volumetría de precipitación, Exámenes de Bioquímica

¡Descarga volumetría de precipitación y más Exámenes en PDF de Bioquímica solo en Docsity! 1 TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA PARA LA OBSERVACIÓN DE BACTERIAS I. INTRODUCCIÓN Existen una serie de procedimientos básicos en bacteriología médica, incluyendo preparación de frotis, tinción de Gram y rayado de placas para cultivo y aislamiento que deben ser técnicamente dominados. Estos procedimientos son fundamentales para el estudio de los diferentes grupos bacterianos así como para el aislamiento y la identificación de bacterias de importancia médica a partir de diferentes tipos de muestras clínicas. Rayado de placas La técnica del rayado de placas (siembra en estrías) consiste en la distribución, utilizando el asa bacteriológica, de un inóculo de bacterias sobre una superficie de agar para obtener colonias separadas. En esta es importante que se siga cuidadosamente la técnica aséptica y observar que las placas a utilizar no contengan ninguna colonia contaminante, burbujas, grumos o agua de condensación. La calidad del rayado depende directamente de la cantidad de bacterias en la muestra y en el inóculo que se siembra según la cantidad de bacterias de la que se parte. Se debe procurar la utilización al máximo de la superficie del agar y realizar los trazos lo más seguido posible pero sin que se traslapen.  Mentalmente se divide la placa en tres secciones como se muestra en la figura 1. En la zona 1 se coloca la muestra con un hisopo o con el asa bacteriológica y se distribuye homogéneamente el inóculo en toda la zona 1. Se esteriliza el asa.  Se distribuye una pequeña porción del material de la zona 1 hacia la zona 2 de la placa ingresando unas 3 ó 4 veces con el asa bacteriológica y se repite el procedimiento para distribuir el material de la zona 2 hacia la zona 3 tratando de abarcar la mayor parte de la superficie disponible. Figura 1: Técnica de rayado de placa Preparación de Frotis Bacteriano La preparación de un frotis bacteriano es el primer paso para lograr la visualización morfológica clara y definida al microscopio de muestras de origen bacteriano. El procedimiento es sencillo, pero riguroso debido a que requiere de mucha concentración en cada uno de sus pasos. Si usted es cuidadoso y consiente de cada uno de ellos obtendrá resultados LABORATORIO VIRTUAL No.1 FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA 2 satisfactorios que facilitarán y ofrecerán más información de la muestra analizada. Recuerde que la preparación de un frotis es el paso previo a cualquier técnica de tinción. Un buen frotis debe tener una capa muy delgada de muestra, es decir, no muy denso. Los frotis gruesos o densos son aquellos que se observan como manchas blancas sobre el portaobjetos y ocurren por añadir exceso de muestra y el inconveniente de los mismos es que su densidad impide el paso de la luz lo cual afecta su observación al microscopio. Un buen frotis es aquel que una vez se ha secado aparece como una película apenas opaca sobre la superficie del portaobjetos. Los frotis bacterianos pueden prepararse ya bien sea de muestras crecidas en medio líquido (caldo) o creciendo sobre medio sólido (agar). Tinción de Gram La tinción de Gram es una técnica de coloración de contraste o diferencial, considerada por los microbiólogos como la técnica de tinción de mayor ayuda en la identificación bacteriana. Fue descubierta accidentalmente por Christian Gram en 1884 mientras trabajaba buscando el origen de las enfermedades respiratorias en un hospital de Berlín. Se utiliza en microbiología para la observación de bacterias, las cuales, con base en la reacción que tengan las paredes de los microorganismos a los colorantes usados con esta técnica, se les califica en grampositivos y gramnegativos; considerándose bacterias Gram positivas a las bacterias que se aprecian en color violeta y en color rosa bacterias a las Gram negativas, otra ventaja es que se puede efectuar una percepción primordial a las diferencias entre bacterias, por su morfología (cocos, bacilos y espirilos). La tinción de Gram es una tinción diferencial que emplea un colorante primario y otro de contraste, un mordiente y un decolorizante. El colorante primario es el violeta cristal y su función es impartir el color a todas las células, el mordiente el yodo de Gram sustancia que combinada con el colorante primario forma un complejo insoluble coloreado. El decolorizante, alcohol-acetona o etanol al 95% (sustituto del primero) puede o no remover el complejo cristal violeta-yodo de todas las células o sólo de ciertas células o estructuras y finalmente el colorante de contraste, la safranina que imparte un color rojo a la célula decolorada. Basándose en esta tinción las células bacterianas se pueden dividir en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas. Las bacterias Gram positivas retienen el color púrpura del violeta cristal durante la coloración con el agente respectivo, en cambio las bacterias Gram negativas fueron decoloradas perdiendo el color púrpura del violeta cristal y aparecen de color rojo al final pues adquieren la coloración del colorante de contraste, la safranina. A pesar de que la tinción de Gram parece una técnica sencilla y rápida requiere de práctica para su dominio, su éxito requiere del control de algunos factores como una preparación de un frotis delgado y especial atención durante la decoloración pues es un paso crítico y podría falsear el resultado. La reacción de Gram está basada en las diferencias en composición química de las paredes celulares bacterianas. Por ejemplo, las paredes celulares de una bacteria Gram positiva presentan muchas capas de peptidoglucano formando una estructura gruesa y rígida y adicionalmente contiene ácido teicoico. Las bacterias Gram negativas presentan una pared celular más compleja que las Gram positivas, contiene una a varias capas delgadas (5-10% del peso) de peptidoglucano, además contiene, lipoproteínas, lipopolisacáridos y fosfolípidos, siendo estos elementos los que permiten la reactividad de la tinción de Gram. Por el método de coloración de Gram, tanto las bacterias patógenas oportunistas y las que hacen parte de la flora normal pueden teñirse y observarse, es importante tener en cuenta el sitio anatómico de donde provienen las muestras clínicas y su adecuada recolección para que la tinción de Gram, constituya una herramienta de utilidad diagnóstica en las infecciones bacterianas. 5 los cuales son útiles para la identificación de virus, bacterias, parásitos y hongos. II PARTE: TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA PARA LA OBSERVACIÓN DE BACTERIAS 1. Siembra y Cultivo de Bacterias Se ha de realizar una siembra de bacterias Gram Negativas utilizando agar MacConkey. El número de platos Petri a utilizar para la siembra es de 25 platos. A cada plato se le ha de agregar 20 ml de medio de cultivo. ¿Cuántos mililitros (ml) del medio de cultivo se requiere preparar? Haga los cálculos necesarios para preparar el medio de cultivo según la cantidad que se requiere (gramos del medio y cantidad de agua). Luego de hecho los cálculos incluya el método de preparación del medio de cultivo (paso a paso). Considere según ficha técnica: suspender 50 g de polvo (medio) en 1 litro de agua purificada. Responda: C ¿Qué es un medio de cultivo y cuáles son los constituyentes habituales de los mismos? C ¿Qué cuidados deben observarse en la preparación de los medios de cultivo? C ¿Qué importancia tiene la asepsia en los procedimientos de cultivo de bacteria? C ¿Exponga las formas de siembra de bacterias en medio de cultivo? C ¿Exponga las condiciones para una correcta siembra? C ¿Cuáles es el método de esterilización por excelencia utilizado en la esterilización de asas de inoculación o bacteriológica; hisopos, medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos, que se desechan? 2. Preparación de un Frotis Bacteriano (de un medio sólido) Responda: Ordene las siguientes etapas en la preparación de un frotis bacteriano. (Enumere de 10 a 14, en orden secuencial de las etapas). ____12___Distribuya y esparza la muestra con movimientos circulares. ____14___Fíjelo con calor ___11____Tome una muestra, de la siembra en agar, con un leve toque y deposítela sobre unas gotas de agua en el portaobjetos. ____13___Déjelo secar al aire ___10____Coloque 1-2 gotas de agua con el asa bacteriológica sobre un portaobjetos. 3.Tinción de Gram Responda: Escriba en orden los colorantes y/o reactivos a utilizar en la tinción de Gram, indique los tiempos de exposición y la función de cada cual en la tinción. a.___________________________ tiempo: ___________________________ función:___________________________ b.___________________________ tiempo: ___________________________ función:___________________________ c.___________________________ tiempo: ___________________________ función:___________________________ d.___________________________ tiempo: ___________________________ función:___________________________ ¿Qué color presentan las bacterias Gram Positivas y Gram Negativas una vez realizada la tinción de Gram? ¿Cuál es el procedimiento a seguir en la tinción de Gram? ¿Qué componente estructural de la célula bacteriana juega un papel importante en la tinción de Gram? 6 ¿Escriba el nombre de dos bacterias Gram Positivas y dos Gram Negativas de importancia médica?