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Scarica appunti appunti appunti appunti appunti appunti e più Appunti in PDF di Geologia solo su Docsity! UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI BARI Corso di Laurea Magistrale in Scienze Biosanitarie LABORATORIO di BIOLOGIA MOLECOLARE DELLE PATOLOGIE UMANE Anno accademico 2017-2018 Prof.ssa G. CHIMIENTI Espressione e purificazione mediante cromatografia per interazioni idrofobiche della Proteina Verde Fluorescente (GFP) da cellule ba�eriche trasformate Il plasmide pGLO con�ene il gene per la GFP and un gene per la resistenza all’ampicillina. L’espressione della GFP è regolata dalla proteina araC. Infa� pGLO è stato ingegnerizzato per presentare alcune delle cara�eris�che della regolazione dell’espressione dell’operone per l’arabinosio. L’operone Ara è cos�tuito da 3 geni (araB, araA, araD) codifican� per enzimi coinvol� nella degradazione dello zucchero arabinosio, pos� so�o il controllo di un unico promotore Pbad. La sua trascrizione richiede la presenza della DNA binding protein araC e dell’arabinosio. L’arabinosio interagisce con araC legata all’operatore inducendo una variazione conformazionale che, a sua volta, determina l’a�vazione della trascrizione, in quanto favorisce il legame della RNA polimerasi. Nel pGLO sono presen� il promotore Pbad e il gene araC, ma i tre geni metabolici sono sta� rimpiazza� dal gene per la GFP. In presenza di arabinosio, la proteina araC promuove la trascrizione di questo gene e la produzione della proteina verde fluorescente. L’espressione del gene per la GFP può essere accesa semplicemente aggiungendo l’arabinosio al mezzo di coltura, mentre l’aggiunta dell’an�bio�co perme�e la selezione delle cellule trasformate. Le cellule appariranno bianche su un terreno privo di arabinosio e mostreranno una fluorescenza verdognola in presenza dello zucchero. Espressione e purificazione mediante cromatografia per interazioni idrofobiche della Proteina Fluorescente Verde (GFP) da cellule ba�eriche trasformate (I parte). Trasformazione di ba�eri, selezione delle singole colonie trasformate e loro crescita in fase liquida per isolare i cloni esprimen� la GFP. 1) La trasformazione ba�erica implica il trasferimento di materiale gene�co esogeno (gene per la GFP di Aequorea victoria) in un ceppo ba�erico ricevente (E. coli HB101 K-12), mediante un plasmide (pGLO Bio-Rad) contenente il gene per la beta-la�amasi che conferisce la resistenza all’an�bio�co ampicillina, per la selezione dei cloni ba�erici ricombinan�. Il plasmide con�ene anche un sistema per la regolazione dell’espressione genica (operone dell’arabinosio) che può essere usato per controllare l’espressione di GFP nei ba�eri trasforma�. I ba�eri ricombinan� esprimono la proteina acquisita in seguito all’aggiunta di arabinosio al medium di coltura e mostrano fluorescenza verde so�o la luce UV. 2) Preparazione della piastra starter (agar nutriente in LB medium) (24 h prima della trasformazione) mediante striscio di un’ansata di cellule di E. coli, risospese in acqua sterile, a dare singole colonie ba�eriche. La piastra strisciata viene incubata, capovolta, a 37°C o.n. 3) Trasformazione delle cellule ba�eriche mediante incubazione con 50 mM CaCl2, pH 6.1, che neutralizza la repulsione tra le cariche nega�ve dello scheletro zucchero-fosfato e quelle dei fosfolipidi della membrana cellulare, perme�endo l’ingresso del DNA nelle cellule. Usae due eppendorf colorate da 2 ml (un colore per ogni gruppo) ed indicatene una come +pGLO ed una come –pGLO. Aggiungete con le pipe�e pasteur sterili 250 µl di 50 mM CaCl2 per eppendorf e ponete le prove�e in ghiaccio. Prelevate con un’ansa sterile una singola colonia ba�erica dalla piastra starter ed inseritela nella soluzione contenuta nel tubo +pGLO, ruotando l’ansa tra indice e pollice della mano fino a disperdere completamente la colonia. Riportate l’eppendorf in ghiaccio e ripetete la procedura per il tubo –pGLO u�lizzando un’ansa sterile. Prelevate 10 µl di DNA plasmidico pGLO dal contenitore e mescolateli con la sospensione cellulare del tubo +pGLO, chiudete la prove�a e rime�etela in ghiaccio. Non aggiungete DNA plasmidico nel tubo –pGLO. Incubate in ghiaccio per 10 minu�. Contemporaneamente, scrivete i nomi dei �pi di piastra sul fondo delle 4 da usare per ogni gruppo: LB/Amp = +pGLO, LB/Amp/Ara = +pGLO, LB/Amp = –pGLO, LB = –pGLO. 4) Heat-shock a 42°C per aumentare la permeabilità della membrana cellulare al DNA. Trasferite le 2 eppendorf a 42°C ed incubateli per esa�amente 50 secondi. Quindi, riportate rapidamente i tubi in ghiaccio ed incubateli per 2 minu�. 5) Crescita dei ba�eri trasforma� su diversi �pi di piastre: LB, LB-Amp, LB-Amp-Ara per selezionare i singoli cloni ricombinan�. Trasferite le eppendorf sul bancone. Con una pipe�a pasteur sterile, aggiungete 250 µl di brodo nutriente LB. Ripetete l’operazione per ogni tubo con una pipe�a sterile nuova. Incubate per 10 minu� a TA. Picchie�ate i tubi con le dita per mescolare il contenuto. Con una pipe�a sterile pulita prelevate 100 µl dalla sospensione di trasformazione (+pGLO) o da quella di controllo (–pGLO) e deponeteli sulle piastre appropriate che sono, rispe�vamente, LB/Amp e LB/Amp/Ara per +pGLO, LB/Amp per –pGLO. Usate un’ansa sterile nuova per ogni piastra e stendete la sospensione in maniera uniforme sulla superficie dell’agar. Trasferite le piastre capovolte nell’incubatore a 37° C o.n. 6) Crescita in fase liquida di un clone ricombinante esprimente la GFP. Preparate due tubi da 15 ml per gruppo, con 2 ml di brodo nutriente LB addizionato di Amp ed Ara ed indicarte i nomi delle piastre di provenienza: LB/Amp (da cui prelevare una colonia bianca trasformata, ma senza induzione di GFP= +pGLO), LB/Amp/Ara (da cui prelevare una colonia verde fluorescente con induzione di GFP = +pGLO). Incubate in agitatore orbitale a 32°C o.n. Concentrazione e lisi delle cellule ba�eriche trasformate con il gene per GFP e fa�e crescere in fase liquida. Purificazione della proteina ricombinante GFP mediante Cromatografia per Interazioni Idrofobiche (HIC) (II parte). 1) La proteina GFP, espressa dai ba�eri ricombinan�, viene liberata da ques� mediante lisi con l’enzima lisozima e raccolta nel sovranatante della successiva centrifugazione. Tale sovranatante viene so�oposto a Cromatografia per Interazioni Idrofobiche (HIC) in quanto la GFP ha numerose regioni idrofobiche che risultano esposte sulla superficie della proteina quando questa è contenuta in un