¡Descarga Niveles de organización biologica y más Diapositivas en PDF de Biología solo en Docsity! APARTADO II ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE LAS FORMAS OXIDADA Y REDUCIDA DEL FMN. LEY DE LAMBERT-BEER: CÁLCULO DEL COEFICIENTE DE EXTINCIÓN MOLAR (J. Peinado, F. Toribio) 3(II). PROTOCOLO A REALIZAR 3(II).1. Espectro de absorción de las formas oxidada y reducida del FMN El FMN en su forma oxidada presenta color amarillo. Cuando se reduce, la forma reducida, FMNH2, no presenta color. La reducción se hará empleando un potente reductor, el ditionito sódico, también llamado hidrosulfito (Na2S2O4). 1. Paso primero: Se necesitan 3 tubos, uno blanco y dos que contienen igual cantidad de FMN que, en uno de ellos, se reduce por adición de ditionito sódico. (volumen en ml) Blanco FMN FMNH2 Agua 5,0 4,4 4,3 FMN 0,25 mM - 0,6 0,6 Ditionito Sódico 0,5 M - - 1 0, El ditionito debe ser preparado en el momento y, tras adicionarlo al tubo con FMN, se deben comenzar las lecturas en el colorímetro inmediatamente, debido a la tendencia a oxidarse del FMNH2 y que se observa por la aparición de nuevo del color amarillo. 2. Paso segundo: Con el blanco se ajusta a cero el colorímetro. Tras sacar el tubo blanco, se lee la absorbancia de los otros dos tubos a distintas longitudes de onda, desde 380 a 500 nm. 3(II).2. Ley de Lambert-Beer. Cálculo del coeficiente de extinción molar La absorbancia medida en el colorímetro varía linealmente cuando se emplean concentraciones diluidas del compuesto. 1. Paso primero: Se prepararán los siguientes tubos de ensayo, cuya composición y concentración se indican a continuación. El tubo 6 se suministrará ya preparado para que los alumnos determinen la concentración de FMN que contiene. Blanco Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Agua (ml) 5,0 4,9 4,8 4,6 4,4 4,2 FMN 0,25 mM (ml) 0,0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 X 2. Paso segundo: Se selecciona 450 nm, ya que a esta longitud de onda está el máximo de absorción del FMN; se ajusta el cero de absorbancia con el 1 blanco y se mide la absorbancia de los tubos, empezando por el de menor concentración. 4(II). RESULTADOS Y DISCUSION 4(II).1. Espectro de absorción de las formas oxidada y reducida del FMN 1. Paso primero: Los valores de absorbancia obtenidos a distintas longitudes de onda se muestran en la siguiente tabla. Longitud de onda (nm) 380 400 420 440 450 460 480 500 FMN 0,80 0,40 0,20 0,32 0,44 0,38 0,23 0,10 FMNH2 0,70 0,35 0,10 0,04 0,01 0,005 0,00 0,00 2. Paso segundo: La representación de los espectros del FMN oxidado y reducido muestra que la máxima diferencia se encuentra a 450 nm y ésta será la longitud de onda que se empleará para el apartado 3(II).2, acerca de la comprobación de la ley de Lambert-Beer. Espectro de las formas oxidada y reducida de FMN 0 0,2 0,4 0,6 0,8 380 400 420 440 460 480 500 longitud de onda (nm) A bs or ba nc ia FMN FMNH2 4(II).2. Ley de Lambert-Beer. Cálculo del coeficiente de extinción molar 1. Paso primero: La ley de Lambert-Beer (A = ε·c·l) indica que la absorción de luz a una determinada longitud de onda es directamente proporcional a la concentración de una disolución de un compuesto. La recta de calibrado para la determinación gráfica de ε se obtiene representando en una gráfica los valores de absorbancia obtenidos en ordenadas frente a los correspondientes de concentración (abcisas). Blanco tubo 1 tubo 2 Tubo 3 tubo 4 tubo 5 tubo 6 Conc. Final (mM) 0 0,005 0,01 0,02 0,03 0,04 Absorbancia a 450 nm 0 0,056 0,12 0,24 0,33 0,45 ? 2
