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Scarica appunti appunti appunti appunti appunti appunti e più Appunti in PDF di Geologia solo su Docsity! COMPONENTI del GENOMA EUCARIOTICO 1. DNA in singola copia (una o poche copie): è costituito dalla maggior parte dei geni che codificano per proteine = 25% genoma 2. DNA mediamente ripetuto (decine o centinaia di copie) > 50% genoma: è costituito da • Geni per rRNA • Geni per proteine istoniche • Famiglie geniche • Pseudogeni • Trasposoni (45% del genoma) •3. DNA altamente ripetuto: è costituito da corte sequenze intersperse = 25% genoma Geni che compongono famiglie: I ~30 000 geni umani si dividono in 15 000 famiglie: molti geni hanno almeno un “parente”. Il numero di geni in un genoma è dato dal numero di geni unici più il numero di famiglie, a cui appartengono due o più geni correlati (famiglia dei recettori olfattivi: un migliaio di geni). Serie di geni molto simili per sequenza che derivano da un gene ancestrale comune per duplicazione o variazione in seguito ad accumulo di mutazioni  Hanno struttura e funzione conservate  Possono essere raggruppati insieme o sparsi.  Possono trovarsi anche su cromosomi diversi La correlazione spesso riguarda solo la parte esonica: costrizione funzionale. Gli introni sono molto più divergenti Progenitore proto-b Progenitore proto-a Cromosoma 22 Cromosoma 16 Cromosoma 11 Famiglia dei geni per le globine All’interno della famiglia i singoli geni si sono evoluto per svolgere funzioni specializzate: maggiore affinità per l’ossigeno per i prodotti dei geni espressi nella fase embrionale e fetale rispetto a quelli espressi nella fase adulta. L'altezza delle curve indica l’espressione relativa dei geni perla globina nei vari tessuti. _ ‘% della sintesi di globina complessiva prima della nascita si passa dall'espressione della y-globina a quella della B-globina. Duplicazione genica Produzione di due copie identiche di un gene Delle due copie, una continua a svolgere la propria funzione, l’altra può andare incontro a diversi destini Il gene duplicato mantiene la stessa funzione del gene ancestrale: Gene redundancy Il gene duplicato, non essendo sottoposto alla stessa pressione selettiva del gene ancestrale, può accumulare mutazioni casuali L’accumulo di mutazioni fa sì che il gene duplicato possa acquisire una nuova funzione utile per l’organismo (le nuove funzioni acquisite possono diventare specie-specifiche) L’accumulo di mutazioni porta all’inattivazione del gene duplicato, trasformandolo in pseudogene (pseudogeni delle α e βb globine) Destino dei geni duplicati GENI OMOLOGHI Gene ancestrale speciazione Uomo cetacei mutazioni emoglobina emoglobina I due geni per l’emoglobina nelle due specie sono tra loro ORTOLOGHI Ortologhi da Ortos = esatto: geni che derivano da un gene ancestrale comune. Le mutazioni che intervengono dopo la speciazione non modificano sostanzialmente la funzione Sono presenti attualmente in specie diverse dove codificano per la stessa funzione (es: emoglobina nel cetaceo e nell’uomo) GENI OMOLOGHI Gene ancestrale per la globina umana Duplicazione Mutazioni Mutazioni Emoglobina Mioglobina IL gene per l’emogoglobina e quello per la mioglobina in una stessa specie sono tra loro PARALOGHI Paraloghi da Para = somigliante, affine geni che derivano da duplicazione del gene ancestrale comune. Sono presenti attualmente nella stessa specie dove codificano per funzioni affini ma diverse (es: emoglobina e mioglobina; globine) Pseudogeni Sequenze presenti nel genoma eucariotico correlate a geni funzionali, ma che non sono tradotte in una proteina funzionale Hanno caratteristiche strutturali di geni, ma vengono resi inattivi dall’accumulo di mutazioni che bloccano l’espressione Possono essere la versione inattiva di geni attualmente ancora attivi Elementi in comune e elementi di diversità tra un gene e uno pseudogene SIGNIFICATO degli PSEUDOGENI () Relitti evolutivi, cioè un prodotto indesiderato del riarrangiamento di geni funzionali durante l’evoluzione però Da uno pseudogene può nascere un nuovo gene e quindi una nuova funzione In questo caso sarebbero utili per l’evoluzione geni per: rRNA (300),tRNA (1300), 5S RNA (2000), istoni (20) sequenze ripetute intersperse sequenza Alu: 300 nt (x 300.000)) sequenze semplici o satelliti: 2-10 nt (x 2-100 copie in tandem x 1-100 blocchi interspersi) Sequenze ripetute Le sequenze ripetute possono essere raggruppate in “cluster” o “a tandem” (copie multiple adiacenti) o intersperse SEQUENZE MEDIAMENTE RIPETUTE Ripetute in tandem Molti prodotti genici sono richiesti in grande quantità e sono codificati da geni in copia multipla: •Geni per rRNA •Geni per tRNA •Geni per istoni I geni per rRNA sono raggruppati in una regione del DNA, rDNA, con una morfologia caratteristica tale da costituire la regione organizzatrice nucleolare, NOR. Nel genoma umano ci sono 5 NOR, localizzate sui cromosomi acrocentrici 13,14,15,21 e 22. La regione del nucleo in cui avviene la sintesi dell’rRNA ha un caratteristico aspetto con un centro fibrillare (rDNA) circondato da una corteccia granulare di ribonucleoproteine, il nucleolo ORGANIZZAZIONE DELLE TRE CLASSI DI ELEMENTI TRASPONIBILI Si muovono mediante un meccanismo di escissione e integrazione in siti differenti del genoma. LTR. Simili ai retrovirus. A differenza di essi mancano di uno stadio vitale extracellulare, ma sono puramente intracellulari. RT: trascrittasi inversa Due tipi: LINE e SINE. LINE: codificano per la RT. Elementi autonomi. SINE: non codificano per la RT, ma possono essere mobilizzati dalle proteine prodotte dagli elementi LINE. Sono trasposoni non autonomi. Trasposoni a DNA Elementi replicativi •Trasposoni a DNA che si spostano replicandosi (copia e incolla): una copia rimane nel sito originale, mentre la nuova copia si inserisce altrove nel genoma Elementi conservativi •Trasposoni a DNA che si spostano in maniera conservativa (taglia e incolla) da un sito all’altro del genoma senza aumentare il numero di copie • Sono caratterizzati da una sequenza codificante la trasposasi contenente introni, fiancheggiata da ripetizioni terminali invertite. • Sono meno comuni negli eucarioti (3% nel genoma umano, raggruppati in 7 classi principali) rispetto ai retrotrasposoni • I più noti sono gli Elementi Ac e Ds del granturco, i primi elementi mobili identificati negli anni 50 da B. McClintock e gli elementi P di Drosophila • Traspongono mediante il meccanismo di trasposizione conservativa (taglia e incolla) Trasposoni a DNA COMPLESSO RIBOSOMA-SRP (SEQUENZA SEGNALE) Una sequenza segnale per il reticolo endoplasmatico rugoso e una particella di riconoscimento del segnale (SRP) indirizzano il ribosoma alla membrana del reticolo stesso. L’SRP si lega alla sequenza segnale per il reticolo endoplasmatico (RE) esposta dal peptide nascente. Il complesso SRP-ribosoma si lega quindi a un recettore per SRP situato nella membrana dell’RE. A questo punto l’SRP si libera, lasciando il ribosoma sulla membrana dell’RE, in corrispondenza di un canale di traslocazione. Il canale allora risucchia la catena polipeptidica nella membrana e comincia a traslocarla dall’altro lato. 26 Danni genomici indotti da Alu Numerose patologie sono provocate dall'integrazione casuale di Alu (Neurofibromatosi, haemophilia, sindrome di Apert, ecc.) o da ricombinazione disuguale (diabete di tipo II, sindrome di Lesch–Nyhan, malattia di Tay–Sachs, ipercolesterolemia familiare, α-thalassaemia, ecc.). LINEs = long interspersed sequences > 6 kpb Sequenze ripetute anche 500 000 volte Spesso contengono moduli di lettura per possibili prodotti proteici che provvedono alla propria mobilità: trascrittasi inversa, integrasi. Un LINE ha un promotore e una coda di poli A che serve per il processo di retro-trascrizione Costituiscono il 20% del genoma umano Teoricamente qualunque mRNA cellulare potrebbe essere retro-trasposto ma in realtà questo evento è molto raro Come mai si retro-traspongono i trascritti delle LINES e non altri mRNA cellulari? Le proteine codificate dal LINE si legano immediatamente al proprio RNA mentre viene tradotto e ciò favorisce la retro-trascrizione e integrazione solo degli RNA che li hanno generati. Sono proteine cis-agenti. Nel genoma umano: DNA alfoide. ▪ Localizzato nel centromero di tutti i cromosomi. ▪ Unità ripetuta di 171pb. ▪ Costituisce il 3-5% del DNA in ciascun cromosoma. ▪ Altri satelliti presentano unità ripetute più corte. Localizzati anch’essi a livello del centromero. Il centromero è responsabile della corretta segregazione dei cromosomi durante la divisione cellulare ▪ È la regione del cromosoma a cui le strutture del fuso mitotico o meiotico si attaccano ▪ È la regione di appaiamento dei cromatidi fratelli fino alla separazione ▪ A livello del centromero c’è un grado diverso di impaccamento della cromatina Le sequenze alfoidi sono interessate in questi processi MINISATELLITI Corte sequenze ripetute in tandem di DNA:ciascuna unità è di 10-100 bp. Si dividono in due gruppi: DNA minisatellite telomerico DNA minisatellite ipervariabile DNA minisatellite telomerico: è generalmente formato da esanucleotidi 5'-TTAGGG-3', ripetuti in tandem, con una grandezza totale di circa 10-15 kb, che vengono aggiunti alle estremità di ogni cromosoma dall'enzima telomerasi Ciascuna estremità cromosomica è composta da una particolare struttura costituita da DNA e proteine: il telomero. Tale struttura è essenziale per la stabilità del cromosoma. Le sequenze telomeriche: • partecipano alla replicazione della porzione terminale dei cromosomi • hanno la funzione di impedire la degradazione delle estremità dei cromosomi Le modalità con cui avviene la replicazione del DNA generano un processo di ACCORCIAMENTO delle estremità ad ogni duplicazione; ciò porterebbe ad un punto critico in cui verrebbe bloccata la REPLICAZIONE del DNA e la cellula andrebbe incontro a MORTE CELLULARE PROGRAMMATA (apoptosi) La cellula è in grado di sopperire a questo “ACCORCIAMENTO” mediante la presenza di enzimi chiamati TELOMERASI che aggiungono piccole sequenze ripetute alle estremità del cromosoma La TELOMERASI è un complesso ribonucleoproteico che funziona da trascrittasi inversa Presenta una componente ad RNA: TER (che funge da stampo), una subunità TERT: telomerase reverse transcriptase (DNA polimerasi RNA dipendente, ) Subunità RNA-DNA elicasi, per distaccarsi temporaneamente dallo stampo e effettuare un successivo ciclo di allungamento 1) “CAPPING” telomerico o protezione delle estremità libere La presenza di estremità libere a livello di ogni cromosoma può dare luogo ad uno dei seguenti problemi: 1) Le estremità generate da rotture cromosomiche sono “appiccicose” e tendono a reagire con altri cromosomi dando luogo a “FUSIONI TELOMERICHE” 2) Le estremita’ libere possono essere riconosciute dalle nucleasi e quindi determinare degradazione del cromosoma Il telomero deve, quindi, “chiudere” ciascuna estremità del cromosoma Le cellule proteggono i telomeri dagli enzimi di riparo delle rotture a doppio filamento. L’estremità 3’ a ss del telomero si ripiega, in modo da allinearsi con le sequenze ripetute presenti nella regione a ds. Al pari di quanto avviene nella ricombinazione, l’ssDNA invade la regione a ds, spiazza uno dei due filamenti e si appaia con il complementare. Si forma una struttura ad ansa: t-loop, che protegge le estremità del cromosoma. Le proteine che legano i telomeri favoriscono la formazione del t-loop. Minisatellite ipervariabile DNA minisatellite ipervariabile, o VNTR (variable number tandem repeat): più di 1000 gruppi di corte sequenze ripetute, localizzati in diversi loci, soprattutto nelle regioni centromeriche. • La lunghezza di ogni unità ripetuta è compresa tra 6 e più di 50 bp, con una estensione totale compresa tra 100 bp a circa 20 kb • Queste sequenze presentano un core centrale rappresentato dalla sequenza "GGGCAGGAXG" (dove X rappresenta una qualsiasi base) • Il numero di unità ripetute di ogni gruppo risulta estremamente variabile tra gli individui di una stessa specie • Il significato di queste sequenze non è stato ancora chiarito ma, a causa del loro estremo polimorfismo, sono utilizzate nelle analisi diagnostiche, come il fingerprinting genetico (diagnosi di paternità) • la figlia 2 deriva da un secondo matrimonio della madre • il figlio 2 è adottato I minisatelliti sono considerati hot spot (punti caldi) della ricombinazione omologa, sono cioè zone del DNA all'interno delle quali la frequenza di ricombinazione è più elevata rispetto alla media. Se slitta l’elica di nuova sintesi si ha un’espansione del numero di ripetizioni (la stessa regione viene copiata due volte) Se slitta l’elica stampo si ha una contrazione del numero di ripetizioni (una regione non viene copiata) i microsatelliti come i minisatelliti sono polimorfismi multiallellici del DNA quindi sono utili come marcatori genetici e vengono usati per le indagini diagnostiche (DNA fingerprinting) Possono essere associati a patologie umane (X-fragile, tumori)  POSSONO ESSERE UTILI MARCATORI DIAGNOSTICI Analisi di fenotipi mutatori in pazienti affetti da tumori Fenotipo mutatore: mutazioni nei geni deputati al riparo del DNA interferiscono con la frequenza di mutazione spontanea le mutazioni si accumulano anziché essere eliminate. Gli errori di scivolamento della DNA polimerasi a livello delle sequenze ripetute (microsatelliti) sono riparati dal sistema di riparo dei mismatch (in E. coli: sistema MutSL). Omologhi umani di mutS e mutL mutati in alcune forme ereditarie di tumore: HNPCC, human non polyposic colorectal cancer. Nonostante la definizione “Non-Polyposis”, il cancro del colon retto si sviluppa a causa della trasformazione maligna di polipi adenomatosi, che non sono però numerosi e diffusi come invece si osserva nella Poliposi Adenomatosa Familiare. PATOLOGIE da ESPANSIONE delle TRIPLETTE Tripletta ripetuta Malattia Gene sul filamento Situazione normale delizie codificante PRESSA Sindrome di Kennedy recettore degli androgeni (CAG)*n n=13-30 n=39-60 (Xq13) Sindrome dell’X-fragile FMRI (Xq27,3) (CGG)n n=6-46 n=50-200 (premutazione) n>300 i (mutazione completa) Distrofia miotonica —1miotonina protein-kinasi (CTG)*n n=5-27 n=52-1000 (19g13) X-FRAGILE Gene FRM1 Solo durante l’oogenesi si può avere l’espansione del numero di triplette da premutazione a mutazione. I maschi con la premutazione la trasmettono sempre alle figlie femmine senza variazioni Le femmine con la premutazione corrono il rischio di avere figli malati perché durante la formazione della cellula uovo potrà avvenire l'espansione. Le femmine eterozigoti sono di solito asintomatiche, ma nel 50% dei casi trasmettono la mutazione ai figli, sia ai maschi che alle femmine. I maschi affetti non trasmettono la malattia, anche se il 100% delle loro figlie sono portatrici obbligate della mutazione. La patologia è associata alla espansione della regione contente la tripletta localizzata a monte del gene, che determina ipermetilazione dell’isola CpG nel promotore RIASSUMENDO Funzione degli elementi ripetuti ▪ Punti caldi per ricombinazione: plasticità del genoma ▪ Alterazione della espressione genica in quanto portatori di segnali trascrizionali ▪ Presenza in geni per proteine. Le Alu contengono siti criptici di splicing, per cui possono determinare l’esonizzazione dell’introne: trasformare l'introne che ospita una Alu in una sequenza esonica determinando nuovi siti di splicing alternativo e quindi sono fonte di domini proteici; contributo a variabilità delle proteine) ▪ Fonte di pseudogeni processati (ritorno in vita come lunghi esoni? Come nuovi geni? ) Esonizzazione: Il cDNA generato dalla trascrittasi inversa usando come stampo il trascritto di un qualunque gene o retrotrasposone si può integrare, attraverso un meccanismo di retrotrasposizione, nella regione intronica di un altro gene. Se la regione di DNA integrata contiene o acquisisce siti di splicing funzionali può dare origine a un nuovo esone non presente nel trascritto maturo originale. Mostrano una particolare predisposizione a riarrangiamenti con conseguenti effetti fenotipici Di grande interesse in campo medico: Sono note varie malattie genetiche correlate a queste regioni (es. sindrome DiGeorge, Charcot-Marie-Tooth). Duplicazioni segmentali Possono essere originate da: 1. Crossing over diseguale durante la meiosi 2. Scambio diseguale tra cromatidi fratelli Le duplicazioni segmentali (note anche come dupliconi o Low Copy Repeats LCR) sono blocchi di poche sequenze ripetute con omologia reciproca e grado di similarità molto alto (94-99%) grandi 200-400kpb Rappresentano circa il 6% del genoma umano Sono intersperse in tutto il genoma ma maggiormente concentrate nelle regioni pericentromeriche e subtelomeriche, possono contenere inoltre anche geni e pseudogeni (A) Crossing-over disuguale gear ripetute i Coppia di cromosomi omologhi n= -- a ST 2 | _-_ _ Duplicazione Pac a =S (B) Scambio disuguale tra cromatidi fratelli | n n — i Almeno il 10% del nostro genoma e’ costituito da regioni presenti in piu’ o meno copie rispetto alle due attese secondo la genetica mendeliana Che tipo di geni sono contenuti all’interno delle CNV? ▪ Geni per i recettori dell’olfatto ▪ Geni per la risposta immune ▪ Oncosoppressori ▪ Geni per il metabolismo degli ormoni e dei farmaci ▪ Geni per i processi digestivi (i.e. amylase genes) Gene dell’amilasi salivare AMY1 Codifica per l’enzima responsabile della digestione dell’amido Il genoma umano può avere da 2 a 15 copie ripetute in tandem di tale gene Il numero di copie del gene dell’amilasi salivare e’ correlato positivamente con la quantita’ della proteina salivare Le popolazioni che utilizzano di più l’amido nella dieta hanno un maggior numero di copie così da esprimere una maggior quantità di enzima cibi che contengono amido come mais, riso, grano, legumi e patate fanno parte della dieta di questi popoli Il numero di copie del gene AMY1 è alto nelle popolazioni asiatiche Societa’ Biaka Raccoglitori e cacciatori Popolazioni artiche essenzialmente pescatori Basso numero di copie del gene AMY1 • Un maggior numero di chemochine può bloccare il legame del virus HIV al recettore e quindi ostacolare la sua entrata nella cellula E’ stato dimostrato che il numero di copie del gene CCL3L1 e di conseguenza la quantita’ di proteina prodotta varia moltissimo tra gli individui e tra diverse popolazioni Gli individui con un maggior numero di copie del gene sono più resistenti all’infezione da HIV, mentre quelli con un numero di copie minore sono più suscettibili all’infezione del virus Gonzalez, Science, 2005 Ibridazione genomica comparativa su array: Comparative Genomic Hybridization CGH Modificazioni del numero di copie del DNA: monosomie, trisomie, delezioni submicroscopiche e traslocazioni, CNV sono evidenziate mediante analisi comparativa a livello genomico su microarray. La risoluzione è più alta di quella ottenibile con la FISH. Array CGH: The Complete Process Steps 1-3 Patient and control DNA are labeled with fluorescent dyes and applied to the microarray. Step4 Patient and control DNA compete to attach, or hybridize, to the microarray. The microarray scanner measures fluorescent signal intensity. Computer software gathers the data and generates a plot. Step 5 Steps COMPUTER DATA PLOT SOFTWARE (Chromosome 7)