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Scarica appunti appunti appunti appunti appunti appunti e più Appunti in PDF di Geologia solo su Docsity! METODICHE per lo STUDIO delle INTERAZIONI PROTEINA - DNA Le interazioni proteina-proteina e proteina-acido nucleico servono ad organizzare, esprimere e regolare i componenti cellulari Molte interazioni di questo tipo coinvolgono i fattori trascrizionali Metodi per studiare le interazioni ➢ EMSA ➢ DNA footprinting ➢ Immunoprecipitazione della cromatina ➢ Proteine di fusione espresse in procarioti ➢ Immunoprecipitazione e pull-down ➢ Saggio del doppio ibrido ➢ FRET ➢ Geni reporter (proteine di fusione espresse in eucarioti) Saggio di “gel-shift” o EMSA A) Schema riassuntivo della funzionalità del saggio EMSA; gli asterischi arancione alle estremità 5' indicano la marcatura con 32P (fosforo radioattivo). B) Il saggio è stato eseguito su un estratto grezzo di embrioni di Xenopus utilizzando come sonda radioattiva un frammento di DNA di circa 40 nt corrispondente a un tratto del promotore del gene GATA2 che contiene la sequenza CCAAT a cui si lega una proteina chiamata CBTF. Il legame specifico tra CBTF e il di DNA (prima corsia) è dimostrato da esperimenti di competizione, usando un eccesso di competitore specifico freddo (seconda corsia) e un competitore aspecifico (terza corsia) . Da sinistra verso destra: all’aumentare del DNA competitore freddo si ha la progressiva scomparsa della banda ritardata (L) e una sempre maggiore proporzione di frammenti di DNA marcato migra come DNA nudo L N Il dato deve essere confermato da esperimenti di controllo con competitori freddi specifici ed aspecifici Prova di saturazione con quantità crescenti di proteina Binding assay Free DNA complesso A quale sequenza di DNA si lega la proteina purificata? DNA footprinting Permette di determinare sul DNA la sequenza alla quale la proteina si va a legare. Bisogna disporre della proteina purificata. Un frammento di DNA, supposto contenere una regione di legame, viene marcato terminalmente, fatto interagire con la proteina in esame, e digerito parzialmente con la DNasi I L’eventuale legame alla proteina proteggerà la regione di legame dalla degradazione endonucleasica La miscela di reazione viene quindi risolta su un gel di poliacrilammide, insieme ad una reazione di controllo senza proteina, e viene visualizzata per autoradiografia Lo stesso frammento utilizzato per il footprinting viene sequenziato chimicamente con il metodo di Maxam-Gilbert per risalire alla sequenza di legame Saggi ChIP (Chromatin Immuno Precipitation) L’immunoprecipitazione della cromatina permette di studiare l’interazione proteina- DNA «in vivo» ➢ Permette di determinare se una data proteina è legata a un dato gene ➢ Permette di studiare il DNA coinvolto nell’interazione con una proteina del complesso trascrizionale ➢ Permette di determinare se i componenti di un dato complesso trascrizionale sono legati a un certo promotore in un dato momento ➢ Metodica che permette di identificare più precisamente siti di DNA che siano target di fattori di trascrizione 1. Cellule in coltura vengono trattate con formaldeide che forma un cross-link che lega covalentemente proteine e DNA che siano in stretta prossimità tra loro ChIP 2. Si rompono le cellule e il DNA viene frammentato per sonicazione in modo da generare frammenti tutti di circa 500 pb 3. I frammenti che sono legati a specifiche proteine sono poi separati da tutti gli altri non legati sfruttando l’interazione della proteina con un anticorpo specifico 4. I complessi antigene- anticorpo vengono poi precipitati usando sferette in grado di legarsi in modo specifico agli anticorpi ChIP-Seq: immunoprecipitazione della cromatina seguita da analisi next-generation sequencing. Permette di investigare su scala genomica (genome-wide) lo stato della cromatina, usando anticorpi rivolti contro specifiche modificazioni istoniche. METODICHE per lo STUDIO delle INTERAZIONI PROTEINA - PROTEINA Molte tecniche di biologia molecolare si basano sull’uso di proteine di fusione. Si possono far esprimere proteine in un organismo che normalmente non le produrrebbe: espressione eterologa Per evitare la degradazione di proteine eterologhe e facilitarne la purificazione queste vengono prodotte come proteine fuse con una proteina stabile dell’organismo ospite VETTORI DI ESPRESSIONE: concepiti per raggiungere alti livelli di espressione controllata di un gene, con produzione della proteina a livelli tali da raggiungere il 40% delle proteine cellulari totali. Vettori per l’espressione di geni estranei in cellule procariotiche Contengono i segnali che forniscono istruzioni all’apparato trascrizionale e traduzionale della cellula. Promotore: permette la trascrizione, definendone il punto di inizio. Sito di legame al ribosoma: sequenza riconosciuta dal ribosoma come punto a cui legarsi al mRNA e iniziare la traduzione Segnali di inizio e terminazione della traduzione Fattori principali che regolano l'espressione genica nei batteri Sequenze Sito di iniziò consenso del della promotore trascrizione d Sito di inizio della trascrizione Se Ae di inizio | della traduzione LL, PIOteiNa ———_y Sito di legame del Sito di inizio della ribosoma traduzione (a) Operatore/ promotore 0/p mel Jacl JI nun» Il repressore silega all'operatore: assenza ditrascrizione Repressore (b) Hc Repressore Induttore CC Ilrepressore modificato nonè in gradodilegarsi all'operatore y mRNA E Figura 11.4 Regolazione del promotore lac: (a) induttore assente; (b) induttore presente Promotori artificiali: utili per ottenere un maggiore livello di espressione. Promotore tac: ibrido tra i promotori lac e trp, ottenuto fondendo la sequenza -35 di trp con quella -10 di lac similarità 100% con la sequenza consenso Si definisce sequenza consenso una sequenza derivata da un multiallineamento che presenta solo i nucleotidi più conservati per ogni posizione Promotore Regione -35 Regione -10 Sequenza consenso TTGACA TATAAT lac TTTACA TATAAT trp TTGACA TTAACT Indotto da IPTG. Proteine di fusione: fusione traduzionale Oltre alla fusione trascrizionale [il gene d’interesse è clonato a valle (fuso) di un promotore presente sul vettore], si può fondere il gene di interesse con i segnali necessari per la traduzione. I tag che funzionano da etichetta di affinità o da epitopo facilitando anche il recupero della proteina sono: ✓6-istidina (His) ✓Glutatione-S-transferasi (GTS) ✓Immunoetichette Per la purificazione della proteina di fusione si utilizza la cromatografia per affinità. Tag His6 I lisati batterici vengono frazionati su agarosio a cui è stato complessato nickel-acido nitrilotriacetico (Ni- NTA). Le istidine della proteina di fusione etichettata formano un complesso con il nickel, facendo aderire la proteina alla matrice della colonna. Le altre proteine di E. coli non hanno affinità per la matrice e fuoriescono come flow-through. La proteina His-tagged viene eluita mediante il competitore imidazolo che, grazie alla somiglianza strutturale con le His, compete con esse per il legame alla resina. Modificazione della proteina di interesse con un tag contente 6 istidine (6xHis) e purificazione mediante cromatografia di affinità su colonnina contenente ioni Ni. Schema di purificazione: •Raccolta delle cellule ricombinanti •Lisi cellulare •Cromatografia di affinità: l’affinità dei residui di istidina per gli ioni Ni fa si che le proteine contenenti il tag sono trattenute, mentre tutte le altre proteine di E. coli vengono facilmente lavate via dalla colonna. •Eluizione •Controllo del risultato mediante •elettroforesi su SDS-PAGE • B) colorazione Comassie-blue • C) western-immunoblotting Corsia 1: estratto cellulare Corsia 2: frazione di lavaggio delle proteine aspecifiche Corsia 3: eluizione della proteina di interesse. Comassie-blue Western immunoblotting APPLICAZIONI DELLE PROTEINE DI FUSIONE Saggi di Pull-Down Saggi di Doppio Ibrido Fa ccreina di rin FRET Proteina DO VO Saggi di legame Tecniche per studiare le interazioni proteina-proteina Saggio di pull-down (In vitro) Saggio del doppio ibrido Co-immunoprecipitazione FRET (In situ) In vivo Il sistema si avvale di due componenti: • Esca = proteina fusa con TAG e immobilizzata su una resina • Preda = proteina ottenuta da altre fonti (lisati cellulari, proteine ricombinanti purificate) di cui si vuol saggiare la proprietà di legame con la proteina esca Pull-Down Si basa sulla proprietà dei fattori di trascrizione di essere organizzati funzionalmente in domini distinti: • DNA Binding Domain DBD =Dominio legante il DNA • Activation Domain AD = Dominio di attivazione Viene utilizzato per stabilire se due proteine interagiscono tra di loro Saggio del doppio ibrido Il saggio è basato sulla interazione di due componenti: Esca: proteina di fusione contenente la proteina A di cui si vuol validare la capacità di interagire con la proteina B L’ibrido contiene il dominio di interazione con il DNA DBD di un fattore di trascrizione Preda: proteina di fusione contenente la proteina B che si presume interagisca con A L’ibrido contiene il dominio di attivazione di un fattore di trascrizione La presenza di una attività trascrizionale viene valutata attraverso l’analisi dell’attività di un gene reporter Saggio del doppio ibrido di lievito 1) Costruzione di un ibrido contenente una proteina di interesse X fusa con il dominio di legame al DNA di un fattore di trascrizione GAL4 2) L’ibrido è introdotto in un ceppo di lievito 3) Il gene reporter non si esprime e il substrato X-Gal della beta galattosidasi non viene trasformato  Colonie bianche Gene reporter Allison cap 9 • Le cellule sono lisate • Il lisato è incubato con un anticorpo primario specifico per la proteina X •L’anticorpo primario viene legato a un anticorpo secondario attaccato a una resina che può essere sedimentata in centrifuga •Se la proteina Y si lega a X, verrà recuperata nell’immunoprecipitato, le proteine non legate resteranno nel sovranatante •Le proteine precipitate possono essere analizzate per SDS-PAGE o WB La co-immunoprecipitazione può identificare proteine d'interazione o complessi della proteina presenti in estratti delle cellule La FRET può essere utilizzata per rivelare il legame tra due proteine Due fluorofori differenti CFP (ciano) e YFP (yellow) vengono usati per marcare due proteine Il fluoroforo donatore eccitato trasferisce la sua energia sul fluoroforo accettore purché si trovi a una distanza massima di 10 nm, quindi solo in caso di interazione delle due proteine La FRET emessa dal secondo fluoroforo è rivelata da opportuni filtri FRET Trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza o FRET. L’interazione tra le due proteine X e Y viene analizzata producendo le proteine in esame come proteine di fusione attaccate a due varianti diverse di GFP. Nello schema, la proteina X è accoppiata a una GFP che è eccitata da luce violetta (370-440 nm) ed emette luce blu (440-480 nm). La proteina Y è accoppiata a una GFP che è eccitata da luce blu ed emette luce verde (510 nm). Se le due proteine X e Y non interagiscono (A), l’illuminazione del campione con luce violetta emette solo luce blu, mentre se X e Y interagiscono tra di loro (B) può avvenire il FRET. Ne consegue che l’eccitazione con luce violetta eccita la proteina fluorescente blu, la cui emissione eccita, a sua volta, la proteina di fusione Y portando all’emissione di luce verde. CLONAGGIO IN CELLULE EUCARIOTICHE Utilizzi: •Ricerca di base: Tecnica usata per determinare la funzione di un gene. •Ricerca applicata: terapia genica. Ingegnerizzazione di cellule umane per curare malattie su base genetica. Trasferimento di geni in cellule eucariotiche Il trasferimento è altamente inefficiente per cui bisogna partire da un numero notevole di cellule per riuscire ad ottenere dei risultati: cellule in coltura. TRASFEZIONE: introduzione di DNA nudo in cellule eucariotiche il termine trasformazione si usa per l’introduzione di DNA in cellule procariotiche. Metodi: • trasfezione chimica •Lipofezione •Elettroporazione •Iniezione diretta •Microbalistica (biolistica) Trafezione chimica con fosfato di calcio: il DNA nudo viene mescolato con tampone fosfato. L’addizione di CaCl2 determina la precipitazione del DNA sotto forma di granuli di fosfato di calcio (grazie ai gruppi fosfato del DNA) che vengono captati dalle cellule tramite endocitosi. Una parte di questo DNA non verrà distrutto nel citoplasma e passerà nel nucleo ove potrà essere trascritto. Alternativamente: DEAE-destrano. Il DNA è incubato con un carboidrato polimerico inerte (destrano) al quale è legato un gruppo chimico carico positivamente (DEAE, dietilaminoetile). Il DNA si complessa col DEAE tramite i suoi gruppi fosfato negativi, i grossi complessi vengono inglobati dalle cellule per endocitosi. Trasferimento mediato da liposomi: il DNA viene incapsulato in doppi strati lipidici sintetici che assomigliano alle membrane cellulari. I liposomi si fondono spontaneamente con la membrana cellulare e scaricano il loro contenuto all’interno di esse. Promotore Gene per l'espressione donato della pianta Sequenze tum batteriche ® ® _ _ Precipitato di DNA sulle microparticelle Microparticelle di tungsteno ii în una particolare pistola Percussore Scarica Proiettile di plastica (macroproiettile) -Microparticelle ——_—_—»-+ Bombardamento delle microparticelle sulle cellule vegetali Coltivazione Aperture Piastre __ di ritenzione 5 BS se ) —» Piante rigenerate Cellule 0 tessuto bersaglio Membrana Parete cellulare plasmatica Le microparticelle entrano nelle cellule Citoplasma Vacuolo Nucleo Transfezione: Transiente O Stabile Destino del DNA transfettato Transfezione transiente: nei batteri i vettori plasmidici possono essere replicati e mantenuti come episomi (DNA extracromosomiale). Nelle cellule eucariotiche il DNA extracromosomiale non si lega ai microtubuli del fuso mitotico e quindi viene perso per diluizione quando la cellula si divide. Per alcune applicazioni è sufficiente introdurre il DNA nella cellula per breve tempo, utilizzando vettori episomali: vettori in grado di effettuare una replicazione plasmide-simile in quanto contengono l’origine di replicazione di un virus. Se il gene di interesse è sotto il controllo di un promotore, la proteina verrà espressa transitoriamente permettendo studi funzionali. Analisi di regioni regolatorie La regione regolatoria di cui si vuole valutare l’efficienza viene clonata a monte del gene reporter in un plasmide d’espressione episomico (in questo caso il vettore non presenta il Pcmv). Saggio di cotrasfezione per valutare se un determinato fattore di trascrizione riconosce una specifica sequenza sul DNA 1. Si costruiscono due plasmidi: - uno contiene il cDNA di un gene x fattore di trascrizione sotto il controllo di un promotore costitutivo - l’altro contiene la regione regolatrice di cui si vuol studiare il livello di espressione, seguita da un gene reporter 2. Le cellule sono co-trasfettate con i due plasmidi 3. Si incuba per far esprimere il mRNA e tradurre il TF 4. Se il fattore di trascrizione riconosce e si lega alla regione regolatrice che si vuole studiare si otterrà l’espressione del gene reporter clonato a valle. Geni reporter usati comunemente: Codificano per proteine con attività enzimatica o proprietà fluorescenti che normalmente non sono presenti nelle cellule eucariotiche: conferiscono nuove proprietà alla cellula ospite. lac Z: Codifica per la b-galattosidasi. Converte un substrato incolore in un precipitato colorato che permette di localizzare l’espressione di un gene in situ GUS: gene di origine batterica. Codifica per la b-glucuronidasi. Utilizzato in sistemi vegetali. Converte un substrato incolore X-gluc in un precipitato colorato (espressione in situ). I prodotti di lac Z e GUS possono essere quantificati spettrofotometricamente. cat: Codifica per la cloramfenicolo acetil transferasi. Nel saggio CAT, che può essere effettuato in vitro saggiando l’attività dell’estratto cellulare: l’enzima trasferisce gruppi acetile al cloramfenicolo radiattivo. Il grado di acetilazione del prodotto viene determinato mediante cromatografia su strato sottile che separa il cloramfenicolo non acetilato dalle sue forme a diversi livelli di acetilazione, seguita da autoradiografia. A destra: risultati sperimentali. Corsia 1: cloramfenico non acetilato. Corsie 2-6: estratti cellulari con differenti livelli di attività CAT. Le reazioni necessarie per produrre il prodotto evidenziabile uccidono le cellule. Sono stati sviluppati marcatori più versatili che possono essere utilizzati nelle cellule in vivo. Saggio GFP In questo saggio la sequenza nucleotidica che codifica per un prodotto X da studiare viene fusa con la sequenza nucleotidica di GFP all’interno di un vettore di espressione. Localizzazione intracellulare di una proteina di interesse mediante proteine di fusione con GFP Sinistra: cellule transfettate con il plasmide GFP tal quale osservate al microscopio a fluorescenza e controcolorate con DAPI : colorante BLU ad alta affinità per il DNA. Evidenzia i nuclei. La GFP diffonde in tutta la cellula. Destra: cellule transfettate col ricombinante GFP-TR. Il recettore per l’ormone tiroideo è un fattore di trascrizione nucleare. La proteina di fusione ha localizzazione nucleare. Oltre alla GFP wt si possono utilizzare forme mutagenizzate: •Enhanced GFP (EGFP): emette fluorescenza con intensità 35 volte superiore a quella wt Sono disponibili proteine fluorescenti in un intervallo di colori che va dal blu al rosso: •proteina fluorescente cyan (CFP: azzurro) •proteina fluorescente gialla (YFP). Si possono effettuare marcature multiple di strutture o organelli diversi all’interno della stessa cellula. Colocalizzazione nei lisosomi: a) Molecola x marcata con GFP b) Lysotracker c) Merge a) b) c) Tecnologia del TA cloning in combinazione con il TOPO cloning. Frammenti prodotti mediante PCR possono essere rapidamente ligati nel vettore linearizzato e attivato per la reazione con la topoisomerasi. Vettori di espressione di proteine di fusione Progettati per permettere l’espressione di una proteina di fusione, costituita dalla proteina di interesse etichettata mediante GFP. Permettono l’espressione ad alti livelli della proteina di fusione nelle cellule eucariotiche. Le proteine ricombinanti possono essere facilmente identificate nelle cellule in vivo utilizzando il microscopio a fluorescenza. TOPO cloning Utilizzo della topoisomerasi I al posto della ligasi. Il ruolo fisiologico della topoisomerasi è di tagliare e riunire il DNA durante la replicazione mediante reazioni di transesterificazione. Una topoisomerasi di tipo I genera una incisione in una molecola di DNA, fa passare il filamento intatto attraverso la lacuna e risalda l’incisione. La topoisomerasi può legarsi al DNA tramite legame 5’ o 3’ fosfotirosinico, a seconda di come viene tagliato il legame fosfodiestere CLONAGGIO Topo TA La topoisomerasi I di Vaccinia virus riconosce la sequenza 5’CCCTT3’ e si lega covalententemente mediante un ponte fosfotirosinico alla timina al 3’ della sequenza riconosciuta. I TOPO® vectors sono forniti linearizzati, con la Topoisomerasi I legata covalentemente al 3´ fosfato. La sequenza di DNA che presenta estremità compatibili viene quindi covalentemente ligata dalla topoisomerasi. Il processo è più efficiente rispetto all’utilizzo della ligasi e si completa in 5 minuti a temperatura ambiente.