7. REGOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA, Appunti di Biologia Molecolare

Scarica 7. REGOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA e più Appunti in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI I batteri si sono specializzati in modo di velocizzare il processo di espressione genica L’espressione genica (trascrizione + traduzione) è un processo molto dispendiosi dal punto di vista energetico, quindi vengono espressi solo i geni che sono necessari La regolazione dell’espressione genica è essenziale per la vita della cellula e per la sua “competitività” - per una risposta efficiente (che richiede meno energia) il gene è spesso regolato a livello della trascrizione, i batteri utilizzano maggiormente questa strategia - per una risposta rapida è necessario, una proteina precursore che è prodotta in anticipo e poi rapidamente si converte in proteina attiva in condizioni favorevoli La regolazione dell’espressione genica nei procarioti segue il modello dell’operon Il genoma di E.coli contiene circa 4000 geni che si suddividono in geni costitutivamente attivi (codificano per proteine costitutive) e geni regolati ON/OFF (codificano per proteine adattative) , tutti i geni vengono funzionalmente correlati sono raggruppati insieme e regolati in maniera coordinata, tale unità trascrizionale integrata è definita “operon” Le proteine costitutive sono sempre necessarie ma sono espresse in maniera differente a seconda della dell’affinità sequenze promotrici con l’RNA polimerasi quindi si distinguono promotori più forti e promotori più deboli L’operone è costituito da: - Geni strutturali: codificano per le proteine la cui espressione è regolata in maniera coordinata - Promotore e operatore: elementi di regolazione che agiscono “in cis” (sequenze di acidi nucleici di regolazione) - Repressore: elemento di regolazione diffusibile che agisce “in trans” (fattori che si legano alle sequenze cis) Il promotore è una sequenza che richiama l’RNA polimerasi, inizia la trascrizione dal quale si ottiene un mRNA policistronico che viene tradotto in proteine dal ribosoma L’operatore è una sequenza a cui si può legare un repressore che è un agente proteico che quando si lega nel sito di legame reprime l’attività dell’RNA polimerasi, ma ci possono essere anche attivatori che favoriscono la trascrizione Gli Operon si distinguono in inducibili (lac Operon), che sono solitamente repressi e vengono espressi se necessario, e reprimibili (trp Operon), che sono solitamente espressi e vengono repressi quando non sono servono Lac Operon contiene i geni che codificano per le proteine che servono per utilizzare il lattosio (disaccaride) Trp Operon contiene i geni per la biosintesi del triptofano (amminoacido) Lac Operon: Le cellule batteriche possono utilizzare come fonte energetica diversi substrati, in particolare glucosio Jacobs e Morrow hanno fatto crescere i batteri in un terreno di coltura in cui era presente il glucosio poi hanno sostituito il terreno di coltura con uno contenente lattosio, inizialmente la crescita si è fermata per alcuni minuti perché i batteri si sono dovuti adattare, cioè i geni del lattosio sono presenti nel genoma dei batteri ma dovevano essere espressi infatti erano contenuti in un operon che doveva essere indotto, poi è la crescita è ripresa Il livello di lac mRNA risente dell’aggiunta dell’induttore si passa dal livello basale a quello indotto poi l’induttore viene rimosso e in pochi minuti ritorna al livello basale perché viene velocemente degradato a causa dell’instabilità del trascritto Il livello della β-galattosidasi, che scinde lattosio in glucosio e galattosio, passa dal livello basale al livello indotto e rimane costante a quel livello per più tempo perché è più stabile L’operone è costituito da tre geni: lacZ codifica per la β-galattosidasi che scinde il lattosio in glucosio e galattosio lacY è una permeasi che aiuta il lattosio ad entrare nella cellula lacA è una transacetilasi che acetila metaboliti che derivano dalla degradazione dello zucchero (tossici per la cellula) Quando non c’è lattosio i primi due in particolare non sono necessari quindi per non trascriverli interviene un repressore, fattore proteico, che si lega all’operatore (sito di regolazione in cis) che ostacola l’RNA polimerasi impedendogli di legarsi o di lavorare quindi questo repressore si deve legare in sito sovrapposto o adiacente al promotore in modo tale che contrasta l’operato della polimerasi Nello stato represso il repressore è legato all’operatore e la polimerasi non riesce a trascrivere Questo repressore è codificato a monte da un gene regolatore lacI (elemento in cis), il prodotto del gene regolatore (molecola in trans) si va a posizionare sull’operatore Quando è presente il lattosio i geni lacZ, lacY, lacA devono essere espressi quindi interviene un induttore l’allolattosio (disaccaride) che si lega al repressore libero facendogli cambiare conformazione e impedendo il legame all’operatore ma deve essere anche in grado di staccare il repressore legato al DNA Il repressore è una proteina allosterica cioè costituita da più siti che permettono di interagire con più ligandi, un sito lega il DNA e un altro sito lega l’induttore promuovendo un cambio conformazionale Il lattosio che sta nel terreno per rimuove il repressore deve entrare nella cellula grazie all’aiuto della permeasi quindi anche se l’operon è represso in realtà mantiene una grande affinità per l’operatore e comunque minimo di trascrizone basale si ha perciò uno/due molecole di mRNA producono le proteine sufficienti per innescare l’induzione. L’operone si sblocca grazie al fatto che anche quando è represso non è una repressione del 100% Reazioni catalizzate dalla β-galattosidasi: a) Scissione del lattosio nei due zuccheri costituenti (galattosio + glucosio) b) Conversione del lattosio in allolattosio (induttore) Nel lattosio il galattosio e il glucosio sono legati con un legame β-1,4 mentre nell’allolattosio il galattosio e il glucosio sono legati con un legame β-1,6 Lo studio dei mutanti costitutivi (Lacc) ha evidenziato che l’operatore funziona in cis mentre il repressore agisce in trans Le mutazioni dell’operatore agiscono in cis e portano a un operone lac espresso costitutivamente (sempre espresso), queste prendono il nome di mutazione cis-dominante Un mutante costitutivo del repressore agisce in trans e porta ad un operone sempre attivo, mutazione recessiva Dei ricercatori hanno cercato di rendere i batteri, che hanno una sola copia del genoma, merodiploidi cioè costituiti da una porzione di cromosoma parzialmente diploide, per fare ciò hanno introdotto all’interno di cellule batteriche con mutazione cis-dominante un plasmide contenente un lac operon uguale a quello del genoma tutto wild type L’operon lac sul genoma ha la mutazione sull’operatore, l’operatore wild type sul plasmide interferisce solo sui geni che si trovano contigui ad esso (sullo stesso tratto di DNA) e non su quelli dell’operon sul genoma perché l’operatore agisce in cis Mentre se la mutazione ha colpito il gene del repressore (produce un repressore non funzionale) quindi viene inserito un plasmide contente un lac operon con il gene del repressore wild type che produce un repressore funzionale quindi l’operon sul genoma può beneficiare del repressore nuovo perché opera in trans Il gene del repressore è sempre attivo ed espresso a bassissimi livelli perché all’interno di una cellula di E.coli sono presenti una decina di copie. Il repressore ha una grande affinità con il sito dell’operatore L’operatore è formato da due “emisiti simmetrici” regioni uguali e invertite con sequenza palindromica e viene legato da un dimero di repressore Il repressore funziona come dimero e si lega a un sito del repressore in cui ciascun monomero interagisce con un emisito nel solco maggiore della doppia elica Il legame dell’induttore (allolattosio) induce un cambiamento conformazionale che allontana tra loro i domini di legame al DNA cosicché il repressore perde la sua affinità per il DNA Il repressore lac si può legare anche come tetramero a due/tre siti dell’operatore O1, O2 e O3, il secondo si trova nella regione codificante di LacZ, il terzo si trova a monte, il repressore quando tetramerizza si lega a due siti dell’operatore e la sequenza di DNA interposta fra di essi forma un’ansa La mutazione più drastica è quella sull’operatore O1 Lac Operon è soggetto a una regolazione negativa ma anche a una regolazione positiva mediata da un attivatore Se c’è il repressore la trascrizione non può avvenire ma anche se non c’è il repressore quell’operon è trascritto a bassi livelli perché il promotore è debole (ha le sequenze a -10 e -35 diverse dalle sequenze di consenso) quindi per essere espresso ad alti livelli interviene un attivatore A monte del promotore vi è un altro sito chiamato activator binding site che è un elemento in cis in cui si lega la proteina CAP (Catabolite Activating Protein) CAP è una proteina attivatrice, che complessata all’AMP ciclico, si lega sul sito attivatore e aiuta l’RNA polimerasi a legarsi sul promotore legandosi direttamente ai domini C-terminali delle subunità alfa della polimerasi La concentrazione di cAMP è controllata dal glucosio: cAMP aumenta quando il livello di glucosio diminuisce Durante il ciclo lisogeno prevale cI che è legato a OR1, reprime la trascrizione del gene cro a partire dal promotore PR se è legato anche a OR2 continua a reprimere cro ma attiva la trascrizione di cI dal promotore PRM, a concentrazioni ancora più elevate il repressore si lega anche al sito OR3 inibendo così anche la trascrizione di sé stesso Durante il ciclo litico cro prende il sopravvento legandosi al sito OR3, reprime la sintesi del repressore a partire da PRM e attiva la propria trascrizione a partire da PR, quando raggiunge concentrazioni più elevate cro si lega anche ai siti OR1 e OR2 inibendo la trascrizione di sé stesso Appena il DNA fagico è iniettato nella cellula i promotori PL e PR sono attivi quindi la polimerasi inizia la trascrizione di cro (repressore di cI agendo su PRM) e la trascrizione di cII (attivatore di cI agendo su PRE) Se prevale cII viene indotto il repressore di lambda e quindi PL e PR vengono repressi portando alla via lisogena Se prevale cro avviene la trascrizione da PL e PR attiva portando al ciclo litico La proteina cII è il vero interruttore per la scelta tra ciclo litico o lisogeno perché è molto instabile cioè sensibile alla degradazione di proteasi batteriche quindi la stabilità di cII dipende dalle condizioni di crescita del batterio, se la cellula è in buone condizioni le proteasi degradano cII e si andrà verso il ciclo litico mentre se la cellula è in cattive condizioni le proteasi non riescono a degradare cII e si andrà verso il ciclo lisogeno Una volta stabilito il ciclo lisogeno il fago può fare induzione lisogenica uscendo da questo ciclo il quale viene mantenuto dal repressore cI che deve essere reso inattivo Se ci sono danni al DNA viene prodotta la proteina RecA che provoca l’autoproteolisi di altre proteine ma può anche interagire con il repressore di lambda causando l’autoproteolisi che porta a una degradazione parziale con la separazione dei due domini e il distacco dal DNA I raggi ultravioletti attivano la proteina RecA che causa la proteolisi del repressore tagliando il linker flessibile e portando alla separazione dei due domini N-terminale e C-terminale, la degradazione del repressore promuove il suo distacco dall’operatore. La separazione dei domini C- e N-terminale del repressore cI ha come effetto la perdita dei domini di dimerizzazione del repressore stesso che non è più in grado di legarsi cooperativamente al DNA Regolazione della traduzione nei procarioti: - Regolazione generale (di tutte le proteine) comprende controllo del numero dei ribosomi e risposta stringente - Regolazione di geni specifici - Regolazione da parte di RNA regolatori: Riboswitches (ribointerruttori) e sRNA La regolazione generale della traduzione: attivazione della risposta stringente nei procarioti Una condizione sfavorevole che porta a una risposta stringente è la carenza di aa cioè presenza di molti tRNA scarichi nel ribosoma, il tRNA scarico nel sito A causa il legame di RelA (fattore di stringenza associato ai ribosomi) che utilizza come substrato GTP/GDP + ATP sintetizzando pppGpp e ppGpp (guanosina penta/tetra fosfato), il quale è un allormone (ormone che segnala status di allerta) che interagisce con l’RNA polimerasi, spegnendo la trascrizione in particolare del gene rRNA quindi si ha una minor produzione di ribosomi perciò minor sintesi proteica La regolazione autogena della sintesi delle proteine ribosomiali in E.coli , ci sono 19 operoni che raggruppano tutti i geni per le proteine ribosomiali, una decina dei quali sono regolati in modo che da ogni operone si ottiene un trascritto policistronico dal quale sono sintetizzate più r-proteine che si vanno a complessare con gli rRNA per partecipare alla costituzione della subunità a cui appartengono quindi se la quantità di r-proteine sintetizzate è bilanciata con la quantità di rRNA prodotta la traduzione continua mentre se la quantità di r-proteine è in eccesso rispetto agli rRNA con cui devono associarsi una delle r-proteine in eccesso va a legarsi all’mRNA (nella regione 5’- UTR) bloccandone l’ulteriore traduzione Riboswitch o Ribointerruttori regolano l’espressione genica in conseguenza di cambiamenti nella concentrazione di piccole molecole, si trovano solitamente nelle regioni 5’-UTR dei geni e sono costituiti da due componenti: Aptamero è una regione di circa 70-200 nt che interagisce con il ligando e subisce un cambiamento conformazionale Piattaforma di espressione è una regione adiacente all’aptamero che subisce un cambiamento conformazionale in seguito ad una interazione ligando-aptamero controllando l’espressione genica (ON-OFF) ON assenza di ligando quindi espressione genica accesa OFF presenza di ligando quindi espressione genica spenta (il ligando lega l’aptamero nel ribointerruttore causando un cambiamento conformazionale nella piattaforma di espressione) I ribointerruttori (elementi in cis) possono avere il loro effetto sia a livello traduzionale che a livello trascrizionale Nel controllo traduzionale la piattaforma di espressione è quella regione che comprende il sito della traduzione (sequenza di Shine-Dalgarno) in cui se non c’è presenza del ligando il ribosoma si può legare e iniziare la traduzione Se il ligando è presente si lega all’aptamero che subisce un cambiamento conformazionale che va ad influenzare anche le strutture secondarie, terziarie della piattaforma di espressione bloccando la traduzione I ribointerruttori regolano la terminazione della trascrizione o l’inizio della traduzione Nel controllo trascrizionale in assenza di legando non si forma la forcina di terminazione quindi la trascrizione può continuare mentre se il ligando è presente e si lega all’aptamero avviene il cambio di conformazione formando la forcina di terminazione Esistono anche ribointerruttori che sono RNA “termosensori” in cui la risposta allo shock termico è governata da un fattore sigma alternativo denominato σ 32 o σ H che dirige l’RNA polimerasi ai promotori dei geni “heat shock” Un riboswitch controlla la traduzione del fattore H = 32 Se la temperatura è bassa l’mRNA assume una conformazione tale inglobando il RBS e il sito d’inizio della traduzione non consentendo l’accesso alle subunità ribosomiali per tradurre la proteina codificata da 32 Se la temperatura è alta la struttura si denatura localmente consentendo l’acceso al ribosoma attivando la traduzione della proteina codificata da 32 Controllo della traduzione da parte di small RNAs (sRNAs) in batteri: questi sRNA sono costituiti da 80-110 nt, sono trascritti da piccoli geni indipendenti (che hanno un promotore a monte che li regola) e funzionano in trans, cioè legano l’mRNA bersaglio spesso associandosi alla proteina Hfq (RNA-binding protein) L’interazione di questi sRNA può guidare la distruzione dell’mRNA inibendo la traduzione o stimolandola In assenza di sRNA si può formare una struttura secondaria tale da nascondere il RBS (sito in cui si aggancia il ribosoma per iniziare la traduzione) quindi la traduzione è inibita però un sRNA che ha una affinità per il braccio della struttura secondaria ripiegato sul RBS facendolo distendere e liberando il RBS In caso contrario il RBS e gli altri elementi in cis necessari per la traduzione sono accessibili ma un sRNA può legarsi nella regione del RBS inibendo la traduzione CRISPR = clustered regularly interspaced short palindromic repeats (brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente interposte) CRIPR-Cas9 è un sistema diffuso nel mondo degli archea e dei batteri, costituito da regioni genomiche (locus CRISPR) in cui si alternano sequenze ripetute (brevi sequenze di ~32 basi uguali e ripetute) e sequenze spaziatrici (diverse tra loro) precedute a monte da una sequenza leader (~500 basi ricche di A-T) Le sequenze spaziatrici diverse tra loro erano riconducibili a sequenze di genomi virali (fagi) o di plasmidi noti, quindi di genomi esogeni inoltre queste sequenze dei locus corrispondevano ai DNA estranei con cui il batterio era stato a contatto p A monte di questi locus ci sono geni che codificano per proteine associate a CRISPER quindi chiamati geni Cas I prodotti dei geni Cas mediano l’acquisizione di nuove sequenza spaziatrici: - L’acquisizione di nuove sequenze spaziatrici vicino alla sequenza leader - La sequenza spaziatrice deriva dall’acido nucleico invasore, è denominata Proto-spaziatore e si trova vicino ad una sequenza di riconoscimento PAM (Protospacer Adiacent Motif) Quindi questi geni CAS hanno attività endonucleasica, tagliano e inseriscono le nuove sequenze Modello dell’attività del sistema CRISPR/cas: A) Durante l'acquisizione dello spaziatore, un tassello del genoma del fago invasore viene incorporato nella regione CRISPR, il tassello viene tagliato a livello della sequenza PAM B) Nella fase di elaborazione, il locus è trascritto e trasformato in crRNA maturo (CRISPR RNA) contenente una sequenza ripetuta di 8nt e una singola sequenza spaziatrice C) Durante la fase effector, il crRNA maturo è associato con le proteine cas in un complesso che portano alla degradazione di acidi nucleici complementari Il sistema CRISPR/Cas9 permette di individuare un DNA bersaglio mediante RNA guida e tagliarlo, quindi può essere utilizzato per effettuare specifiche modifiche al genoma di una cellula perciò è possibile eliminare sequenze di DNA dannose dal genoma bersaglio oppure è possibile sostituire delle sequenze, andando ad esempio a correggere delle mutazioni causa di malattie