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Scarica appunti appunti appunti appunti appunti appunti e più Appunti in PDF di Geologia solo su Docsity! REGOLAZIONE dell’ESPRESSIONE GENICA negli EUCARIOTI Caratteristiche Organismi Unicellulari • Duplicazione cellulare • Risposta agli stimoli dell’ambiente esterno Caratteristiche Organismi Pluricellulari • Duplicazione cellulare • Risposta agli stimoli dell’ambiente esterno • Sviluppo e differenziamento di tipi cellulari specializzati • Coordinamento tra le funzioni dei diversi tipi cellulari Quali sono i meccanismi che determinano l’accensione o lo spegnimento dell’espressione di un gene? Nei procarioti: un’espressione genica selettiva permette alle cellule di risparmiare energia La regolazione avviene prevalentemente a livello trascrizionale Negli eucarioti: l’espressione genica selettiva permette alle cellule di svolgere ruoli specializzati La regolazione avviene a vari livelli Regolazione genica nei procarioti • Geni costitutivi: costantemente attivi. Es. geni che codificano per gli enzimi della glicolisi • Geni regolati: espressione regolata in modo tale che la quantità di prodotto (proteina o RNA) sia controllata in relazione al fabbisogno cellulare. Es. sintesi adattativa di enzimi I batteri utilizzano strategie diverse per regolare la sintesi degli enzimi Vie cataboliche: induzione da substrato (degradazione del lattosio) Con il termine catabolismo s'intende l'insieme dei processi metabolici che hanno come prodotti sostanze strutturalmente più semplici e povere di energia, liberando quella in eccesso sotto forma di energia chimica, ATP, ed energia termica. Vie anaboliche: repressione da prodotto finale (sintesi del triptofano) L’anabolismo comprende l'insieme dei processi di bio-sintesi delle molecole organiche (biomolecole) più complesse a partire da quelle più semplici o dalle sostanze nutritive. Questi processi richiedono energia. Gli enzimi che catalizzano queste vie sono spesso regolati in modo coordinato: la sintesi di tutti gli enzimi coinvolti in una particolare via viene attivata o repressa simultaneamente PRINCIPALI LIVELLI DI ESPRESSIONE GENICA Î @ Genoma @© Trascrizione Maturazione dell'RNA e esportazione d lal nucleg mRN Cromatina NUCLEO \ Gene utilizzabile per l'espressione Trascritto di RNA primario (pre-mRNA) JA nel nucleo Nabi Possibile amplificazione o delezione genica (rara) Possibile riarrangiamento genico (raro) Decondensazione della cromatina Metilazione del DNA Acetilazione degli istoni, cambiamenti delle proteine HMG, matrice nucleare Trascrizione (controllo da parte dei fattori di trascrizione) Splicing dell'RNA e altri eventi di maturazione Trasporto dell'mRNA nel citoplasma Pe a e o CITOPLASMA mRNA nel citosol @ Traduzione Degradazione dell'mRNA > (turnover) Traduzione (controllo da parte dei fattori di inizio e dei repressori della traduzione) Prodotto polipeptidico nel citosol o nel RE @ Post-traduzione Conformazione della proteina e assem- blaggio Possibile taglio del polipeptide Possibile modificazione Possibile importazione negli organelli Proteina funzionale ===> . > Degradazione della proteina (turnover) Vari livelli di regolazione dell'espressione genica negli eucarioti DNA ces RNA ss Proteina sò Fenotipo Ah À DA Regolazione Regolazione Regolazione trascrizionale post-trascrizionale post-traduzionale 7? | S b° de Lera Modulazione Stabilità Trasporto Traduzione funzionale Maturazione Modificazione La cellula umana contiene circa 30 000 geni geni per rRNA e tRNA (in copie multiple) Geni per mRNA (proteine) essenzialmente in singola copia Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola parte di questo potenziale (˜ 6000 geni) Geni housekeeping Geni tessuto - specifici metabolismo biosintesi p. membrana Differenziamento cellulare istoni p. ribosomali Come è possibile che due esseri, che hanno lo stesso patrimonio genetico e che quindi concordano al 100% dal punto di vista della sequenza del DNA, possano manifestare forti divergenze, per esempio nel campo delle malattie? Cellule geneticamente identiche trasmettono un «diverso codice di utilizzo» del genoma alle cellule figlie. Operaia Regina Fuco E ancora…. Le api sono insetti sociali Ogni colonia è composta da 50-60.000 individui un‘ ape regina che fa le uova ed è la madre di tutte le api della famiglia qualche centinaio di fuchi, i maschi della famiglia decine di migliaia di api operaie, femmine sterili che si dedicano alla cura della prole e alla ricerca del cibo Nelle società di api, a partire da uno stesso genotipo possono manifestarsi fenotipi differenti: un embrione di sesso femminile può diventare una regina in seguito a una dieta a base di pappa reale, oppure può diventare un’ape operaia sterile. Questi individui, pur avendo lo stesso genotipo, hanno delle caratteristiche fenotipiche differenti Cosa fa sì che siano così diversi per morfologia e comportamento? Tutti questi fenomeni vengono oggi spiegati con l’epigenetica MECCANISMO GENETICO MECCANISMO EPIGENETICO Caratteri ereditari che risultano da cambi nella sequenza del DNA Caratteri ereditari che non. dipendono dalla sequenza del DNA La modificazione degli istoni è un evento chiave della espressione dei geni eucariotici. La maggior parte delle proteine eucariotiche, al contrario di quelle procariotiche, vanno incontro a modificazioni post-traduzionali: • Enzimatiche (proteolisi) • Chimiche (aggiunta di gruppi chimici) che conferiscono loro la struttura matura e la funzione. Gli istoni sono una classe di proteine che può subire tale aggiunta di gruppi chimici. Modificazioni degli istoni I residui aminoacidici all’N-terminale di ciascun istone (20-60 residui) si estendono al di fuori della superficie del nucleosoma. Queste regioni sono particolarmente ricche in lisina (K), che può essere modificata in maniera reversibile mediante metilazione, fosforilazione, acetilazione, ubiquitinazione, sumoilazione. L'ubiquitina è una piccola proteina regolatoria, ubiquitaria negli eucarioti. Ubiquitinazione: legame covalente di uno o più monomeri di ubiquitina ad una proteina. Tale legame porta, solitamente, alla degradazione della proteina stessa. Sumoilazione: legame covalente a varie proteine nucleari e di membrana di macromolecole polipeptidiche dette small ubiquitin-related modifier (SUMO, da cui sumoilazione), distinte in SUMO1, SUMO2 e SUMO3 Modificazioni chimiche delle code delle proteine istoniche: Metilazione di Lys e Arg Fosforilazione di Ser e Thr Acetilazione di Lys Tali modificazioni determinano il grado di impacchettamento della cromatina Interruttori on/off che determinano se un gene è espresso oppure no. Le modificazioni riducono le cariche positive (acetilazione) o introducono cariche negative (fosforilazione): • si riduce l’interazione elettrostatica con il DNA • diminuisce l’aggregazione degli istoni e •l’interazione tra i singoli nucleosomi Acetilazione degli istoni Il livello di acetilazione degli istoni è definito dall’equilibrio dinamico tra due classi di enzimi: HAT: Istone acetilasi. Aggiungono gruppi acetile alle code istoniche HDAC: istone deacetilasi. Rimuovono i gruppi acetile. Il gene è silenziato quando si trova nel contesto di una cromatina con conformazione più densa: eterocromatina, così detta per l’aspetto mostrato al microscopio, rispetto a quella con conformazione meno densa: eucromatina. L’acetilazione è associata alla attivazione della trascrizione dei geni La deacetilazione è associata al silenziamento genico. Il silenziamento è determinato da un «effetto posizione» dovuto alla localizzazione fisica del gene, e in grado di diffondere lungo il DNA. L’eterocromatina contiene istoni non acetilati: geni silenziati. L’eucromatina contiene istoni acetilati: geni attivi. Le modificazioni istoniche agiscono da interruttori molecolari: on/off 1. Il gruppo acetile è rimosso dalla Lys 9 2. L’ Istone metil transferasi SUV metila la Lys 9 dell’H3 3. Si può legare la proteina HP1 (heterochromatin protein 1) 4. Si innesca la formazione della cromatina inattiva A) Lys 9 HP1 a sua volta recluta la metil-transferasi che metila i nucleosomi adiacenti, aumentando i siti di legame per HP1.  propagazione dell’eterocromatina inattiva B) La struttura della cromatina è influenzata da: Numero di residui istonici modificati, Posizione dei residui Tipo di modificazione Le modificazioni delle code istoniche formano un Codice istonico Che può essere letto da proteine coinvolte nell’espressione del DNA. QUINDI Oltre alla sequenza del DNA anche i nucleosomi assemblati su un gene, con le loro specifiche modificazioni, sono in grado di influenzare l’espressione del gene sottostante. Quali proteine contengono questi domini? L’incorporazione del DNA nei nucleosomi impatta sull’espressione: molte proteine che legano il DNA preferiscono farlo sul DNA nudo. Quindi è necessario che i nucleosomi possano essere spostati per permettere l’accesso delle proteine al DNA. Esistono complessi multiproteici che facilitano i cambiamenti della posizione dei nucleosomi usando ATP. I complessi di rimodellamento dei nuclesomi contengono bromo e cromodomini. Anche il fattore di trascrizione generale TFIID contiene un bromodominio: il macchinario della trascrizione viene diretto sui siti contenenti nucleosomi acetilati, permettendone una efficace trascrizione. HP1, invece, contiene un cromodominio. Riassumendo Metilazione e Acetilazione degli istoni e le altre loro modificazioni la transizione da cromatina chiusa, inattiva a cromatina aperta, attiva Restrizione calorica, allungamento della vita e modificazioni degli istoni L’acetilazione degli istoni generalmente attiva la trascrizione, mentre la deacetilazione ha un effetto inibitorio. Le due attività sono condotte dalle istone-acetilasi: HAC e dalle istone deacetilasi: HDAC. Meccanismi reversibili rapida regolazione dell’espressione genica. HDAC di classe III, SIRT, sirtuine omologhe delle proteine SIR di lievito silent information regulator. De-acetilano il substrato, trasferendo il gruppo acetile su una molecola di NAD+ L’acetile è trasferito sul NAD+, che a seguito di idrolisi diventa niconitamide e 2’O-acetil-ADP ribosio. La deacetilazione dipenda dalla disponibilità di NAD+. Il rapporto NAD+/NADH dipende dal metabolismo energetico. Le sirtuine interpretano lo stato metabolico della cellula: inattive in presenza di abbondante apporto nutritivo (NADH incrementa), attive in caso di ridotto apporto calorico. • Durante l’invecchiamento incrementa la produzione di radicali liberi. • Le sirtuine attivano proteine del pathway anti-ossidante. • La riduzione calorica causa un significativo aumento dell’aspettativa di vita in molte specie animali, inclusi i primati. SIRT1 attiva PGC-1α, un fattore di trascrizione che induce l’espressione dei geni della risposta allo stress ossidativo: glutatione perossidasi (GPx1), catalasi. Inattiva NF-ĸB attraverso la deacetilazione. L’inibizione di NF-ĸB sopprime la ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS) e quindi la produzione di ossido nitrico, riducendo il carico di radicali liberi. I Mitocondri producono la maggior parte dei ROS. SIRT3 mitocondriale deacetila e attiva alcuni enzimi critici per il controllo dei livelli intracellulari di ROS, ad es SOD2 (MnSOD:mitocondriale). ROS, aging e restrizione calorica interagiscono tra loro influenzando l’attività delle sirtuine. SIRT1 e SIRT3 deacetilano non solo gli istoni, ma anche proteine che promuovono la resistenza allo stress ossidativo. Nel DNA replicato entrambi i filamenti sono metilati Esistono due tipi di DNA metiltransferasi, DNMT, che provvedono al fenomeno di metilazione de novo, può metilare a bassa frequenza un DNA che non sia stato precedentemente modificato metilazione di mantenimento, metila siti di DNA emimetilati La famiglia delle DNA metiltransferasi contiene più enzimi con struttura diversa e con attività più o meno selettiva per la metilazione de novo o di mantenimento: DNMT1, DNMT3a DNMT3b e DNMT3L Metilasi di mantenimento mantengono lo schema di metilazione durante le divisioni cellulari durante la mitosi e anche la meiosi. Secondo una modalità semiconservativa (in maniera analoga alla replicazione) viene trasmesso da una cellula all’altra lo stato espressivo di un gene (esprimibile/non esprimibile), determinato dalla metilazione del DNA e dalla struttura della cromatina Dopo la replicazione, la doppia elica risulta emimetilata, con il vecchio filamento metilato e il nuovo non metilato Una metiltransferasi, DNMT, riconosce soltanto i siti emimetilati e metila in modo appropriato il nuovo filamento di DNA La DNA metilasi di mantenimento utilizza come substrato il DNA emimetilato e lo metila completamente La frequenza del dinucleotide CpG nel genoma è più bassa di quella attesa, a parte a livello delle isole CpG, che risultano generalmente non metilate. La metilazione delle citosine ha un “costo” per l’organismo L’uracile è rimosso dalla Ung, quindi il danno al DNA viene riparato efficientemente. La variazione a timidina viene spesso fissata come transizione C->T: 25-50% delle mutazioni spontanee sono transizioni C->T a livello di CpG I triangoli pieni mostrano le transizioni 5-meC->T a livello di CpG trovate nel gene p53 in pazienti affetti da tumori di diversa natura. I triangoli vuoti mostrano mutazioni di natura differente. Si noti la prevalenza delle mutazioni che riguardano 5-meC. Quando le isole CpG sono metilate: • La presenza della C metilata fa si che un fattore di trascrizione non sia più in grado di riconoscere la sua sequenza bersaglio • La sequenza metilata viene riconosciuta dalle proteine MBD (Metil-CpG-Binding Domain Protein), che a loro volta reclutano altri fattori, tra cui la istone deacetilasi, implicati nel rimodellamento della cromatina in eterocromatina. • la HDAC modifica la cromatina permettendone l’impacchettamento: L’espressione del gene viene inattivata MBD+HDAC A Cosa Serve La Metilazione Del DNA? DUE FUNZIONI PRINCIPALI INON MUTUALMENTE ESCLUSIVE. 1) INIBIZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA 2) MANTENIMENTO DELL'INTEGRITA’ GENOMICA ATTRAVERSO L'INATTIVAZIONE DI SEQUENZE PARASSITE QUALI I TRASPOSONI E IL DNA DEI PROVIRUS. Alcuni genomi sono particolarmente ricchi in sequenze trasponibili: nel mais e nell’uomo le sequenze correlate ai trasposoni costituiscono il 50% delle sequenze genomiche. Nell’uomo la maggior parte degli elementi è costituita da «fossili» inattivi che derivano da eventi di trasposizione antichi. Solo i retrotrasposoni (LINE, SINE) sono ancora attivi. La loro trasposizione determina variabilità genetica, ma occasionalmente, è causa di patologie. Circa lo 0.27% di tutte le patologie umane è attribuibile a elementi retrotrasponibili. I trasposoni vengono silenziati mediante modicazioni della cromatina indotte da piccoli RNA, infatti la maggior parte delle 5MeC presenti nel genoma si trova nei retrotrasposoni. L’inserzione di un elemento mobile all’interno o nelle vicinanze di un gene può determinare l’alterazione dell’espressione del gene. Possibili effetti dell’inserimento di un elemento trasponibile L’elemento trasponibile è rappresentato dal quadrato azzurro. In rosso sono rappresentai gli esoni. A monte del gene è indicata la porzione regolatoria. a) L’elemento si è inserito nella regione 5’ e aggiunge nuove regioni regolatorie, portando all’over- espressione del gene b) L’inserimento dell’elemento nella regione regolatoria determina inattivazione del gene c) L’inserimento in un esone altera la reading frame e/o introduce un codone di stop d) Distruzione della 3’UTR mediante inserimento di un sito di legame per miRNA e) Distruzione della 5’UTR f) Quando un elemento si inserisce in un introne altera lo splicing perché può essere incorporato nel trascritto maturo come nuovo esone g) Oppure porta a un trascritto tronco a causa dell’introduzione di un codone di stop h) Introduce nuovi siti di splicing che portano a trascritti alternativi i) Se si inserisce con orientamento opposto rispetto al gene puo’ dare luogo a trascritti antisenso j) puo’ diffondere i meccanismi del silenziamento epigenetico sulle sequenze circostanti, portando a inattivazione del gene. La metilazione del DNA regola l’Imprinting genomico Per la maggior parte dei geni, entrambe le coppie di alleli sono espresse dalla cellula Una piccola classe di geni però è espressa monoallelicamente, cioè la trascrizione avviene di preferenza a partire da un singolo allele. In generale si tratta di geni per recettori: è necessario che ciascuna cellula esprima un solo tipo di molecola recettrice Molte cellule scelgono a caso l’allele da trascrivere per produrre una proteina (cellule del sistema immunitario, neuroni olfattivi) Imprinting genomico Per alcuni geni la selezione dell’allele attivo non è casuale •Proviene da istruzioni epigenetiche depositate sotto forma di una metilazione differenziale dei due alleli •Avviene solo nei mammiferi (o in piante ma con differente meccanismo) •Riguarda alcuni geni (80 nell’uomo) la cui espressione è importante per lo sviluppo. Perché si è evoluto l’imprinting? Teoria della parentela o del conflitto genetico. I maschi e le femmine competono per le dimensioni del feto sottoponendo a imprinting i geni fondamentali per la crescita. I geni sottoposti ad imprinting hanno un ruolo nell’organogenesi, nella morfogenesi, nella crescita cellulare: funzioni associate con la crescita. Nei mammiferi i genitori hanno interessi contrastanti nei confronti della progenie. • Il padre ha interesse che la sua prole, che potrebbe esser l’unica concepita con quella madre, goda del migliore ambiente intrauterino, anche se ciò ha un elevato costo per la madre. • La madre, che sostiene il maggiore sforzo nella generazione della prole, ha lo stesso interesse genetico per ciascuno dei suoi figli, e vuole suddividere la sue risorse equamente su tutte le gravidanze. Il padre trasmette alla prole la copia silente di un gene che altrimenti inibirebbe la crescita. La madre, per limitare le richieste della prole, trasmette copie silenziate di un gene che altrimenti promuoverebbe la crescita fetale. Instaurazione e mantenimento dell’imprinting Zigote . cu Mammifero Linea cellulare somatica: adulto mantenimento | \ della metilazione / > | \ \ 2 DNMTI \A A Linea cellulare \ germinale: cancellazione Spermatozoo \ Restaurazione nella linea germinale # DNMT3a DNM73L ® ® I gruppi di geni sottoposti a imprinting sono silenziati in modo coordinato dalla metilazione del DNA in grandi (fino a 100 kb) regioni intergeniche ricche in CpG chiamate ICR (Imprinting Control Region) regioni di controllo dell’imprinting regioni metilate differenzialmente centri di imprinting Il silenziamento è mediato da interazioni a lungo raggio che comportano la formazione di anse di cromatina Una ICR può funzionare da isolatore Meccanismi di espressione monoallelica Alterazione nelle regioni di controllo dell’imprinting possono portare allo spegnimento di alcuni geni che determinano disordini soprattutto a carico dello sviluppo del sistema nervoso. Sia negli animali che nell’uomo si possono avere disturbi nell’apprendimento e nella memoria o vere e proprie malattie: Es: Sindrome di Prader Willi (perdita dell’allele paterno) Sindrome di Agelman (perdita dell’allele materno) Sindrome di Rett 1. Alterazione della struttura della cromatina a livello del promotore La metilazione del DNA causa il silenziamento genico. La deregolazione di questo meccanismo è alla base di due malattie dello sviluppo del sistema nervoso: • Sindrome di Prader-Willi (perdita dell’alelle paterno) • Sindrome di Angelman (perdita dell’allele materno) Un dominio di 2 Mb sottoposto a imprinting è localizzato sul cromosoma 15 ed è sotto il controllo di una ICR. Sindrome di Rett Alterazioni epigenetiche (difetti negli schemi di metilazione e acetilazione degli istoni) della ICR della sindrome di Prader-Willi/Angelman sono associate alla sindrome di Rett, una patologia dalla sintomatologia simile alla Angelman. Il gene MeCP2, sul cromosoma X, che codifica per la proteina 2 che lega il metil-CpG risulta mutato nella Rett. La proteina che lega Metil-CpG forma un complesso con HDAC che reprime la trascrizione mediante deacetilazione degli istoni. In caso di mutazione si ha modificazione degli schemi di acetilazione/metilazione degli istoni che portano alla perdita dell’imprinting che causa produzione diallelica dell’RNA antisenso UBE3A, e quindi riduzione dell’espressione del gene senso UBE3A materno. Quindi, come nella Angelman, la malattia è associata a deficienza della proteina ubiquitina proteina-ligasi. Sindrome di Prader-Willi:malattia genetica rara (1/25.000 nati) caratterizzata da anomalie ipotalamico-pituitarie, grave ipotonia nel periodo neonatale e nei primi due anni di vita e insorgenza di iperfagia, che esita nel rischio di obesità patologica durante l'infanzia e nell'età adulta, a difficoltà di apprendimento e a disturbi comportamentali o problemi psichiatrici gravi. Caratteristiche facciali peculiari (fronte stretta, occhi a mandorla, labbro superiore sottile e bocca rivolta verso il basso), mani e piedi molto piccoli. L'obesità è la causa più importante di morbidità e mortalità dei pazienti. Altre anomalie endocrine correlate contribuiscono a un quadro clinico caratterizzato da bassa statura, deficit dell'ormone della crescita, sviluppo puberale incompleto. Il deficit cognitivo è estremamente variabile e si associa a difficoltà di apprendimento e a uno sviluppo anomalo del linguaggio, spesso aggravati dai disturbi comportamentali e psicologici. La maggior parte dei casi è sporadica e i casi familiari sono rari. La diagnosi precoce, la terapia multidisciplinare precoce e la terapia con l'ormone della crescita (GH) hanno migliorato sensibilmente la qualità della vita di questi bambini. Sindrome di Angelman (AS): malattia neurologica, di origine genetica, caratterizzata da grave ritardo mentale e dismorfismi facciali caratteristici. Prevalenza stimata tra 1/10.000 e 1/20.000. Appaiono normali alla nascita, nei primi 6 mesi di vita possono manifestarsi ipotonia e disturbi dell'alimentazione, seguiti da ritardo dello sviluppo tra i 6 mesi e i 2 anni. I sintomi si manifestano a partire dal primo anno di vita, con grave ritardo mentale, assenza del linguaggio, crisi di riso associate a movimenti stereotipati delle mani, microcefalia, macrostomia, ipoplasia mascellare, prognatismo e disturbi neurologici con andatura da 'burattino', atassia e attacchi epilettici associati ad anomalie all'elettroencefalogramma. Altri segni clinici: l'aspetto felice, l'iperattività senza aggressività, il basso livello di attenzione, l'eccitabilità, i disturbi del sonno, elevata sensibilità al calore e attrazione per l'acqua. L'epilessia persiste nei pazienti adulti, mentre migliorano l'iperattività, il deficit dell'attenzione e i disturbi del sonno. Necessaria la somministrazione di farmaci anticonvulsivanti per il trattamento dell’epilessia. Nell'età adulta diventano meno attivi e tendono a essere obesi. L'attesa di vita sembra essere normale, ma non può essere raggiunta l'autonomia. 3. Blocco di un enhancer da parte di un isolatore IGF2: fattore di crescita simile all’insulina, o somatomedina A. Stimola la crescita legandosi al recettore IGF1R. Il gene materno è soggetto ad imprinting: la quantità di fattore di crescita è molto ridotta. Il gene paterno è attivo, viene prodotta una corretta quantità di fattore di crescita. In caso di mutazione dell’allele paterno, si osservano topi di dimensioni ridotte, in quanto l’allele materno resta silenziato. Ricapitoliamo gli ENHANCER Enhancer Promotore Gene —100 bp —200 bp a monte del punto d'inizio Contiene vari Il tratto che Contiene elementi di sequenza dispersi, elementi di sequenza separa su cui si legano fattori di trascrizione molto vicini fra loro, l'enhancer sui quali si legano dal promotore Solo gli elementi nelle immediate vicinanze fattori di trascrizione può essere di (meno di 50 bp) del punto d’inizio della parecchie kb trascrizione hanno una posizione fissa Elemento amplificatore Fattore di trascrizione Ansa del DNA Proteina ) legante il TATA TATA Sito box di inizio ISOLATORE Sequenza che blocca la trasmissione di un effetto attivante (o silenziante) Due i meccanismi: 1. Blocca il passaggio di fattori attivatori (o inattivatori) 2. Impedisce la diffusione della eterocromatina, permettendo a un promotore di rimanere attivo Inattivazione del cromosoma X Effetto Lyon o Lyonizzazione Per bilanciare il dosaggio trascrizionale tra femmine e maschi, uno dei due cromosomi X dei mammiferi deve essere inattivo ipotesi di Lyon o compensazione del dosaggio nello zigote femmina un cromosoma viene "silenziato", ovvero reso inerte dal punto di vista trascrizionale, tramite impacchettamento in un'unità densa di eterocromatina a formare una struttura inerte definita corpo di Barr Differenti strategie di compensazione del dosaggio Mammiferi: uno dei due cromosomi X della femmina è disattivato Drosophila: è raddoppiata l’espressione dell’unico cromosoma X del maschio Caenorhabditis: l’espressione di ciascuna cromosoma X della femmina (ermafrodita) è dimezzata. Inattivazione della X alcune delle loro cellule esprimono il cromosoma X di origine materna e altre cellule esprimono il cromosoma di origine materna Nei marsupiali l’X paterno è inattivato preferenzialmente allo stadio 2-4 cellule e resta inattivo in tutti i tessuti. Nei placentati avviene prima la cancellazione dell’inattivazione, e poi, allo stato di 32- 64 cellule (blastocisti), viene inattivato casualmente l’uno o l’altro cromosoma X, che resterà inattivo in tutta la progenie cellulare. Questa differenza dipende da un complesso di geni detti Xic (X inactivation centre), che non è presente nel genoma dei marsupiali. Pertanto, il gruppo Xic deve essere evolutivamente più recentemente rispetto alla separazione dei marsupiali dai placentati. A causa della inattivazione casuale in ciascuna cellula, le femmine presentano Mosaicismo tissutale: Il meccanismo molecolare della inattivazione del cromosoma X è un meccanismo epigenetico Xic: X-inactivation center. Locus cis agente, esprime long ncRNA (non coding). • I due cromosomi X hanno un centro di inattivazione, da cui derivano il trascritto gene XIST (X-inactive specific transcript) e il trascritto antisenso Tsix. Prima dell’inattivazione entrambi i trascritti sono prodotto a bassi livelli da entrambi i cromosomi X • Durante il differenziamento, sul cromosoma che diventerà inattivo aumenta il livello di XIST e si abbassa quello di Tsix • Il trascritto XIST ricopre l’X da inattivare e richiama un complesso di proteine modificatrici degli istoni le modificazioni epigenetiche della cromatina silenziano il cromosoma • Sull’altro cromosoma aumenta la trascrizione di Tsix che reprime l’espressione di XIST dello stesso cromosoma  X attivo Regola n-1: la cellula è in grado di «contare» i cromosomi X e di inattivarli tutti tranne 1. Un evento specifico è limitato ad un solo cromosoma X e lo protegge dall’inattivazione. a) Prima della inattivazione l’RNA Xist è espresso in forma instabile. Fattori non ancora identificati reprimono l’attivazione del gene e/o il legame dell’RNA in cis sul cromosoma. b) Xist RNA viene up-regolato tramite stabilizzazione, attivazione della trascrizione o rimozione dei fattori bloccanti. I LINEs potrebbero partecipare al processo di diffusione di Xist sul cromosoma (fungere da stazioni di posta) o attraverso l’associazione con proteine nucleari o attraverso una forma particolare di RNAi: REPEAT-INDUCED TRANSCRIPTIONAL SILENCING (RITS). c) Xist RNA riveste l’X da inattivare d) Silenziamento dei geni sulla X. e) Modificazioni della cromatina: deacetilazione degli istoni, metilazione dei promotori dei geni X-linked, reclutamento della variante istonica macroH2A, e impacchettamento del cromosoma nella eterocromatina. Il 75% dei geni della X inattiva sono inespressi Il 15% di geni, raggruppati in un dominio di cromatina, sfugge all’inattivazione 10% ha un livello di espressione che differisce da donna a donna I geni espressi hanno un prodotto che è a livello doppio nella femmina rispetto al maschio: contribuiscono ai tratti dimorfici sessuali Metilazione e patologie La regolazione aberrante dei meccanismi epigenetici è stata correlata a • Malattie croniche, • Cancro, • Malattie cardiovascolari, • Disordini mentali anche in risposta a stimoli ambientali Alterazione nelle caratteristiche epigenetiche di regioni di DNA possono causare malattie come la Sindrome dell’X fragile • La sindrome del ritardo mentale da X fragile è un disordine legato alla X • frequenza 1:4000 nei maschi ed è molto grave • frequenza 1:7000 nelle femmine ed è più lieve (50% di probabilità che l’X difettoso sia quello inattivo) • I pazienti presentano anche l’espansione di una ripetizione trinucleotidica CGG nella regione UTR 5’ del gene FRM1 posto sul cromosoma X L’espansione si verifica nel corso di diverse generazioni, a causa di più eventi di scivolamento replicativo Il numero di ripetizioni è variabile con effetto diverso Se la ripetizione supera le 200 unità (-> 1000) compaiono i sintomi della malattia L’espansione porta a una ipermetilazione del DNA e ipoacetilazione degli istoni  perdita di espressione del gene FRM1 che dovrebbe codificare una proteina coinvolta nello sviluppo dei neuroni  ritardo mentale Le cellule cancerose in molti tipi di tumore oltre ad avere un particolare profilo di metilazione del DNA, hanno anche una firma nell’istone H4, che è caratterizzata dalla perdita di acetilazione della Lys 16 e dalla trimetilazione della Lys 20 E’ oramai sempre più evidente che il cancro non è solo causato da fattori genetici, ma può anche essere considerato una malattia epigenetica In alcune cellule tumorali c’è • una maggior produzione di HDAC, o la produzione di forme aberranti di HDAC ipoacetilazione degli istoni, in particolare H4, che reprime la espressione di geni per il controllo del ciclo cellulare, proliferazione, e morte programmata Inoltre… Importante considerazione Al contrario dei loci che vanno soggetti a mutazioni, i geni che sono silenziati da modificazioni epigenetiche sono ancora intatti e pertanto possono essere riattivati da piccole molecole che agiscono come modificatori dei meccanismi epigenetici Mirare alle modificazioni epigenetiche è una strategia promettente, particolarmente nella terapia del cancro e nella chemioprevenzione Farmaci epigenetici (epi-farmaci) • Gli enzimi epigenetici promettono d’essere un importante bersaglio per le terapie anti‐cancro Diversi "farmaci epigenetici" sono stati individuati e il primo epi‐farmaco è entrato in clinica per la terapia delle manifestazioni cutanee del linfoma a cellule T (sebbene la sua efficacia sia per ora limitata) • Un tema centrale nello sviluppo di un farmaco è quello di aumentare l'indice terapeutico e l'azione tumore‐specifica e di limitare, al contempo, lo sviluppo di resistenza • La soluzione finora è quella di combinare più farmaci che agiscono sinergicamente e numerosi studi clinici in corso riguardano terapie di combinazione contro il cancro Si può trovare un farmaco che inibisce simultaneamente più bersagli epigenetici (per esempio DNMT ed HDAC), fondando così una nuova classe di "epi‐farmaci a bersaglio multiplo" con potente attività antitumorale in vivo Per es: Se si inibisce l’attività HDAC ne risulta l’accumulo di gruppi acetile sui residui di lisina maggior apertura della struttura della cromatina che favorisce l’attività trascrizionale Si è pensato di somministrare inibitori delle HDAC da soli o in combinazione con agenti che demetilano il DNA per riattivare geni soppressori dei tumori che siano stati silenziati nelle cellule tumorali Possibile terapia