercera Unidad ▪ Cálculo del factor: 𝐅 = 𝟎. 𝟒𝟓𝟕 𝐠/𝐥 𝐒 0.457 resulta de corregir los diferentes volúmenes y se aplica para reactivo de 2 ml y concentración de S de 200 mg/dl ▪ Cálculo de la concentración de HDL-Colesterol. (de cada una de las muestras). HDL-Colesterol (g/l) = D x F Conversión: HDL-Colesterol (g/l) = 0,01 x HDL-Colesterol (mg/dl) - Interpretación de los resultados. ▪ Valores Referenciales: • Normal: 0,40 a 0,6 g/l • Bajo o de Riesgo: < 0,40 g/l • Protector: ≥ 0,60 g/l - Explique bioquímicamente lo encontrado. 7) Preguntas de aplicación: a) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica. b) Identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus principales características. c) ¿Cómo es el metabolismo de las HDL? d) ¿Porqué es importante la determinación de HDL? e) ¿Qué alteraciones pueden reportarse de los valores de HDL colesterol? f) ¿Cuándo se consideran de riesgo los valores de HDL? g) ¿Cómo se mejorarían los niveles de HDL colesterol? PROCEDIMIENTO 4: Determinación de LDL-Colesterol. 1) Introducción: La lipoproteína de baja densidad o LDL se encarga del transporte del colesterol en la sangre. Es la principal lipoproteína aterogénica. Habitualmente se determina por la fórmula de Friedwald empleando la fórmula: 𝐿𝐷𝐿 − 𝐶𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 = 𝐶𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 − 𝑇𝑟𝑖𝑔𝑙𝑖𝑐é𝑟𝑖𝑑𝑜𝑠 − 𝐻𝐷𝐿 5 Si los Tg >=400 mg/dl se determina directamente. 2) Fundamento de la Técnica: Las lipoproteínas de baja densidad (LDL o β­lipoproteínas) se separa del suero precipitándolas selectivamente mediante el agregado de polímeros de alto peso molecular. Luego de centrifugar, en el sobrenadante quedan las demás lipoproteínas (HDL y VLDL); el colesterol ligado a las mismas se determina empleando el sistema enzimático Colesterol oxidasa/ Peroxidasa con colorimetría según Trinder (Fenol/4-AF). Por diferencia entre el colesterol total y el determinado en el sobrenadante, se obtiene el colesterol unido a las LDL. 3) Muestra y Reactivos a emplear: ▪ Muestra: suero sanguíneo. ▪ S. Estándar: solución de colesterol = 200 mg/dl (2 g/l). ▪ A. Reactivo A: (Reactivo precipitante) sulfato de polivinilo disuelto en polietilenglicol al 25 % 4) Procedimiento: ▪ Extracción de muestras: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de sangre de la flexura del codo con jeringa hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20, de dos pacientes en ayunas. ▪ Una vez obtenidas las muestras, colocarlas en tubos de ensayo y dejarlas reposar durante 10 minutos. ▪ Terminado el reposo, contrapesar los tubos conteniendo las muestras y centrifugarlos a 3000 RPM durante 10 minutos. ▪ Finalizado el centrifugado separar el suero para trabajar la determinación. ▪ Para la determinación se realizará lo siguiente: En un tubo de vidrio colocar: Muestra (suero / ul) 200 Reactivo Precipitante (ul) 100 Homogeneizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos. Dejar 15 minutos en baño de agua a 20-25°C Centrifugar 15 minutos a 3000 r.p.m. Separar inmediatamente el sobrenadante. Usar el sobrenadante como muestra para el ensayo colorimétrico. En 3 tubos marcados B, S y D; armar lo siguiente: Metabolismo de los Lípidos 7 Tercera Unidad COMPONENTES TUBOS DE ENSAYO B S D Sobrenadante (ul) -- -- 100 Estándar (ul) -- 20 -- Reactivo de Trabajo (ml) 2.0 2.0 2.0 Mezclar e incubar por 5 minutos a 37°C si se usa el reactivo de trabajo de Colestat enzimático AA/líquida o 15 minutos a 37°C cuando se usa el Colestat enzimático. Retirar del baño y enfriar. Leer a 505 nm en espectrofotómetro, llevando a cero con el blanco. 5) Resultados: ▪ Luego de la incubación de las muestras: ▪ Lecturas de las muestras en el espectrofotómetro: 6) Actividades a desarrollar por el alumno: - Cálculos de resultados: ▪ Cálculo del factor: 𝐅 = 𝟎. 𝟔𝟐𝟒 𝐠/𝐥 𝐒 ▪ Cálculo de la concentración de LDL-Colesterol. (de cada una de las muestras). LDL-Colesterol (g/l) = D x F Conversión: LDL-Colesterol (g/l) = 0,01 x LDL-Colesterol (mg/dl) - Interpretación de los resultados. ▪ Valores Referenciales: • Deseable: < 1,00 g/l • Casi deseable: 1,00 a 1,29 g/l B S D