Informe de Práctica N° 3 “CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS”, Resúmenes de Bioquímica

¡Descarga Informe de Práctica N° 3 “CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS” y más Resúmenes en PDF de Bioquímica solo en Docsity! “FACULTAD DE AGRONOMÍA” ASIGNATURA: Bioquímica TRABAJO: Informe de Práctica N° 3 “CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS” DOCENTE: Ms.C. Erick Suclupe Farro ALUMNOS: Oscar Elvis Díaz Alarcón Walter Hernández Quispe CICLO: 2020 – I CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS I. INTRODUCCIÓN: Las proteínas son macromoléculas complejas que desempeñan múltiples funciones de gran importancia. Son compuestos constituidos por aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Son moléculas de elevado peso molecular. Por su composición se dividen en simples y conjugadas, y se producen por hidrolisis de aminoácidos y otros componentes orgánicos e inorgánicos. Existen miles de proteínas en nuestro organismo que desempeñan funciones específicas, ya sean estructurales, transporte, protección, etc. La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas es una de las pruebas que más frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioquímica. La aparición de métodos calorimétricos ha permitido determinación cuantitativa de las proteínas. Existen diversos métodos que permiten cuantificar la concentración de proteínas presente en muestras biológicas. El método más usual es: Compuestos que tienen dos o más uniones peptídicas (péptidos y proteínas) al reaccionar con el reactivo de Biuret (sulfato de cobre alcalino) se forma un complejo de color púrpura (Método de Biuret). En la siguiente práctica se va a aplicar el Método de Biuret en la albúmina. Es un tipo de proteína simple, compuesta de carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrógeno y un pequeño porcentaje de azufre. Está presente en tejidos animales tales como la clara de huevo, la leche y el músculo, además de encontrarse en el plasma sanguíneo. II. OBJETIVOS: Aplicar el método de Biuret para la determinación cuantitativa de la albúmina. Construir una gráfica de calibración. Analizar y comparar los datos resultantes. III. PROCEDIMIENTO: “Método de Biuret”  Pasos: 1. Se va a analizar en 8 tubos de ensayo que estaban limpios y secos. 2. Con las pipetas adecuadas se adiciona a cada uno de los volúmenes de la disolución patrón de albúmina. Agregue los reactivos en el siguiente Tabla N° 2 .Abs ג 350 0.221 400 0295 450 0.313 540 0.354 575 0.473 625 0.460 675 0.322 725 0.125 Gráfica N° 2 IV. FUNDAMENTOS: El reactivo de Biuret está compuesto por hidróxido de potasio, sulfato cúprico y tartrato de sodio y de potasio. El hidróxido de sodio se utiliza para alcalinizar el medio, ya que esta condición es indispensable para que se dé la reacción. Las sustancias que reaccionan con las proteínas es el sulfato cúprico, mientras que el tartrato de sodio tiene como función no permitir la formación de hidróxido de cobre, el cual tiende a precipitar e interfiere en la reacción. Si en la muestra se encuentran sustancias que posean enlaces peptídicos (polipéptidos o proteínas) la prueba dará positiva. El complejo violeta se puede formar de dos maneras: una es por la pérdida de protones de los grupos amidas que se unen al metal (despronotación), y la otra por la unión de los electrones de oxígeno y nitrógeno que se encuentren libres y se unen con el cobre. Esta reacción puede variar en intensidad y en el color dependiendo del tipo de proteína. La prueba se puede realizar de forma cualitativa o cuantitativa. En la forma cualitativa se reporta como positivo o negativo. Mientras que en la forma cuantitativa se puede medir la concentración por el método espectrofotométrico. La reacción se lee entre 540-560 nm. La intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de enlaces peptídicos de la muestra. V. RESULTADOS: Como se puede ver a medida que aumentan los mg de proteínas aumenta la absorbancia, debido a que los resultados obtenidos se debe a que en el espectrofotómetro simple, leído a 540 nm de ondas un haz de luz reflejada en un espejo atraviesa un tubito con determinada solución para medir las proteínas concentradas y entre menos luz pase más proteínas estarán presentes en la solución pero este debe de estar previamente calibrado por la respectiva muestra blanco. VI. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES: Efectivamente, aplicando el método Biuret se puede determinar la concentración de una proteína. El método de Biuret es el más utilizado para la cuantificación de proteínas, es un método rápido, sencillo y eficiente. Una manera fácil y concisa para conocer la concentración de la proteína es por medio de análisis como éste. En el método de Biuret, con el uso de la espectrofotometría es posible conocer las concentraciones de la muestra problema, esto comparando con la gráfica que se construye a partir de las absorbancias leídas, entonces se reforzó la construcción de curvas de calibración relacionando la absorbancia y la concentración, y a partir de esto se pudo identificar por medio de la interpolación, la concentración de la muestra problema VII. DESARROLLO DE PREGUNTAS: 1. Realice una curva de calibración para los siguientes datos: TUBO AH 200 µg/ mL (µL) Volumen de agua destilada (µL) Concentración AH (µg/mL) 1 0 250 0.0 2 25 225 20 3 50 200 40 4 75 175 60 5 100 150 80 6 125 125 100 7 150 100 120 8 175 75 140 9 200 50 160 10 225 25 180 11 250 0 200 [ ]g/L Abs. 0 0.0720 0.02 0.0819 0.04 0.0759 0.06 0.1123 0.08 0.2097 0.1 0.3374 0.12 0.4433 0.14 0.5512 0.16 0.6875 0.18 0.7701 0.20 0.8949 y = 4.4607x - 0.061 R² = 0.9479 0.0000 0.0800 0.1600 0.2400 0.3200 0.4000 0.4800 0.5600 0.6400 0.7200 0.8000 0.8800 0.9600 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 A B SO R B A N C IA CONCENTRACIÓN G/L Curva de calibración 3.- ENSAYO DE BRADFORD O AZUL COOMASIE » Rango de concentración: 20-2000 ug/ml » Características: Método descrito en 1976 Se caracteriza por ser un método rápido, sencillo y compatible con los agentes reductores utilizados para estabilizar las proteínas en solución. La tinción azul Coomasie cargada negativamente, se une a proteínas con carga positiva. Se une principalmente a residuos de arginina, triptófano, tirosina, histidina y fenilalanina. La tinción en solución es de color rojo y absorbe a 465nm, mientras que al unirse a los aminoácidos básicos de Una proteína se vuelve azul y absorbe a 595nm. La medición de la absorbancia se compara con los valores de una curva estándar para determinar la concentración de proteína de la muestra. » Limitaciones: No es válido para detectar proteínas de <3kDa Es incompatible con detergentes como el SDS o el Triton X-100 4.- ENSAYO DE LOWRY + Rango de concentración: 10-1000 ug/ml + Características: + Uno de los métodos para cuantificar proteínas más utilizado, fue desarrollado en 1951 + Esun ensayo muy sensible y preciso + Al igual que el ensayo BCA, se da una reacción en dos pasos: + Formación de complejos Cu-N (presente en la proteína) + Los complejos de tirosina y triptófano reaccionan con el rectivo Folin-Ciocalteau, dando lugar a un color azul verdoso que absorbe entre 650 y 750nm. + La medición de la absorbancia se compara con los valores de una curva estándar para determinar la concentración de proteína de la muestra. + Limitaciones: + Esincompatible con determinados reactivos químicos de uso común como el Tris, EDTA, DDT, 2-mercaptoetanol, carbohidratos, etc. 5.- ENSAYO CBOCA (3-(4-CARBOXIBENZOIL)QUINOLINA-2-CARBOXIALDEHÍDO) + Rango de concentración: 100 ng - 1500 ug/ml + Características: + Sa trata de un agente fluorogénico de alta sensibilidad que se utiliza para la detección de aminas primarias en las proteínas. + La intensidad de la fluorescencia emitida será directamente proporcional a la concentración de proteína presente en la muestra. + No interacciona con compuestos lipídicos + Limitaciones: e El resultado depende del número de determinados aminoácidos presentes en la proteína.  VIII. REFERENCIAS: https://es.slideshare.net/lesteryahh/bioquimica-lab-2 http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/dilucion/dilucion.htm https://www.abyntek.com/5-metodos-para-cuantificar-proteinas/ Moore, J.; R. Langley. 2008. Biochemistry for dumies. Wiley Publishing, inc. Indianapolis, Indiana. Voet, D.; J.G. Voet. 2004. Biochemistry. 3a ed. Wiley international edition. USA. González-Soto, E.; L. Bucio-Ortiz; P. Damián-Matzumura; F. Díaz de LeónSánchez; E. Cortés-Barberena; L.J. Pérez-Flores. (2009) Manual de bioquímica 1. 3ª ed. México. Nelson, D.L.; M.M. Cox; 2007.Lehninger Principles of Biochemistry. 4a ed.