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Scarica appunti appunti appunti appunti appunti appunti e più Appunti in PDF di Geologia solo su Docsity! Studio del trascritto northern blotting Dato che l’RNA è a singola elica e tende a formare strutture secondarie, per ottenere un’accurata calibrazione delle dimensioni occorre aggiungere nel gel un agente denaturante, quale la formaldeide che assicura che l’RNA rimanga a ss. Siccome l’RNA tende a non incorporare l’etidio bromuro in maniera efficiente come il DNA, l’etidio va aggiunto sia nel gel che nella soluzione di caricamento. Linearizzazione del vettore per ottenere trascritti run-off Trascrizione in vitro in presenza di ribonucleotidi marcati e Rna polimerasi Digestione del DNA con Dnasi Purificazione delle ribosonde S1 mapping: determinare le estremità 3’ o 5’ di un RNA Si marca a una estremità una sonda a DNA, specifica per una porzione del trascritto di interesse Dopo l’ibridazione, si tratta con nucleasi S1 che taglia solo acidi nucleici a singola elica L’ibrido DNA-RNA è protetto dalla degradazione. La dimensione della sequenza protetta può essere misurata con gel elettroforesi Determinazione del sito di inizio della trascrizione: S1 mapping del 5’ La sonda è un frammento di DNA, di cui sono note le dimensioni, che sicuramente contiene il sito di inizio 5’ di un trascritto. Viene marcata all’estremità 5’ e poi denaturata per permettere l’ibridazione La sonda viene testata contro il pool dei mRNA e si ibridizza al trascritto in analisi (complementare) L’ibrido viene sottoposto a S1 nucleasi che taglia tutto ciò che non è protetto dall’ibrido La estremità 5’ rimane come estremità netta dell’ibrido Una gel elettroforesi, confronterà la sonda tagliata con quella originaria; affiancata da una reazione di sequenza permetterà di individuare il 5’ del trascritto S1 mapping del 3’ Con analogo procedimento si localizza il 3’ del trascritto Limiti: la determinazione delle estremità del trascritto può non essere del tutto accurata S1 può smozzicare le estremità dell’ibrido S1 può anche smozzicare regioni A-T che siano state aperte (melted) Può non digerire perfettamente le regioni a singolo strand TECNOLOGIA del DNA MICROARRAY (to array = posizionare in un arrangiamento ordinato) CHIP a DNA Permetteno di analizzare contemporaneamente l’espressione di molti geni e quantificarne la entità Studio del trascrittoma Per genoma si intende la sequenza completa del DNA di un organismo Per trascrittoma si intende l'insieme di tutti i trascritti (rRNA, mRNA,tRNA) di un dato organismo o tipo cellulare ESPRESSIONE genica Cellule di differenti tessuti contengono lo stesso set di cromosomi e di geni identici, tuttavia sono specializzate a svolgere differenti funzioni nell’organismo. Durante l’esistenza di un organismo il genoma viene utilizzato in maniera differenziale. Espressione regolata spazialmente e temporalmente Il ruolo delle cellule è determinato dalle proteine che esse producono, cioè dall’espressione dei loro geni L’espressione genica è controllata da due meccanismi: 1. On-off che accende o spegne un gene 2. Volume control che aumenta e diminuisce il livello di espressione GENE EXPRESSION ARRAY Ci permette di conoscere: a) Se particolari geni sono espressi o no b) Il livello di espressione dei geni Finalità: Rispondere alle seguenti domande: 1. Quale è la espressione differenziale dei geni • nei diversi tipi cellulari dei vari tessuti • nei diversi momenti dell’ontogenesi • in diverse condizioni metaboliche fisiologiche • in situazioni patologiche in cellule normali sottoposte a specifici stimoli (trattamento a farmaci) 2. Quale è l’entità di questa espressione Cioè: quale è il profilo di espressione connesso al differenziamento morfologico e funzionale delle varie cellule di un organismo 2.Sintesi di oligonucleotidi su array La catena nascente di nucleotidi viene attaccata ad un supporto solido I nucleotidi utilizzati per la sintesi presentano un gruppo bloccante fotolabile al 3’ (atomi aggiuntivi legati al gruppo reattivo ossidrilico). Questo gruppo previene reazioni non desiderate tra i nucleotidi stessi In ciascuna microarea ci sarà un tipo di oligo diverso 107 molecole per area PREPARAZIONE del GENE-CHIP Si adatta la tecnologia della fotolitografia alla sintesi chimica degli oligonucleotidi Il supporto viene illuminato con luce UV che filtra dai pori di una maschera fotolitografica. Nelle aree colpite dalla luce i gruppi proteggenti sono rimossi con produzione di un gruppo idrossido Si fa avvenire la reazione con un dNTP a sua volta protetto da un gruppo fotolabile Il supporto viene di nuovo illuminato attraverso una maschera che fa filtrare la luce in posizioni diverse, così da liberare nuovi gruppi proteggenti e far legare nuovi nucleotidi Il processo è ripetuto fino a ottenere oligo della lunghezza desiderata ORGANIZZAZIONE DEL GENE-CHIP Per ciascun gene da analizzare sono presenti in media da 20 oligonucleotidi differenti che possono ibridizzare ciascuno con differenti regioni della sequenza genica. 107 copie di ciascuno di essi sono localizzate in 20 aree distinte Ogni area è fiancheggiata da un’area di controllo contenente anch’essa 107 nucleotidi che differiscono da quelli sonda per una singola base nella regione centrale, di solito la sua complementare I cDNA sono stati clonati. I cloni sono stati sequenziati (da un lato e dall’altro) usando primers fiancheggianti l’inserto. I primers universali sono complementari a sequenze plasmidiche. Le porzioni iniziali di ciascuna sequenza costituiscono le EST, che sono state depositate in una appropriata banca dati: dbEST IDENTIFIERS dbEST Id: 76156542 EST name: MYA001 GenBank Acc: JK750314 GenBank gi: 379048767 CLONE INFO DNA type: cDNA PRIMERS Sequencing: T7 PolyA Tail: Unknown SEQUENCE GAGAGTGAGTANTAAAATGTTTANTGAGCCTACGGTGTTGTGAGTGTAAATTANTGCNATGANTA GGGGAAGGGAGCCTACTAGGGTGTANAATAGGAANTATGTGCCTGCGTTCAAGCG TTCTGGCAA Entry Created: Mar 2 2012 Last Updated: Mar 3 2012 LIBRARY Lib Name: LIBEST_027717 Human blood related cDNA library Organism: Homo sapiens Sex: male Tissue type: blood SUBMITTER Name: Park K.K.; Ahn M.Y.; Hwang J.S.; Yun E.Y.; Kim I.W. Lab: Department of Agricultural Biology Institution: National Academy of Agricultural Science, RDA Address: 61 Seodund-Dong, Suwon, South Korea 441-100 Tel: 82-31-290-8577 Fax: 82-31-290-8543 E- mail: amy@rda.go.kr CITATIONS Title: Human blood cDNA MYA001 Authors: Park,K.K., Ahn,M.Y., Hwang,J.S., Yun,E.Y., Kim,I.W. Year: 2012 Status: Unpublished Le decine di milioni di EST prodotte sono state depositate nella banca dati dbEST accessibile al mondo scientifico tramite centri di bioinformatica quali NCBI (national centre of biotechnology) o EBI (european bioinformatics institute). Attraverso la banca dati specializzata Unigene i dati EST sono stati organizzati e per ciascuna EST è stato annotato il gene a cui corrisponde. Una piccola parte della sequenza EST (~ 30nt) viene sintetizzata su un’area del chip Un chip quindi conterrà gli oligo che corrispondono all’intera collezione di EST di un organismo o tipo cellulare = rappresenterà tutti i suoi geni espressi In tal modo si possono studiare simultaneamente la maggior parte dei geni espressi, anche senza averli completamente sequenziati Con che cosa si ibridizza il chip? Se si vuol studiare l’espressione non ha senso indagare il DNA Il target deve rappresentare tutti gli mRNA maturi e funzionali presenti nel preparato biologico di cui si vuol studiare l’espressione Il target è’ costituito da un pool di tutti i cDNA ottenuti dai messaggeri estratti da una sorgente biologica 1) Estrazione RNA totale, per esempio, da campione tumorale e dal “controllo normale”. 2) Sintesi del cDNA con trascrittasi inversa e dNTs marcati con coloranti fluorescenti: verde (CY3) per il tumorale e rosso (CY5) per il normale. Si ottiene l’intero tracrittoma di entrambi i campioni. 3) I due tipi di cDNA vengono ibridizzati con l’array, uno per volta. Sull’array sono stati fissate migliaia di sequenze geniche differenti, le EST, secondo una griglia ordinata. 4) Prima scansione dell’array mediante microscopia a fluorescenza. I segnali fluorescenti indicano l’avvenuta ibridazione. L’immagine digitalizzata viene conservata. 5) Lavaggi dell’array e ibridazione con la seconda serie di cDNA 6) Seconda scansione dell’array e ottenimento della seconda immagine digitalizzata. 7) Analisi delle immagini digitalizzate: le due immagini ottenute vengono sovrapposte e analizzate. Il colore indica in quale campione: tumorale (verde), normale (rosso), entrambi (arancione) è avvenuta l’ibridazione, cioè il gene a cui corrisponde la EST è espresso. L’intensità del colore indica il grado relativo di espressione. 8) Determinazione dei geni differentemente espressi nel tumore. In genere la variazione di espressione è di circa 1.5-2 volte rispetto al normale. Wavelength (nm) La sovrapposizione dell'emissione di Cy3 e Cy5 in uno stesso spot genera una colorazione gialla. L'intensità della fluorescenza è legata al numero di fl fori Lon i fluorofori legati # Marcatura differenziata dei cDNA: Cy3-green; Cy5-red Espressione differenziale durante la sviluppo Si confronta il profilo di espressione dei geni nelle cellule sottoposte all’azione del farmaco con il profilo di espressione dei geni di cellule sottoposte a sostanze sicuramente non tossiche e a sostanze sicuramente tossiche La somiglianza con quest’ultimo ci suggerisce che il potenziale farmaco possa essere tossico e ci induce a scartarlo PREVEDERE il DECORSO di un TUMORE Studio prospettico durato 12 anni. Un particolare profilo di espressione era caratteristico delle pazienti che avevano sviluppato metastasi durante l’osservazione. Il profilo opposto corrispondeva all’assenza di metastasi Poiché la chemioterapia postoperatoria è pesante e ha comunque degli effetti collaterali, conoscendo il profilo di espressione si potrebbe fare una previsione sulla probabilità di recidiva o meno, calibrando in modo opportuno la terapia per le pazienti con profilo favorevole o sfavorevole Nuova applicazione della tecnica microarray Effetti della dieta Effetti di nutrienti su stabilità genoma e regolazione espressione genica. Macro e micronutrienti possono modulare la stabilità genomica e prevenire la genotossicità di tossici endogeni/esogeni, ad es.: Vit C: la sua carenza causa ossidazione del DNA e danno ai cromosomi‘ e inibisce la modificazione ossidativa della guanosina Vit E: inibisce la rottura del DNAss causata dai ROS e rad. UV Niacina: interviene nella riparazione del DNA e nel prevenire morte cellulare Folato: interviene nel regolare la metilazione nelle regioni ric- che del dinucleotide CpG con inibizione dell'espressione genica. DNA microarray: valutazione dell’intero profilo dell'espressione genica in risposta ad un intervento dietetico.  Stepa DNA DNA hybridization dosageloss dosage gain \S / Array CGH: The Complete Process Steps 1-3. Patient and control DNA are labeled with fluorescent dyes ‘and applied to the microarray. Step 4 Patientand control DNA compete to attach, or hybridize, to the microarray. Step 5 The microarray scanner measures fluorescent signal intensity. Step6 — Computer software gathers the data and generates a plot. Steps Stepo SNP CHIP Permettono di analizzare contemporaneamente molti polimorfismi a singolo nucleotide, SNP, che caratterizzano una popolazione sana o una patologia Si usa un chip su cui sono legati oligonucleotidi che contengono varianti nucleotidiche note del tipo SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Sul chip saranno fissati gli oligo contenenti tutti i possibili SNP conosciuti in una specie Il chip sarà ibridizzato con DNA genomico estratto dai soggetti di cui si vogliono individuare gli SNP, o con ampliconi derivanti dagli individui di cui si vuol conoscere il profilo genetico L’Analisi dei SNP Chip permette di individuare le mutazioni puntiformi e consente: 1) Loscreening di mutazioni causative di una malattia 2) Individuazione di mutazioni in geni deputati a proteggere da alterazioni della regolazione del ciclo cellulare 3) Individuazione di alterazioni coinvolte nel riparo del DNA e quindi correlate alla progressione di alcune forme di cancro *4) Aiutarea capire perché gli individui differiscono nelle loro capacità di assorbire o eliminare certi farmaci o essere addirittura avversi ad essi Gli array di proteine servono a studiare: •Interazioni con i ligandi •Interazioni proteina-proteina •Interazioni proteina-DNA •Modificazioni post-traduzionali •Saggi enzimatici •Mappatura degli epitopi I due campioni proteici differentemente marcati sono incubati sul chip dove sono legati differenti possibili ligandi: anticorpi antigeni, ac. nucleici carboidrati ecc Proteine purificate o peptidi sintetizzati sono depositati sul chip. Il chip viene saggiato contro proteine, ac. nucleici, altri ligandi marcati. Applicazione di un chip a proteine analitico Protein microarray sono utilizzati nelle applicazioni biomediche per determinare la presenza e/o la quantità di proteine in campioni biologici, ad esempio nel sangue Sul chip sono bloccati un gran numero di anticorpi di cui si conosce la specificità L’individuazione delle proteine presenti nel campione biologico avviene mediante una immuno-reazione Ricerca di un agente infettivo nel sangue di un paziente