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Scarica appunti appunti appunti appunti appunti appunti e più Appunti in PDF di Filologia solo su Docsity! Lezione 14 marzo Micobatteri [pagina 198] I Micobatteri sono bacilli lunghi e sottili, sottili sempre lunghi non sempre. Sono caratterizzati da una parete ricchissima di lipidi, il 60%, che rendono la superficie esterna idrofoba e quindi resistente alla penetrazione di coloranti, disinfettanti, eccetera. Una volta che si riesce a colorare questi micobatteri, essi non si lasciano decolorare nè con acidi né con alcol, pertanto, i micobatteri sono definiti come dei bacilli acido-alcol resistenti. I micobatteri sono capaci di penetrare nelle cellule, di resistere e di moltiplicarsi. Causano una risposta infiammatoria di tipo granulomatoso. Il genere Mycobacteria, comprende numerose specie. Per definizione i micobatteri sono batteri aerobi, bastoncellari, tutto sommato piccoli, rigidi e immobili. Per colorarli si utilizza la colorazione di Ziehl Neelsen. Sono abbastanza resistenti alle sostanze chimiche. La specie più importante è il Mycobacterium Tuberculosis che è responsabile di una delle più importanti malattie che ha mietuto vittime in passato quando c'era povertà e che è tutt’oggi un grosso problema nei Paesi in via di sviluppo, cioè la tubercolosi. Inoltre nei paesi industrializzati è responsabile di infezioni soprattutto nei pazienti immunocompromessi. Un'altra specie importante è il Mycobacterium Leprae, l'agente eziologico della lebbra, che ha come unico serbatoio l’uomo. Questi appartengono agli Actinomycetales, che possiedono anche altri batteri, appartenenti al genere Actinomyces e Nocardia, che causano infezioni granulomatose e sono acido-alcol resistenti. Esiste anche il Mycobacterium Bovis che ha come serbatoio soprattutto i bovini ma può colpire anche l'uomo ed è responsabile di una forma di tubercolosi che colpisce soprattutto l'apparato intestinale e anche le ossa. I lipidi che compongono la parete cellulare dei micobatteri sono acidi grassi beta idrossilati, che si chiamano acidi micolici che hanno una catena molto lunga. Di fatti si viene a creare una struttura molto ricca costituita appunto da questi lipidi che hanno un aspetto quasi ceroso (quasi come il formaggio parmigiano, hanno lo stesso colore) altamente idrofobica. La ricchezza di lipidi a livello della parete cellulare conferisce a questi batteri le caratteristiche di acido-alcol resistenza, difficoltà a lasciarsi permeare dai coloranti e disinfettanti, lo scambio di sostanze nutritive con l'esterno è molto rallentato, per cui non riescono ad entrare bene le sostanze nutritive quindi c'è un rallentato scambio con l'ambiente esterno. Questo spiega il motivo per il quale questi batteri hanno un tempo di duplicazione lungo. Il tempo di duplicazione dei micobatteri varia dalle 8 alle 24h. Quindi il Mycobacterium Tuberculosis cresce molto lentamente. Questi lunghi tempi di incubazione spiegano il perchè dopo la semina, le colonie si riescono ad osservare dopo due mesi. NB. Ad esempio E. Coli si duplica in 20 minuti. Per quanto riguarda il Mycobacterium Tuberculosis, colpisce molti soggetti specie quelli che vivono in aree povere. L’unico serbatoio di infezione è l’uomo. L’infezione non è sinonimo di malattia anche se un certo numero di soggetti si ammala, cioè presenta la malattia attiva. Negli Stati Uniti come in tutti i paesi industrializzati, i Paesi dell'Ovest, i paesi sviluppati, questa malattia ha una bassissima incidenza. Quindi, mentre si assiste al declino della Tubercolosi nei paesi Sviluppati, si assiste ad un aumento del numero di casi nei Paesi in Via di Sviluppo, soprattutto Sud-Est asiatico e Africa Sub-sahariana. In Africa, oltre la tubercolosi, un’altra malattia predominante è l'AIDS. Oggigiorno sono aumentati i casi di tubercolosi anche nei paesi sviluppati. Epidemiologia: Questi micobatteri non sono resistenti e quindi sono sensibili alle radiazioni ultraviolette. Se il soggetto vive in un ambiente pulito, non soleggiato, i micobatteri possono rimanere vitali nell'ambiente per un lungo periodo di tempo. La principale modalità di trasmissione è quella diretta da un soggetto malato ad uno sano. Per la tubercolosi non esiste lo stato di portatore. Se un soggetto risulta infetto vuol dire che è malato. Contatti ripetuti e prolungati sono necessari affinchè un soggetto si infetti e abbia la malattia. È un batterio che se un soggetto è malato può infettare altri soggetti specialmente quelli che sono in reparti ospedalieri. La malattia è una malattia polmonare, che esiste da tantissimo tempo. Pare che fosse presente in era anti cristo, come è stato dimostrato da alcune lesioni riscontrate in una mummia egiziana. La malattia ha preso diversi nomi tra cui Bacillo di Koch oppure tisi. Il medico, batteriologo e microbiologo tedesco Robert Koch ha studiato approfonditamente questa malattia, tanto che ha dato il nome al batterio. Il quale ha ricevuto anche il premio Nobel. Durante la Seconda Guerra Mondiale il numero dei casi di tubercolosi aumentò. Tuttavia dopo la guerra e con il boom economico, in cui si stava bene, vi erano case arieggiate con finestre, per cui si assistette ad una significativa riduzione di questa malattia. C’erano dei centri dispensari in cui si veniva monitorati per questa malattia. Quindi negli anni ‘60-70 si è abbassata l’incidenza di questa malattia. Negli anni ’90 il WHO, (World Health Organization), importante ente, cominciò a sostenere che la TBC era un problema globale poiché si assistette ad una riemergenza di questa malattia che si pensava oramai essere debellata grazie alle migliorate condizioni di vita. Nel 2000, il WHO ha sostenuto che AIDS, malaria e TBC sono delle malattie globali che bisogna contrastare. I motivi dell’aumento dei casi di tubercolosi negli anni 80, anche nei paesi industrializzati, sono stati diversi. 1. Innanzitutto l'avvento dell'AIDS, moltissimo soggetti con AIDS, venivano colpiti da un'infezione tubercolare, non solo Mycobacterium Tuberculosis ma anche da micobatteri atipici. 2. L'aumento del numero di migrazioni da quei Paesi dove la tubercolosi era diffusa. 3. L'aumento degli homeless, cioè l’aumento di quei soggetti che vivevano in povertà 4. La diffusione di ceppi di Mycobacterium Tuberculosis resistenti agli antibiotici. Per quanto riguarda i terreni, ce ne sono tanti per i micobatteri. In passato c'era il terreno di Petragnani, probabilmente era stato messo a punto da un italiano, ora nessuno lo usa più perchè tutte le linee guida che vengono dall'America dicono di usare che cosa il terreno di Lowenstein Jensen che contiene rosso d'uovo che è fonte di lipidi; una patata, contiene glicerolo, asparagina che son tutti fattori di crescita. Il Verde di malachite è un colorante che conferisce al terreno un gradevole colore verde. Inoltre dovrebbe diminuire la crescita dei microrganismi contaminanti. Quando si mettono le colonie di Mycobacterium Tuberculosis su terreno Lowenstein Jensen, le colonie appaiono a forma di cavolfiore. Esiste un altro terreno liquido che è il Dubos. I Micobatteri sono resistenti a varie sostanze chimiche, agli acidi, alle basi, ai detergenti, anche al disseccamento. Mentre sono sensibile ai raggi solari perchè vengono uccisi dai raggi ultravioletti, e sono sensibili anche al calore. Vengono uccisi con il calore e su può utilizzare come disinfettante chimico la gliceraldeide. Sono dotati di antigeni di natura polisaccaridica e proteica che non vengono utilizzati per la diagnostica. Gli antigeni di natura proteica purificati sono i PPD ovvero Derivato Proteico Purificato, utilizzati per eseguire la cosiddetta reazione alla Tubercolina, o Reazione di Mantoux. La Reazione Mantoux serve per evidenziare lo stato ‘allergico’. Mediatori del potere patogeno Il potere patogeno nei micobatteri è dovuto ai lipidi, fattore cordale che sono tossici per i macrofagi, inibiscono il binding intraleucocitario. I micobatteri hanno la capacità di sopravvivere all'interno dei fagociti e di moltiplicarsi al loro interno. Il batterio viene eliminato dal soggetto malato, non esiste il portatore, attraverso le goccioline del Flugge. E quindi dal soggetto malato al soggetto sano. Queste goccioline si distribuiscono sia con la tosse sia con il linguaggio parlato. Altra modalità di infezione avviene con il latte, solo per il M. Bovis. Infine si può contrarre in laboratorio se cade una provetta contenente micobatteri e si inala l’aria. Se succedesse qualcosa del genere, bisogna uscire dalla stanza e chiamare gli operatori che con gli scafandri disinfettano la stanza. Patogenicità Una volta inalati i micobatteri raggiungono gli alveoli polmonari dove si moltiplicano, in particolare si moltiplicano nell'epitelio polmonare dei macrofagi. Nel giro di qualche settimana vengono distrutti dal sistema immunitario mentre alcuni riescono a sopravvivere e possono essere trasportati nei tessuti extrapolmonari. Quindi, la virulenza rappresenta la capacità di moltiplicarsi all'interno dei fagociti. Il batterio non produce tossine nè endotossine nè esotossine ma ha la capacità di inibire i fagosomi e quindi di non essere ucciso all'interno dei fagociti. Immunità: la malattia Mycobacterium Tuberculosis stimola sia una immunità umorale che una cellulo-mediata. Gli anticorpi dell’immunità umorale non sono protettivi nei confronti del micobatterio. In passato avevano valutato gli anticorpi contro gli antigeni polisaccaridici tipo arabinomannani ma li hanno ritirati dal mercato perché inefficaci. Quindi la prevenzione contro questo micobatterio è l'immunità cellulo-mediata. In particolar modo sono importanti le cellule T perchè esprimono in superficie un recettore TD400. Si parla quindi di tubercolosi primaria Per tubercolosi primaria si intende il primo contatto con questo batterio. Una volta avvenuto il contatto, se il soggetto è immunocompetente, riesce ad arginare l'infezione e non ha la malattia oppure se il soggetto è immunodepresso, non riesce a contrastare la malattia e si ammala. Nella maggior parte dei contatti l'infezione viene arginata. Poiché il tutto avviene in maniera asintomatica. Gli unici test al contatto sono il test della tubercolina o un test radiologico positivo. Per quanto riguarda il test radiologico, all’esame radiologico si osserva un nodulo polmonare iniziale circoscritto perchè c'è stata una reazione fibrotica e calcificazione; questo quadro, costituisce quello che si chiama complesso di Ghon. Nella malattia primaria in fase iniziale è interessata la parte mediale del polmone. Questo perché i micobatteri arrivano a livello dei bronchioli e degli alveoli polmonari e qui vengono fagocitati dai macrofagi che vengono attivati e si innesca il processo granulomatoso. I batteri che vengono internalizzati dai monociti e macrofagi possono essere anche trasportati. Questa parte iniziale è caratterizzata da una risposta che solo inizialmente è di tipo essudativo perchè c'è un impianto di PMNS, polimorfonucleati, ma ben presto arrivano altri macrofagi a livello alveolare. I macrofagi inglobano i micobatteri che vanno a costituire una sorta di accumulo. A questo punto i batteri tubercolari si riproducono nei macrofagi e questo crea un ulteriore richiamo di macrofagi. Si assiste alla morte di alcuni macrofagi per cui al centro di questo granuloma, si forma un’area centrale caseosa che porta alla morte, al disfacimento dei macrofagi. Sono presenti anche delle cellule giganti, le cosiddette cellule di Langhans. Queste cellule sono dei macrofagi che si sono riuniti per cui sono giganti. Hanno una grande massa citoplasmatica e tanti nuclei. Il tutto è avvolto da un manicotto di linfociti, talmente assiepati che hanno perso la forma e hanno appunto una forma un po' poligonale. Il tutto, viene ricoperto da un tettuccio fibrotico che può anche andare incontro a calcificazione. A questo punto i micobatteri non sono stati uccisi ma sono murati vivi all'interno del tubercolo, cioè i bacilli tubercolari sono vivi ma non possono espletare la loro azione perchè si trovano all'interno. Quindi reazione infiammatoria, formazione granuloma, non si moltiplicano più, la regione va incontro a fibrosi e calcificazione e si parla di micobatteri murati vivi. Questo è quello che succede quando il soggetto è sano. Nel momento in cui si crea una sorta di immunodepressione, invecchiamento, diabete, HIV, terapie antitumorali, si abbattono le difese immunitarie. Questo può favorire la riattivazione della infezione. Quindi il tubercolo si rompe e i batteri possono portarsi nell'apparato respiratorio oppure tramite corrente circolatoria andare in vari distretti dando altre forme tubercolari di tubercolosi che non siano la polmonare. Il soggetto quindi si ammala e diventa infettivo. Il batterio può andare nel sangue, dare batteriemie e disseminarsi in altri organi. Tramite corrente circolatoria può andare di nuovo al polmone e si localizza in regione apicale. Oppure può raggiungere il rene e avere tubercolosi renale. Può raggiungere l’apparato riproduttore quindi le ovaie, comportando sterilità. Ai linfonodi, al Sistema nervoso. Il batterio della tubercolosi ha l'aspetto di latte condensato. Differenza fra l'infezione e la malattia: Nell'infezione il batterio è presente e si trova sui patogeni. Anche nella malattia è presente. Il test di Mantoux risulta positivo in entrambi i casi. I raggi X in un soggetto infetto sono normali e si può vedere il complesso di Ghon. Invece nella malattia si vedono le lesioni. All'esame batterioscopico dell'espettorato di un soggetto che è stato infettato, i batteri sono murati vivo. Invece il batterioscopico coltivato in un soggetto malato. Il soggetto con infezione non ha sintomi. Mentre il soggetto con malattia li ha. Ad esempio nella forma polmonare si hanno tosse, febbricola e perdita di peso. Il soggetto infetto, che ha avuto infezione, ma che non ha avuto malattia, non può trasmettere l’infezione. Invece il soggetto malato sì. Le forme di tubercolosi possono essere: la Tubercolosi polmonare e la Tubercolosi extrapolmonare. Tubercolosi scheletrica in cui viene reinfettato l'apparato osseo, anche se questa è più frequente con il Mycobacterium Tuberculosis. Per quanto riguarda le vie respiratorie, si può verificare anche la neurite da Mycobacterium Tuberculosis come anche la pericardite. Si possono avere peritoniti, artriti, in particolare quella genitourinaria che interessano il rene e l’apparato genitale. Osteomielite. Tubercolosi intestinale che però è una forma ottenuta dal Bovis. Interessamento dei linfonodi, in questo caso linfonodi cervicali. Meningite tubercolare. Reazione alla tubercolina La reazione alla tubercolina è un test che valuta se un soggetto è venuto a contatto in passato con questo batterio quindi se ha avuto una infezione primaria. È anche un tassello che serve per fare diagnosi. Questo test è un test cutaneo che valuta la reazione alla tubercolina. È una reazione di iperreattività ritardata nei confronti di antigeni del Mycobacterium Tuberculosis. È indice dello stato immunitario di un soggetto nei confronti di questo batterio perchè gli anticorpi non hanno nessun valore quindi si fa questo test di ipersensibilità. Una volta stabilito se il soggetto è infetto o meno, in caso di positività, si curerà l’infezione, il granuloma. Quindi si può fare chemioprofilassi. cappe dedicate. Poi ci sono i laboratori di terzo livello che sono muniti di ceppoteca, fornendo monitoraggi più raffinati. Supponiamo che in laboratorio arrivi un espettorato. L’espettorato è un materiale contaminato da altri batteri ed è più o meno denso; un campione di urine invece è un materiale sicuramente non denso ma potenzialmente contaminato. Quindi se abbiamo l'espettorato prima di fare qualsiasi cosa si procede ad un'operazione di fluidificazione e decontaminazione del campione. Se abbiamo le urine procederemo solo alla decontaminazione. In caso di espettorato, la fluidificazione viene mantenuta trattandolo con n-acetilcisteina e con NAOH, idrossido di sodio, al 4%. A questo punto si aspetta un po’ di tempo in modo che i microrganismi che non siano micobatteri vengano eliminati, perchè non sopravvivono al trattamento con NAOH. Questo trattamento sfrutta la resistenza dei micobatteri agli acidi e alle basi, quindi i micobatteri non sono sensibili a questo trattamento mentre tutti gli altri si. Si agita e si lascia riposare. Dopo di che si tampona aggiungendo tampone fosfato per riportare tutto alla neutralità. Dopo di che si centrifuga, si allontana il sopranatante e si lavora sul pellet. Sul pellet si prepara uno striscio. Il preparato verrà colorato con la colorazione di Ziehl Neelsen, il resto si utilizza per gli esami colturali. NB. Il liquor invece non necessita di questo trattamento. Nemmeno il liquido articolare. Sul pellet si può effettuare l'esame batterioscopico con le colorazioni di Ziehl Neelsen (colorazione a caldo) o quella a freddo di Kinyoun. Successivamente si fa l'esame colturale con i metodi tradizionali (che oggi non usa più nessuno). Il metodo tradizionale richiedeva di esaminare le prove biochimiche una per una, non essendo disponibili sistemi miniaturizzati. Oggigiorno si usa il metodo di identificazione sulle colonie. Per alcuni materiali, si può fare direttamente sul materiale patologico un’indagine molecolare che nel giro di poco tempo afferma se c’è un micobatterio. Esame microscopico: con la colorazione di Ziehl Neelsen oppure Kinyoun, se si vedono dei batteri rossi, il referto sarà ‘presenza di batteri acido alcol resistenti’ oppure ‘assenza di bacilli’. Se non si vedono, nell’esame batterioscopico si scrive ‘negativa la presenza di bacilli acido alcol resistenti’. Comunque anche se i batteri non si vedono non si può escludere che un soggetto abbia la tubercolosi. Questo perché se i batteri sono pochi nel materiale patologico, non vengono osservati all'esame microscopico. I batteri, per essere visibili all’esame microscopico, devono essere presenti in quantità di 104-1045 per mL di materiale patologico. Quindi, un esame microscopico negativo non mi esclude la presenza di acidi alcol resistenti. Esame colturale: viene sempre eseguito abbinando un terreno solido e uno liquido. Dopo che il materiale è stato decontaminato, si può impiegare secondo la metodica tradizionale, il Lowenstein Jensen. Un terreno un po’ più datato è il Petragnani. Un altro terreno che è disponibile in commercio ma nelle linee guida che si seguono non viene utilizzato si chiama terreno IUTM (international union of Tuberculosis medium), oppure il Middlebrook. Oggigiorno si tende, per accorciare i tempi, ad usare delle metodiche di arricchimento seminando il pellet ottenuto prima in opportuni terreni liquidi. Oggi tutti i laboratori utilizzano metodiche di arricchimento in terreni liquidi e la valutazione della crescita microbica viene fatta in maniera automatizzata. Uno dei sistemi più utilizzati in laboratorio per l'esame colturale su terreno liquido è il metodo fluorimetrico, quindi si comprano i BACTEC MGIT (micobacterial growth (crescita) indicator tube). Questo sistema utilizza delle provette di plastica, così se cadono a terra non si rompono, non c'è il crash, sotto cappa in cui c'è un terreno liquido che è il 7H9 al quale si addiziona un supplemento per far crescere meglio i micobatteri e soprattutto si aggiunge un cocktail di antibiotici, che viene chiamato PANTA, dalle iniziali degli antibiotici presenti. Nella provetta, a cui si aggiunge questo cocktail di crescita, alla base c'è uno strato di silicone a cui è attaccato un sale metallico di rutenio che è fluorescente e sensibile alle variazioni della concentrazione di ossigeno. All'inizio l'ossigeno è presente in quantità elevata, poi se vi è crescita di batteri l'ossigeno viene consumato. Questo causa l’emissione, da parte del sale, di un’intensa fluorescenza arancio nel momento in cui la provetta è esposta ai raggi ultravioletti. Ricapitolando, la provetta di plastica contiene un brodo, Middlebrook 7H9 che contiene un supplemento di crescita che favorisce la moltiplicazione dei micobatteri e contiene questo cocktail di antibiotici chiamato PANTA, P sta per Polimixina B, A per Amfotericina, B è un antifungino, N sta per acido Nalidixico, T sta per Trimetoprim e A sta per Azlocillina che è un betalattamico. È quindi un cocktail di antibiotici che dovrebbe inibire ai batteri. L'apparecchio è capace di segnalare le provette che si sono positivizzate. Una volta segnalata la positività, si prende un'aliquota di questo brodo, e si effettua la colorazione di Ziehl Neelsen per vedere se ci sono batteri acidi alcol resistenti che, specialmente nei terreni liquidi, crescono sotto forma di cordoni. Una volta accertato che nel cordone sono cresciuti micobatteri seminiamo il brodo in un terreno. Quindi i tempi di diagnosi si accorciano. A questo punto cresceranno nei terreni solidi dei micobatteri che si devono identificare. L’identificazione dei micobatteri avviene mediante HPLC, cromatografia in fase liquida ad alta pressione. In passato si utilizzava la gascromatografia, oggigiorno si usa l'identificazione molecolare. Quest’ultima si basa sulla sequenza nucleotidica del DNA ribosomiale 16s. Questa indagine molecolare può anche essere fatta direttamente sul campione. Un sistema molto più moderno per l’identificazione dei micobatteri è il MALDITOF. Trattamento e terapia Esistono pochi farmaci per la terapia della, del micobatterio. I farmaci di prima linea, ovvero quei farmaci utilizzati nella terapia della tubercolosi sono: isoniazide, rifampicina, etambutolo, streptomicina e pirazinamide. Il laboratorio, grazie al sistema digit fornisce anche le prove di sensibilità ai farmaci antitubercolari, perché stanno emergendo ceppi resistenti. Questi farmaci si somministrano tutti insiemi. È la terapia standard. Farmaco resistenza. I farmaci sono pochi e la terapia è lunga (dura diversi mesi) per cui non è difficile che si abbia a che fare con ceppi resistenti che possono anche comparire in seguito a terapia. Si utilizzano sostanzialmente tre farmaci contemporaneamente perché se si usa un farmaco da solo si ha la possibilità di comparsa di ceppi resistenti. Se si usano due o tre farmaci, la possibilità di comparsa di ceppi resistenti, durante la terapia, si riduce notevolmente. Se si usa solo isoniazide, vi è la probabilità di 10-5 che possa esserci resistenza all'isoniazide. Se si usa solo la streptomicina, con tutti i problemi ototossici e nefrotossici, la probabilità di comparsa di ceppi resistenti è di 1 su 106 quindi 10-6. La probabilità che compaia, durante il trattamento, una resistenza a questi farmaci somministrati contemporaneamente è di 10-11. Quindi si riduce. Ci sono altri farmaci di seconda scelta, tra cui si ricorda la Levofloxacina e altri aminoglicosidi. Un altro motivo per cui si utilizzano tre farmaci, durante la terapia, è il fatto che l'antibiotico utilizzato, deve essere in grado di agire sia sui micobatteri che si trovano nelle cellule, cioè i micobatteri intracellulari, sia di agire su quelli che sono liberi, cioè fuori dalle cellule. E questo non tutti lo fanno. Ad esempio la rifampicina, agisce sia sui micobatteri extracellulari che sugli intracellulari, come appunto l'etambutolo. Mentre, la Pirazinamide, agisce solo sugli intracellulari e la Streptomicina, solo sugli extracellulari. Durata del trattamento Il trattamento dura 6 mesi, soprattutto il trattamento per la tubercolosi polmonare. 2 mesi si somministrano tre farmaci come l’Isoniazide, la Rifampicina e la Pirazinamide. Poi i restanti 4 mesi si somministrano due farmaci quali Isoniazide e Rifampicina. La Streptomicina non si usa molto. Invece in corso di meningite tubercolare, il trattamento deve essere più lungo. La terapia in questo caso durerà 12 mesi. Di cui, i primi 2 mesi si somministrano quattro farmaci e nei restanti 10 mesi se ne somministrano solo due. Chiaramente, l'infezione è più grave e va trattato in maniera più pesante. Chemioprofilassi