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Scarica appunti appunti appunti appunti appunti appunti e più Appunti in PDF di Geologia solo su Docsity! REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE dell’ ESPRESSIONE GENICA procaryotio mRNA eucaryotio mRNA G' S' 3 Og -(®)(P)(F) II eee]: ji#ga rr“ EE][]i]e+=#ee a AUG lr r——_—_—_ rl 5' cap key: ME fib0s0me-binding coding ME n0nc0di09 MI stop codons sites sequentes sequentes RNA capping Tre enzimi: • Fosfatasi • Guanil transferasi • Metil transferasi Fosfatasi Guanil transferasi Metil transferasi Funzioni del cap: • Protegge l’mRNA dalla degradazione: il legame 5’-5’ non può essere attaccato dalle 5’ esoribonucleasi • Facilita il trasporto dell’mRNA nel citoplasma • Aumenta l’efficienza dello splicing • E’ coinvolto nel reclutamento del ribosoma Negli eucarioti il tRNA iniziatore si lega alla subunità minore, nel frattempo il cap viene legato da fattori di inizio. Il ribosoma viene reclutato dopo il riconoscimento e il legame del cap da parte del fattore di inizio della traduzione eIF4E. Scorre lungo il mRNA alla ricerca dell’AUG nel contesto della sequenza di Kozak (scanning).Si lega la subunità maggiore. Inizio della traduzione nei procarioti Inizio della traduzione negli eucarioti Il virus dell'influenza inizia rubando cappucci dagli mRNA cellulari (la cellula non sarà più capace di tradurre i REA mRNA maturi) I Lane eee Lada de, 0a E> Ad Nel nucleo l'mRNA cellulare neoformato viene tagliato staccando il cap + pochi nt => si forma l'innesco per la sintesi del filamento RNA+ ad opera della trascrittasi, RNA polimerasi RNA dipendente tz il messaggero cellulare non potrà più essere utilizzato dalla cellula e andrà incontro a rapida degradazione ‘cap snatching*  Figura 13.6 Processo che porta : alla formazione dell’estremità 3’ dell’mRNA e alla sua poliadeni lazione. Negli eucarioti la forma- : AAUAAA Elemento GU/U zione dell’estremità 3’, dell'mRNA : Viene generata da un taglio endo- : nucleolitico a livello dell'mRNA : in fase di allungamento. CPSF si : lega al segnale di poliadenilazione : AAUAAA, mentre CstF sì lega alla © regione ricca in GU (o in U) a valle : del sito di poliadenilazione. A que- : ces CFI&II sto punto intervengono i fattori : CstF CFI e CFII che operano il taglio : sti endonucleolitico. Infine, la poli(A) © polimerasi (PAP) aggiunge la coda © di poli(A) (in rosso) cui si lega una : proteina specifica (PAB II). Sito di poliadenilazione PAP Ato Azzo PAB Il Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia Molecolare Copyright 2011 CEA Casa Editrice Ambrosiana Funzioni della coda di poli(A) •Stabilizzare l’mRNA •Facilitare lo splicing •Facilitare la traslocazione nel citoplasma •Aumentare l’efficienza della traduzione Il legame della poliA binding protein citoplasmatica alla coda di poliA e al fattore di inizio della traduzione eIF4G che riconosce il cap induce la circolarizzazione dell’mRNA favorendo il riciclo del ribosoma. Turnover della coda di poli(A) La lunghezza della coda non resta costante: nel citoplasma la coda può essere accorciata da una Rnasi, e una PoliA polimerasi citoplasmatica tende ad allungarla. Lunghezza della coda poli(A) e regolazione della traduzione Gli oociti immaturi di Xenopus accumulano nel citoplasma mRNA materni che non vengono tradotti immediatamente, ma saranno attivati durante lo sviluppo embrionale. Nel 3’ UTR è presente la sequenza CPE (elemento per la n poliadenilazione citoplasmatica), che viene legato dalla —____ FE ArUAAAe an proteina CPEB, che media l'accorciamento della coda a20 nt. CEPB lega Maskin, che interagisce il fattore di inizio | Cina fis eIF4E, legato al CAP. E' impedito il legame di elF4e con DielF4e elF4G. Quando l’oocita è attivato, una chinasi fosforila CPEB., il ( le poli(a) viene allungato, Maskin si stacca, elF4e può AAUARA=—AAAAAAAAAAAARA interagire con elF4G. Pe .—__:i Poliadenilazione citoplasmatca elF4G lega la poli(a) bindig protein ( ©_° O citoplasmatica, I'mRNA circolarizza e Must Poly A lungo. mRNA tradotto PUÒ essere tradotto efficientemente. • Un’alta conservazione si trova solo immediatamente all’interno degli introni alle giunzioni presunte. • Questo identifica la sequenze di un introne generico come regola GU-AG, o GT-AG. • I due siti hanno per il resto sequenze diverse e definiscono le terminazione degli introni direzionalmente Sequenze consenso negli introni Sito di ramificazione Tratto di polipirimidine Sito donatore al 5' | | Sito accettore al 3' Esone 1 | * Esone 2 Ie ___LtLL A B E C mRNA splicing Passaggi dello spliceosoma ➢Complesso E (early) ➢A: (Branch site) ➢B1: (spliceosoma completo) ➢B2: U1 è rilasciato e si ha un riarrangiamento ➢C1: U4 è rilasciato ed inizia la catalisi ➢C2: sito 3’ tagliato e gli esoni ligati Gli snRNAs sono necessari per lo splicing. I cinque snRNAs coinvolti nello splicing sono U1, U2, U5, U4, e U6. In associazione con proteine specifiche, formano le snRNPs. Insieme ad altre proteine addizionali, le snRNPs formano lo spliceosoma. Tra esse: U2AF (U2 Auxillary Factors) e BBP (branch point Binding Proteins). Le proteine agiscono in modo coordinato con la formazione di complessi intermedi • Un esone può essere saltato • Si possono usare siti criptici Errori di splicing Tutti i siti 5’ e 3’ site sono funzionalmente equivalenti, ma lo splicing segue delle regole che assicurano che il sito 5’ sia unito al sito 3’ che viene dopo nell’ RNA Accuratezza dello splicing Il sistema di splicing è sulla CTD (CarbossiTerminalDomain) della RNA polimerasi ed interagisce sequenzialemente con l’RNA neosintetizzato. Alcune delle proteine coinvolte nello splicing vengono trasportate dal CTD. Quando viene trascritto un sito di splicing 5’ vengono trasferite sull’RNA e qui aspettano che venga trascritto il successivo sito 3’ su cui vengono a loro trasferite le proteine appropriate. In questo modo è più probabile che un sito di splicing 5’ interagisca col corretto sito di splicing 3’ evitando il salto degli esoni. Caricamento contemporaneo alla trascrizione. • Le proteine SR (ricche in Ser e Arg) si legano a sequenze esoniche dette Exonic splicing enhancer, ESE • Queste reclutano U2AF al 3’ ed U1 al 5’, per cui vengono definiti entrambi i lati dell’esone Dato che le sequenze consensus dei siti di splicing sono piuttosto corte e degenerate, come si fa ad evitare tutte le sequenze simili (siti criptici)? Vengono riconosciuti i siti vicini agli esoni: definizione dell’esone Splicing alternativo dell’mRNA della caspasi 2 durante l’apoptosi Apoptosi: morte cellulare programmata. Via del «recettore di morte» estrinseca: segnali extracellulari trasmessi al macchinario intracellulare. Via intrinseca: rilascio di fattori pro-apoptotici dai mitocondri. Entrambe le vie necessitano delle caspasi (cisteina-acido asparico proteasi). Le caspasi iniziatrici (2,8,9,10) attivate tagliano e attivano le caspasi effettrici (3,6,7) che a loro volta tagliano bersagli nucleari o citoplasmatici. 2 isoforme della caspasi 2: una pro-apoptotica (Casp2L) e una anti-apoptotica (Casp2S). Derivano da splicing alternativo mediato dalle proteine SR, regolatori postivi e hnRNP, regolatori negativi. Regione di 100 nt nell’introne 9, ln100, che rappresenta un sito criptico 3’. Funziona da sito «trappola» che lega U2snRNP e in combinazione con il sito splicing al 5’ dell’esone 9 produce un complesso di splicing non produttivo che facilita l’exon skipping dell’esone 9. Questo processo è stimolato dalle proteine SR. Le proteine hnRNP, invece, inibiscono il legame di U2 a ln100 e quindi facilitano l’inclusione dell’esone 9. L’inclusione dell’esone 9 porta alla produzione dell’isoforma «corta» anti-apoptotica a causa dello spostamento della cornice di lettura che determina l’uso di un codone di stop prematuro nell’esone 10. Patologie causate da errori nello splicing. 15% delle mutazioni puntiformi patologiche modifica le sequenze consensus per lo splicing Attivazione di un sito criptico di splicing 3’: beta thalassemia. Produzione difettosa di beta-globina, una subunità dell’emoglobina. Mutazione TTGGT a TTAGT determina la formazione di un sito criptico di splicing 3’ nel primo introne. Nel messaggero maturo vengono inclusi alcuni nucleotidi dell’introne. Viene quindi prodotta una proteina tronca di soli 35 aa. Un mRNA maturo che ha subito lo splicing è legato da una serie di proteine, tra cui le proteine SR, a cui si aggiunge il complesso EJC, che lo identifica come una specie da destinare al trasporto fuori dal nucleo attraverso il complesso del poro. Gli introni sono invece legati dalle proteine hnRNP che li marcano come specie da non esportare e degradare. Le proteine effettuano un controllo di qualità dell’RNA: solo quelli correttamente maturati formano le mRNP che possono essere esportate. Lo stato di fosforilazione delle proteine SR identifica gli mRNA che hanno subito lo splicing: le SR vengono defosforilate durante lo splicing. Gli mRNA aberranti vengono indirizzati alla degradazione negli esosomi nucleari. I complessi dei pori sono canali dinamici, costituiti dalle proteine nucleoporine, che attraversano la membrana nucleare e consentono l’esportazione dei messaggeri correttamente maturati Passaggio del mRNA nel citoplasma I complessi dei pori nucleari sono costituiti dalle nucleoporine. Il trasporto delle molecole più grandi di 60 kD è mediato da proteine deputate all’import e export dette carioferine (importine e esportine), che riconoscono segnali NLS (nuclear localization signal) e NES (nuclear export signal) presenti su RNA o proteine. Il trasporto attivo richide l’idrolisi del GTP da parte della GTPasi RAN. Sequenze che controllano la stabilità degli mRNA La sequenza AUUUA ripetuta più volte nella regione 3’ UTR (elemento ARE: AU-rich element) rappresenta un elemento di controllo della stabilità del mRNA. In genere li destabilizza, indirizzandoli alla deadenilazione, perdita della coda poliA, delle proteine PABP, e alla degradazione. A seconda delle proteine che legano l’elemento ARE, l’mRNA puo’ anche essere stabilizzato. Le proteine HU-R competono con le proteine destabilizzanti AUF1 e preservano gli mRNA. 2 vie per la degradazione, entrambe innescate dalla deadenilazione: a) Decapping e degradazione esonucleasica 5’-3 b) Deadenilazione e indirizzamento all’esosoma, un complesso multiproteico con attività esonucleasica 3’-5’. Meccanismi di degradazione degli mRNA L’esosoma è un complesso formato da molte subunità proteiche coinvolto nella degradazione dei messaggeri eucariotici Sistema di sorveglianza L’MRNA di tipo selvatico ha stabilità normale Traduzione >» LZ 5 > & Una mutazione non senso innesca la degradazione \Terminazione prematura ’ Degradazione  (A) CPEB-Maskin sla ————_——éweécc,,:, Esportazione Citoplasma B dell'mRNA (B) mRNA normale (C) rotore mRNI silente EIC EJC ee eENCTà Primo ciclo di traduzione Primo ciclo di traduzione Rimozione completa degli EJC Rimozione incompleta degli EJC @ 2 se + i se EJC e Reclutamento della proteina Upf Traduzione normale Upf a EIC Traduzione prematura Individuazione degli EJC da parte del “complesso di sorveglianza” Degradazione dell’"mRNA nonsenso Turnover dell'mRNA TT O ) Deadenilazione e degradazione esonucleolitica 3°->»5" Rimozione del cappuccio dell’mRNA e digestione esonucleolitica 53” Se erroneamente si genera un mRNA senza codone di stop, la coda di poliA viene tradotta e genera dei codoni per la polilisina DECADIMENTO dell’mRNA MEDIATO da NONSTOP NSMD: non stop mediated decay La polilisina è un segnale per il reclutamento della proteina Ski, affine al fattore di terminazione della traduzione RF3, che determina il rilascio del ribosoma e indirizza il mRNA verso l’esosoma per la degradazione. Anche la proteina viene degradata. Regolazione post-traduzionale Un numero sempre maggiore di prove indica che il controllo post-traduzionale è un altro importante livello di regolazione del geni Allison cap 14 a) deformilazione, fosforilazione, carbossilazione, metilazione ecc. b) glicosilazione per legame covalente di catene laterali di oligosaccaridi d) attacco di lipidi Modificazioni degli amminoacidi La reazione più comune di regolazione è la fosforilazione reversibile delle catene laterali degli ammino acidi Molte proteine sono attivate/inattivate dalla fosforilazione/defosforilazionre Le chinasi sono molto specifiche e si autoregolano tramite autofosforilazione Un meccanismo fondamentale conservato dai lieviti ai mammiferi è quello della fosforilazione del fattore di traduzione eIF2 che regola a monte l’intero processo di traduzione Molti passaggi dell’espressione genica coinvolgono la fosforilazione delle proteine