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Scarica appunti appunti appunti appunti appunti appunti e più Appunti in PDF di Filologia solo su Docsity! Lezione 16 aprile Prove di sensibilità agli antibiotici I batteri si scambiano geni di resistenza, per esempio le Enterobatteriacee passano geni di resistenza allo Pseudomonas e lui a sua volta alle Enterobatteriacee che lo passano al Vibrio Cholerae, al Campylobacter. Ci sono ceppi resistenti ai Fluorochinoloni nell'ambito dei batteri Gram negativi. Invece nei batteri Gram positivi, gli Enterococchi hanno passato i geni di resistenza agli Streptococchi, per esempio la Vancomicina. Gli Stafilococchi possono passare i geni agli Enterococchi. Gli Enterococchi agli Pneumococchi e agli Streptococchi. Antibiogramma L'antibiogramma è un test in vitro che si può eseguire in vari modi. In genere si esegue esponendo una concentrazione standard dell'agente eziologico in esame (cioè del batterio di cui vogliamo conoscere la sensibilità) al pannello di antibiotici, in particolare ad una serie di concentrazioni scalari e definite di farmaci antibatterici. Questo permetterà di impostare una antibiotico terapia mirata, fatta per il batterio responsabile di una determinata infezione. L'antibiogramma è quasi sempre utile, soprattutto va eseguito su batteri isolati da emocoltura (pazienti con sepsi) o da un liquor, dalle vie respiratorie (basse vie respiratorie tipo l'espettorato) oppure il BALL ovvero liquido di lavaggio bronco alveolare. Campioni provenienti da ossa in caso di osteomieliti, articolazioni in caso di artriti, urina da catetere, fluidi biologici, liquido pleurico. Viene effettuato per batteri isolati da infezioni ospedaliere, non solo per la terapia antibiotica mirata ma anche per scopi epidemiologici e anche per conoscere la diffusione delle resistenze in un determinato reparto. Quando si ha un campione biologico, escluso il sangue, questo viene seminato su vari terreni di coltura. Il giorno dopo, si va a vedere che colonie sono cresciute. In queste colonie successivamente si effettua sia l’identificazione biochimica che le prove di sensibilità. Le piastre vanno osservate accuratamente a luce riflessa per essere certi della purezza delle colonie. Il materiale seminato sono le urine. Quindi bisogna valutare la purezza delle colonie e prelevare due o tre colonie dello stesso tipo. Queste si prelevano con un’ansa oppure con un tampone. Successivamente le colonie vengono stemperate in acqua distillata o soluzione fisiologica in modo da prepararci l'inoculo cioè la sospensione batterica che verrà utilizzata per le prove di sensibilità agli antibiotici. A questo punto si eseguono i test di sensibilità agli antibiotici. Per eseguirli ci sono vari metodi, quello più usato è il metodo fenotipico, che si basa sull'attività antimicrobica e sulla conoscenza dei break point. Oppure ci si basa su metodi genotipici, disponibili anche in commercio, basati sulla ricerca di uno o più geni di resistenza. I metodi genotipici per la ricerca de gene mecA (meticillino resistenza in S. Aureus), geni che codificano per le SBL, gene vanA, vanB, eccetera. Uno di questi metodi è il metodo di Agar diffusione, conosciuto anche come metodo di Kirby Bauer. Già dagli anni 60 ci si pose il problema di avere dei metodi per valutare la sensibilità agli antibiotici. Negli anni 70 furono introdotti i metodi di microdiluizione in brodo, poi divennero semiautomatizzati e completamente automatizzati. Più recentemente vi è stata appunto l'introduzione di questo test di Kirby Bauer. I test di sensibilità se non sono standardizzati, si rischia di dare risultati inesatti. Attualmente in America esiste l’NCCLS, cioè National Committee for Clinical Laboratory Standard. Attualmente questo si chiama CLSI, ovvero Clinical Laboratory Standards Institute, che non stabilisce solo le linee guida ma fornisce indicazioni ad esempio per gli esami di chimica clinica e quindi per tutto quello che riguarda il laboratorio. In Europa invece hanno creato il cosiddetto EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing), ovvero un comitato che stabilisce delle linee guida che devono essere seguite da tutti i paesi. L’EUCAST è organizzato dall’ESCMID, che vuol dire European Society Clinical Microbiology and Infectious Disease, che insieme all’ECDC, European Center for Disease Control (istituzione che controlla in Europa non solo l'andamento dei ceppi resistenti ma tutti i tipi di infezione) riporta periodicamente incidenze di malattie tipo il morbillo, quindi tutte le malattie diagnosticate in Europa. È stato fondato nel ’97 e si aggiorna molto spesso. Metodo di Kirby Bauer Questo metodo in passato era molto utilizzato in laboratorio. Innanzitutto si deve ricordare che per fare i test di sensibilità agli antibiotici di qualsiasi tipo, si deve standardizzare l'inoculo batterico. Di fatti i batteri da esaminare vengono posti in una soluzione fisiologica sino a che questa soluzione fisiologica non raggiunga la stessa densità ottica di uno standard di torbidità. In passato questi standard, disponibili in commercio, erano delle sospensioni contenenti solfato di bario a una determinata concentrazione. Questo solfato di bario quando è completamente sospeso nel solvente che in genere è acqua distillata, deve dare una densità ottica di 0,5. In passato queste provette erano molto utilizzate, mentre oggi la densità della sospensione che viene preparata, non si stabilisce più ad occhio cioè paragonando la torbidità della sospensione con la torbidità della scala 0,5, ma esistono degli apparecchi detti densitometri che misurano la torbidità della sospensione cellulare in un range da 0,3 sino a 5 quindi. NB. quando preparo la sospensione, se compare 0,5 la posso utilizzare, se invece la densità è a 0,8 la diluisco ulteriormente. Se la densità è 0,2 aggiungo altri batteri. In definitiva deve normale, Resistente il ceppo non è inibito dalle concentrazioni ottenibili in vivo somministrandolo secondo un dosaggio normale cioè consigliato da bugiardino. I break point, cioè i limiti al di sotto dei quali un ceppo è considerato resistente, tengono conto della farmaco cinetica e della farmaco dinamica delle concentrazioni raggiunte in vivo nel sangue e nel tessuto dell'antibiotico, quando somministriamo secondo la posologia normale. Tengono anche conto dell'attività clinica, cioè della correlazione tra i risultati in vitro (valore della MIC) e dei risultati in vivo cioè la guarigione, la risoluzione del processo infettivo. Se in vitro il batterio è risultato sensibile e si somministra l'antibiotico, il paziente non è detto che guarirà. Sicuramente ci sarà un effetto positivo della terapia. Ma non sempre i risultati in vitro riflettono la situazione in vivo. Per esempio è molto importante lo stato immunitario del paziente (nei pazienti immunocompromessi si evitano i batteriostatici, si usano i battericidi), le caratteristiche farmacocinetiche dell'antibiotico cioè la sua capacità di penetrare in determinati tessuti o cellule e altri fattori. Quindi il test di Kirby Bauer non dà risultati qualitativi. Dunque le ditte hanno commercializzato un test che si chiama E-test o Epsilon test, la epsilon, l'ellisse, si riferisce alla forma dell'alone di inibizione. In questo test si contano le strisce, non ci sono dischetti ma strisce di plastica contenenti un gradiente di concentrazione a raddoppio dell'antibiotico. Le concentrazioni in passato si indicavano con microgrammi per millilitro, oggigiorno si indicano in milligrammi per litro e quindi diverse grandezze scalari dell'antibiotico. La tecnica di semina è identica a quella ricordata per il metodo precedente: dopo che abbiamo seminato il ceppo si aggiunge la striscia impregnata di antibiotico e qui sopra [indica slide] c'è la sigla che indica l'antibiotico e queste sono le varie concentrazioni presenti in questi punti. Si mette ad incubare e il giorno dopo si osserva che cosa succede. L'alone di inibizione non è circolare ma a forma di ellisse perché in questo test c'è più antibiotico che diffonde maggiormente, dunque man mano che ci spostiamo la concentrazione diminuisce e ne diffonde di meno. Calcolare la MIC La MIC è data dal numero che si legge dove l'alone incontra la striscia, in questo caso la freccia indica il numero 0,0064 e appunto questa sarà la MIC. Questo se non ci sono contaminazioni. Nel caso in cui ci fossero contaminazioni la MIC non sarà questa. Per dare dei valori molto precisiti, si ricorre al metodo di brododiluizione oppure Agar diluizione. Brodo diluizione, i vantaggi sono che sicuramente è un metodo quantitativo poiché dice esattamente la MIC, tuttavia presenta anche degli svantaggi, ovvero è costoso e laborioso. Il metodo di brododiluizione può essere fatto con la tecnica in macrometodo, in cui le varie diluizioni dell'antibiotico sono ottenute in provette, il che comporta spreco di terreni e antibiotico. Un altro metodo che si effettua oggi con maggior frequenza è il metodo della brododiluizione con tecnica di micrometodo in cui le prove vengono fatte in micropiper a 96 pozzetti con il fondo a U, valutando l'intorbidimento del brodo o la formazione di un sedimento sul fondo dei pozzetti di questi micropiper. Per esempio prendiamo questo ceppo, diciamo che è un Escherichia Coli, qui è stato saggiato il ceftriaxone a varie concentrazioni, per esempio 128, la metà, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125. Quindi allestisco diluizioni scalari dell'antibiotico e a ciascuna aggiungo una aliquota della sospensione batterica sempre a McFarland 0,5, metto ad incubare e il giorno dopo vado a prendere la piastra. A questo punto qui vedo torbido e questo vuol dire che il batterio non si è sviluppato perché è stato inibito. Qual è la MIC? 2 che è un valore già notevole. Questo micrometodo viene eseguito anche in maniera automatizzata. Si comprano degli apparecchi dove si riempiono delle gallerie con i vari antibiotici a determinate concentrazioni. Queste gallerie vengono poste nella macchina che rileva l'intorbidamento e il giorno dopo dice se il batterio è sensibile, intermedio o resistente. Altri sistemi con le piastre sono il microscan e la BioMerieux che ha prodotto VITEK2 molto utilizzata perchè la metodica è miniaturizzata. Nelle piastre da utilizzare per le prove di sensibilità, cioè in questi pozzettini, ci sono le varie concentrazioni di antibiotico che devono essere saggiate. Quindi c’è sicuramente un risparmio di spazio. Queste metodiche hanno una serie di vantaggi, meno personale, facilitano il lavoro di laboratorio, i costi sono più bassi, eliminano la soggettività di interpretazione personale poiché ci sono sempre dei criteri soggettivi di interpretazione mentre con l'apparecchio no. Tuttavia ci sono anche tutta una serie di svantaggi, tra i quali non è possibile eseguirlo per tutti i tipi di batteri, posso esserci possibili errori nel determinare la resistenza. Talvolta non identificano correttamente che un ceppo è resistente, hanno qualche problema per qualche antibiotico. Può capitare di sentire ceppo wild type, ovvero un batterio che ha acquisito meccanismi di resistenza ad un determinato antibiotico, invece un ceppo non wild type è un microrganismo che ha acquisito meccanismi di resistenza all'antibiotico in questione. Il metodo di microdiluizione non è semplice, si deve comprare l'antibiotico, in genere li vende la SigmaTau, oppure l’antibiotico deve essere fornito dalla ditta, anche se non sempre questo accade. Quindi, comprare l'antibiotico, scioglierlo in maniera opportuna a determinate concentrazioni con una bilancia di precisione, che molto spesso non è molto precisa. Un altro problema è che bisogna preparare delle soluzioni madri ed eseguire le MIC. Per fortuna molte ditte hanno commercializzato questi sistemi a lettura manuale che facilitano il lavoro. In alcuni casi si può utilizzare il metodo di Agar diluizione, in cui si usa sempre il Mueller a 0,5 McFarlan. La differenza è che nell’Agar diluizione, si prendono tutta una serie di piastre contenenti concentrazioni scalari di antibiotico, quindi si prepara un set di piastre con 32 microgrammi di antibiotico, un set con 16 microgrammi di antibiotico, con 8, con 4, anche se sono numeri alti. Quindi le varie concentrazioni sono presenti nell'Agar. Come? Si prendono le piastre vuote, si mette un'aliquota di ciascuna concentrazione e si aggiunge il terreno fluido che si gira e si fluidifica. Quindi la determinata concentrazione di antibiotico viene inclusa nell'Agar e le piastre vengono suddivise in settori in cui si depone un microlitro della sospensione batterica 0,5 McFarlan. [indica slide] Supponiamo che in questa piastra ci sono 0,5 microgrammi dell'antibiotico X. Si mette ad incubare e il giorno dopo si va a vedere se c’è stata crescita o meno. Il ceppo n° 1 è cresciuto, quindi la MIC non è 1, questi non sono cresciuti, questo si. La MIC sarà la più bassa concentrazione di antibiotico dove non si vede la crescita del batterio. Il vantaggio rispetto alla brododiluizione è che nella brododiluizione si deve effettuare la prova per ogni batterio nei confronti di ciascun antibiotico. Se si vogliono saggiare 5 antibiotici, si deve fare 5 volte la brododiluizione. Invece con il metodo di Agar diluizione una volta che si preparano le varie piastre contenenti concentrazioni di antibiotico, su una stessa piastra si possono saggiare più batter. Questo è l'unico vantaggio. Farlo manualmente è un problema ma per fortuna ci sono sistemi che seminano in maniera automatizzata. Ci sono dei metodi sempre più complicati, dove si compra l’antibiotico e si devono avere le sospensioni in congelatore alla soluzione madre. Prima di fare la prova, si deve scongelare questa soluzione madre. Oggigiorno i medici spesso chiedono delle prove di sinergismo, cioè saggiare contemporaneamente due antibiotici per vedere se hanno un effetto sinergico o meno. Si può effettuare il metodo con due strisce oppure si può fare il cosiddetto checkerboard dilution assay cioè il test di diluizione a scacchiera, in cui due antibiotici sono diluiti serialmente e saggiati insieme. Cioè si saggia 00, 2,5 con 0, 2,5 con il 2,5, e così via. Facendo degli opportuni calcoli, si deve conoscere la MIC del primo antibiotico da solo, la MIC del secondo antibiotico da solo, la MIC del primo con il secondo e la MIC del secondo con il primo. Alla fine si calcola un indice che viene chiamato FIC, e in base al valore del FIC si può dire che tra i due antibiotici c'è un effetto sinergico o indifferente o addirittura un antagonismo. Ci sono diversi svantaggi: è difficile da fare, richiede tempo, lavoro. Ci sono degli errori quando si preparano le soluzioni madre. Un sinergismo noto è la colistina + rifampicina, i due dati insieme hanno effetto sinergico. La colistina da sola ha MIC 0,25, la rifampicina è resistente. Mettendoli insieme si riduce il suo valore di MIC, anche se di poco. Quando un fagocita incontra una Candida che emette il germ tube, è meno efficiente nel killing. E la candida, invece di stare dentro al fagocita, protrude con il tubetto germinativo. La Candida in assenza di malattia può vivere un po’ dappertutto. È stata isolata nel terreno, nell’ambiente ospedaliero e negli alimenti. Nell’organismo dell’uomo può essere presente come semplice commensale, senza dare malattia. È stata isolata nella cute, nell'intestino, nelle alte vie respiratorie, quindi può essere isolata nell'espettorato e infine può trovarsi anche nel tratto genitale e nelle mucose. La malattia da Candida il più delle volte è di origine endogena, cioè sono causate da quelle poche Candide che non albergano nell’organismo dell’uomo. È descritta anche la trasmissione interpersonale, da persona malata o infetta a persona sana e persino da animali all'uomo. Spesso, ma non sempre, viene acquisita in ambiente ospedaliero. Parliamo di vaginite da Candida. La trasmissione interumana può essere verticale, per esempio dalla madre al neonato e può anche avvenire durante l'attraversamento del canale da parto. Oppure, può essere orizzontale con una trasmissione per via sessuale, da donne che hanno vaginite, nel maschio si manifesta un'infezione del prepuzio e del solco balano prepuziale. Per quanto riguarda la trasmissione in ambiente ospedaliero, il personale deputato all'assistenza, se non si lava continuamente le mani, può trasportare i batteri da un paziente all'altro. La Candida viene definita come patogeno opportunista perché dà malattia solo in presenza di fattori di rischio. Tra i quali neutropenia, immunosoppressione e immunodepressione, la presenza di cateteri sia intravascolari venosi che urinari, l'emodialisi, il diabete. Il soggetto diabetico va incontro a infezioni di vario tipo. L'uso di corticosteroidi, quindi di cortisonici che abbassano le difese dell'ospite, ma soprattutto anche l'uso di antibiotici ad ampio spettro. Nuovi fattori di rischio sono rappresentati anche dall’ospedalizzazione e dall'uso di cateteri, di ventilazione assistita e così via. L’uso di antibiotici favorisce l'infezione da Candida perché l’antibiotico riduce o elimina la microflora residente. La microflora residente impedisce un’eccessiva proliferazione di altri batteri ma anche della Candida. Per cui questa Candida aumenta di numero e può dare la malattia. In questo modo lavora anche l'immunodepressione. Sino a che il soggetto è immunocompetente la Candida non riesce a moltiplicarsi più di tanto. Nel momento in cui le difese immunitarie si abbassano la Candida si moltiplica e dà la malattia. Per esempio affetti da Candida sono per definizione i pazienti affetti da AIDS. La candida in questi soggetti è una delle prime infezioni opportunistiche che compare. Manifestazioni cliniche A livello delle mucose appare il cosiddetto Mughetto. Vi è quindi la comparsa di macchie color crema sulla lingua e sulla mucosa buccale e orale. Sono delle pseudomembrane in cui si trovano tanti batteri, inclusa la Candida. Il mughetto si osserva nei pazienti con tumori. Chiaramente è la chemioterapia che abbassa le difese immunitarie e favorisce questa manifestazione clinica, così come nei pazienti affetti da AIDS. È presente anche nei neonati che si possono infettare con l'attraversamento del canale da parto. Chiaramente le madri devono essere colonizzate a livello vaginale. Oppure il neonato può presentare mughetto se la mamma non usa i ciucciotti o il biberon sterilizzati. Se non curata, la Candida può raggiungere l'esofago causando esofagiti, sempre in pazienti con tumori o AIDS. Le esofagiti si vedono nei pazienti che fanno chemioterapia. E quindi, a livello dell'esofago come nel cavo orale, si vedono queste macchie color biancastre. Soprattutto nei pazienti con tumore del sangue. La Candida è il primo agente eziologico delle vaginiti. La candida viene favorita da tanti fattori: scarsa igiene, prolungata esposizione ad ambienti umidi, viene soprattutto in estate quando si tiene per molto tempo il costume bagnato addosso, specie se il soggetto è anziano, il diabete eccetera. Potrebbe manifestarsi anche in gravidanza perché la donna è lievemente immunocompromessa. Clinicamente la candida si manifesta con un intenso prurito della vulva, che risulta anche arrossata. Il prurito interessa anche la vagina, grandi e piccole labbra. Vi è inoltre la presenza di una secrezione biancastra, tenace. Qualcuno l'ha paragonata al latte coagulato. Nell'uomo se viene trasmessa dalla donna, può comparire una balanoprostite cioè un'infezione del prepuzio e del solco balanoprepuziale. La candida può dare infezione a livello dell'apparato urinario. Può dare infezioni respiratorie. Può dare peritoniti. Può dare, anche se rare, infezioni del SNC, artriti, osteomieliti, infezioni a carico dell'occhio che in genere sono secondarie a più candidemie. Quindi la candida si trasferisce nel torrente circolatorio e raggiunge l'occhio. Oppure può essere dovuta ad una complicanza di interventi chirurgici a carico dell'occhio. La Candida può dare endocarditi legate o alla presenza di valvole cardiache danneggiate oppure in seguito all'uso di cateteri intravascolari. Da lì il batterio che cresce sotto forma di biofilm va in circolo e si va a localizzare a livello dell'endocardio. Per quanto riguarda le infezioni cutanee, queste si manifestano con un'erezione diffusa, particolarmente accentuata in zone umide e compaiono delle piccole vescicole, molto piccole che tendono a confluire. Per esempio nelle aree sotto mammarie. Possono apparire anche sul volto o a livello delle pliche inguinali. Anche sotto le ascelle. Un'altra infezione cutanea è il Rash cutaneo da pannolino. Colpisce il neonato al quale la mamma non lo cambia molto frequentemente. Quindi l'urina macera la cute delicata del neonato. Poi, se il neonato ha prodotto anche del materiale fecale e la mamma non lo cambia, la cute si macera con le feci del neonato. Nelle feci può essere presente la Candida per cui questo contatto può favorire rash cutaneo da pannolino. Oppure la Candida può dare infezioni interdigitali, quindi fra le dita, per esempio del piede. Questa si manifesta nelle donne che tengono a lungo le mani nell'acqua. Può dare infezioni delle unghie, quindi è uno dei tanti agenti di onicomicosi. Esiste anche una forma di Candidiasi disseminata, vista soprattutto nei pazienti con neoplasie. Può essere più accentuata nei soggetti immunodepressi perché magari hanno subito un trapianto, oppure sono stati sottoposti ad interventi di cardiochirurgia. Nel momento in cui la Candida va in circolo, si ha una Candidemia. Questo fungo può andarsi a localizzare in qualsiasi distretto. Accertamento diagnostico. Materiali vari. Innanzitutto si può fare un esame microscopico anche con la colorazione di GRAM, oppure a fresco. Oppure mettendo sul vetrino una goccia di glucotone lattofenolo e stemperando il materiale. In questo modo si può osservare la Candida in tutte tre le forme. Si procede con l'esame colturale con semina del materiale su Agar Sauboraud. Le colonie sono varie, hanno un color crema, quasi perlaceo, inoltre sono Smooth, cioè lisce. Sono opache con un aspetto che qualche volta potrebbe ricordare anche la cera. La caratteristica delle colonie quindi è che ricordano una mezza perla e sono opache. Le colonie crescono anche su Agar sangue. Per confermare che sono lieviti si effettua una colorazione di GRAM sulle colonie. Se sono lieviti, successivamente si identificano con le prove biochimiche. In genere sono prove di fermentazione di alcuni substrati e di assimilazione di alcuni zuccheri. È possibile farle con metodi manuali, attraverso sistemi miniaturizzati come l'API per le Enterobatteracee e il Campylobacter. Per l’identificazione dei lieviti, quindi la Candida, esistono le ZIM. La lettura viene fatta manualmente, anche se oramai esistono sistemi automatizzati per cui si può fare l'identificazione con delle card più piccole e fa tutto la macchina. Oggigiorno è pure possibile fare, sempre in maniera automatizzata, le prove di sensibilità ai farmaci antifungini. Hanno creato anche dei metodi molecolari per l'identificazione della Candida. Quando il laboratorio non aveva disponibilità di questi sistemi automatizzati, poteva affermare di aver isolato una Candida Albicans, oppure un'altra Candida, semplicemente allestendo il test del tubetto germinativo. Questo test è molto semplice. Viene effettuato attraverso una provetta, un pool di sieri e si aggiunge la colonia di Candida. Si mette ad incubare a 37 gradi sino a due ore, si preleva un'aliquota della sospensione, la si mette su di un vetrino e si va ad osservare al microscopio. Chiaramente a fresco. Se si osserva la presenza di queste protuberanze, il test del germ tube è positivo e quindi la Candida isolata è una Candida Albicans nel 90% dei casi. Oggigiorno ci sono anche delle Candidiasi disseminate. Per cui in commercio c’è la possibilità di determinare antigeni di Candida nel siero. L’antigene che viene ricercato è il Mannano. Si ricerca quindi il Mannano come antigene con la metodica immunoenzimatica.