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Scarica appunti appunti appunti appunti appunti appunti e più Appunti in PDF di Geologia solo su Docsity! Regolazione dell’espressione genica da parte dei piccoli RNA interferenti Piccoli RNA che silenziano i geni L’RNA non ha solo funzioni codogeniche. Ha attività catalitica e di regolazione nell’espressione: silenziamento genico (RNA interference, RNAi) Piccoli RNA (21-23 nt) attivi in funghi, piante, animali (tra cui l’uomo). Si pensa costituiscano un primitivo sistema immunitario: difesa della cellula dalla penetrazione di acidi nucleici esogeni. • Petunie ingegnerizzate con una copia addizionale del gene per la calcone sintetasi (colorazione viola) per ottenere una colorazione più intensa. Risultato: fiori con colorazione a settori. Co-soppressione del gene endogeno e del transgene Meccanismo dell’interferenza da miRNA Nucleus Export-induced nuclear export = nd Pre-miRNA Transcription Drosha processing OR Dicer processing Translationally Mature miRNA + RISC repressed mRNA nd I miRNA fanno parte di trascritti più lunghi sintetizzati dalla RNA Pol II. miRNA 1. Trascritto pri-miRNA (primario): strutture a forcina riconosciute dalla nucleasi specifica (Drosha), presente nel nucleo. Il pri-miRNA fa parte di un trascritto più lungo, si può trovare nella regione leader, negli esoni o negli introni. Drosha (con la subunità Pasha, che conferisce specificità per dsRNA) è una RNasiIII che taglia alle basi dello stelo, lasciando 2 nt sporgenti al 3’OH. L’attività di Drosha rilascia la forcina (pre-miRNA: 65-70 nt), che viene esportata nel citoplasma da una esportina. 2. Nel citoplasma il pre-miRNA è tagliato dalla ribonucleasi Dicer, una RNasiIII, e si forma un dsRNA, il miRNA maturo delle dimensioni di 21-25 nt privo dell’ansa, che innesca il meccanismo della RNAi. Il taglio di Dicer è «dimensione» e non «sequenza»specifico. La proteina è simile ad un’accetta: un dominio PAZ alla base dl manico con una tasca di legame per l’estremità 3’ del dsRNA, un dominio linker carico positivamente che lega l’RNA e funge da «righello» (in grado di alloggiare al massimo 25 nt), due domini RNAsiIII disposti simmetricamente a livello della lama: ciascun dominio taglia uno dei due filamenti del dsRNA siRNA Derivano da un precursore dsRNA più lungo. Non necessitano del taglio da parte di Drosha ma solo di Dicer Nelle piante una RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRP) amplifica il silenziamento. Il segnale dei siRNA può essere amplificato producendo un maggior numero di siRNA. Il complesso siRNA-RISC recluta una RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRP) sull’RNA bersaglio. Il siRNA funge da primer per l’allungamento da parte della polimerasi, così da trasformare il bersaglio a singolo filamento in un dsRNA che, a sua volta, diventa bersaglio del taglio da parte di Dicer. Questo meccanismo di amplificazione dei siRNA è particolarmente utile nel difendere le piante dalle infezioni virali. Un complesso RISC può essere indirizzato al nucleo, ove recluta altre proteine che modificano la cromatina nella regione del gene interferito. Quale è la funzione dell’RNAi? • Protezione degli organismi dai trasposoni e dai virus. I trasposoni sono condensati in eterocromatina e sono trascrizionalmente silenti. Nelle piante e nei vermi sono stati individuati siRNA corrispondenti ai trasposoni. In laboratorio….. Sistema potente per manipolare l’espressione e valutare l’effetto dell’inibizione dell’espressione di un gene. Nell’organismo modello C. elegans il siRNA viene assunto dal verme attraverso la dieta: si nutre il verme con batteri ricombinanti che esprimono dsRNA Gene target Sistema binario: l’induttore attiva la trascrizione della RNA polimersi che andrà a trascrivere il gene di interesse Promotore T7: riconosciuto dalla RNA Pol del fago T7, più attiva della RNA Pol batterica. Ceppi lisogeni per il fago T7: contengono una copia del gene della RNA Pol del fago, sotto il controllo del promotore lac. L’aggiunta di IPTG al mezzo di coltura induce la produzione della Pol T7 il gene di interesse, clonato a valle del promotore T7, viene trascritto efficientemente IPTG In cellule di mammifero: dsRNA >26nt scatenano una risposta generalizzata, analoga a quella contro le infezioni virali, con inibizione della sintesi proteica dovuta a fosforilazione di eIF2a e degradazione dell’RNA dsRNA più piccoli: 21-23 nt inducono la risposta specifica. IL dsRNA attiva una chinasi che inattiva il fattore di inizio della traduzione. Inoltre viene attivata la 2’,5’ oligoadenilato sintetasi che induce la RNAsi L, che a sua volta degrada tutti gli RNA della cellula. CRISPR/CAS nei procarioti | batteri presentano un sistema di difesa dalle sequenze extra-genomiche, ad es i fagi, sorprendentemente simile al meccanismo della RNAi degli eucarioti. Sequenze CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic sequences (brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente interposte) ripetizione spaziatore ripetizione a sane Ì Numero variabile di ripetizioni di 30 basi, conservate, alternate a sequenze spaziatrici, delle stesse dimensioni, ma altamente divergenti (identiche a regioni di genomi fagici). Precedute da una sequenza leader Meccanismo di difesa contro acidi nucleici estranei penetrati nella cellula (immunità acquisita). » Batteri resistenti ad un determinato fago presentano sequenze derivate proprio da quel fago » La resistenza incrementa all’incrementare del numero di spaziatori derivati da quel fago » | fagi recuperano la virulenza in seguito a mutazioni nel proprio genoma nella regione corrispondente alle sequenze spaziatrici. Il locus CRISPR in E. coli è trascritto in un precursore di RNA più grande, che viene processato dal complesso proteico Cascade in corti frammenti contenenti spaziatori unici identici in sequenza al DNA del fago. Aiutati dalla proteina Cas3, questi piccoli RNA CRISPR bloccano il ciclo di infezione del fago. Proteine Cas Geni associati alle sequenze CRISPR, che codificano per proteine coinvolte nelle funzioni delle CRISPR. | più conservati: Cas1: integrasi Cas2: ribonucleasi. L'acquisizione di regioni spaziatrici fagiche conferisce una diminuita sensibilità alla infezione da parte di quel fago. CRISPR di £ co casi CRISPRI di S_ thermophilus casse cast ese? cse) csed | _ cas? cse cas csnî_ cas! | BD n) cas? CRISPR di 2 furiosus mr cas? emi cms cme | cesti casst__cas4| ATO UD» cas “coma cs cmrs cst2 cas3 cas! Come vengono acquisite le sequenze fagiche? protospaziatore PAM cas7 casì sequenza leader pre VITE, La sequenza fagica che diventerà uno spaziatore viene definita protospaziatore ed è vicina alla sequenza PAM (motivo adiacente al protospaziatore). Viene acquisita mediante un meccanismo di integrazione. Poiché gli spaziatori si inseriscono sempre vicino alla sequenza leader, l'ordine degli spaziatori è un «archivio temporale» delle acquisizioni. Il DNA invasore di virus o plasmidi è tagliato in piccoli frammenti che vengono incorporati nel locus CRISPR, inframmezzati da una serie di corti repeats (circa 20 pb). Il locus è trascritto , e i trascritti sono processati per generare dei piccoli RNA (crRNA – CRISPR RNA). Durante l’interferenza la endonucleasi Cas9 si complessa con un crRNA e con un tracrRNA (trans-attivatore, parzialmente complementare al crRNA) e taglia il DNA estraneo contenente una sequenza complementare al crRNA che sia adiacente alla sequenza PAM (Proto-spacer Adiacent Motif). Il tracrRNA è necessario per la maturazione del trascritto primario, che contiene molteplici pre-crRNA. La maturazione avviene in presenza della RNasiIII e di Cas9. CRISPR di tipo II: per il silenziamento è necessaria solo una proteina Cas (Cas9). CRISPR-Cas9 RNA-guided genome editing Cas 9 taglia entrambe le eliche del DNA, generando double-stranded breaks (DSBs), a livello delle sequenze complementari ai 20 nt del crRNA. Il dominio HNH (2 b foglietti uniti da un loop) della Cas9 taglia l’elica complementare, mentre il dominio RuvC taglia l’elica non complementare. Perchè Cas9 tagli è assolutamente necessaria la presenza di una corta sequenza (2-5 nt), nota come motivo associato al proto-spacer (PAM), localizzata immediatamente al 3’ della sequenza complementare al crRNA. Tuttavia, date le ridotte dimensione, è molto facile che nelle vicinanze di ogni target si trovi una sequenza PAM. In laboratorio: trcrRNA e crRNA combinati assieme in un unico RNA guida sintetico: sgRNA. A. wild-type Cas9 taglia il DNA double-stranded in maniera sito-specifica, attivando i sistemi di riparo delle rotture a doppio filamento (DSB): • Non-Homologous End Joining (NHEJ) pathway, che da luogo a inserzioni e/o delezioni che distruggono il locus target. • Alternativamente, se si fornisce un template con omologia con il locus target, il DSB può essere riparato tramite homology-directed repair (HDR) pathway, permettendo di inserire nuovo DNA.