appunti appunti appunti appunti appunti appunti, Appunti di Geologia

Scarica appunti appunti appunti appunti appunti appunti e più Appunti in PDF di Geologia solo su Docsity! I progressi delle ricerche nel campo della biologia molecolare permettono di conoscere con sempre maggiore facilità la sequenza del DNA. Piattaforme di sequenziamento di nuova generazione NGS: next generation sequencing SEQUENZIAMENTO in PARALLELO di un gran numero di frammenti di DNA Riduzione dei tempi: in un solo giorno si ottiene la quantità di dati prodotta in 30 anni mediante il sequenziamento secondo Sanger. Riduzione dei costi: Il goal, ormai vicino, è: un intero genoma al prezzo di 1000 dollari. n.b.:Il sequenziamento dei primi due genomi umani, uno portato a termine dall’NIH e l’altro da una società privata, è costato 300 milioni di dollari!!! @) DNA a doppio COATOTACGTCTAGG filamento 1FGCTACATGCAGATCO== Sequenziamento secondo Sanger Preparazione dello stampo a singolo filamento ANIA NISIATI Assemblaggio di quattro reazioni I ' ‘ i Nucleotide A T G c dal darp dalp dar ; dp ddATP dTTP dp Miscela ridi P dp dGTP derP nucleotidi goTp dOTP dCTP ddGTP deTP derP ddctP deTP Aggiunta di DNA polimerasi ON ANTI DINI DINI DIIIINIISNINIISO (b) EaeoAm ITOTA GTAC CGA] GTACGICTA GTACOTE GIACG ITGTACGI GIACGICTAG TaTACGTOT GIACGICTAGG Gee! l J Primer (O) sr Separazione di un campione di ciascuna miscela di reazione in una corsia separata di un gel di poliacrilammide co M AT G C Lettura della sequenza: ACATGCAGATCC E Sh fa WI =» - e 0 a i n Piattaforme NGS: •Utilizzano nanotecnologie •Sequenziano in maniera parallela molecole di DNA amplificate in maniera clonale •Non prevedono una separazione elettroforetica. •454 genome sequencer FLX della Roche •Genome Analyzer della Illumina •SOLiD della Applied Biosystem Piattaforma 454 Tecnologia 454 Produce fino a 400 Mb in 4 ore. In 2-3 settimane si ottiene un genoma umano completo. Rilevazione della chemiluminescenza prodotta dal rilascio del pirofosfato nella reazione di sintesi del DNA. Limiti: compie errori su omopolimeri di lunghezza superiore ai 5-6 nt La luce prodotta nella reazione viene registrata da una CCD camera e viene visualizzata sotto forma di picco nell’output della macchina: pirogramma. L’altezza di ciascun picco corrisponde all’intensità del segnale luminoso registrato ed è proporzionale al numero di nucleotidi incorporati. Difficile determinare la lunghezza di omopolimeri più grandi di 6 nt. Fasi del sequenziamento con la piattaforma 454 Preparazione della libreria di DNA: Ligazione di adattatori A e B biotinilati ai frammenti da sequenziare Es: DNA genomico (gDNA) frammentato per nebulizzazione o prodotti di PCR Selezione mediante purificazione avidina/biotina. Un adattatore servirà per il successivo legame alla microbiglia, l’altro è complementare al primer per la emulsion-PCR. Amplificazione clonale in emulsione acqua-olio: i frammenti a singolo filamento vengono mescolati con un eccesso di microbiglie di agarosio, sulle quali si legano (un frammento per ogni microbiglia). Produzione di microreattori costituiti dalle micelle che si formano mescolando le microbiglie con una emulsione acqua-olio costituita da micelle contenente i reagenti necessari per la PCR: EMULSION-PCR Le molecole di DNA vengono amplificate in maniera clonale ciascun microreattore dà luogo a una polonia (neologismo per: PCR + colonia) Piattaforma ILLUMINA PIATTAFORMA ILLUMINA Anche questa piattaforma prevede una fase di amplificazione clonale del DNA ottenuto dalla frammentazione del campione in esame. I frammenti di DNA ottenuti, opportunamente modificati dall’aggiunta di adattatori alle due estremità, vengono legati su un vetrino sul quale erano stati precedentemente fissati un gran numero di primer complementari agli adattatori. Sequencing-By-Synthesis Demo Attach DNA to surface Bind single stranded fragments randomiy to the inside surface of the flow cell channels. * PREV NEXTA Ottenimento delle singole eliche costituite dall’estensione dei primer. Aggiunta di primer per il sequenziamento Sequenziamento mediante deossinucleotidi fluorescenti con un gruppo bloccante termolabile al 3’. I dNTPs vengono aggiunti tutti assieme ad ogni ciclo. Solo quello complementare allo stampo viene incorporato e ne viene rivelata la fluorescenza. Rimozione del gruppo bloccante e successiva aggiunta di nuovi dNTPs. Vantaggi: poiché viene inglobato 1 nucleotide per volta si risolvono problemi legati alla presenza di tratti omopolimerici. In un singolo esperimento si possono produrre 2 miliardi di letture di lunghezza di circa 100 pb. A) Roche 454/Pyrosequencing Sequencing library preparation Pyrosequencing Primer amcesli ammo Non one dNTP Ne “a flow E Leni base incorporation = e paia "= | Release of So (Ppi) ATP sulfurylase rn Si 2 Appriolà HYruciferase +4 Emulsion PCR Beads carrying single-stranded DNA clones are deposited into wells of a fibre-optic slide B) illumina sequencing DNA sample I tai Adapter Iigation Fragmentation Alla library viene aggiunto un primer complementare all’adattatore. Vengono aggiunte le sonde di interrogazione: per ciascun frammento si appaia una sonda, che viene ligata al primer. Le sonde non ligate vengono rimosse per lavaggio e si rileva la fluorescenza emessa dalla sonda appaiata: si determina la sequenza dei primi due nt del frammento. Digestione della sonda per eliminare gli ultimi 3 nt. Successiva reazione di appaiamento e ligazione con la sonda. Dopo 7 cicli di ligazione si conosce la sequenza dei dinucleotidi in posizione 1-2; 6-7; 11-12; 16-17; 21-22; 26-27; 31-32 rispetto al primer. Ligasi Biglia di emulsione z Î 9 Primer n AroeT A (OIL ELILII4 IL 44 |L III ALII ASILI III LIES IIIIIALII Adattatore P1 TA Stampo Taglio n. D Primer n ATnnn 0 S TITTITITTTTITITITTTTT® 5 BO (COMALLILILILILL LAI IA III VISI III VISI III LILIAN III III LIL, Adattatore P1 TA Stampo Ligasi gi Primer n AT TTnnnzz: @ c (OLMI LL III ALII ASILI I IIS III III III LISI ILLE - Adattatore P1 TA AA Stampo Primer n 3 GT GT ET CA GC po (CYAMLLLLI LILLA LALA ALII VISI IA II III III III III III, Adattatore P1 TA AA GA CA AA GT cG Stampo Denaturazione, rimozione del primo primer e ibridazione con il secondo primer, sciftato di un nucleotide (n-1) rispetto al precedente Secondo ciclo di sequenziamento. Si ottengono le sequenze dei dinucleotidi in posizione: 0-1; 5-6; 10-11; 15- 16; 20-21; 25-26; 30-31. L’utilizzo di primers progressivamente spostati di un nucleotide, fino a n-4 consente di determinare due volte ciascuna delle basi presenti sul DNA. In una corsa si genera più di 1 miliardo di reads di 60 pb Poiché ciascun nucleotide viene letto due volte, il sistema è particolarmente adatto alla identificazione di mutazioni geniche. Un cambiamento nucleotidico determina il cambiamento di due colori adiacenti. Nuove tecnologie di terza generazione: sequenziare singole molecole di DNA, senza la fase preliminare dell’amplificazione clonale, che può portare all’introduzione di artefatti (errori compiuti dalla polimerasi durante questa fase). Il filamento di DNA da sequenziare viene ancorato, insieme ad una DNA polimerasi, sul fondo di una zero-mode waveguide (ZMW - una nanostruttura fotonica: un minuscolo tubo all'interno del quale è possibile rilevare cambiamenti infinitesimali di luce colorata). Il complesso DNA-polimerasi viene cimentato con una soluzione contenente i quattro nucleotidi (A, C, G e T), opportunamente marcati ciascuno con un fluorocromo diverso. La DNA polimerasi comincia ad incorporare i nucleotidi. Quando il nucleotide viene incorporato, il i fluorocromo del nucleotide viene rilasciato e l'apposito sistema di d\, rilevazione registra l'evento luminoso associato. Il software di elaborazione rielabora quindi i segnali luminosi registrati fino a ricostruire la sequenza. Un intero genoma eucariotico viene completamente sequenziato in 8-10 ore. * lon Torrent ha messo in vendita un sequenziatore piccolissimo, che costa un decimo di quello di Pacific Biosciences: registra gli inserimenti dei nucleotidi misurando la variazione di pH determinata dalla formazione del legame fosfodiestere (il gruppo OH in 3' che funge da nucleofilo perde un H+ quando viene impegnato nella formazione del legame. Per essere sicuri di sequenziare l’intero genoma è necessario che la library sia ridondante, cioè sia rappresentativa del genoma 10x. Bisogna assicurarsi di avere un numero di cloni tale che ogni frammento del DNA sia rappresentato 10 volte (sia presente in 10 cloni diversi). Produzione di una sequenza genomica: Sequenziamento dei frammenti Assemblaggio dei contigui Produzione della sequenza grezza: Draft sequence contenente errori e incertezze. Sequenziamento mirato per chiudere i gap e correzione degli errori evidenti Produzione della sequenza finita, ad un livello prescelto di accuratezza Annotazione: identificazione di sequenze codificanti, predizione della natura dei prodotti. Oggi: sequenziamento in parallelo di tutti i frammenti di DNA mediante piattaforme NGS. Poiché la lunghezza di ciascun frammento di sequenza varia da 20 a 700 pb, a seconda della piattaforma usata il volume di dati da analizzare è enorme. Esistono algoritmi ad hoc per analizzare i dati metagenomici: es. MEGAN MEtaGenome ANalyzer Bioinformatica: nuova disciplina che combina la tecnologia dell’informazione con la biotecnologia. Area dell’informatica dedicata alla raccolta, organizzazione e analisi dell’enorme volume di dati di sequenze di DNA e proteine generate dai laboratori di genomica e proteomica. •Localizzare sequenze in database pubblici tramite codici di accesso o parole chiave •Allineare sequenze •Analizzare schemi di sequenze per individuare siti di restrizione, promotori, domini di legame al DNA •Eseguire analisi filogenetiche Interazioni tra il microbiota intestinale e l’ospite Il tratto gastrointestinale umano ospita organismi che fanno parte di tutte e 3 i grandi domini dell’albero della vita: archea, batteri e eucarioti. 100 trilioni di organismi tra archea e batteri, appartenenti a più di 1000 specie diverse. 1 trilione = 1 000 000 000 000 000 000 o 1018 L’intero corpo umano è fatto da un numero di cellule intorno a 1014- 1015 Ospitiamo più batteri di quante siano le cellule del nostro corpo!! • Microbiota: l’insieme delle comunità microbiche che popolano uno specifico ambiente • Microbioma: contenuto genomico totale di un microbiota In prevalenza batteri: Firmicutes, Bacterioidetes, Actinobacteria e Proteobacteria. I batteri, gli archea, i funghi e i lieviti nel tratto gastrointestianle convertono in vari metaboliti nutrienti e altre sostanze derivate dall’ospite. La composizione del microbiota è influenzata dalla dieta:  Enterotipo 1: prevalentemente Bacteroidetes, dieta ricca in grassi e proteine animali  Enterotipo 2: prevalentemente Prevotella, dieta ricca in carboidrati  Enterotipo 3: Ruminococcus, dieta varia. Comparazione del microbiota tra bambini italiani e bambini dell’Africa rurale (Burkina Fasu), con dieta prevalentemente ricca in fibre La composizione del microbiota influenza lo stato di salute dell’ospite. Il microbiota dei soggetti obesi è composto da batteri con notevoli capacità di assorbimento delle calorie, che predispongono l’ospite all’accumulo di grasso e all’insulino-resistenza. Obesità:BMI>30 BMI (indice massa corporea): peso/altezza2 Il microbiota influenza processi metabolici negli organi periferici: • controllo della sazietà nel cervello • rilascio di adipochine dal tessuto adiposo viscerale • sintesi e accumulo o metabolismo dei lipidi nel fegato, tessuto adiposo e muscolo • incremento della permeabilità intestinale con conseguente infiammazione e insulino- resistenza. Lo stato infiammatorio cronico è un fattore di rischio per patologie cardiovascolari >Otu00001_45895 ACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGTGCCTCGAGCACTTAGTGGCGCAGTTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGA CGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACCCTTGACATCCTCGGAATCTGCCGGAGACGGCGGAGTGCCTTCGGGAACCGA GTGACAGGTG >Otu00002_1249 GCGCCGTAAACGATGAATGCCAGACGTCGGGGGGCTTGCCCTTCGGTGTCACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGAC GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATCGCCTGACCGGCCTGGAGACAGGTTTTCCCCGCAAGGGGCAGGT GGACAGGTG >Otu00003_476 TAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTTGCGAGTATCGACCCTCGCAGTGCCGTAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCGCGCAAGCGTGAAACTCAAAGGAATTG ACGGGGGCCCACACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGACTTGACATGTCGCGAATCTTAGGGAAACCTAAGAGTGCCTTCGGGAGCGC GAACACAGGTG >Otu00004_358 TAGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTGGGCGGAGTCGAATCTGTCTGTGCCGAAGCCAACGCGATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAAGAATTG ACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTTCTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTAGGCTTGACATGGTGCTGCAAGCGCACAGAAATGTGTGACCTTCGAGGGTGCA CCACAGATG Otu00001_45895 Bacteria(100);"Proteobacteria"(100);Gammaproteobacteria(100);Oceanospirillales(98);Halomonadaceae(97);Hal omonas(88); Otu00002_1249 Bacteria(100);"Proteobacteria"(100);Alphaproteobacteria(100);Rhodobacterales(99);Rhodobacteraceae(99);Rub ellimicrobium(98); Otu00003_476 Bacteria(100);Cyanobacteria/Chloroplast(99);Cyanobacteria(99);FamilyVI(29);FamilyVI(29);GpVI(29); Otu00004_358 Bacteria(100);"Actinobacteria"(98);Actinobacteria(98);Rubrobacterales(97);Rubrobacteraceae(97);Rubrobacte r(97); Ciascuna sequenza rappresenta una OTU: unità tassonomica operativa, che è utilizzata per identificare una specie, tramite confronto con una banca dati di sequenze specie-specifiche La regione genica scelta come etichetta molecolare deve: •essere localizzata in regioni conservate del genoma e quindi facilmente amplificabile con primer universali •possibilità di essere standardizzata per essere usata in qualsiasi tipo di esperimento si voglia effettuare •presentare variabilità interspecie, ma non intraspecie •non deve essere troppo lunga, per non creare problemi per campioni in cattivo stato di conservazione: Frammento di 650 pb del gene mitocondriale per la subunità I della citocromo ossidasi: COI Oppure rDNA (16S RNA per i procarioti e 18S RNA per gli eucarioti) Perché il DNA mitocondriale? I mitocondri di piante e animali hanno un proprio genoma. mt-DNA: molecola circolare chiusa.