8a. REGOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI, Appunti di Biologia Molecolare

Scarica 8a. REGOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI e più Appunti in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity! REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI Necessità di regolare selettivamente l’espressione genica per: - Garantire le risposte cellulari a variazioni ambientali (temperatura, pH, disponibilità di nutrienti, presenza di tossine o di molecole segnale, situazioni di stress) - Supportare le attività richieste nelle variazioni di fase del ciclo cellulare (replicazione del DNA, mitosi, morte) - Consentire una specializzazione funzionale delle cellule differenziate (organismi pluricellulari) L’espressione genica (trascrizione + traduzione) è un processo molto dispendioso dal punto di vista energetico La regolazione dell’espressione genica è essenziale per la vita della cellula e per il suo differenziamento “selettivo” In un esperimento hanno dimostrato che in una cellula uovo a cui viene distrutto il nucleo e inserito quello di una cellula differenziata (ad esempio dell’epidermide), questa è in grado di svilupparsi dando origine a un girino e poi a una rana, quindi le cellule differenziate presentano un’espressione genica selettiva, ma conservano l’intero patrimonio genetico In un secondo esperimento è stato clonato il primo animale, la pecora Dolly, è stato distrutto il nucleo di una cellula uovo e rimpiazzato con il nucleo di una cellula di una ghiandola mammaria Lo Xenopus laevis è un’eccezione perché i geni del nucleo di questo ovocita maturo di sono amplificati selettivamente, ogni nucleolo contiene una lunga molecola di DNA circolare in cui sono ripetute in tandem centinaia di copie dei geni per l’rRNA ribosomiale Un’altra eccezione è il riarrangiamento dei geni per le immunoglobuline nei linfociti B, in cui quando la cellula è matura e si specializza subisce una ricombinazione VDJ nella quale ogni cellula si associa a un segmento V, J o C ma questa ricombinazione è irreversibile Nei procarioti la regolazione dell’espressione genica avviene a livello trascrizionale (da DNA a mRNA), un controllo di stabilità e traduzionale (da mRNA a proteine), a livello della degradazione delle proteine (da proteine ad aminoacidi) La regolazione dell’espressione genica negli eucarioti avviene in diversi livelli: - livello della cromatina - livello trascrizionale - livello della maturazione di RNA - livello del trasporto di citoplasma - livello della degradazione di mRNA - livello traduzionale - livello di modificazioni chimiche (post-traduzionale) - livello della degradazione di proteine (1) Negli eucarioti a causa della condensazione della cromatina per regolare l’espressione genica sono necessari meccanismi di decondensazione Le regolazioni epigenetiche si suddividono in metilazione del DNA (a livello di isole di CpG) e rimodellamento della cromatina (modificazioni post-traduzionali degli istoni, complessi di rimodellamento ATP-dipendenti, sostituzione di varianti istoniche) La metilazione del DNA negli eucarioti coinvolge la citosina (5-metilcitosina) ed è controllata da tre enzimi: Metilasi de novo aggiunge un gruppo metilico a un sito non metilato chiamato isole-CG Demetilasi rimuove un gruppo metilico Metilasi di mantenimento aggiunge un secondo gruppo metilico, riconosce i siti emimetilati e metila il filamento di neosintesi ricostituendo una CpG metilata su entrambi i filamenti, l’altro sito resta non metilato (emimetilato = un filamento metilato e uno no, che viene poi metilato) Nel nostro genoma le isole CpG (= cluster di sequenze CG) si trovano in prossimità dei geni: - geni housekeeping che sono espressi in tutti i tessuti e hanno isole CpG non metilate - geni tessuto-specifici che sono non metilati solo nei tessuti in cui sono espressi La metilazione può causare un silenziamento dell’espressione genica perché in alcuni casi impedisce il legame all’attivatore mentre in altri può favorire il legame di una Metil-Citosina Binding Protein (MeCP) che rimodella la cromatina rendendola inattiva Se la citosina viene deaminata porta a Uracile mentre la 5-metilcitosina deaminata porta a Timina quindi è frequente causa di mutazioni perché non esistono meccanismi di riparo per la timina, le isole CG sono regioni di ipometilazione Per essere trascritto un gene è importante che le regioni di trascrizione non devono essere metilate Nel meccanismo di inattivazione casuale del cromosoma X inizialmente entrambi i cromosomi XX sono attivi poi viene espresso un RNA Xist che è un RNA che viene espresso da un gene presente sul cromosoma X che va a tappezzarne la sua sequenza e richiama delle metilasi che metilano tutto il cromosoma rendendo tutti i geni inattivi tranne quello dello Xist RNA che rimane espresso, funge da elemento in trans e inattiva il cromosoma X Il cromosoma che rimane attivo è quello in cui la metilazione colpisce il gene del Xist RNA che non viene più espresso Il Xist RNA tappezza il cromosoma in cis, quello da cui è stato sintetizzato Il gene per il colore del pelo del gatto sta sul cromosoma X quindi se ci sono due alleli diversi sui due cromosomi X, uno per un colore e uno per l’altro, visto che l’inattivazione è casuale, ci saranno cellule che hanno mantenuto attivo per un colore e altre cellule che hanno mantenuto attivo il gene per l’altro colore Esistono due complessi proteici di rimodellamento della cromatina: SWI/SNF (rimodellamento dei nucleosomi) e ISWI (riposizionamento dei nucleosomi) Il filamento stampo del nucleosoma deve essere reso accessibile per fare ciò può essere rimosso completamente, smantellato parzialmente, possono essere sostituiti dei componenti per variare la struttura e l’affinità con il DNA, o può essere spostato facendolo scivolare Le modificazioni post-traduzionali delle catene istoniche (sulle code N-terminali) alterano la struttura/funzione della cromatina. Le code N-terminali degli istoni possono essere metilate su lisine e arginine e altri aa (Ser/His), fosforilate su serine e treonine, ubiquinate e acetilate su lisine Residui modificanti sono presenti anche nell’histone-fold Gli istoni con il loro ottamero sono il primo livello di compattamento della cromatina, attorno a cui è avvolto il DNA, tanto è più forte l’interazione istone-DNA più difficile è utilizzare quel DNA come stampo per la traduzione Tutte queste modifiche post-traduzionali sulle code N-terminali degli istoni sono reversibili Le modifiche avvengono sulle code N-terminali perché sono meno strutturate, non partecipano all’histone-fold, a secondo delle modifiche che portano con sé possono essere più o meno adese al DNA se la loro interazione con il DNA è forte hanno funzione repressiva, queste modifiche hanno effetti diversi sull’espressione genica La metilazione non ha sempre effetto repressivo, infatti la metilazione della lisina 4 sull’istone H3 ha una funzione di attivazione dell’espressione genica Anche l’ubiquitinazione non ha sempre effetto repressivo, infatti se avviene sulla lisina 119 dell’istone H2A ha funzione repressiva mentre se avviene sull’istone H2B ha funzione attivante L’acetilazione delle lisine sulle code istone ha sempre effetto attivatore, gli istoni acetilati sono sempre sintomo di cromatina attiva mentre quelli deacetilati sono sintomo di cromatina repressiva perché la lisina è un aminoacido basico carico positivamente quindi quando le code degli istoni sono ricche di aminoacidi basici questi formano legami elettrostatici ionici con lo scheletro fosfodiesterico del DNA Deacetilazione: le lisine non sono modificate ma hanno loro carica positiva quindi creano forti interazioni con il DNA carico negativamente perciò l’apparato trascrizione fatica ad accedere a questo DNA Se sul gruppo amminico della catena laterale della lisina addizioniamo un gruppo acetile, questa acetilazione ne rimuove la carica positiva eliminando l’attrazione tra il DNA e le code degli istoni L’acetilazione serve a sboccare l’espressione genica, ci sono delle istone acetil-transferasi che acetilano le code istoniche e delle deacetilasi che rimuovono il gruppo acetile Non ci sono solo le due condizioni estreme (completa acetilazione e non acetilazione) ma ci sono vari intermedi che daranno una diversa compattazione della cromatina Il codice istonico comprende molti pattern di modificazioni istoniche ognuno di queste da un risultato sull’espressione genica, il livello di espressione dipende dal codice istonico Tra le modificazioni post-traduzionali degli istoni c’è coerenza, infatti una modificazione su un istone è in grado di influenzare modificazioni (inducendole o inibendole) su altre molecole istoniche dello stesso nucleosoma Cross-talk in trans fra le modificazioni post-traduzionali su differenti molecole istoniche Ad esempio l’istone H2B può essere ubiquitinato sulla lisina 120, questa modifica ne promuove altre, favorendo la metilazione sulla lisina 4 e la lisina 79 dell’istone H3, a sua volta la lisina 4 dell’istone H3 induce l’acetilazione su altre lisine dell’istone H4 ma allo steso tempo l’acetilazione della lisina 9 dell’istone H3 va ad inibire le acetilazioni delle lisine dell’istone H4. Quindi si ha il cross-talk in trans quando la modifica su una molecola istonica determina o ostacola modifiche su le altre molecole istoniche Cross-talk in cis fra le modificazioni post-traduzionali sugli istoni H3 e H4 Alcuni recettori dell’ormone steroideo si trovano già nel nucleo ma devo essere attivati dall’ormone steroideo per andare a modulare la trascrizione genica NF-kB pathway è un fattore di trascrizione che regola molti geni quelli coinvolti nella risposta immune, risponde a molti stimoli e quando arrivano molecole segnale sulla superfice della cellula questo fattore si attiva, è uno dei bersagli delle cascate di trasduzione del segnale Le molecole segnale vanno ad attivare un complesso chinasico, l’attivazione di queste proteine chinasi vanno a fosforilare diverse proteine che direttamente o indirettamente sono coinvolti nella trascrizione Una di queste proteine che viene fosforilata è I-kB (Inibitore di NF-kB) che finché è legato al fattore di trascrizione questo rimane bloccato nel citosol perché l’inibitore nasconde il segnale di localizzazione nucleare, quando è richiesta l’attività di NF-kB l’inibitore deve essere degradato fosforilandolo e poi ubiniquinandolo Le proteine poliubiquinate vengono riconosciute dal proteosoma e degradate, il fattore libero entra nei pori nucleari Questi fattori rispondono a questi stimoli (stimoli positivi o stimoli di stress) andando a regolare l’espressione genica Quando il fattore di trascrizione va nel nucleo ad attivare i suoi geni bersaglio tra cui il gene del suo inibitore I repressori trascrizionali sono proteine, elementi in trans che si legano ad elementi in cis e possono agire attraverso diversi meccanismi: competizione (quando il sito di legame del repressore è parzialmente sovrapposto a quello dell’attivatore), inibizione (il repressore si lega sul sito bersaglio del DNA inibendo l’attivatore), repressione diretta (il repressore si lega sul sito bersaglio sfavorendo il posizionamento dell’apparato trascrizionale), repressione indiretta (3) Regolazione dell’espressione genica a livello co- e post-traduzionale mediante la maturazione dei pre-mRNA Maturazione del pre-mRNA: - Splicing (alternativo) - Capping - Poliadenilazione (alternativa) - Editing Controllo di qualità dell’mRNA nel nucleo: - Degradazione hnRNA nel nucleo Esportazione dal nucleo: - Richiede una corretta maturazione dell’mRNA Per ottenere più trascritti maturi da un solo gene si possono utilizzare siti di inizio alternativi o siti di terminazione alternativi oppure attraverso splicing alternativo Alcuni geni hanno promotori multipli quindi la trascrizione può iniziare da più punti regolata da fattori di trascrizioni gene-specifici ottenendo trascritti maturi di diverse lunghezze Anche la terminazione può avvenire in siti differenti perché ci possono essere siti multipli di poliadenilazione Con lo splicing alternativo si possono ottenere il maggior numero di prodotti maturi attraverso: salto dell’esone (esoni a cassetta), esoni mutuamente esclusivi, mantenimento dell’introne (nel 15% dei casi), siti donatore al 5’ alternativi, siti donatore al 3’ alternativi Difetti nello splicing (alternativo) sono correlati a patologie Anche i promotori e i siti di poli-adenilazione subiscono una selezione alternativa Esiste un unico gene che codifica p53 ma possono essere prodotte diverse isoforme della p53 umana utilizzando tre promotori alternativi, le nove isoforme proteiche risultanti possono essere sia di lunghezza intera sia tronche al loro N-terminale Anche per la tropomiosina vi è un unico gene codificante, la tropomiosina è una proteina che si associa con l’actina e ne regola il legame con la miosina, le diverse isoforme di questa proteina derivano da splicing alternativo (salto di esone) ma anche dall’uso di siti di poliadenilazione alternativi Gli esoni costitutivi sono quelli mantenuti nelle varie isoforme dei trascritti maturi Gene DSCAM di Drosophila (moscerino della frutta): Dscam (Down syndrome cell-adhesion molecule) è un gene codificante per le proteine della famiglia delle immunoglobuline richieste per la formazione di connessioni neuronali, questo gene è costituito da 24 esoni di cui 20 costitutivi e 4 cluster di esoni alternativi (esoni 4-6-9-17) Ogni mRNA finale prodotto contiene una delle 12 possibili alternative dell’esone 4, una delle 48 possibili alternative dell’esone 6, una delle 33 possibili alternative dell’esone 9 e una delle 2 possibili alternative dell’esone 17; tutte le possibili combinazioni dei singoli esoni 4, 6, 9, e 17 permettono di ottenere (12x48x33x2) 38016 trascritti alternativi che danno origine a 38016 isoforme proteiche L’inclusione di 1 solo esone dei 48 presenti nel gruppo 6 è regolata da due classi di elementi conservati: - un sito di ancoraggio localizzato a valle dell’esone 5 costitutivo - sequenze selettrici localizzate a monte di ogni variante esonica all’interno del gruppo 6 Ogni sequenza selettrice è complementare ad una porzione del sito di ancoraggio Un repressore dello splicing si lega a ciascun esone alternativo (tranne uno) inibendone lo splicing Lo splicing (alternativo) aberrante può portare a diverse patologie come distrofia muscolare, fibrosi cistica.. Poliadenilazione alternativa è il meccanismo utilizzato per la produzione di immunoglobuline di membrana e secrete, dalla poliadenilazione si possono ottenere trascritti di diversa lunghezza inoltre nella versione più lunga ci può essere un altro esone che può avere una porzione codificante Ad esempio il linfocita B può produrre immunoglobulina solubile o immunoglobulina legata alla membrana a seconda se il linfocita secerne anticorpi o è in circolo e queste due isoforme dipendono dal sito di poliadenilazione in cui termina la trascrizione Anche l’editing rappresenta un meccanismo per regolare l’espressione genica, l’editing di APO-B mRNA tramite deaminazione, da APO-B si possono ottenere 2 proteine: la proteina lunga (APO-B-100) in assenza di editing nel fegato oppure la forma deaminata (APO-B-48) nell’intestino (deaminazione sito-specifica di una tripletta CAA in UAA) (4) L’esportazione dell’mRNA dal nucleo al citosol è mediata da hnRNP Con la maturazione nel trascritto di mRNA si trova l’Exon Junction Complex che viene depositato con lo splicing, il Cap Binding Complex lasciato con il capping sulla struttutra del cap, la poliA bindig protein sulla coda di poliA e altre proteine che ricoprono l’mRNA Quando arriva a livello del poro nucleare alcune di queste proteine rimangono nell’mRNA accompagnandolo fino al citosol, alcune rimangono nel nucleo mentre altre lo scortano fino al citosol e tornano indietro A livello del citosol il Cap Binding Complex viene sostituito dai fattori di inizio della traduzione, la poliA binding protein nucleare viene sostituita da una poliA binding protein citoplasmatica, gli Exon Junction Complex vengono eliminati dal primo ribosoma che traduce Nel nucleo avviene la degradazione di tutto ciò che non deve arrivare nel citosol come gli introni e di tutti quei mRNA che non sono maturi (mancanza del CAP o della coda di poliA), controllo di qualità prima dell’esportazione nel citosol Quindi ci sono esoribonucleasi che degradano in direzione 3’-5’ se vi è mancanza della coda di poli A e endoribonucleasi che degradano in direzione 5’-3’(esosoma) se vi è mancanza del CAP La degradazione inizia con un taglio endonucleolitico effettuato da un componente dell’esosoma succeduto da un oligoadenilazione dell’estremità 3’ da parte del complesso TRAMP e infine una degradazione esonucleasica TRAMP ed esosoma sorvegliano tutti gli RNA, ma degradano solo quelli privi di strutture protettive o anomali Un messaggero maturo che arriva nel citosol viene tradotto e degradato (quando non è più necessario) (5) L’emivita media dell’mRNA (nei batteri è breve nell’ordine dei minuti) nelle cellule eucariote può essere di 10-15 ore per “long-lived” mRNAs che codificano per proteine “housekeeping” oppure di 5-15 minuti per “short-lived” mRNAs che codificano per prodotti proteici che non sono sempre presenti nella cellula come fattori di crescita, citochine, linfochine, recettori ormonali, fattori di trascrizione, proto-oncogeni.. L’instabilità dell’mRNA rende significativa la regolazione a livello trascrizionale La degradazione degli mRNA negli eucarioti avviene in maniera differente per mRNA non difettosi e mRNA difettosi Per mRNA non difettosi ci sono due vie principali di degradazione: decadimento dipendente dalla deadenilazione e decadimento non dipendente dalla deadenilazione La deadenilazione consiste nello smantellamento della coda di poliA Nel primo caso (deadenylation-dependent decay) una deanilasi (esoribonucleasi specifica per degradare la coda di poli A) inizia a rimuovere la struttura protettiva che era stata costruita al 3’ del trascritto maturo poi o si arriva a degradare tutta la coda di poliA e l’esosoma sostituisce la deanilasi degradando in direzione 3’-5’ quasi tutto fino al cap oppure la coda di poli A viene degradata dalla deadenilasi e si ha l’attivazione degli enzimi di decapping che tagliano il cap così che poi possono inserirsi le esoribonucleasi che degradano tutto Nel secondo caso (deadenylation-indipendent dacay), anche chiamato decadimento tramite un taglio endoribonucleotidico, gli mRNA sono tagliati da una endoribonucleasi e le estremità libere che si formano sono un punto di accesso per le esoribonucleasi che degradano tutto il trascritto La coda di poli A che viene prodotta nel nucleo, nel corso dell’emivita di quel trascritto può subire accorciamenti e allungamenti fino quando la deadenilasi la rimuove completamente L’enzima di decapping interviene quando arriva il segnale di destabilizzazione da parte della deanilasi La degradazione di alcuni mRNA è controllata da sequenze ARE (ricche in AU) che solitamente si trovano nella porzione non tradotta al 3’-UTR, i messaggeri contenti queste sequenze sono instabili perché richiamano proteine destabilizzanti che quindi richiamano le deadenilasi e vengono presto degradati Ma affinché questi mRNA instabili vengano tradotti la sequenza ARE viene prima coperta da proteine stabilizzanti che prevengono l’interazione con le proteine destabilizzanti, quando il messaggero deve essere rimosso le proteine stabilizzanti vengono sostituite da proteine che richiamano le deadenilasi provando il decadimento di questi trascritti Nel decadimento endoribonucleotidico il messaggero viene tagliato da un endoribonucleasi generando le estremità libere che sono accessibili alle esoribonucleasi, Il sito di taglio dell’endoribonucleasi si trova in mezzo ad una sequenza che rappresenta il sito di legame di una proteina stabilizzante che nasconde questo sito durante la traduzione poi quando non è più necessario la proteina stabilizzante viene rimossa e l’endoribonucleasi taglia il trascrtto Un messaggero che viene degradato con il meccanismo endoribonucleotidico è il messaggero che codifica per il recettore della transferrina TFR, la stabilità di questo messaggero è regolata da IRE Binding Protein (IRP) che è una proteina regolata dal ferro Le cellule cercano di modulare l’ingresso del ferro all’interno in base alle proprie necessità Esternamente alle cellule il ferro si lega alla transferrina e il recettore della transferrina che si trova sulla membrana delle cellule interagisce con la transferrina e fa sì che il complesso ferro-transferrina viene internalizzato poi la transferrina torna fuori mentre il ferro interagisce con i sistemi che ne hanno bisogno e quello in eccesso viene depositato legandosi alla ferritina (rappresenta la forma di deposito intracellulare del ferro) Se il ferro è poco il messaggero per quel recettore sia più stabile e dia origne alla sintesi della proteina recettore che va nella membrana interagendo con il ferro-transferrina e lo internalizza Se il ferro è abbondante quindi non deve essere internalizzato la cellula deve degradare il messaggero per il recettore della transferrina in modo da non tradurlo più in proteina Il messaggero della transferrina nella sua regione 3’-UTR contiene una sequenza IRE (Iron Responsive Element) che risponde alla presenza o meno di ferro e rappresenta anche il sito di taglio dell’endoribonucleasi Se il ferro è a bassa concentrazione la struttura a forcina è ricoperta da una IRE binding protein che quando il ferro è disponibile va a fare l’aconitasi nel cilo di Krebs mentre quando il ferro è poco modula la stabilità di questo messaggero mascherando il sito di taglio dell’endoribonuclesi così che il messaggero TFR non viene degradato Se il ferro è abbondante si lega all’IRE Binding protein che perde l’affinità per la sequenza IRE del messaggero TFR che quindi viene tagliato dall’endoribonucleasi e degradato Per mRNA difettosi ci sono diversi meccanismi di degradazione: Decadimento mediato da un codone Non-senso (NMD): degradazione di RNA che hanno codoni di stop prematuri Decadimento mediato da un codone Non-Stop (NSD): degradazione di RNA che non hanno un codone di stop Decadimento No-Go (NGD): degradazione dovuto allo stallo del ribosoma sul trascritto che sta traducendo Nonsense-Mediated Decay (NMD): dopo lo splicing i siti dell’mRNA da cui sono stati rimossi gli introni restano marcati dalla presenza di complessi proteici (Exon Junction Complex), questi subiscono poi dei cambiamenti strutturali tra cui il legame delle proteine Upf che se non rimosse porteranno l’mRNA a degradazione Se l’mRNA contiene un codone di stop normale al primo ciclo di traduzione il ribosoma che scorre su un mRNA normale rimuove le proteine Upf rendendo così l’mRNA stabile, l’mRNA è immune dall’NMD e viene tradotto Se l’mRNA contiene un codone di stop prematuro (PTC) questo causa il rilascio del ribosoma prima che esso abbia raggiunto e rimosso la seguente proteina Upf, l’interazione tra la Upf e il complesso post-terminazione innesca l’NMD (degradazione dell’mRNA) Non-Stop mediated mRNA Decay (NSD): il ribosoma traduce attraverso la coda di poliA allontanando le proteine che legano il poliA, poi il ribosoma va in stallo e la molecola adattore Ski7 si lega al sito a vuoto e rilascia il ribosoma, Ski7 recluta l’intero complesso SKI e l’esosoma portando la proteina alla degradazione in direzione 3’-5’ No-go Decay (NGD): è un meccanismo di degradazione dovuto allo stallo del ribosoma sul messaggero quindi il peptide viene rilasciato e degradato tramite poliubiquitinazione, poi il ribosoma viene rilasciato e le subunità vengono disassemblate e degradate Nonsense-Mediated Decay porta alla degradazione di mRNA che hanno codoni di stop prematuri perché darebbero origine a proteine troncate ma ci sono alcuni mRNA che volutamente hanno due codoni stop, uno che deriva dalla