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REGOLAZIONE dell’ESPRESSIONE negli EUCARIOTI A LIVELLO dell’ INIZIO della TRASCRIZIONE Geni trascritti dalla RNA polimerasi II RNA Polimerasi eucariotiche • RNA pol I si trova nel nucleolo ed è responsabile della trascrizione delle specie di rRNA • RNA pol II si trova nel nucleoplasma ed è responsabile della sintesi dell’hnRNA, precursore degli mRNA e altre specie di piccoli RNA (snoRNA, snRNA e microRNA) • RNA pol III produce i tRNA e altri piccoli RNA Sono grandi proteine di circa 12 subunità, ognuna con il suo tipo di promotore RNA pol di mitocondri e cloroplasti sono enzimi più piccoli Regione del DNA su cui si lega la RNA polimerasi e i fattori di trascrizione per dare inizio alla trascrizione Può essere lungo decine di kb a monte rispetto all’inizio della trascrizione (negli eucarioti è più lungo che nei batteri) E’ definito da una serie di brevi sequenze consenso* di solito nella regione a monte rispetto al punto di inizio della trascrizione PROMOTORE *Sequenza teorica costruita confrontando tra loro piu’ sequenze reali e annotando per ciascuna posizione il nucleotide presente più frequentemente. ACGTAACTTACCGTTACG ACATATGTTGCCATTAGG GCGTAAGTTATCACTAGG consensus ACGTAAGTTACCAATAGG La trascrizione nei batteri è generalmente sottoposta ad un controllo di tipo negativo in cui la RNA polimerasi oloenzima (associata al fattore sigma) si lega direttamente al promotore, dirigendo la trascrizione del gene immediatamente a valle a meno che venga repressa dalla presenza di un repressore Promotori procariotici I promotori batterici hanno due sequenza consenso distinte Promotori eucariotici Negli eucarioti esistono tre classi di promotori riconosciuti rispettivamente dalla RNA polimerasi I, II e III Negli eucarioti il controllo della trascrizione è generalmente di tipo positivo e la RNA polimerasi non è in grado di sostenere una trascrizione efficace senza l’ausilio di fattori aggiuntivi. Inoltre La RNA polimerasi non si lega direttamente al promotore ma ha bisogno di una serie di fattori di trascrizione che formano il cosiddetto complesso di pre-inizio che presiede a livelli basali di trascrizione I promotori eucariotici sono ricchi di sequenze di legame per fattori di trascrizione Elementi del nucleo del promotore della RNA PolII Contribuiscono alla trascrizione basale Possono essere tutti presenti o solo alcuni La loro posizione e l’orientamento sono fissi. Sono tutti riconosciuti da TFIID, a parte l’elemento BRE. TATA box è presente in meno del 50% dei promotori identificati. Può funzionare anche in assenza degli altri elementi. INR: può funzionare in assenza di TATA, ma possono funzionare sinergicamente DPE: si trova nei promotori TATA-less. Necessita dell’elemento INR MTE: ha attività sinergica nei confronti di TATA o DPE. I fattori di trascrizione generali si legano al nucleo del promotore Nucleo del promotore (promotore core) = sequenza minima (40-60 nt, a monte e a valle del sito di inizio della trascrizione) che permette alla polimerasi e ai fattori basali di iniziare la trascrizione L’assemblaggio dei fattori basali al nucleo del promotore consente solo una bassa efficienza di trascrizione Efficienza di un promotore = numero di trascritti prodotti nell’unità di tempo. La trascrizione eucariotica di molti geni, oltre che l’apparato basale di trascrizione può richiedere molti altri fattori Gli attivatori/repressori, i coattivatori/corepressori si legano ad altre sequenze bersaglio che si trovano a monte del nucleo del promotore 1. Fattori generali di trascrizione, TFII: necessari alla RNA pol per formare il complesso di inizio su tutti i promotori: determinano il riconoscimento del promotore. Mediatore: complesso di 20 subunità che trasduce le informazioni dagli attivatori o repressori alla RNA Pol La trascrizione negli eucarioti richiede l’intervento di molti fattori 2. Fattori di trascrizione: legano sequenze specifiche, prossimali o distali, e attivano o reprimono la trascrizione = fattori a monte 3. Co-attivatori e co-repressori: attivano o reprimono la trascrizione mediante interazioni proteina-proteina (non si legano al DNA). Reclutano proteine in grado di modificare la struttura della cromatina Apparato basale TBP TBP La specificità del legame è determinata da due coppie di residui di fenilalanina che con il loro anello aromatico si intercalano tra le basi del DNA ad entrambe le estremità della sequenza di riconoscimento e determinano il ripiegamento di 80° del DNA. I fattori trascrizionali e la RNA pol risultano più vicini di quanto lo sarebbero su un DNA lineare TFIIB posiziona la RNA Pol misurando la distanza dalla TATA box. Definisce la direzione della trascrizione e determina il filamento stampo Interagisce con TBP, col DNA nella regione =>) della curvatura indotta da TBP, e con la RNA pol. RI pere TFNE ri Il dominio dito B (B-finger) si inoltra nel canale di fuoriuscita dell'RNA nel sito attivo della RNA pol: stabilizza l'ibrido RNA-DNA. Ruolo simile alla regione linker 3-4 del fattore sigma procariotico. Quando l'RNA in crescita supera i 5-6 nt, deve competere con TFIIB per lo spazio nella cavità dell'enzima. Esiti: sintesi abortiva oppure espulsione di TFIIB e distacco della RNA Pol dal promotore. ® Assemblaggio del complesso di preinizio MP BI VA Mediatore ——RNA polimerasi Il TRIE di Blicasi e chinasi USRIAA) _Siolo Il ©@ Inizio din So dia Dopo l'evasione dell > 9 70) ORIO & Ci (PYÙN po l'evasione della RNA pol è so probabile che TFIID resti legato al promotore per facilitare l'assemblaggio di un nuovo complesso di trascrizione @) Reinizio Il mediatore: un ponte molecolare La RNA Pol con i TF non è in grado di rispondere agli attivatori/repressori che regolano l’efficienza della trascrizione. Il mediatore connette la Pol con le prot regolatrici legate agli elementi a lungo raggio. Inoltre stimola l’attività chinasica di TFIIH. E’ un componente del complesso di preinizio: lega la RNA Pol interagendo con il CTD e la trasporta sul promotore. I fattori di trascrizione basali eucariotici hanno un ruolo analogo a quello del fattore sigma dei batteri: permettere alla RNA pol II di riconoscere in modo specifico le sequenze del promotore che segnalano il sito di inizio della trascrizione Questo assemblaggio non è sufficiente per una trascrizione efficiente Occorre il legame dei fattori di trascrizione agli elementi a monte che fanno aumentare (attivatori) o diminuire (repressori ) la frequenza di inizio. • Facilitano la formazione del complesso di pre-inizio (reclutamento e legame di TF e RNA pol al promotore) • Induzione di un cambiamento conformazionale o modificazione chimica (es. fosforilazione) che stimoli l’attività trascrizionale • Interazione con i complessi di rimodellamento della cromatina per permettere una migliore accessibilità del DNA Elementi prossimali CCAAT box a -75bp lega i fattori CBF (proteina che lega CAAT) e C/EBP (proteina che lega CAAT/enhancer) GC box (GGGCGG), a -90pb a monte del TATA box, lega uno specifico fattore Sp1 Ottamero: è una sequenza di 8pb in varia posizione nel promotore. Lega Oct-1 Gli elementi a monte legano attivatori o repressori, ma anche «elementi di collegamento» che reclutano fattori legati a siti distali, es: ad enhancer. ELEMENTI di RISPOSTA del GENE per la METALLOTIONEINA Questi elementi rispondono a differenti stimoli esterni, costituiti da sostanze di natura proteica e non proteica (glucocorticoidi, metalli pesanti). La funzione delle metallotioneine è legata alla loro abilità di legare metalli pesanti, quali Zn, Cu, Cd, grazie alla presenza di numerosi residui di cisteina. Esse agiscono come buffer omeostatici nei confronti dei micronutrienti metallici (Zn, Cu) e come molecole detossificanti nei confronti dei metalli tossici (Cd). MTF1: fattore di trascrizione che induce l’espressione dei geni coinvolti nella detossificazione dei metalli pesanti. E’ una proteina citoplasmatica che passa nel nucleo a seguito dell’esposizione ai metalli pesanti e si lega ai promotori dei geni che contengono un elemento MRE. Glucocorticoidi: ormoni steroidei, capaci di attraversare le membrane. Cortisolo: risposta allo stress, mediante attivazione dei geni della risposta antiinfiammatoria. • Metalli pesanti • Metalli con peso atomico superiore di quello del ferro (55) • densita' molto elevata (superiore ai 5 g/cm3) • si comportano in genere come cationi • bassa solubilita' dei loro idrati • spiccata attitudine a formare complessi • affinita' verso i solfuri • ferro, cobalto, cromo, rame, manganese, molibdeno, selenio, zinco: metalli indispensabili per gli organismi viventi, con potenziale tossicita‘ se la loro concentrazione è eccessiva. • alluminio, arsenico, berillio, cadmio, mercurio, nichel e piombo: ritenuti prevalentemente tossici. • mercurio, cadmio, cromo e piombo: i maggiori responsabili dei danni ambientali e alla salute. I metalli pesanti si legano facilmente ai gruppi sulfidrici (SH) delle proteine, il complesso metallo-zolfo altera la struttura della proteina e nel caso di enzimi ne determina l’inattivazione. R-S-H + R-S-H + M2 R-S-M-S-R + 2H+ L'eliminazione di tali metalli avviene solo in minima parte, per salivazione, traspirazione, allattamento, portando a bioaccumulo. I metalli si concentrano, danneggiandoli, in particolare in alcuni organi: cervello, fegato e reni e nelle ossa, e sono spesso un fattore aggravante o determinante, in numerose malattie croniche. Danni all'organismo Allumino - Danni al sistema nervoso centrale, demenza, perdita di memoria Antimonio - Danni cardiaci, diarrea, vomito, ulcera allo stomaco Arsenico - Cancro linfatico, cancro al fegato, cancro della pelle Bario - Aumento della pressione arteriosa, paralisi Bismuto - Dermatite, stomatite ulcerosa, diarrea Cadmio - Diarrea, dolori di stomaco, vomito, fratture ossee, danni immunitari, disordini psicologici Cromo - Danni ai reni e al fegato, problemi respiratori, cancro polmonare, morte Rame - Irritazioni al naso, bocca ed occhi, cirrosi epatica, danni al cervello e ai reni Gallio - Irritazione alla gola, difficolta' respiratorie, dolori alla cassa toracica Afnio - Irritazione agli occhi, alla pelle e alle mucose Indio - Danni al cuore, reni e fegato Iridio - Irritazione agli occhi e al tratto digestivo Lantanio - Cancro polmonare, danni al fegato. E’ presente nei televisori a colori Piombo - Frutta, verdura, carni, cereali, vino, sigarette ne contengono. Causa danni al cervello, disfunzioni alla nascita, danni ai reni, difficolta' di apprendimento, distruzione del sistema nervoso Manganese - Coagulazione del sangue, intolleranza al glucosio, disordini allo scheletro Mercurio - Distruzione del sistema nervoso, danni al cervello, danni al DNA Nickel - Embolia polmonare, difficolta' respiratorie, asma e bronchite cronica, reazione allergiche della pelle Palladio - Altamente tossico e carcinogeno, irritante Platino - Alterazioni del DNA, cancro, danni all’intestino e reni Rodio - Macchie alla pelle, potenzialmente tossico e cancerogeno Rutenio - Altamente tossico e carcinogeno, danni alle ossa Scandio - Embolia polmonare, minaccia il fegato quando accumulato nel corpo Argento - Usato come colorante E174, emicrania, difficolta' respiratorie, allergie della pelle, estremamente concentrato causa coma e morte Tantalio - Cancro ai polmoni, nei bambini difficolta' di sviluppo delle ossa Stronzio - Irritazione agli occhi, e alla pelle, lesione del tratto respiratorio superiore Tallio - Usato come veleno per topi, danni allo stomaco, al sistema nervoso, coma e morte, per chi sopravvive al Tallio rimangono danni al sistema nervoso e paralisi Stagno - Irritazione agli occhi e alla pelle, emicrania, dolori di stomaco, difficolta' ad urinare Tungsteno - Danni alle mucose e alle membrane, irritazione agli occhi Vanadio - Disturbi cardiaci e cardiovascolari, infiammazioni allo stomaco ed intestino Ittrio - Altamente tossico, cancro ai polmoni, embolia polmonare, danni al fegato Come sono fatti i fattori di trascrizione? Sono proteine modulari, organizzate in più domini. i Figura 11.18 Attivatori della tra- Dominio i scrizione. La struttura semplifi- di attivazione cata dell'attivatore trascrizionale Gal4 mostra la presenza di due domini funzionali separati: uno che lega il DNA come un dimero, l'altro che attiva la trascrizione interagendo con il complesso di inizio e la polimerasi. Dominio di legame al DNA Sito di legame al DNA Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia Molecolare Copyright 2011 CEA Casa Editrice Ambrosiana R Figura 11.20 Esperimento del- lo scambio dei domini (domain swapping). Con questo esperi- mento è stata dimostrata la strut- tura degli attivatori degli eucarioti Dominio di attivazione Dominio di legame costituiti da due domini separati, : al DNA quello di legame al DNA e quello di attivazione. In (A) la proteina Gal 4 è in grado di legarsi al DNA, Acceso ma se è priva del dominio di atti- i vazione, la trascrizione non avvie- Sito di Gal4 ne. In (B) il dominio di legame al : DNA di LexA, che è un repressore batterico, è stato fuso al dominio : di attivazione di Gal 4. Come si ve- lacZ de, latrascrizione è attivata solo se © Spento ‘a monte del promotore è presente la sequenza di riconoscimento Sito di Gal4 specifica per LexA. In questo espe- ! rimento è stato usato a valle del i B Dominio promotore il gene reporter /acZ, si legame: È che permette la quantificazione a del livello di trascrizione, misuran- lacz do l'attività della B-galattosidasi Spento Sito di LexA Dominio di attivazione di Gal4 Dominio di legame al DNA di LexA Acceso Sito di LexA Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia Molecolare Copyright 2011 CEA Casa Editrice Ambrosiana Motivi del dominio di legame il DNA Il dominio posiziona il fattore di trascrizione su una specifica sequenza del DNA (sequenza consensus). I fattori possono essere suddivisi in categorie che presentano «motivi» correlati. MOTIVO: un gruppo di residui aminoacidici che mostrano uno schema caratteristico di ripiegamento e che svolgono una funzione specifica. Sequence logo: visualizzazione grafica che consente di apprezzare il grado di conservazione di ciascuna base nella sequenza consensus Caratteristico delle proteine regolatrici procariotiche 3 a-eliche ripiegate. L’elica 3 (elica R: di riconoscimento) penetra nel solco maggiore del DNA MOTIVO STRUTTURALE ELICA-GIRO-ELICA (HTH) La struttura del DNA risulta deformata dalla interazione Bending del DNA Esistono varianti con 2 o 4 eliche. Nella variante HTH winged, il giro è sostituito da un’ala, costituita da 2 foglietti b OMEODOMINIO E’ una variante dell’HTH Dominio di 60 aa organizzato in 3 a-eliche: l’elica R contatta 6 pb nel solco maggiore. Presenta un braccio flessibile, non strutturato, che interagisce col solco minore. Le proteine che contengono gli omeodomini agiscono da attivatori o da repressori della trascrizione, soprattutto di geni coinvolti nello sviluppo (geni omeotici o omeobox) MOTIVO a DITA di ZINCO Un atomo di zinco coordina 4 residui di cisteina e/o istidina, formando un’ansa di 12- 13 amminoacidi che ricorda la forma di un dito. Aa idrofobifici sulla punta dell’ansa la stabilizzano. L’ansa è costituita da una a-elica, che interagisce con il solco maggiore del DNA, e un foglietto b. In genere ci sono più motivi a dito di zinco, adiacenti separati da un linker di 7-8 aa: ogni dito aggiuntivo aumenta la specificità del legame al DNA. Ciascun dito riconosce sequenze contigue di 3 nt. Dominio elica-ansa-elica (HLH: helix-loop-helix) Due a-eliche anfipatiche (i residui idrofobici sono su una faccia e quelli idrofilici sull’altra), ognuna di 40 aa, connesse da un’ansa. Dominio basico nella regione N-terminale dell’elica piu’ lunga, con il quale interagisce col DNA. LA dimerizzazione è dovuta alle interazioni idrofobiche tra le facce dei due monomeri. Sempre sotto forma di eterodimeri. A seconda del partner, la stessa proteina può assumere ruoli opposti: Max-Myc: attivatore trascrizionale Max-Mad: repressore. Dominio di transattivazione • Regolazione della trascrizione mediante interazioni proteina-proteina. • Reclutamento o accelerazione dell’assemblaggio dei fattori generali di trascrizione sul promotore • Interazione con i coattivatori. Motivi ricchi di aa acidi (blob acidi) Motivi ricchi di glutammina Motivi ricchi prolina e foglietti b idrofibici Dominio di dimerizzazione Coinvolto nell’interazione tra due proteine uguali, o simili. Motivo leucin zipper Motivo elica-ansa-elica. Nella maggior parte dei casi l’attività del promotore è enormemente aumentata dalla presenza di uno o più enhancer, cis-agenti, posti a una distanza variabile dal nucleo del promotore, a volte anche a decine di kb L’orientamento rispetto al gene è vario e la posizione non è fissa. Può essere bidirezionale: può trovarsi a monte o a valle del promotore, in un introne È un elemento di circa 500pb, modulare come il promotore, costituito da brevi elementi di sequenza (circa 10) che legano vari fattori di trascrizione ELEMENTI REGOLATORI A LUNGO RAGGIO: Enhancer, isolatori, LCR, MAR Puo’ attivare il promotore in maniera tessuto- specifica. L’enhaceosoma è il complesso di fattori di trascrizione che si assembla in modo cooperativo a livello di un enhancer ISOLATORE Sequenza che blocca la trasmissione di un effetto attivante (o silenziante) con due i meccanismi: impedisce la diffusione della eterocromatinablocca il passaggio di fattori attivatori (o inattivatori) SIGNIFICATO degli ISOLATORI: Aumentano la precisione della regolazione genica 1. Impediscono che un enhancer funzioni indiscriminatamente: un enhancer agisce solo sul promotore più vicino 2. Impediscono che un promotore sia inattivato per errore dalla propagazione della cromatina Complessi di rimodellamento della cromatina Condizione necessaria per l’inizio della trascrizione è che la cromatina si trovi in forma aperta, con il DNA accessibile Durante la trascrizione cambia la struttura della cromatina Ciò comporta un cambiamento della organizzazione dei nucleosomi Lo studio delle trasformazioni della cromatina durante la trascrizione ha portato alla scoperta dei Coattivatori e corepressori I fattori di trascrizione legano proteine che fungono da Co-attivatori o co-repressori: in grado di alterare la struttura della cromatina o di reclutare altre proteine con questa attività. Complessi di rimodellamento della cromatina: svolgimento del DNA ATP dipendente. Riposizionamento degli istoni per permettere l’accesso al DNA dei fattori di trascrizione. 1.Scivolamento dei nucleosomi sul DNA 2.Rimodellamento dei nucleosomi 3.Spostamento per dissociazione completa 4.Sostituzione di un istone con una variante che impedisce la diffusione dell’eterocromatina nella eucromatina (H2A.Z presente negli istoni della cromatina attivamente trascritta). CONCLUDENDO La trascrizione richiede un cambiamento strutturale della cromatina per permettere l’accesso al DNA della polimerasi e dei fattori di trascrizione Inoltre: Gli ottameri di istoni vengono spostati durante la trascrizione, si disassemblano e riassemblano con l’aiuto di fattori proteici I nucleosomi si riorganizzano quando la RNA polimerasi passa attraverso un gene Come avviene il reclutamento di tutte queste proteine sul promotore? Processo dinamico secondo il quale le proteine coinvolte nella trascrizione interagiscono tra loro e con il DNA. Influenza dei complessi di rimodellamento della cromatina. • I fattori presi singolarmente si legano al promotore e agli enhancer con bassa specificità. • Il legame cooperativo di più proteine regolatrici a siti raggruppati sul DNA fornisce l’elevato grado di specificità necessario. Due modelli per l’assemblaggio: ✓ Modello dell’enhanceosoma ✓ Modello colpisci e fuggi Enhanceosoma Il complesso dei fattori di trascrizione è stabilizzato dalle interazioni che si creano tra ciascuno di essi e il DNA (legame cooperativo), e che avvengono in più passaggi ES: Il legame dei fattori di trascrizione è sfavorito perché il DNA presenta una curvatura intrinseca. Il legame delle «proteine architettoniche» HMG al promotore raddrizza il DNA facendo abbassare l’energia libera necessaria per il legame dei fattori di trascrizione. L’assemblaggio dell’enhanceosoma avviene tramite interazioni proteina-proteina Viene reclutata la RNA polII Saggio di sensibilità alla DNasi Sito ipersensibile Sito di restrizione Taglio con l'enzima di restrizione Elettroforesi, trasferimento e uso di una sonda per | una regione adiacente al sito di restrizione La banda è un frammento di taglio in cui un’estremità è prodotta n dalla DNasi | e l’altra dall’enzima di restrizione Determinazione dei siti ipersensibili Digestione della cromatina con la DNasi | VI KK,I Elettroforesi dei frammenti e denaturazione del DNA: una sonda per un gene espresso e una per uno non espresso Sonda 1 = — Sonda 2 Si confronta l'intensità delle bande presenti in preparazioni in cui la cromatina è stata digerita ‘con concentrazioni crescenti di DNasi DNasi DNasi Il DNA della sonda 1 Il DNA della sonda 2 è preferenzialmente non è preferenzialmente digerito digerito Gli eritroblasti di embrione di pollo di 15 gg sintetizzano attivamente a-globina ma non vitellogenina che è espressa solo nel fegato 1. Isolamento nuclei dagli eritoblasti 2. Incubazione con concentrazioni crescenti di DNasiI 3. DNA estratto e digerito con Bam HI che taglia i 2 geni in frammenti di 1.5 e 3.7 kb rispettivamente 4. Analisi Southern con sonde per a-globina e vitellogenina, rispettivamente Il DNA a-glob trascrizionalmente attivo era sensibile alla DNasi (la banda sparisce alla concentrazione di DNasi di 0.25 mg/ml.) DNA inattivo VTG era resistente anche ad alte concentrazioni di DNasi. Tipicamente siti di ipersensibilità alla DNasi I sono riscontrati su sequenze regolative come gli ENHANCER e i PROMOTORI, ma anche su altri elementi più complessi LCR (Locus Control Region) Questi elementi delimitano e definiscono dei domini funzionali e presentano ipersensibilità piuttosto estesa alla DNasi I (a volte su regioni di parecchie Kb). LCR e patologie: Talassemie Famiglia di malattie tutte caratterizzate dalla produzione ridotta dell’emoglobina deficit nel trasporto dell’ossigeno L’eziologia è eterogenea ma risiede sempre in una alterazione (una o più mutazioni puntiformi, delezione) nei geni della alfa o beta globina La talassemia ispanica è una forma di talassemia caratterizzata da delezioni della regione che contiene i geni della b-globina Ridotta quantità di emoglobina nel sangue con conseguente anemia più o meno grave a seconda dell’ampiezza della delezione e dello stato di omozigosità o eterozigosità Gli esperimenti dimostrano l’esistenza di delezioni che non interessano direttamente le sequenze dei geni ma la regione regolatoria LCR. Tale alterazione dell’LCR porta al silenziamento dei geni anche se essi sono intatti. Esperimenti con DNasi I hanno dimostrato che In soggetti sani, la regione della famiglia dei geni della beta globina è trascrizionalmente attiva, la cromatina a monte dell’LCR è resistente alla DNasi I, quella a valle è sensibile Viceversa, nel malato, in cui la LCR è deleta, la regione a valle (locus ispanico) è resistente alla DNasiI cioè è trascrizionalmente inattiva Perché avvenga la trascrizione la cromatina deve essere in una conformazione tale da rendere accessibile il DNA che deve essere trascritto la cromatina deve essere rimodellata per consentire al macchinario della trascrizione di lavorare Riassumendo pertanto FABBRICHE di TRASCRIZIONE e TERRITORI CROMOSOMICI La trascrizione provoca una decondensazione visibile dei territori della cromatina, formando regioni decondensate associate a “fabbriche di trascrizione” associate alla matrice Le fabbriche sono associazione di anse contenenti un numero di geni attivi, molecole di RNA pol e fattori Le anse di cromatina appaiono come estruse a formare una nuvola Le anse collassano quando cessa la trascrizione • Le fabbriche contengono un certo numero di geni attivamente trascritti e sono associate ai complessi dei pori nucleari • In tal modo i geni trascrizionalmente attivi si associano nei pressi del complesso del poro e viene favorito l’ingresso immediato dei pre-mRNA nelle vie di modificazione e nell’esportazione al citoplasma • Il chromosome painting dimostra che ogni cromosoma occupa nel nucleo un suo territorio • In genere i cromosomi con alta densità di geni sono nella parte interna e quelli a densità minore sono alla periferia Simulazione di un modello di nucleo umano basata su ibridazione in situ con sonde specifiche per ciascun cromosoma Territori cromosomici Il cromosoma Philadelphia: t(9:22): una prova della costrizione dei cromosomi ad occupare una regione specifica del nucleo durante l'interfase. Poiché il cromosoma 9 e il 21 occupano territori adiacenti, il riparo errato delle rotture che avvengono in questi cromosomi causa questo riarrangiamento. La traslocazione è associata alla leucemia mieloide cronica (il 95% delle cellule leucemiche sono Ph+). La malattia ha origine da una espansione clonale delle ” cellule staminali del midollo osseo, precursori delle so È crotone 2 Pl Changes cromosoma S civestne È del sangue. Le cellule non completano il processo di È maturazione e si accumulano in forma immatura (blasti) «Cronica»: la malattia ha una progressione lenta e può rimanere asintomatica anche per anni nella fase iniziale. Fusione di due geni: il gene BCR (Breakpoint Cluster Region) sul cromosoma 22 ed il gene ABL (Abelson) sul cromosoma 9. Si forma il gene chimerico BRC-ABL. ABL codifica per una tirosin-chinasi (fosforila i substrati a livello di tirosina) espressa ubiquitariamente. Riorganizzazione del citoscheletro, risposta al danno al DNA e allo stress ossidativo. abl è in grado di attivare una “cascata” di altre attività enzimatiche intracellulari che innescano i meccanismi della proliferazione cellulare. La proteina ibrida derivata dal gene ibrido ber-ab/ mantiene una attività TK, aumentata e non più sottoposta a normali meccanismi di controllo. Da ciò deriva il potenziale leucemogeno: interferenze sulla attività proliferativa della cellula neoplastica, sui meccanismi di adesione e sulla responsività ai fattori regolanti la proliferazione e i meccanismi di morte cellulare (apoptosi).