Appunti biochimica metabolismo, Appunti di Biochimica

Scarica Appunti biochimica metabolismo e più Appunti in PDF di Biochimica solo su Docsity! 10.11.21 Introduzione al METABOLISMO Per mantenere dell’ordine occorre spendere un sacco di energia |__> al concetto di ordine è associato ENTROPIA (disordine, casualità) Cellule e organismi sono entità con un elevatissimo di ordine. II legge termodinamica: - Il grado di disordine del sistema isolato può solo aumentare - L’inclinazione al disordine è un processo spontaneo - L’entropia è la misura del disordine ANABOLISMO —> ANA = costruzione —> richiedo energia (ATP, NADH, FADH2 = potenziali riducenti che derivano dal catabolismo e servono per far avvenire l’anabolismo) CATABOLISMO —> CATA = distruzione, demolizione —> libero energia | Insieme costituiscono il METABOLISMO La parte catabolica prende le molecole nutritive, otteniamo da esse sia l’energia utilizzabile sia gli elementi di base costruttive per la biosintesi e le usiamo per costruire le macromolecole che formano le cellule. I legge della termodinamica —> l’energia si può convertire da una forma all’altra, ma non si può né creare né distruggere. La materia organica deriva dalla luce del sole utilizzata dagli organismi fotosintetici per organicare CO2 e ottenere tutta l’energia che serve a noi. Organismi fotosintetici vanno a convertire l’energia che arriva dal sole attraverso un sistema che è la fotosintesi in materia organica (non solo zucchero ma tutto ciò che agli organismi fotosintetici può servire). Le molecole centrali che sono il punto di scambio energetico sono ATP e NADPH. Sono gli scambiatori energetici essenziali in quanto conservano dentro di loro l’energia del sole con un legame chimico o come equivalenti di riduzione. Batteri fanno fotosintesi ma solo pochi di loro fanno fotosintesi ossigenica e sono i cianobatteri. Trasformano energia solare in O2 e zuccheri. Riossidiamo zuccheri e otteniamo CO2 e H2O e otteniamo equivalenti di riduzione e energia. Ridotto = idrogenato Man mano che togliamo atomi di H e mettiamo atomi di O noi andiamo ad ossidare il metano e otteniamo il metanolo poi formaldeide, acido formico e infine CO2. Passando dall’alto al basso la nostra molecola contiene meno energia. Tanto più una molecola è ossidata tanto meno energia ottengo dalla molecola stessa. Si deve investire energia per ridurre le molecole. Ciò che è ridotto è ricco di energia, ciò che è ossidato è povero di energia. Ossidazione corrisponde a deidrogenazione. METABOLISMO è un insieme di reazioni chimiche. di 1 91 Nelle cellule in ogni momento avvengo migliaia di reazioni in condizioni drastiche. Tantissime reazioni che avvengono allo stesso momento senza che succeda un gran casino e questo grazie alla compartimentalizzazione delle vie metaboliche e rigorosa regolazione di ciascuna delle reazioni. Azoto è uno dei composti più stabili in quanto la nostra atmosfera contiene quasi l’80% di azoto. H altamente infiammabile. Per farli reagire insieme vengono richieste delle condizioni drastiche. Quindi per evitare ciò e farli reagire in condizioni più blande abbiamo la presenza degli enzimi ma il tutto richiede comunque molta energia. Piccoli passaggi con piccole quantità di energia alla volta. Tanti piccoli passaggi ognuno dei quali può avvenire in condizioni blande, quindi andando a liberare una piccola quantità di energia alla volta. ANABOLISMO e CATABOLISMO divisibile in 3 parti: - Da polimeri —> intermedi monomerici - Da monomeri —> composti organici più semplici (piruvato, AcetilCoenzimaA) - Da composti semplici —> degradazione finale a composti inorganici finali Otteniamo piccole molecole semplici, come H2O, CO2, NH3, ma non possiamo riutilizzarle, dobbiamo utilizzare sempre composti metabolici. Metabolismo energetico parte da monosaccaridi passa a polisaccaridi, via glicolitica. Gli AA possono o essere convertiti in piruvato o in nuovi acetilcoenzimaA (deriva dal piruvato o glucosio o da AA). Compartimentalizzazione vale solo per gli eucarioti e serve per far si che in tutte quelle reazioni che devono avvenire, si possono far avvenire tutte quelle reazioni che insieme non potrebbero mai avvenire. Come viene convertita l’energia da una forma all’altra? Attraverso la sintesi di molecole che hanno delle caratteristiche tali per cui sono ricche di energia e servono da vettori e scambiatori di energia. Sono ATP, NADH, NADPH —> ricche di energia in quanto nella loro forma ridotta. Sono facili da scambiare o come gruppo chimico o come elettroni ad alta energia. Immagazzinano temporaneamente energia in quanto vengono continuamente riciclate e quindi vengono continuamente ossidati-ridotti o fosforilati-defosforilati. Le sintetizziamo sfruttando energia che deriva dall’ossidazione di molecole. |__> reazioni accoppiate Anabolismo —> reazioni endoergoniche da convertire in esoergoniche in modo tale che siano termodinamicamente fattibili. Ad esempio, ATP immagazzina energia del glucosio che si ossida per fare un altro lavoro. Possono immagazzinare energia anche ad esempio dalla sintesi di nucleotidi. ATP è un nucleotide = adenosintrifosato Gruppi fosfato sono quelli che hanno il legame ad alta energia, legame che ha delle condizioni particolari. Cosa succede quando ATP viene idrolizzato ad ADP o AMP? Gruppi fosfati chiamati alfa, beta e gamma a partire dall’attacco sulla molecola. Quello più idrolizzato è quello gamma. Legame fosfoanidridici tra i gruppi fosfati. di 2 91 Marker del miocardio e muscolare —> CK —> molto più sensibile |__> riesce a vedere ancora prima che avvenga il danno. Ha un decadimento temporale più lungo, si capisce meglio se il danno continua o si sta riducendo. FosfoCK è sbagliato. ATP è prodotto indirettamente da reazioni di ossidazione, ma non è una molecola che viene ossidata o ridotta. Quindi durante il catabolismo le sostanze organiche vengono ossidate e contemporaneamente vengono prodotte sostanze ridotte. Glicolisi e ciclo di Krebs non producono subito molto ATP. La grande maggioranza dell’energia dei carboidrati viene accumulata sotto forma di equivalenti di riduzione che sono il NADH e FADH2. Calcolare il rapporto tra il NAD ox e la sua controparte red. Le molecole vengono riciclate molte volte durante la giornata. Quando la cellula ha troppo NADH e FADH2 è il caso di mettere in moto meccanismi con i quali andiamo a costituire NAD+. Se c’è tanto NADH e poco NAD+ la cellula è ricca di composti ridotti. Se c’è tanto NAD+ si ha la necessità di generare un NADH e quindi bisogna attivare le vie metaboliche consumando ATP. Anello nicotinamminico è la parte energetica che deriva da una vitamina (PP). Nicotinammide - adenina - nucleotide. Non c’è un NAD semiridotto, o ne prende 2 o non ne prende. NAD+ cofattore delle maggior parti di deidrogenasi, enzimi coinvolti nelle reazioni cataboliche (metaboliti ridotti vengono ossidati ottenendo energia, vie ossidative), c’è una sua controparte identica (tranne per fosfato legato al riposo) che è invece il cofattore delle riduttasi. NADP coinvolto in reazioni che consumano energia, quindi nelle vie sintetiche (=vie riduttive). Se queste reazioni avvengono contemporaneamente e nello stesso distretto è molto più facile controllarle. Vie anaboliche e cataboliche vengono tenute separate in quanto vengono utilizzati enzimi e composti diversi. I cofattori flavinici FMN e FAD hanno una parte redox attiva che deriva da un’altra vitamina che è la riboflavina o vitamina B2. Gruppo adenina - ribosio - fosfato, quindi sorta di nucleotide. Parte redox attiva del FAD sono i 4 stimo dell’isoallossazina. Permette di accoppiare dei trasportatori monoelettronici a dei trasportatori dielettronici obbligati. FAD trasferisce protoni da una proteina che ha un gruppo Fe e si ossida. Coenzima A è una molecola che trasporta non e- o energia ma dei gruppi acilici (gruppi RCOO-). Tutto il metabolismo è possibile grazie agli enzimi, i quali devono essere regolati e controllati. Il modo per controllare le reazioni è controllare l’attività degli enzimi stessi. Molti enzimi sono sottoposti all’azione di attivatori/inibitori reversibili. Quindi un enzima non funziona sempre ma solo quando deve funzionare. Una molecola può essere modificata reversibilmente. Quindi la cellula decide quando attivarlo/inibirlo. Si possono fare delle modifiche covalenti reversibili (es. fosforilazione). Un enzima a cui si aggiunge un gruppo fosfato, con un legame covalente può aumentare o diminuire la sua attività. È un’inibizione non è irreversibile. di 5 91 Modificazione enzimatica attraverso la modifica dell’enzima stesso. La cellula può anche decidere di far defosforilare l’enzima e farlo tornare com’era all’inizio. Consumo ATP per regolare attività dell’enzima. Enzimi la cui attività è regolata attraverso substrato, ciò che varia è la capacità di regolare la reazione. Tanto più e elevata la concentrazione di substrato tanto più l’enzima è capace di catalizzare la reazione. |__> enzima allosterico presenta una cooperatività del legame del substrato. Abbiamo un enzima che quando si lega il substrato questo modifica la struttura dell’enzima che lo rende più affine al substrato stesso. Cambia la Km. Enzimi cooperativi sono sempre costituiti da più subunità, in quanto … Insieme di due enzimi che a bassa concentrazione di substrato hanno una Km molto bassa. Il legame del substrato coopera per aumentare l’attività dell’enzima. Effetto omoallosterico è lo stesso substrato che agisce sulla reazione. Ci sono attivatori/inattivatori allosterici che sono diversi, che non agiscono solo modificando la velocità dell’enzima ma anche il comportamento nei confronti del substrato. |__> controllo eteroallosterico Noi abbiamo un enzima allosterico la cui allosteria è determinata dalla presenza sia del substrato sia di altre molecole. Ci sono dei controlli più facili come esochinasi che è inibita dal suo substrato. Lo stesso livello del substrato è in grado di modificare la velocità dell’enzima ma non in modo allosterico. Regolazione a retroazione —> feedback |__> quando la cellula ha ottenuto la quantità che gli interessa, è lo stesso composto E che catalizza la prima reazione della via biosintetica e quindi va ad inibire la reazione. Blocco tutto dall’inizio e blocco tutta la reazione. Attivazione mediante taglio proteolitico è una regolazione particolare e utilizzata per enzimi “pericolosi” come quelli digestivi che devono essere secreti. Es. proteasi pancreatiche Quindi gli enzimi vengono prodotti come enzimi/precursori inattivi un po’ come l’insulina. Regolazione nel lungo periodo riguarda la regolazione della sintesi e degradazione degli enzimi stessi. Enzimi che servono ad esempio per il ciclo cellulare, quindi regolazioni più lunghe. GLICOLISI prima tappa del catabolismo (metabolismo ossidativo) dei carboidrati. Può avvenire in condizioni aerobie, quindi in presenza di O2 e quindi bisogna aggiungere anche la reazione della piruvato deidrogenasi, il quale produce ACoA e produciamo molto NADH ridotto che viene ossidato nella catena di trasporto mitocondriale e funziona solo con O2. Se non c’è si blocca e si ha un accumulo di NADH ridotti e si blocca tutto. Seconda parte con Krebs che è ossidazione completa di acetil-CoA a CO2 e produzione di molto NADH e FADH2. Poi abbiamo la sintesi di ATP mediante fosforilazione ossidativa con riduzione di O2 in H2O. di 6 91 Polisaccaridi principali forme di carboidrati che derivano dall’amido o dal glicogeno o dalle riserve di glicogeno presenti nel fegato (lo immettono nel sangue quando ce n’è bisogno) e nei muscoli (lo tengono per loro). Seconda fonte di carboidrati sono i disaccaridi che derivano dalla dieta o assumiamo direttamente monosaccaridi che vengono assorbiti direttamente a livello intestinale. Disaccaridi devono essere scissi in monosaccaridi a dare glucosio, fruttosio e maltosio. Le destrine sono delle corte catene di glucosio, quindi oligosaccaridi. Alfa-amilasi riesce a produrre maltosio (alfa/beta-glucosio), quindi non produce glucosio direttamente ma produce unità disaccaridiche. Tutto quello che vede lo riduce e catalizza una reazione di idrolisi e quindi è un enzima che fa parte delle idrolasi, quindi rompe il legame glicosidico ottenendo unità disaccaridiche di maltosio. Per rompere il maltosio abbiamo la maltasi che è sempre una idrolasi dal cui otteniamo glucosio che viene assorbito. Legami alfa-1,6 non sono digeribili dalla alfa-amilasi che idrolizza solo alfa-1,4. È necessario un secondo enzima che si chiama enzima deramificante, in quanto rompe il legame a questo livello. Destrina limite quando alfa-amilasi si trova davanti a un legame alfa-1,6 e deve intervenire l‘enzima deramificante. Saccarasi per ottenere il normale zucchero da cucina. Enzima lattasi che scinde il lattosio, la quale mancanza genera l’intolleranza al lattosio. Nei batteri si riesce a fare la fosforilazione del sacrario a dare glucosio e fruttosio. La mobilizzazione del glucosio non è la digestione ma è l’ottenimento del glucosio a partire da glicogeno endogeno. Quindi quando mobilizziamo le riserve di glucosio non facciamo un’idrolisi ma facciamo una fosforolisi attraverso l’enzima che si chiama glicogeno fosforilasi, cn la differenza che non entra H2O ma gruppo fosfato. Enzimi idrolasi, catalizzano delle reazioni di idrolasi, e fosforilasi, catalizzano delle reazioni di fosforilasi dove viene introdotto il gruppo fosfato, sono enzimi litici. Mobilizzazione del glicogeno che richiede un enzima deramificante. Punti di ingresso della glicolisi —> punto di partenza comune è il G6P. La glicolisi viene fatta partire dal glucosio ma c’è qualcosa più a monte, ma diciamo che il composto che funge da collettore delle varie sostanze è il G6P, il quale continua la glicolisi che lo fa attraverso un residuo di serina che utilizza il gruppo fosfato legando il suo gruppo fosfato al C6. Residuo di fosfoserina che cede gruppo fosfato e poi lo recupera. Galattosio, mannosio e fruttosio sono gli altri che entrano che sono epimeri in … Il metabolismo dei grassi produce glicerolo dalla degradazione trigliceridi e poi viene fosforilato. Composto a bassa energia, ci vuole ATP per fosforilare il glicerolo. Glicerolo ossidato a diidrossiacetonefosfato. La glicolisi può essere divisa in due parti: investimento energetico e produzione di energia. Si ottiene energia sotto forma di ATP (sotto forma di energia) e NADH (sotto forma di equivalenti di riduzione). Gran parte dell’energia contenuta ancora nelle due molecole di piruvato. La glicolisi avviene nel citosol delle cellule. Produzione di glucosio fosfato e fruttosio fosfato nella fase di investimento di energia. La prima cosa che fa la cellula è quindi attaccare il fosfato al glucosio e fruttosio in quanto sono molto reattivi (= +energetico) e “scapperebbero”. Dobbiamo investire energia Rompo in due la molecola di glucosio con 6C ottenendo 2 molecole di gliceraldeide 3 fosfato. Si ha una scissione. di 7 91 reazione successiva è l’isomerizzazione del DHAP (diidrossiacetone fosfato) dalla triosofosfato isomerasi, enzima che catalizza isomerizzazione di un trioso (zucchero a 3C) fosfato. DeltaG0’ lievemente positivo. Reazione necessaria perchè solo la D-gliceraldeide-3-fosfato (G3P) può continuare la via glicolitica. G3P sparisce subito perchè deve essere utilizzata nella reazione successiva quindi reazione spostata verso destra in quanto la G3P è immediatamente utilizzata per la reazione successiva della via glicolitica, questo fa abbassare la G3P il che sposta verso destra anche la reazione di isomerizzazione del DHAP a DG3P. La prima reazione della glicolisi rimane irreversibile in quanto il potenziale di trasferimento del Glu6P non è sufficiente per trasferire il suo fosfato ad un ADP per formare ATP. La reazione 6 è quella che consente la produzione del primo composto ad alta energia senza sprecare ATP. Come faccio a produrre un composto ad alta energia se non investo energia? L’energia si investe ma è quella strappata al substrato ridotto che viene ossidato. Partiamo da un gruppo aldeidico e otteniamo un gruppo carbossilico fosfato e il legame col fosfato è un legame ad alta energia. Riduzione del NAD+ a NADH. È la reazione che sfrutta l’energia di ossidazione del glucosio. Atomi di C del glucosio ossidati sono 2, in quanto da una molecola di glucosio ottengo 2 molecole di G3P. Tutti i prodotti della reazione precedente vengono utilizzati come substrati per la reazione successiva e quindi vengono rimossi. Quindi ossidazione è sempre esoergonica è accoppiata con la formazione di un composto ad elevato potenziale di trasferimento del fosfato. La fosfoglicerato chinasi consuma il prodotto della Glu3P deidrogenasi spingendo l’equilibrio verso destra. Fosforilazione a livello del substrato chiamata così per distinguerla dalla fosforilazione ossidativa. 1,3-bisfosfoglicerato ha un potenziale di trasferimento del fosfato più alto dell’ATP quindi può sintetizzare ATP. Quindi possiamo far reagire il 1,3-bisfosfoglicerato con una molecola di ADP e sintetizzare ATP ottenendo il 3-fosfoglicerato con deltaG negativo. Ho ottenuto la prima moneta di scambio —> ATP Bilancio netto energetico = 0 perchè avevo consumato 1ATP nella prima reazione, 1ATP nella terza reazione e quindi ne ottengo 2 perché per ogni glucosio per cui consumo 2ATP ottengo 2 1,3-bisfosfoglicerato. Quindi il mio bilancio energetico è a 0. Fosforilazione a livello del substrato vuol dire che riesco ad ottenere la fosforilazione dell’ATP utilizzando un substrato che ha un deltaG0’ più negativo dell’ATP stesso, con potenziale di trasferimento del fosfato maggiore. Avviene una mutasi perchè dobbiamo prepararci alla sintesi di un secondo composto ad alta energia. Reazione tali per cui viene prima spostato il gruppo fosfato dalla posizione 3 alla 2 con un deltaG0’ vicino all’equilibrio e quindi la reazione viene continuamente sposata verso destra. Legame fosfato che non è ad alta energia e quindi si può facilmente spostare con l’enzima chiamato fosfoglicerato mutasi. Quando c’è fosfato di mezzo c’è sempre magnesio. Arriva una reazione di disidratazione in cui eliminando una molecola di H2O, cioè passando da un C tetraedrico sp3 ad un C sp2 riesco a trasformare un composto che non ha un legame ad alta energia in un composto con un legame ad alta energia: il fosfoenolpiruvato è un composto ad alta energia per la reazione di tautomerizzazione. Solo questa reazione ha un deltaG vicino all’equilibrio però questo fa si che questo penultimo intermedio della glicolisi diventi ad alta energia. di 10 91 Il C in posizione 1 è diventato un carbossile, non è più un’aldeide quindi è stato ossidato. Si ha la seconda fosforilazione a livello del substrato dalla piruvato chinasi che sintetizza la seconda molecola di ATP per ogni molecola di fosfoenolpiruvato che bilanciando col glucosio abbiamo 2ATP netti. Anche qui la seconda reazione di fosforilazione a livello del substrato ha un deltaG0’ estremamente negativo. Guadagno netto 2 molecole di ATP e 2 NADH che escono dalla via glicolitica. NADH viene riossidato sulla catena di trasporto mitocondriale e questo può avvenire solo in presenza di O2. Negli organismi o nei tessuti anaerobi succede che a mano a mano che la glicolisi procede, il NAD+ attraverso le 10 reazioni continua ad essere convertito in NADH. La coppia NAD+ e NADH funziona un po’ come la coppia ADP-ATP. Se continuo la glicolisi e contemporaneamente continuo a ridurre NAD+ a NADH ad un certo punto la concentrazione di NAD+ comincia a scendere e quella del NADH comincia a salire. Se consumo NADH nella catena di trasporto mitocondriale riottengo NAD+, ma se sono in assenza di O2 non posso fare questo. Quindi cosa se ne fa l’organismo anaerobio di molto NADH se non avendo più NAD+ non riesce più nemmeno a fare la glicolisi. Allora in condizioni anaerobie bisogna inventare il destino anaerobico del piruvato per riuscire a continuare la glicolisi. Il NADH deve essere riossidato a NAD+ in modo tale che la glicolisi possa continuare anche con condizioni molto basse di O2. E questo avviene tramite la FERMENTAZIONE, la quale serve per riossidare il NADH ridotto durante la glicolisi a NAD+ in modo tale che la glicolisi possa avvenire anche in assenza di O2. Fermentazione LATTICA e ALCOLICA. |
 FERMENTAZIONE LATTICA Riduzione del piruvato a L-lattato con la riossidazione del NADH a NAD+, il quale se si continua con glicolisi anaerobia viene ri-ridotto nella via glicolitica e rincomincia il ciclo. Quindi la fermentazione serve per chiudere il ciclo della glicolisi e quindi per rigenerare quel substrato necessario affinché la glicolisi continui. La lattico deidrogenasi (LDH) è utilizzata come market ed è anche questo un enzima presente in 5 diverse forme in quanto è un tetramero formato da 4 subunità che possono essere di 2 tipi (H heart e M muscle). Adesso utilizzano la CPK (creatina chinasi) in quanto più sensibile e informativa. LDH5 unica forma presente nel fegato. Reazione che può tornare indietro perchè è di equilibrio. Isoenzimi nell’elettroforesi migrano a velocità diverse a seconda del peso. FERMENTAZIONE ALCOLICA Divide la reazione in due: la prima prevede la decarbossilazione del piruvato, quindi uscita del gruppo COO- come CO2. Non è una reazione redox, non c’è bisogno di nessuna componente ossidante. Il prodotto è l’acetaldeide che viene ridotta ad etanolo dall’alcol deidrogenasi che riossida il NADH a NAD+. Tutto il metabolismo dell’etanolo avviene nel fegato. Vengono fatti fermentare gli zuccheri di glucosio presenti nelle piante per ottenere il bioetanolo. Bilancio elettronico: Glicolisi aerobia —> otteniamo 2 piruvato, 2 ATP, 2 NADH Fermentazione lattica —> 2 lattato, 2 ATP |__> abbiamo ottenuto pochissimo ATP perchè la grande energia è compresa ancora nel lattato. Fermentazione alcolica —> 2 etanolo, 2 ATP di 11 91 Glicolisi anaerobia è un processo estremamente inefficiente dal punto di vista energetico in quanto se noi facciamo l’ossidazione del Pyr possiamo ottenere tot 2870KJ/mol mentre col lattato solo 2757KJ/mol, quindi vuol dire il 96% dell’energia è ancora del prodotto quindi ho sfruttato pochissimo la potenzialità che si poteva avere. Dal punto di vista energetico nella glicolisi ci sono 3 reazioni che sono assolutamente irreversibili che hanno un deltaG molto negativo. Gluconeogenesi è la glicolisi al contrario ma bisogna passare queste 3 reazioni e lo si fa spendendo energia, ci costa 4 ATP netti invece dei 2 ATP che otteniamo con la via contraria. Bilancio energetico totale deve essere per forza altamente negativo. La resa della glicolisi anaerobia: l’eccesso di deltaG serve per favorire la via. Keq favorita verso i prodotti. Questo indica che noi otteniamo non tantissima energia perché in questo modo riusciamo a far si che la via possa avvenire praticamente sempre perché se blocchiamo la glicolisi non esiste alcun altro modo per ottenere energia. Dal ciclo dell’acido citrico e dalla conseguente fosforilazione ossidativa? Di solito se ne ottengono in condizioni scarse da 30 a 36, quindi 15 volte. È chiaro che è molto più conveniente. Perché 15 volte e non 100 volte? Perché comunque una grande parte di tutta l’energia contenuta nel lattato che in realtà non viene formato e va nel Pyr io comunque non la recupero e quindi la resa non è mai del 100%. Idem la fosforilazione ossidativa e il ciclo di Krebs hanno una resa che si aggira intorno al 30/35%, quindi una grossa parte di energia viene utilizzata per far avvenire le reazioni. Si continua a fare glicolisi in quanto è il modo per ottenere il pyr che è il punto di partenza per gli step successivi e poi perché è rapidissima quindi posso ossidare il glucosio della via glicolitica in brevissimo tempo. Ottengo poca energia, consumo un sacco di glucosio, ho un’efficienza bassissima ma se mi serve energia è l’unico modo per ottenerla in breve tempo. Ecco perchè i nostri muscoli quando andiamo sotto sforzo muscolare intenso si mettono a fare la glicolisi anaerobia in quanto hanno bisogno di rigenerare e la glicolisi aerobia (ciclo di Krebs e fosforilazione ossidativa) è troppo lenta. Carenza di O2 faccio la fermentazione lattica. Anche le cellule tumorali utilizzando la glicolisi per crescere molto più rapidamente ottenendo poca energia ma molto più rapidamente. REGOLAZIONE DELLA GLICOLISI —> effetto Pasteur Se O2 è basso il prodotto della glicolisi sono etanolo e CO2 Se O2 è alto il privato è convertito ad acetil-CoA | Dal punto di vista enzimatico avviene a diversi livelli: esochinasi, fosfofruttochinasi-1 (PFK-1) e piruvato chinasi —> 3 enzimi chiave Esochinasi —> quando c’è un accumulo di glucosio 6 fosfato abbiamo inibizione quindi viene deviato verso la sintesi di glicogeno. PFK-1 è inibita da ATP, dal citrato, attivata dal fruttosio-2,6-bisfosfato e da ADP. Se ho tanto ATP e tanto glucosio consento che avvenga la prima reazione che mi produce il prodotto che convertendosi a glu1P produce glicogeno. Se blocco questa accumulerei glucosio e non me ne faccio niente nella cellula, quindi ATP non può andare ad inibire la prima reazione in quanto il significato deve essere: c’è tanto glucosio, comincio a produrre glu6P e lo converto verso Glu1P però c’è inibizione di questo ma se glu6P viene convertito a glu1P per ottenere glucosio questo non si accumula e quindi non inibisce la prima reazione. di 12 91 È quello che regola la via glicolitica inibendo contemporaneamente la via gluconeogenetica. Il fruttosio 2,6-bisfosfato viene prodotto dallo stesso intermedio glicolitico fruttosio 6P e l’enzima non è PFK1 ma fosfofruttochinasi 2. Fosfofruttochinasi-2 —> enzima bifunzionale in quanto è capace di catalizzare la reazione in entrambe le direzioni, sia nella reazione di sintesi del fruttosio 2,6-bisfosfato sia nella direzione opposta cioè nell’idrolisi del fruttosio 2,6-bisfosfato per ritornare a fruttosio 6P. Non prendiamo il fruttosio 2,6-bisfosfato e la ADP e risintetizziamo ATP defosforilandolo. Quindi le reazioni non sono l’una l’inverso dell’altra. Una reazione è fruttosio 6-bisfosfato + ATP —> fruttosio 2,6-bisfosfato + ADP L’altra è fruttosio 2,6-bisfosfato + H2O —> fruttosio 6P + Pi libero Quindi le loro termodinamiche sono completamente diverse. Quindi questo enzima ha proprio due funzioni diverse. La reazione opposta non potrebbe avvenire per la regola del potenziale di trasferimento del fosfato. L’attività fosfofruttochinasica e l’attività fruttosio bisfosfatasica sono presenti nello stesso enzima, cioè fosfofruttochinasi 2, a seconda dello stato di fosforilazione dell’enzima stesso. Quindi chi decide se questo enzima catalizza una reazione piuttosto che l’altra lo decide lo stato di fosforilazione dell’enzima stesso. Enzima fosfofruttochinasi 2 può essere presente in una forma defosforilata o fosforilata. La fosforilazione è un metodo per regolare l’attività degli enzimi. A questo enzima succede che in determinate condizioni metaboliche che sono quelle di elevato glucosio, questo enzima è presente nella sua forma defosforilata e catalizza la reazione che dal fruttosio 6 fosfato, consumando ATP produce fruttosio 2,6 bisfosfato attivando la via glicolitica. Se siamo in condizioni di basso glucosio, non attiviamo la via glicolitica, ma andiamo nel fegato dove abbiamo la regolazione di questo enzima attraverso gli ormoni, la concentrazione bassa di questo enzima fa si che venga fosforilato da una proteina chinasi (consuma ATP) e se viene legato questo gruppo fosforico in un particolare residuo dell’enzima, questo non viene inattivato ma viene convertito nell’enzima che catalizza la reazione opposta. Quindi non solo non si sintetizza più fruttosio 2,6-bisfosfato ma questo fruttosio 2,6-bisfosfato viene degradato a fruttosio 6P. In queste condizioni la glicolisi viene inibita, che è quello che deve succedere quando siamo a bassa concentrazione di glucosio. Nel fegato noi dobbiamo agire con questa regolazione in quanto il fegato è l’organo che regola molte tra le reazioni del metabolismo a livello sistemico. Regola il livello di glucosio ematico. Per il metabolismo cerebrale che può funzionare solo con il glucosio tranne a digiuno che è una condizione patologica, il SNC consuma solo glucosio. Il cervello non ha depositi di glucosio e quindi di glicogeno e quindi è necessario che lo vada a pescare dal fegato tramite la concentrazione di glucosio nel sangue venga mantenuta costante (90mg/dm). Il fegato fa la gluconeogenesi, cioè risintetizza glucosio a partire da determinati precursori che sono il lattato, pyr e AA, e demolisce le sue riserve di glicogeno e generosamente le dona, esporta il glucosio nel sangue per mantenere elevato il livello. Scopo del fegato: mantenere elevate le concentrazioni di glucosio nel sangue, quindi non può utilizzare il glucosio per fare glicolisi per sé e quindi ottiene energia dalla degradazione degli acidi grassi. In condizioni di basso glucosio, abbiamo la produzione di glucagone (ormone di digiuno) ci dice che sta scendendo la quantità energetica delle cellule. Questo glucagone nel fegato attraverso la via di fosforilazione, attiva queste vie di diversi enzimi tra cui anche quelle della fosfofruttochinasi 2 che smette di produrre fruttosio 2,6- bisfosfato e al contrario acquista la sua attività fruttosio bisfosfatasica. Quindi da un lato inibisce la glicolisi e dall’altro attiva la gluconeogenesi. di 15 91 Il fegato è pronto per risintetizzare glucosio da esportare nel sangue. Quindi glucagone = poco glucosio, si attivano delle cascate di fosforilazioni di diversi enzimi tra cui la PFK2 che diventa fosfofruttosiobisfosfatasi-2 che fa diminuire la concentrazione di fruttosio 2,6-bisfosfato che a sua volta fa diminuire l’attività della PFK1. |__> abbassa la velocità della glicolisi Lo stesso substrato, il fruttosio 6P può, se viene fosforilato dalla PFK1, diventare l’intermedio glicolitico, se viene fosforilato dalla PFK2, può diventare il regolatore della sua stessa funzione con l’altro enzima. Se siamo dopo il pasto si ha una produzione di insulina che è l’alter ego del glucagone. La presenza di insulina (ormone della sazietà) nel sangue ci indica che c’è molto glucosio e quindi la nostra PFK2 non è fosforilata, agisce in modo da sintetizzare il fruttosio 2,6- bisfosfato il quale aumenta l’attività della PFK1 attivando la glicolisi anche nel fegato, in quanto c’è tanto glucosio e quindi anche il fegato può permettersi il lusso di fare la glicolisi per ottenere energia. Tra l’insulina e il glucagone e la fosforilazione della PFK2 c’è la trasduzione del segnale, c’è una regolazione attraverso cAMP nel caso del glucagone ma non per l’insulina la quale ha dei recettori suoi. cAMP regola non solo la fosforilazione della PFK2 ma anche degli enzimi che sintetizzano e degradano il glicogeno, che è l’altro modo che il fegato ha per mantenere elevata la concentrazione di glucosio ematico. È importante che ci sia questa regolazione alternata in quanto sia la glicolisi sia la gluconeogenesi avvengono entrambe nel citosol delle vie epatiche. La gluconeogenesi costa di quanto ottengo dalla glicolisi. Piruvato chinasi è un enzima tetramerico e quindi allosterico, è inibito da elevate concentrazioni di ATP, è attivato da concentrazioni alte di fruttosio 1,6-bisfosfato, ed è regolato dalla fosforilazione nel fegato. È importante non sprecare il fosfoenolpiruvato se voglio sintetizzare glucosio, in quanto per tornare indietro devo consumare ATP, quindi è importante che a basse concentrazioni di glucosio questa via/reazione sia inibita. Ecco perché c’è la reazione di fosforilazione, lo stesso segnale che inibisce questo enzima, inibisce anche questo in modo da evitare un’ulteriore perdita di ATP perchè si passa da fosfoenolpiruvato a piruvato che poi io devo riportare a fosfoenolpiruvato perchè devo ripartire con la gluconeogenesi. Il piruvato è il substrato dell’enzima successivo e se sono in scarsità energetica non voglio continuare a sprecare piruvato per ottenere acetil-CoA. Ottiene direttamente acetil-CoA dal metabolismo degli acidi grassi, cosa che il fegato può fare, il cervello no. Quando siamo a bassa concentrazione di glucosio, il fegato ottiene la sua energia in modo aerobico però bruciando grassi. All’inizio della glicolisi c’erano diversi punti di ingresso. Non vedere mai il metabolismo come un insieme di scatole chiuse ma come un sistema aperto. La glicolisi può essere usata come precursore per molte vie biosintetiche, al contrario si possono ottenere intermedi glicolitici a partire da altri precursori. Dal glucosio 6 fosfato, se siamo in elevata carica energetica, una parte di questo viene convertito in glucosio 1 fosfato che viene usato per la sintesi del glicogeno, che invece di accumulare glucosio che non si può per ragioni osmotiche faccio avvenire la prima reazione della glicolisi e trasformo l’intermedio glicolitico in un altro intermedio che però mi porta alla sintesi del glicogeno. Il G6P può essere usato per la sintesi di pentosi fosfati che portano alla sintesi di nucleotidi. F6P viene usato come punto di partenza per la sintesi di amminozuccheri che portano poi i glicolipidi e glicoproteine con funzioni strutturali. L’intermedio del DHAP è il punto di partenza per la sintesi del G3P che serve a sua volta per la sintesi dei lipidi. di 16 91 Il secondo modo che abbiamo per accumulare energia è quello di sintetizzare i lipidi. Non accumuliamo acidi grassi ma trigliceridi (glicerolo + 3 acidi grassi/lipidi). Glicerolo è una molecola scarica di energia quindi bisogna attivarlo e lo si fa attaccandogli un gruppo fosfato. Allora utilizzo direttamente il DHAP riducendolo a glicerolo 3 fosfato e andando alla sintesi di lipidi. Ho tanto glucosio, ho abbondanza dei diversi intermedi glicolitici, allora ne prendo un po’ per accumulare energia o sotto forma di glucosio o sotto forma di lipidi. Dal 3PG, PEP e Pyr si può partire alla sintesi di AA attraverso reazioni di transamminazioni che avvengono nel fegato. Transaminasi sono nel fegato. Di nuovo il fegato regola anche l’interscambio/cross talk tra il metabolismo dei monosaccaridi e il metabolismo degli AA. Quando siamo in carenza di nutrienti si possono fare le vie opposte. Dai lipidi possiamo ottenere G3P che rientra nella via glicolitica attraverso DHAP e, se sta facendo il fegato la gluconeogenesi, viene riconvertito in glucosio. Non possiamo trasformare lipidi in zuccheri. A parte quella piccola parte di lipidi da cui otteniamo il G3P, gli acidi grassi vengono convertiti in acetil-CoA. Acetil-CoA sta alla fine e non esiste il modo per invertire la reazione della pyrDH che da pyr porta ad acetil-CoA, è una reazione irreversibile. Non possiamo utilizzare lipidi per risentetizzare glucosio. Attraverso una via anabolica del ciclo di Krebs —> ciclo del gliossilato lo fanno i microrganismi e le piante —> possono ottenere dai grassi la sintesi netta di glucosio. Possiamo demolire le proteine in AA e rifacendo le reazioni di transamminazione al contrario, ottenere degli intermedi della glicolisi che servono per la via gluconeogenetica. Non possiamo ottenere zuccheri dai grassi ma possiamo ottenere zuccheri da determinati AA, non tutti perchè non abbiamo le transamilasi per convertire tutti gli AA tra di loro ma alcuni si. Transamminazioni sono reazioni di equilibrio. Il fegato gioca con le sue transaminasi andando da una direzione all’altra a seconda delle esigenze metaboliche. Utilizzare proteine per ottenere energia non va benissimo ma quando siamo a digiuno si fa anche questo. Inizio del secondo passaggio, quindi non proprio ciclo di Krebs ma conversione di piruvato ad ossalacetato, compito della piruvato deidrogenasi. Cosa succede al piruvato una volta conclusa la glicolisi in presenza di O2? Ossidare completamente il piruvato a CO2 in modo da riuscire a strappare tutta l’energia contenuta nel piruvato e ottenere così la maggior quantità di energia sotto forma di ATP disponibile. I numerosi step sono le 8 reazioni del ciclo di Krebs, ma prima di iniziarlo bisogna fare una reazione pre che è l’ossidazione del piruvato ad acetil-CoA, a lui arrivano anche gli atomi di C che derivano dalla beta ossidazione degli acidi grassi. Chi si occupa di ossidare il piruvato ad acetil-CoA è l’enzima della piruvato deidrogenasi. È un enzima che è un insieme di 3 enzimi ognuno dei quali catalizza una sottoreazione. |__> 24 molecole dell’enzima 1 + 24 molecole dell’enzima 2 + 12 molecole dell’enzima 3 È una reazione dal punto di vista energetico molto complicata e quindi servono anche 5 coenzimi. Ciascuno dei 3 enzimi contiene un coenzima. 2 dei coenzimi sono un substrato e un prodotto. Il substrato è il coenzima A che diventa acetil-CoA. Il prodotto è il NADH, quindi il quinto coenzima è la coppia NAD+ NADH. Facciamo reagire il NAD+ e otteniamo alla fine il NADH. Quindi 3 coenzimi legati ai 3 enzimi + 2 coenzimi che vengono chiamati così perchè aiutano gli enzimi e derivano dalle vitamine ma che di fatto sono dei substrati e dei prodotti. di 17 91 Non essendoci la forma di risonanza, il tioestere è meno stabile e quindi quando viene idrolizzato libera una maggior quantità di energia. Rende la reazione più energicamente favorevole, e quindi si sposta più verso destra. Ecco perché c’è una lipoammide con un legame S-S che viene ossidato e ridotto. Il contenuto energetico dei tioesteri è maggiore rispetto a quello degli esteri per una destabilizzazione per mancata risonanza. Anche il CoA è un trasportare di acili un po’ come la lipoammide la differenza è che il CoA viene liberato in giro per la cellula mentre la lipoammide invece rimane legata all’enzima. In entrambi i casi però chi trasporta sono gli atomi di zolfo perchè in questo modo riusciamo ad ottenere l’acetile attivato per destabilizzazione per risonanza. Pag.24 —> reazione riassuntiva Piruvato + tiammina-TPP —> idrossietil-TPP reagisce con lipoammide 1 che ridà la TPP libera pronta per rincominciare il ciclo e lipoammide ridotta che riduce la lipoammide 2 ossidandosi e ritorna al punto di partenza. Lipoammide 2 reagisce con CoA libero a formare acetil-CoA e la seconda molecola di lipoammide che viene ridotta. A questo punto viene riossidata dal FAD dall’E3 che a sua volta viene riossidato dal NAD+ che diventa NADH. Acetil-CoA che diventa il substrato della prima reazione del ciclo di Krebs e il NADH che verrà riossidato sulla catena di trasporto. Questa reazione avviene nella matrice mitocondriale, non siamo più nel citoplasma. Enzima regolato in molti modi diversi: 1. Inibizione da prodotto —> acetil-CoA compete per il legame a E2 il quale deve legarsi al CoA, se c’è troppo CoA si ha una sorta di inibizione competitiva. Il prodotto funziona da inibitore competitivo nello stesso sito in cui si lega il substrato. Il NADH compete per il legame a E3 mantenendo E2 nella forma acetilata. Quindi viene inibito da acetil-CpA, NADH e dalla carica energetica, tanto ATP inibisce la reazione, tanto AMP attiva la reazione. Se prendo il piruvato e lo trasformo in acetil-CoA sto avviando la via che mi produce energia, se ho già tanta energia posso smettere di fare questa reazione. 2. Regolazione covalente —> E1 sottoposto a questa regolazione attraverso fosforilazione. C’è un residuo di E1 la cui fosforilazione è attivata dal NADH e dall’acetil-CoA, ma questo inattiva l’enzima. Quindi NADH e acetil-CoA che inibiscono la reazione, attivando l’attività di un enzima che fosforilando E1 lo inattiva. 
 Al contrario, insulina e Ca attivo piruvato decarbossilasi fosfatasi che quindi attivata E1, quindi produzione di energia, e porta a consumo di glucosio.
 Chi viene fosforilato e defosforilato è E1. La reazione non avviene al contrario, da una parte abbiamo la chinasi dall’altra abbiamo la fosfatasi in cui tolgo enzima, tolgo il fosfato e ottengo il fosfato libero quindi consumo ATP. La reazione in questa direzione (sulla dx) è attivata dal NADH e acetil-CoA e porta l’inattivazione dell’E1, questa reazione (sulla sx) è attivata da insulina e calcio e porta all’attivazione dell’E1. Insulina attiva la via glicolitica, dalla glicolisi si attivano dei precursori per molte vie biosintetiche. È visto sia come un ormone di controllo di glucosio nel sangue ma anche come un ormone della crescita delle cellule non dell’organismo, è come se dicesse alle cellule che abbiamo ricchezza di energia e metaboliti e quindi possiamo andare incontro alle vie biosintetiche. Quindi ha un po’ la funzione di dire alla cellula di crescere. di 20 91 23.11.21 C6H12O6 + 6O2 —> 6CO2 + 6H20 Seconda tappa del metabolismo ossidativo. |__> CICLO DELL’ACIDO CITRICO —> CICLO DI KREBS | O2 di per sé non interviene qui, ma serve per strappare tutta l’energia contenuta nell’acetil-CoA che deriva dal piruvato che deriva dal glucosio, ossidandolo a CO2 e conservando momentaneamente l’energia in trasportatori come FADH2 e NADH. Saranno poi questi ad essere riossidati sulla catena respiratoria di O2. Ciclo di Krebs serve per accumulare tutta l’energia ottenuta dall’ossidazione sotto forma di metaboliti ridotti. Avviene in 8 tappe. Nel 1937 Hans Krebs aveva effettuato uno studio sul metabolismo su sezioni di tessuti, mise in ordine tutti i vari metaboliti ossidati a vario tipo cercando di capire chi derivava da chi e con quale ossidazione. L’ossidazione aerobia del glucosio richiede numerosi passaggi perchè si vedeva che si accumulavano diversi intermedi. Si era visto inoltre che c’erano degli acidi tra cui l’acido citrico (è un acido tricarbossilico) e alcuni acidi bicarbossilici (tra cui succinato —> succinico, malato —> malico, fumarato —> fumarico) i quali a pH fisiologico sono parzialmente dissociati, aumentano la respirazione. Si scoprì il CoA che è quello che permette l’ingresso dei due atomi di C derivanti dal glucosio all’interno del ciclo dell’acido citrico. Fasi respirazione cellulare: PRODUZIONE DI Acetil-CoA a. Glicolisi —> piruvato, ossalacetato e altri intermedi —> quindi AA sono un po’ più preziosi di acidi grassi in quanto li possiamo interconvertire anche a glucosio (dagli acidi grassi otteniamo solo acetil-CoA e da questo non si torna indietro) b. Beta-ossidazione degli acidi grassi c. Catabolismo degli AA OSSIDAZIONE Ac-CoA a CO2 produzione di NADH e FADH2 e la loro riossidazione nella catena di trasporto mitocondriale accoppiata alla fosforilazione ossidativa. Fonti di Aceti-CoA sono acidi grassi, glucosio + altri zuccheri (monosaccaridi), attraverso glicolisi, piruvato. Acidi grassi direttamente all’acetil Co-A, gli AA direttamente ad acetil- CoA anche attraverso il piruvato o altre vie. Siamo nel mitocondrio, importante perchè se la glicolisi, catabolismo degli AA ma non la beta ossidazione che avviene nello stroma dei mitocondri come anche parte del metabolismo ossidativo di AA avviene qui in quanto lo faccio per ottenere energia. Anche il complesso della piruvato deidrogenasi è nella matrice mitocondriale. Mitocondrio è un organello costituito da doppia membrana, una esterna (permeabile a molecole piccole e ioni) e una interna (permeabile alla maggior parte delle molecole soprattutto di H+ il quale gradiente consente il processo di fosforilazione ossidativa). di 21 91 Ci sono tutti i vari trasportatori che devono passare la membrana mitocondriale interna affinché possano passare le molecole. Membrana interna è altamente specializzata. All’interno dei mitocondri ci stanno i ribosomi, ha un suo DNA con un codice genetico un po’ particolare e questo supporta l’idea dell’origine dei mitocondri e anche dei cloroplasti. Siamo nella matrice mitocondriale, quando parleremo della fosforilazione ossidativa e della catena di trasporto saremo all’interno della membrana esterna e a cavallo della matrice e nello spazio intermembrana. Ogni cellula contiene un numero variabile di mitocondri a seconda di quanto la cellula sia attiva dal punto di vista metabolico. Mioglobina serve per traportare O2 nei tessuti con attivo metabolismo respiratorio. Il punto di partenza è l’acetil-CoA la cui ossidazione è complicata perché richiede la rottura di legami C-C e per farlo richiede convertire l’acetile in alfa e beta chetoacidi. La parte che deriva dal glucosio è solo la parte bordeaux sopra. Dei 6C iniziali, abbiamo ottenuto 2 intermedi a 3 atomi di C che è il piruvato e nella reazione della piruvato deidrogenasi abbiamo perso 2 atomi di C come CO2 e ci sono rimasti 4 atomi di C sotto forma di acetil-CoA che contiene ancora un po’ di energia perché un C è ossidato visto che è legato con un legame tioestere ma l’altro è completamente ridotto, e per ossidare questo atomo di C si fa una certa fatica. Bilancio completo dell’ossidazione dell’acetil-CoA (pag.7): 1 molecola di Acetil-CoA produce la riduzione di 3 molecole di NAD+ a NADH, la riduzione di 1 molecola da FAD a FADH2 e la produzione di 1 GTP che è analogo all’ATP. Quindi se bilanciamo per i glucosi, tutto va moltiplicato per 2 perchè 2 atomi di C li abbiamo persi sotto forma di CO2. Ossidazione dei C nel ciclo di Krebs è graduale e avviene in diversi passaggi che sono tutti nella prima parte del ciclo di Krebs. Infatti le ossidazioni avvengono nella seconda e nella terza reazione. Dopo di che si ha una reazione che produce GTP attraverso un intermedio attivato che è analogo all’acetil-CoA ma è il succinil-CoA, ma energeticamente è molto simile. Seguito da una reazione in cui e- vengono trasferiti al FAD, il quale è il coenzima dell’enzima succinato deidrogenasi, che contiene legato una molecola di FAD, e che trasferisce direttamente gli e- nella catena di trasporto mitocondriale. La differenza col NAD è che questo FAD non va in giro libero per il mitocondrio ma l’enzima che lo produce attraverso delle proteine accoppiatrici è collegato direttamente alla catena di trasporto. L’ultima parte che produce una parte di NAD serve per rigenerare l’accettore iniziale che è ossalacetato e questo è il concetto che sta alla base di ogni ciclo, cioè un ciclo in genere prevede una parte iniziale in cui si ha la fuoriuscita di prodotti, in questo caso la CO2, NADH e una seconda fase che prevede la rigenerazione dell’accettore iniziale, in quanto il ciclo inizia quando una molecola di Acetil-CoA si lega all’ossalacetato e quindi alla fine devo rigenerare questo ossalacetato altrimenti non è un ciclo. Bilancio netto degli atomi di C nel ciclo di Krebs è 0 in quanto entrano 2 atomi C come acetil-CoA, escono 2 atomi C come CO2. Ecco il senso del ciclo, alla fine io mi ritrovo nelle condizioni in cui ero all’inizio. Acetil-CoA è una molecola molto lunga che contiene n atomi di C, atomi di C a cui si fa riferimento sono quelli del gruppo acetile che derivano dal glucosio. Il resto esce come CoA ridotto. Quindi la differenza tra acetil-CoA e CoA sono i due atomi di C del gruppo acetile che sono quelli che andranno incontro ad ossidazione. Prima reazione è l’ingresso dell’acetil-CoA catalizzata dall’enzima citrato sintasi. Enzima che catalizza una reazione con un deltaG enormemente negativo in quanto si ha la liberazione di CoA da un intermedio attivato e quindi è fortemente spostato verso destra. I due atomi di C che entrano nel ciclo sono colorati in rosso, quindi il meccanismo della reazione della citrato sintasi prevede che i due atomi di C derivati dall’acetil-CoA vengano di 22 91 È formato da 3 enzimi che contengono 3 coenzimi (TPP, lipoammide e FAD) e infatti utilizza gli stessi substrati: CoA, NAD+ con produzione di NADH. Reazione analoga della piruvato deidrogenasi. Ovviamente l’enzima sarà in grado di legare alfa-chetoglutarato e non il piruvato. Quello che si ottiene è un intermedio con l’enzima E1 che porta legato il succinil-TPP esattamente identico all’intermedio legato all’E1 della piruvato deidrogenasi (idrossibutil- TPP) Non è così regolata come la piruvato deidrogenasi, ha delle sue regolazioni ma non è soggetta a regolazioni complesse come la piruvato deidrogenasi. Reazione 5 —> fosforilazione a livello del substrato Sfruttare energia accumulato per sintetizzare ATP. Libera CoA appena entrato sfruttando la sua idrolisi per la sintesi di ATP. L’energia che porta alla fosforilazione dell’ADP o del GDP non deriva da un intermedio fosforilato ad alta energia ma da un intermedio attivato ad alta energia grazie alla presenza di un legame tioestere. È sempre una sostanza ad alta energia e quindi riesce a trasferire un gruppo fosfato dall’ADP all’ATP o dal GDP al GTP. La scissione del succinil-CoA avrebbe un deltaG di 33-33KJ7mol, di queste ce ne vogliono una trentina per fosforilare il GDP o ADP. Quindi il deltaG0 complessivo di questa reazione è lievemente negativo. ATP/ADP o GTP/GDP perchè ci sono due tipi di enzima succinil-CoA sintetasi. Questo enzima viene nominato col nome della reazione al contrario. Nei muscoli viene utilizzato ATP in quanto il rapporto tra ATP e ADP è molto basso e la reazione è spostata verso la produzione di succinato. Il fegato utilizza GTP in quanto rapporto GTP-GDP 100.1. La reazione è quindi spostata verso la formazione del succinil-CoA perché in realtà questa reazione viene utilizzata dal fegato per la produzione di corpi chetonici (sostanze particolari prodotte durante il digiuno dal fegato) abbiamo quindi un enzima che funziona in modo diverso a seconda dell’organo in cui si trova. Produzione di un GTP è equivalente alla produzione di ATP. Enzimi che consumano ATP non possono utilizzare GTP. Il succinato ottenuto è l’acido carbossilico alfa-B-carbossilico a 4 atomi di C. Reagisce con un enzima che lo ossida riducendosi grazie al suo cofattore FAD. Enzima che si chiama succinato deidrogenasi ma il FAD ha un potenziale redox minore per cui quello che fa è che non riesce ad ossidare il C a livello di un OH ma lo porta da legame singolo a legame doppio, quindi da sp3 lo porta a sp2. Reazione vicina all’equilibrio che viene spostata verso destra dal fatto che il fumarato, che è il prodotto, viene rapidamente rimosso perché continua il ciclo. Siamo già nella fase di rigenerazione dell’accettore. Questo enzima è in grado di produrre uno e un solo isomero che è il fumarato in conformazione trans. Il FAD è legato covalentemente all’enzima succinato deidrogenasi, subunità A, e trasferisce i suoi e- alla subunità B della succinato deidrogenasi che contiene 3 centri Fe- S il quale trasferisce gli e- direttamente al complesso 2 della catena di trasporto mitocondriale. Questo è un enzima direttamente collegato attraverso una proteina intermedia al complesso 2 della catena mitocondriale che è la succinato deidrogenasi. Tutto può essere visto come complesso della succinato deidrogenasi. La cosa essenziale è che gli e- finiscano lì. Quindi questa è la differenza tra il NADH e il FADH2, il NADH viene liberato nella matrice mitocondriale e viene ossidato a livello del complesso 1, il FADH2 rimane legato all’enzima in modo covalente. di 25 91 Seconda reazione di idratazione che è stereospecifica in quanto la fumarato idratasi (=fumarasi) produce dal fumarato il malato. Stereospecifica in quanto produce questo determinato intermedio. Reazione con deltaG lievemente negativo. Ultima reazione che è la riduzione del NAD+ a NADH e la conseguente ossidazione del malato ad ossalacetato. Abbiamo ripristinato il nostro accettore iniziale pronto a rincominciare il ciclo. Ha un deltaG molto positivo, ma la concentrazione di ossalacetato in cellula è sempre molto bassa e siccome ossalacetato serve per i cicli successivi del ciclo di Krebs, la reazione viene spostata verso destra. Il bilancio dell’ossalacetato è il punto chiave di tutta la regolazione del ciclo di Krebs. L’ossalacetato è il più importante tra tutti gli intermedi del ciclo di Krebs. Infatti molte delle reazioni servono a ripristinare l’ossalacetato che è il punto di partenza per la generazione del piruvato che porta alla gluconeogenesi. È un metabolita importantissimo, centra con le transamminazioni degli AA. Stechiometria complessiva |__> come per la glicolisi, il bilancio netto deve prevedere un deltaG molto negativo Da una molecola di glucosio otteniamo 10 NADH, 2 FADH2 e 4 ATP e abbiamo ossidato completamente il glucosio in quanto sono uscite 6 CO2. Come 10 NADH, 2 FADH2 e 4 ATP tutto questo viene riossidato a spese dell’O2 molecolare producendo un sacco di ATP nella fosforilazione ossidativa. Il perché 2 molecole di NADH diano 5 ATP è il meccanismo della fosforilazione ossidativa. Tendenzialmente da un’ossidazione di una molecola di NADH in base all’intensità del gradiente protonico si ottengono 2,5 molecole di ATP per 1 molecola di NADH e 1,5 molecole di ATP per 1 molecola di FADH2. Resa dipende dall’intensità del gradiente protonico. Reazioni che possono essere regolate sono quelle con un deltaG molto negativo e non le reazioni all’equilibrio. Regolazione del ciclo di Krebs —> le 3 reazioni che vengono regolate sono quelle che possono essere regolate dal punto di vista cinetico grazie all’equilibrio di substrati e prodotti nel senso che in questo modo si può regolare l’attività di queste reazioni giocando sul fatto che queste reazioni in realtà sono irreversibili. Il primo modo per regolarlo bisogna utilizzare un enzima, citrato sintasi, la cui attività è regolata dalla concentrazione di acetil-CoA e ossalacetato. Ossalacetato viene mantenuto appositamente in cellula a concentrazioni molto basse, in un certo senso lo stesso vale per l’acetil-CoA che non deve mai essere prodotto in eccesso per determinate ragioni. La citrato sintasi non lavora a saturazione, quindi la sua velocità può aumentare considerevolmente se ci sono a disposizione una maggior quantità di substrati. |__> più ossalacetato e acetil-CoA ci sono più veloce va la citrato sintasi. Per evitare che il ciclo di Krebs vada al contrario troppo velocemente, la stessa reazione è inibita dagli stessi prodotti quindi dal succinil-CoA, citrato e NADH che è l’indice di come sta la cellula, tanto NADH vuol dire che la cellula è ricca di energia. Tanto NADH, poco NAD+, esattamente come ATP e ADP. Ci sono regolazioni allosteriche sugli enzimi fatti da complessi come isocitrato deidrogenasi che è attivata da ADP a bassa carica energetica, inibita da NADH e da un meccanismo di fosforilazione. Alfa chetoglutarato deidrogenasi è inibita da NADH e dal suo prodotto succinil-CoA. di 26 91 Anche il ciclo di Krebs è regolato principalmente dalla carica energetica della cellula, espressa dai prodotti del ciclo stesso ricchi in energia quindi NADH e succinil-CoA e per qualcuno ATP. Ciclo di Krebs è un ciclo anfibolico nel senso che molti degli intermedi di questo ciclo sono coinvolti nel metabolismo di altri metaboliti. Ci sono quindi delle reazioni che vengono dette cataplerotiche che servono per produrre altri metaboliti a partire da intermedi del ciclo di Krebs, e anaplerotiche che servono per riempire i vuoti degli intermedi del ciclo di Krebs qualora questi fossero presenti in condizioni insufficienti. Servono quindi per riempire le basse concentrazioni di alcuni degli intermedi del ciclo di Krebs. Gli intermedi del ciclo di Krebs sono sia utilizzati per le vie biosintetiche ma anche per evitare che ci sia un accumulo in eccesso, in quanto non si devono creare accumuli dei vari intermedi altrimenti è come se ci fossero dei blocchi. Le reazione cataplerotiche che sottraggono intermedi sono quelle che portano alla gluconeogenesi che parte dal fosfoenolpiruvato ma anche dall’ossalacetato. Il citrato può essere scisso a dare acetil-CoA per partire con le vie biosintetiche sia degli acidi grassi che degli steroli. Se c’è un eccesso di citrato vuol dire che c’è un eccesso di acetil-CoA perchè la reazione della citrato sintasi procede troppo rapidamente, a quel punto viene inibita la reazione della citrato sintasi e l’eccesso di citrato viene eliminato attraverso la sua conversione nell’acetil-CoA stesso che però viene deviato sulla sintesi degli acidi grassi perchè a quel punto succede quando abbiamo abbondanza di nutrienti e quindi attiviamo tutte le vie biosintetiche, un po’ come l’eccesso di glucosio 6P dava il via alla biosintesi del glicogeno. Le altre due reazioni importanti sono quelle che partono dai due alfa chetoacidi che sono l’alfa-chetoglutarato e l’ossalacetato che portano alla sintesi di AA attraverso le reazioni di transamminazione. Quindi quando abbiamo degli eccessi di intermedi del ciclo di Krebs possiamo partir con le reazioni biosintetiche utilizzando alcuni degli intermedi del ciclo di Krebs. Se invece dobbiamo riempire i vuoti utilizziamo le reazioni nella direzione opposta e ripristiniamo l’ossalacetato. La piruvato carbossilasi consumando ATP, in quanto è una reazione che non avviene spontaneamente, risintetizza ossalacetato a partire dal piruvato. La fosfoenolpiruvato carbossilasi che è presente in piante e batteri ed è utilizzata per la fissazione del C nelle piante C4, prevede che sia l’energia del composto attivato fosfoenolpiruvato ad essere utilizzata per fissare il bicarbonato a livello di ossalacetato. Il risultato è sempre la produzione di fosfoenolpiruvato. La terza reazione è quella della malato deidrogenasi chiamato anche enzima malico, e anche questo è nominato a partire dalla reazione opposta, reazione anabolica in cui non si arriva a malato che è il composto precedente nel ciclo di Krebs e siccome, per passare da piruvato a malato, occorre una riduzione dell’atomo di C ecco che si ha l’ossidazione del NADPH a NADP+. Pag.34 mette in evidenza tutti i vari metaboliti da cui si possono ottenere o da cui si può partire per ottenere intermedi del ciclo di Krebs. Dall’ossalacetato e dall’alfa- chetoglutarato abbiamo non solo gli AA ma anche le purine, dall’ossalacetato e dal fosfoenolpiruvato abbiamo una certa parte di ossalacetati e AA e le pirimidine, e dal citrato agli acidi grassi e steroli. Considerare il ciclo dell’acido citrico solo come ciclo che serve per il catabolismo del glucosio non è giusto perchè a seconda delle necessità metaboliche viene usato per molte altre cose. Se ho tanta energia, tanti metaboliti, tante sostanze, prendo gli intermedi per sintetizzare gli intermedi per le reazioni anaboliche. Al contrario se ho scarsa energia prendo altri di 27 91 Questo ci aiuta perchè le diverse globine hanno dei residui essenziali che devono essere conservati. Chiamare questi residui con il loro numero sequenziale può indurre confusione perchè non è detto che tutte le globine hanno tutte lo stesso numero di AA ma si possono avere delle differenze, istidina F8 (istidina prossimale) e istidina E7 che vuol dire che è l’ottavo residuo dell’elica F e il settimo residuo dell’elica E. |__> sono così importanti perchè sono quelli che costituiscono le due posizioni di coordinazione dell’atomo di Fe dell’eme. Ci sono altri residui importanti come N-terminale e C-terminale. Ogni singolo monomero lega un gruppo eme quindi la mioglobina lega un gruppo eme e può legare una molecola di O2, mentre l’emoglobina lega 4 gruppi eme e può legare fino a 4 molecole di O2. Il vantaggio è che la emoglobina essendo una proteina tetramerica ha uno spiccato comportamento allosterico (come enzimi che servono per regolare maggiormente la loro attività) il quale fa si che l’emoglobina modifichi la sua affinità per O2 in funzione della concentrazione dell’O2 stesso. È come se stessimo parlando del cambiamento di affinità dell’enzima per il suo substrato in funzione della stessa concentrazione di substrato. Mioglobina ed emoglobina non trasformano O2 ma lo trasportano fino a liberarlo a un certo punto. La concentrazione di O2 disciolta nel sangue è molto bassa, i gas sono poco solubili. | Ma che bisogno c’era di inventare delle proteine così per il trasporto di O2? Perchè O2 verrebbe facilmente ridotto dalle altre sostanze che stanno nel sangue. O2 è un importante ossidante, quindi facilmente tende a ridursi ad H2O. Allora emoglobina e mioglobina sono delle strutture molecolari che consentono alla molecola di O2 di essere trasportata all’interno degli organismi viventi senza essere ridotta e questo succede perchè l’eme è nascosto nel core idrofobico di ogni monomero e l’ambiente molecolare che circonda l’eme è fatto apposta per proteggere la molecola di O2 dalla riduzione. Quindi tutto questo processo che è stato necessario inventare dall’evoluzione è per trasportare O2 proteggendolo da ciò che lui tende a fare facilmente ovvero ridursi, quindi proteggendo allo stesso modo le molecole circostanti dall’ossidazione causata dall’O2 stesso, avere in giro O2 è piuttosto pericoloso per gli organismi. La nitrogenasi è un complesso enzimatico sensibilissimo a O2, se c’è O2 viene avvelenato. I rizobi hanno evoluto una proteina che si chiama leg-emoglobina che serve a spazzare via O2 da tutto ciò che sta intorno alla nitrogenasi. Qui il problema è opposto, io voglio evitare che O2 arrivi lì, in quanto se arriva lì il batterio non riesce più a fissare azoto atmosferico. Quindi O2 per noi è utile perchè serve nella respirazione ma di per sé è una molecola abbastanza reattiva e pericolosa. Tutto lo scopo della mioglobina e emoglobina è quello di sequestrare O2 in un ambiente tale da rendere molto più difficile la sua riduzione. Ci sono dei sistemi che lo tengono ridotto. Si ossiderebbe l’eme. La struttura dell’eme ricorda quella della clorofilla la quale ha la stessa struttura che è l’anello tetrapirrolico che porta al centro un atomo di Fe2+ (il Fe deve essere ridotto!). Fe lega questi atomi di N con legami di coordinazione. Fe può formare fino a 6 legami di coordinazione. Le altre due posizioni di coordinazione del Fe sono con i due residui di istidina F8 e istidina E7. La molecola di O2 se presente si piazza tra la punta del tetraedro che il legame di coordinazione fa tra Fe e istidina e l’istidina stessa. Il piano dell’eme fa si che sia proprio nascosto all’interno della struttura. Ci sono dei canali di accesso e di uscita di O2 fatti in modo tale da far si che durante quel passaggio la molecola di O2 non possa venire ridotta. Piano dell’eme col suo atomo di Fe ridotto al centro. O2 legato che è piazzato tra istidina distale (E7) e istidina prossimale (F8) che ha un’importanza fondamentale perchè è quella di 30 91 che scatena nella emoglobina tutto il riarrangiamento strutturale che fa si che l’emoglobina si comporti in modo completamente diverso dalla mioglobina. Quando non c’è O2 c’è una molecola di H2O. Se l’istidina prossimale ha un’importanza per i cambiamenti conformazionali che fanno si che l’emoglobina funzioni in modo diverso dalla mioglobina, l’istidina distale è fondamentale per regolare le velocità di accesso e di uscita delle molecole di O2. Il problema della cristallografia fa vedere la proteina cristallizzata cioè bloccata. Le strutture ottenute mediante NMR (=risonanza magnetica nucleare) sono in soluzione e quello che si vede è che le proteine sono tutto fuorché cristallizzate. Queste hanno dei micro movimenti ma le catene laterali non sono bloccate, hanno dei movimenti e sono proprio questi movimenti che consentono le uscite e gli accessi dei vari substrati e prodotti degli enzimi. Nel caso della mioglobina: l’ingresso e l’uscita della mioglobina. Quindi questi due residui HisE7 e HisF8 sono essenziali perchè regolano tutto il sistema per cui le globine servono. Istidina prossimale più vicina al piano dell’eme rispetto a quella distale. La molecola di O2 com’è messa tra l’istidina distale e prossimale. Xe1 e Xe4 sono degli molecole di gas xenon che in condizioni anidre hanno consentito degli studi di cristallografia che hanno mostrato quali sono i canali di accesso e di uscita dell’atomo di O2. Gli AA non possono ossidarsi quindi O2 non corre pericolo se si trova circondato da AA, il problema è quando si arriva al Fe che sarebbe facilmente ossidato da O2 che verrebbe ridotto a H2O, l’eme in soluzione in presenza di O2 viene ossidato in tempo 0. La struttura dell’istidina 64 e 93 è presente nel suo tautomero N perchè l’interazione deve avvenire con l’atomo di N che deve essere presente nella forma protonata. Tautomero è quell’isomero di una molecola che differisce dall’altro tautomero che è la posizione di un doppio legame e di un atomo di H. Il legame deve essere reversibile. Koff la costante di liberazione dell’O2, Kon la costante di legame dell’O2. Kd = costante di dissociazione è una costante di equilibrio non cinetica scritta per la reazione di dissociazione dove le due sostanze libere sono i prodotti e stanno al numeratore mentre la concentrazione del complesso è il reagente e sta al denominatore. Occupazione dei siti di legame di O2 (Yo2) quindi frazione dei siti occupati su siti totali disponibili. I siti occupati sono rappresentati dalla concentrazione di mioglobina legata a O2. I siti totali sono rappresentati dalla somma della mioglobina libera e della mioglobina legata a O2. Quindi la mioglobina o è libera o legata a O2 come l’enzima che può essere o libero o legato al substrato. Facendo vari calcoli, scopriamo che la frazione di siti occupati è funzione del rapporto della concentrazione di O2 / Kd + concentrazione di O2. Se poniamo concentrazioni di O2 = a 1/2 della concentrazione totale otteniamo la P50 che è la pressione parziale di semisaturazione. Siamo passati da concentrazione a pressione parziale perchè per la legge di Henry le concentrazioni di un gas in soluzione sono proporzionali alle sue pressioni parziali. Quindi per convenzione si utilizza il termine pressione parziale per definire la concentrazione di O2. Tutto questo mi serve per scrivere la curva iperbolica della saturazione dell’O2 in funzione della pressione parziale di O2. La P50 ricorda molto la Km (in Michaelis-Menten) ma in questo caso la P50 deriva dalla costante di dissociazione mentre nella Km centra anche la trasformazione del prodotto ma qui non si trasforma niente. Per cui la P50 è diretta espressione della costante di dissociazione. di 31 91 La curva di legame ci dice che la P50 della mioglobina è molto bassa, ha un andamento iperbolico. Il tratto azzurro è il range di concentrazione della pressione parziale nei tessuti a riposo espressa come in pressione in mm/Hg = circa 30. La mioglobina a pressione parziale nei tessuti è piuttosto saturata, quindi serve da riserva di O2. Quando il muscolo è in elevata attività consumerà tanto O2 e quindi la %O2 crolla. A questo punto se c’è della mioglobina carica di O2, libera O2. Stiamo parlando di concentrazioni locali a livello tissutale. Se c’è della mioglobina carica di O2, lo libera in quanto il muscolo è in elevata attività. Si incomincia ad avere il rilascio di O2 dal magazzino di mioglobina. La mioglobina è un magazzino di O2 che l’animale utilizza in condizioni di bisogno. Una molecola fatta così non potrebbe funzionare bene come molecola di trasporto in quanto se vediamo la curva verde possiamo pensare la proteina di trasporto con un legame forte con O2. La mioglobina e l’ipotetica proteina trasportatrice con un forte legame tra O2 e sé stessa, a concentrazioni polmonari sono cariche di O2. Ma nei tessuti se lo scopo della proteina di trasporto è quello di cedere O2 ai tessuti, non è che funzioni tantissimo. La differenza rispetto a prima è che la proteina trasportatrice non se ne sta nei tessuti come magazzino ma deve andare avanti e indietro. Quindi una proteina fatta così sarebbe totalmente inefficace come proteina di trasporto. Allora facciamo una proteina che lega molto male O2 a livello dei tessuti ma questo vuol dire che per rispettare la l’equazione iperbolica questo vuol dire che devo legarla molto male anche a livello dei polmoni. Quindi in questo caso lo cede molto di più ma quando arriva nei polmoni se ne riempi poco più del 60% e non è molto efficace. L’evoluzione ha dovuto inventare una proteina che cambiasse la sua affinità per O2 da quando ce n’è poco a quando ce n’è tanto, e questa è la curva della emoglobina che non è una curva iperbolica ma è una curva sigmoide. All’emoglobina succede che a mano a mano che scende la concentrazione di O2, diventa sempre meno affine per O2 stesso, quindi meno O2 c’è più facilmente lo rilascia. L’emoglobina è capace di legarsi al 100% nei polmoni e di rilasciarne tanto a livello tissutale. Ecco che si aumenta molto l’efficienza del trasporto dell’O2. L’emoglobina passa da uno stato in cui lega O2 con bassa affinità, a mano a mano che la concentrazione di O2 aumenta, si trasforma in una proteina che è capace di legare O2 ad elevata affinità. Quando emoglobina esce dai tessuti scarica e se ne va nei polmoni diventa una proteina capace di legare molto meglio O2 proprio perché nei polmoni c’è molto più O2 di quanto ce ne sia nei tessuti. La mioglobina non può fare una cosa del genere, mentre emoglobina lo fa perchè le modificazioni conformazionali subite dalla prima delle subunità dell’emoglobina che si lega a O2 vengono trasmesse alle altre subunità che passano dalla forma a bassa affinità ad una forma ad alta affinità. È lo stesso legame dell’O2 che modifica la conformazione spaziale dei monomeri che non hanno ancora legato O2 per far si che leghi lo stesso O2 meglio. L’unico modo per risolvere questo problema è avere delle proteine multimeriche in cui una delle subunità che interagisce con le altre 3 faccia modificare la conformazione delle altre 3, ecco la ragione per cui tutte le proteine di trasporto sono proteine multimeriche e questo è un sistema top per regolare affinità dell’emoglobina con l’O2 stesso. Nell’emoglobina il Fe rimane ridotto. Tutto questo è reso possibile dal fatto che il tetramero di emoglobina quando lega O2 passa da uno stato T (teso) a uno stato R (rilassato). Questa è la struttura del tetramero ottenuta in assenza o in presenza dell’O2. Si vede che si ha uno spostamento di 15° dell'asse del tetramero stesso. Si vede meglio se osservato dall’alto. Si vedono meglio le due subunità beta (beta 1 e beta 2) e alfa (alfa 1 e alfa 2) che modificano/perdono delle interazioni tra il residuo 97 e 146 (C terminale) di 32 91 Nella cavità centrale sporgono dei residui che sono carichi positivamente in quanto devono andare a legare un 2,3-bisfosfoglicerato che ha molte cariche negative. i residui carichi positivamente sono: lisina delle catene beta e i residui N-terminale delle catene alfa + istidine, le quali quando siamo in presenza di un pH minore sono cariche positivamente e quindi stabilizzano il legame del fosfoglicerato e quindi lo favoriscono. Ma il fosfoglicerato si può legare solo alla forma deossi quindi se favorisco il legame del fosfoglicerato sposto l’equilibrio dalla forma ossigenata alla forma deossigenata col risultato che libero più O2. Quindi l’idea della regolazione dell’emoglobina —> libero più O2 a livello tissutale, faccio in modo che a livello tissutale dove c’è meno O2, l’emoglobina sia nella sua forma T e quindi più affine a rilasciare O2. A livello fetale il residuo di istidina viene sostituito da quello di serina facendo sparire questo residuo che stabilizza il legame del fosfoglicerato. Se il legame del fosfoglicerato viene stabilizzato è meno favorito il rilascio di O2. Il risultato è che l’emoglobina dell’adulto tende a trasferire O2 a livello del feto. Emoglobina fetale tende ad essere più affine all’O2 rispetto all’emoglobina della madre perchè si stabilizza meno la forma deossi e quindi si sposta l’equilibrio verso la forma ossi. Quindi tra l’emoglobina della madre e l’emoglobina del feto vince l’emoglobina del feto. Subito dopo la nascita l’emoglobina fetale deve essere convertita in quella adulta. Negli uccelli la funzione del 2,3-bisfosfoglicerato è fatta dall’inositolo pentafosfato (molecola ricca di gruppi negativi). Negli invertebrati invece si usa ATP. Bisfosfoglicerato principale responsabile dell’adattamento rapido ad altitudini elevate perché la sua concentrazione nel sangue passa da 5mM a livello del mare a circa 8mM ad altitudini elevate e questo fa si che la curva dell’emoglobina si sposti da quella azzurra a quella verde. Libera più O2. In assenza di fosfoglicerato abbiamo quasi un comportamento iperbolico. 0 fosfoglicerato non ce lo abbiamo mai. È una regolazione rapida in quanto regolare la concertazione di 2,3-bisfosfoglicerato dal punto di vista metabolico è facile. La regolazione a lungo termine è l’aumento di globuli rossi. È il gene della beta-globina falciforme dove il residuo in posizione 6 delle catene beta che è un residuo di acido glutammico viene sostituito da un residuo di valina. È una mutazione puntiforme. Sostituzioni puntiformi che si hanno nelle catene alfa e beta, non tutte sono patologiche. Una è quella dell’anemia falciforme in cui il globulo rosso assume la struttura a falce. Il problema è che la sostituzione del glutammico 6 con la valina 6 nelle catene beta fa si che questa vada ad inserirsi in una tasca che c’è nell’altra catena beta nel ripiegamento EF. Col risultato che si formano delle fibre molto stabili che assumono una sorta di forma elicoidale contorta. Questo è un disastro perché a livello tissutale quando la concentrazione di O2 è bassa, la formazione di queste fibre rigide porta addirittura all’emolisi. Quindi innanzitutto porta alla struttura a falce e poi alla possibile rottura del globulo rosso stesso con la liberazione delle fibre di emoglobina nella circolazione. E questo è un problema perché vuol dire che a livello tissutale vuol dire che abbiamo una bassa liberazione di O2, e inoltre vuol dire che una parte di globuli rossi viene persa e quindi abbiamo un’anemia. Avviene solo a livello tissutale e non a livello polmonare in quanto a livello polmonare la forma R ha delle modificazioni strutturali tali da non consentire questa interazione e quindi a livello polmonare il problema non c’è ma c’è a livello tissutale. Formazione delle fibre —> si formano le interazioni tra le molecole e si vede la formazione die filamenti e l’allineamento con la cristallizzazione e la formazione delle fibre stabili che di 35 91 precipitano e sono insolubili e quindi sono delle forme che una volta formate è molto difficile eliminarle e vuol dire anche che non funzionano più. Dal punto di vista genetico è importante per la storia della malaria e e dell’emoglobina S. La forma omozigote è il problema molto grave dove si ha una forma di anemia molto grave. Mentre il portatore sano ha un’anemia ma tutto sommato riesce a sopravvivere. Non ha un’efficacia come il genotipo normale ma il fatto che solo uno dei due geni sia portatore della patologia fa si che in condizioni normali, il portatore, quindi il soggetto eterozigote, non abbia un’anemia grave. Spiegazione del perché si è mantenuto il gene per l’emoglobina falciforme nonostante nella sua forma recessiva provoca una forma di anemia estremamente grave che può portare a morte. Si è mantenuto il gene dell’anemia falciforme nelle regioni dove è diffusa la malaria, perchè l’eterozigote che è in presenza di un po’ di queste cellule falciformi, diventa un po’ resistente alla malaria in quanto il parassita malarico non riesce a riprodursi in modo corretto, non riesce a completare il suo ciclo vitale in quegli eritrociti che tendono ad assumere la forma falciforme. Quindi eterozigote ha una resistenza alla malaria, allora l’individuo normale che non porta questo gene mutante rischia di andare incontro ad ammalarsi alla malaria. È chiaro che se c’è un gene che da resistenza alla malaria questo viene favorito e quindi c’è selezione a favore dell’eterozigote, mentre dove non c’è malaria c’è selezione contro il recessivo, in quanto quello muore di anemia. Il problema di tutto questo è il carico genetico perché se due individui entrambi portatori resistenti alla malaria si incrociano ci sarà 1 probabilità su 4 che nasca un figlio omozigote recessivo e quindi malato di anemia falciforme grave. Ecco dove si è arrivati per una sostituzione tra una alanina e una timina in un gene singolo della catena beta. Pag.26 una delle mutazioni che si ritrovano a livello delle catene beta o alfa e molte di queste possono dare variazioni di affinità per O2, perdita di eme, dissociazione del tetramero con conseguenze più o meno gravi. 01.12.21 FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA È l’ultima fase del classico metabolismo energetico. È divisibile in due parti: la catena di trasporto degli elettroni e l’ATP sintasi (nota anche come complesso V in quanto è quello dove avviene la sintesi di ATP in seguito al riequilibramento del gradiente protonico che viene generato proprio dal trasporto degli e-) Questa fosforilazione è ossidativa in quanto se c’è una catena di trasporto degli e- c’è qualcosa che si ossida (NADH e FADH2) e qualcosa che si riduce (O2 atmosferico). NADH e FADH2 ossidati in NAD+ e FAD. Questo è un processo termodinamicamente favorevole. Riusciamo a sfruttare l’energia di questo processo, la spontaneità termodinamica per sintetizzare ATP. Avviene in seguito all’ossidazione di donatori di e-. L’accoppiamento avviene attraverso i complessi respiratori. Quando e- vengono trasportati da un complesso all’altro questo avviene in modo tale da far si che un ceto numero di protoni venga spostato dalla matrice del mitocondrio verso lo spazio intermembrana —> si genera un gradiente protonico che tende a riequilibrarsi, tenderanno a ritornare spontaneamente verso dove ce ne sono pochi. La membrana non è permeabile ai protoni. Protoni per tornare all’interno della matrice è passare attraverso il complesso F0 che è l’ATP sintasi —> sfruttiamo l’energia favorevole del passaggio di protoni (spontaneo) per sintetizzare ATP —> accoppiamento chemiosmotico tra il di 36 91 gradiente di protoni e la sintesi di ATP. Quindi l’ossidazione dei trasportatori ridotti genera un gradiente che si riequilibria spontaneamente e sintetizza ATP a partire dai protoni. Nella matrice del mitocondrio avvengono le reazioni del ciclo dell’acido citrico ma avvengono anche le reazioni del catabolismo degli acidi grassi e degli AA o del piruvato che possono entrare a diversi livelli del ciclo dell’acido citrico, mentre AA entrano a livello degli alfa-chetoacidi. Abbiamo tanto NADH e tanto FADH2 che viene riossidato in modo sequenziale sulla catena di trasporto, si ha il passaggio di protoni dalla matrice allo spazio intermembrana. I complessi 1, 3 e 4 sono strutturati in modo tale da far si che il passaggio di e- attraverso i trasportatori che stanno nei complessi provochi la cattura di e- dal lato matriciale della membrana e la loro liberazione dal lato intermembranale. È necessario che siano disposti in modo preciso e regolare lungo la catena di trasporto. Trasporto contro gradiente. Energia si ottiene dal passaggio spontaneo degli e- da un trasportatore all’altro. I trasportatori di e- si passano gli e- l’uno con l’altro secondo gradiente termodinamico —> passaggio spontaneo —> fa si che sia possibile sfruttare l’energia di questa spontaneità e questa energia è sufficiente per spostare protoni contro gradiente. Il passaggio di protoni può avvenire solo se accoppiato al passaggio di e-. Energia liberata dall’ossidazione di sostanze ridotte e viene utilizzata per far si che si abbia il passaggio di protoni contro gradiente nei 3 dei 4 complessi. I protoni tendono a rientrare ma possono rientrare solo a livello dell’ATP sintasi, in cui viene sintetizzata ATP. Sfrutto energia di ossidazione per generare un gradiente protonico. I protoni vengono spostati da dove ce n’è poco a dove ce n’è tanto, quindi contro gradiente spendendo energia, e ritornano indietro in modo spontaneo attraverso ATPsintasi. I protoni ricedono energia che è stata loro fornita per generare il gradiente a livello dell’ATP sintasi per sintetizzare ATP. Trasportatori sono molecole intermedie che continuano ad ossidarsi e ridursi passando e-. Quindi e- passano secondo gradiente. 1 trasportatore —> NADH che si ossida a NAD+ Flavine Centri ferro zolfo Chinone Centri ferro zolfo Citocromi Citocromi in presenza di rame nel complesso 4 in cui si ha la riduzione dell’O2 ad H2O. Trasportatori messi in quest’ordine perchè seguono il loro potenziale redox nelle condizioni del mitocondrio. In ognuno di questi complessi ci sono 2/3 trasportatori interni. Per collegare i diversi complessi ci sono dei trasportatori mobili Complesso = insieme di proteine ma non comunicano tra di loro —> ci vuole un trasportatore mobile che è l’ubichinone o coenzima 10 (molecola lipofila) Ubichinone prende e- dal complesso 1 al complesso 2 e li cede poi al complesso 3. Tra il 3 e il 4 il trasportatore mobile si chiama citocromo c —> molecola solubile nello spazio intermembrana. Alla fine O2 viene ossidato dal lato della matrice liberando H2O sempre sul lato della matrice. In tutto ciò vengono liberati protoni con il risultato di gradiente protonico verso lo spazio intermembrana. pH spazio intermembrana < pH matrice Il primo accettore di e- dal NADH è una molecole di flavina mononucleotide la quale cede e- a due centri Fe-S all’interno del complesso 1 che si chiama NADH deidrogenasi cedendo e- al coenzima Q che essendo mobile nella membrana va ad interagire con il di 37 91 complesso che consenta questo accoppiamento. Nei mammiferi il core della citocromo c ossidasi è composto da 3 catene di origine mitocondriale. Nei batteri sono presenti 4 catene. Se O2 ossidato prende un solo e- abbiamo anione superossido, se ne prende un’altro abbiamo il perossido di idrogeno che è una molecola abbastanza stabile. Se prende un altro e- si rompe trasformandosi nel radicale idrossile e poi se ne prende un altro si forma H2O. Molecole ROS pericolose perchè tendono ad ossidare tutto quello che trovano. Superossido dismutasi che catalizza la conversione dell’anione superossido ad H2O2 ridotta poi dalla catalasi. Si tiene molto basso il livello di questi ROS. Il complesso 4 contiene dei citocromi, degli eme, ed è un complesso binucleare quindi ha 2 eme che cede 4 e- simultaneamente e succede che molecola di O2 viene ridotta in una volta sola e si minimizza la formazione di intermedi. Eme a e eme a3 4 molecole di citocromo c ridotto si legano in sequenza dal lato dello spazio intermembrana e cedono e- uno per volta ai complessi intermedi. E- trasferiti tutti insieme alla molecola di O2 che prelevando 4 H+ dal lato della matrice, viene ridotta producendo 2 molecole di H2O. 2 molecole di citocromo c trasferiscono 2e- e riducono il citocromo c, quindi il rame da +1 a +3. A questo punto entra O2 ma non esce un anione o una ROS, ma rimane legato come perossido, quindi legato all’interno del complesso. Quando entrano i due e- successivi che riducono le stesse eme a e eme a3 di prima, entrano due H+ che riescono a rompere il legame perossido formano due legami idrossido, se aggiungiamo 2H+ abbiamo la liberazione di H2O. Tutto questo per evitare che O2 ridotti se ne vadano in giro, in quanto potrebbero formare le ROS. Quindi non sono pericolosi se stanno legati al complesso, vengono liberati in seguito all’aggiunta di 4H+, liberando H2O. La liberazione di H2O riporta tutto allo stato iniziale. Trasferire e- uno per volta ma l’accettazione degli e- viene fatta una per volta ma facendo in modo che intermedi pericolosi rimangano legati al complesso per non farli diventare pericolosi. Quindi noi aggiungiamo step by step producendo intermedi ma senza che siano pericolosi perchè rimangono legati al complesso. Quando entra O2 ciò che si forma sono degli intermedi che rimangono legati agli eme del complesso. È importante un residuo di tirosina che interagisce con l’atomo di rame. Quando si ha la rottura del doppio legame tra O2 e O2, comincia la parte pericolosa. A questo punto atomo di O2 viene trasferito sul rame e H che lo stabilizza serva dal residuo di tirosina della catena polipeptidica. Entra un e- e un H+ e si forma la molecola di H2O sull’atomo di rame. L’altro atomo di O2 è legato al Fe e si trova in uno stato di ossidazione Fe4+. Fe deve ridursi, entra il secondo portone e secondo e- e si forma la forma idrossilata del Fe. Entra il terzo e- ed esce la prima molecola di H2O che è quella legata al rame. Entra il 4e- e viene liberata la seconda molecola di H2O. Vengono consumati 4 protoni per produrre H2O, oltre a questi 4 protoni vengono anche traslocati 4 protoni dall’altra parte quindi abbiamo la riduzione di 8 protoni e questo aumenta il gradiente di membrana. Potenziali redox: I potenziali da più negativi diventano più positivi. Passano dalle semicoppie con potenziale minore a quelle con potenziale maggiore. Risultato netto: tutta energia liberata la usiamo per spostare H+ dalla matrice allo spazio intermembrana contro gradiente. Ben 3 reazioni di queste sono abbastanza esoergoniche da permettere la sintesi di ATP. Si vengano prodotte 3 ATP per ogni NADH ossidato ma in realtà non è così. di 40 91 Cianuro è inibitore irreversibile, agisce anche sull’emoglobina, ma quella più importante è quando agisce sulla citocromo ossidasi perchè blocca tutta la catena. Trasportano protoni da una parte all’altra, 2 nel caso del FAD perchè abbiamo i protoni trasportati nel complesso 1. FAD ha un potenziale minore rispetto al NAD non è in grado di produrre tanta energia quanto NADH. Il rapporto è 2.5 dal NADH e 1.5 dal FAH2 —> il gradiente viene usato anche per altre ragioni. Non c’è un accoppiamento stechiometrico tra ossidazione del NADH e la sintesi di ATP, ma questo accoppiamento si ha attraverso il riequilibrio del NADH a NAD+ e questo ci consente di avere più o meno ATP prodotta. Questo rapporto può essere quindi variabile a seconda delle condizioni metaboliche della cellula. Il tutto ci da quindi per una molecola di glucosio, 30/32 molecole di ATP prodotte. 07.12.21 ATPsintasi Abbiamo trasferito e- fino all’O2 producendo H2O. Quello che ci consente di ottenere ATP è il trasferimento dei protoni dallo spazio intermembrana che abbiamo visto avvenire nei complesso 3 e 4. Protoni tornando indietro attraverso ATPsintasi si riesca ad ottenersi la sintesi di ATP. Ipotesi dell’ACCOPPIAMENTO CHEMIOSMOTICO —> trasferimento energetico negli organismi viventi attraverso la formulazione della teoria chemiosmotica. Si sapeva che la sintesi di ATP era accoppiata ad un potenziale chemiosmotico. La catena degli e- produce una forza motrice protonica la quale permette ad una ATPasi di funzionare al contrario per produrre ATP. ATPsintasi è una pompa protonica che funziona al contrario, in quanto invece di idrolizzare ATP, pompa protoni da dove ce n’è poco a dove ce n’è tanto con consumo di energia si sfrutta il gradiente protonico per idrolizzare ATP. Gradiente protonico che si forma grazie al trasporto di e- e si forma di conseguenza ATP. Funziona solo se la membrana interna del mitocondrio è intatta, impermeabile agli ioni. È necessaria questa assoluta impermeabilità agli ioni per far si che si abbia questa corrente. Gradiente di tipo elettrochimico dovuto sia alla differenza di potenziale di membrana sia alla differenza di pH. Un gradiente protonico permetteva la sintesi di ATP anche senza trasporto di e-. E- generano producono il gradiente protonico il quale a sua volta produce la sintesi di ATP. Proteine coinvolte nella sintesi di ATP erano tutte proteine transmembrana. I disaccoppianti impedivano la sintesi di ATP dissipando il gradiente di protoni. Dissipare = sprecare. |__> riequilibrio il gradiente protonico senza ottenere ATP, quindi spreco l’energia del gradiente protonico. Il disaccoppiante riesce a passare liberamente dentro e fuori dalla membrana, essendo acido può cedere e accettare protoni. Questo funzionava inibendo la sintesi di ATP. Disaccoppia il gradiente protonico dalla sintesi di ATP. ATPsintasi è un grosso complesso multiproteico che si trova sulla membrana interna del mitocondrio. Ci sono due parti debolmente associate tra loro: F0 e F1. F1 sporge dalla membrana mentre F0 è inserito all’interno della membrana stessa. Se ci sono le particelle F0 in membrana, se sono fuori dalla membrana non succede nulla. di 41 91 F0 da sole, isolate venivano lasciate nella membrana, si aveva il consumo di O2 ma non sintesi di ATP. Se si ottenevano le particelle F1 isolate da sole si aveva l’idrolisi di ATP. F0 nella membrana erano coinvolte nel passaggio di protoni mentre F1 coinvolte nella sintesi di ATP. Particella F1 (=fattore di accoppiamento) accoppia il trasporto protonico di ATP + il canale per i protoni che è la particella F0. Costituiti ciascuno da diversi complessi proteici. F1 costituito da un complesso proteico associato alla membrana, mentre F0 è un complesso transmembrana ed insolubile in H2O. Urea classico denaturante delle proteine. Interazione tra le due grosse subunità era più debole rispetto alle interazioni presenti all’interno delle subunità. Possono avere una struttura isolata mantenendo la loro funzione ma non la funzione complessiva. Solubili in H2O = stanno bene in soluzione acquosa. F1 solubile in H2O, F0 insolubile in H2O. Con lettere latine si indicano le subunità di F0 mentre con lettere greche si indicano le subunità F1. Ognuno di queste subunità contiene un residuo di aspartico in grado di associare e dissociare 1 protone. Interazione con subunità a è quella che dà il via a tutto il processo. Ci sono delle proteine di collegamento, come la proteina gamma che è collegata da una parte al centro della struttura del sito di legame dei protoni sui residui di aspartico e al centro del bottone F1. La struttura base del bottone è formato da 3 dimeri alfa-beta. Le subunità beta sono quelle che legano ADP e catalizzano la fosforilazione. Gamma, delta e epsilon sono quelle di collegamento. La subunità gamma asimmetrica è quella che è responsabile della modificazione delle conformazioni delle 3 subunità beta. È lei che risente delle modificazioni conformazionali che a loro volta vengono all’interno della particella F0 quando passano i protoni. I 3 siti corrispondono a 3 differenti conformazioni della subunità alfa-beta. Il sito catalitico è rappresentato dalla subunità beta mentre alfa aiuta beta. Quello al centro è gamma. Le 3 diverse conformazioni vengono chiamate L (loose = debole), T (thight = forte) e O (open = aperto —> non lega niente). In ogni istante esiste una coppia di subunità alfa e beta che è presente in una delle tre conformazioni. Alfa lega sempre ATP, beta lega ADP + Pi che vengono condensati a formare ATP, ecco perchè si dice che è il sito catalitico. Gamma sta al centro ed è quella la cui interazione con beta fa si che beta cambi conformazione. Si ha un meccanismo rotatorio in cui ciascuna coppia, ciascun dimero alfa-beta, assume relativamente le conformazioni O, L e T, ciccando tra queste 3. In questo modo quando si arriva alla conformazione T si ha la sintesi di ATP. Legame molto stretto tra subunità beta di F1 e ATP stesso. Se siamo in condizioni standard dobbiamo spendere 30.5kJ/mol per sintetizzare ATP a partire da ADP + fosfato. Nelle subunità beta delle particelle F1, questa reazione è all’equilibrio ed è dovuto al fatto che non siamo in soluzione ma il legame dell’ATP, delle molecole fosfato alla subunità beta ha un’energia sufficientemente elevata sufficiente per promuovere la sintesi dell’ATP stesso, per promuovere la condensazione dell’ADP + Pi a dare ATP. Quindi se non ci fosse questo legame dei nucleotidi fosfato alle subunità beta il tutto non avverrebbe. di 42 91 Esiste una traslocasi del fosfato che è un simporto e trasloca insieme ai gruppi fosfati anche degli ioni H+. Uno dei modi per utilizzare il gradiente protonico per altri scopi oltre al modo diretto per sintetizzare ATP. Si utilizza perché qui devo rilasciare i fosfati che devono servire poi per legarsi all’ATP. Devo fare entrare ADP ma anche il fosfato. Nucleotide traslocasi e fosfato traslocasi. ATP ha 4 cariche -, mentre ADP ne ha 3 e quindi è come se io portassi fuori un’altra carica - e porto dentro un’altra carica +. Ragione per cui il gradiente protonico viene utilizzato in un modo diverso. Ci sono sostanze che bloccando ADP traslocasi possono essere tossiche. |__> atractiloside e bongkrekico acido I veleni peggiori sono quasi tutti di origine vegetale. Altri sistemi di trasporto che riguardano il piruvato che viene scambiato con un antiporto con un OH- che viene portato fuori. Sistemi di trasporto degli acidi dicarbossilici —> succinato, malato, fumarato Sistemi di trasporto degli acidi tricarbossilici —> citrato, isocitrato È necessario continuare ad avere dei sistemi di trasporto che possono portare avanti e indietro queste molecole a seconda delle esigenze. Sistemi che servono per trasportare e- i quali sono legati ai trasportatori di e-, in quanto non esistono liberi, che sono NADH e FADH2 che non passano la membrana interna e quindi esiste un pool di NADH e FADH2 mitocondriale e uno citoplasmatico. La riossidazione di NADH e FADH2 avviene nel mitocondrio. ATP si sposta fisicamente mentre qui si spostano gli equivalenti di riduzione. I due modi sono attraverso: la glicero-3P deidrogenasi che riduce diidrossiacetone fosfato a gliceraldeide 3 fosfato riossidando il NADH, la flavoproteina deidrogenasi che trasferisce gli e- alla catena di trasporto mitocondriale. Prende il diidrossiacetone fosfato, produce glicerolo-3P riossidando NADH a NAD+. La glicerolo 3P deidrogenasi del mitocondrio quindi un altro enzima che fa la reazione opposta, prende il glicerolo 3P, riproduce il diidrossiacetone fosfato ma poiché questo è legato alla membrana interna del mitocondrio, riducendo la molecola di FADH2 andrà al chinone, al coenzima Q e al complesso 3. Ci siamo persi l’ATP generato dal complesso 1. Quindi ci siamo giocati un NADH per sintetizzare FADH2 e quindi non rientra a livello del complesso 1 ma in quello del complesso 3. In questo modo abbiamo perso dell’ATP perchè NADH non può passare la membrana interna. Quindi NADH, diidrossiacetone fosfato e glicerolo 3P passano interamente la membrana esterna e invece cedono gli e- riducendo il FADH2. Quello che vengono trasferiti sono gli e- e ci siamo giocati 2 ATP. Non è la molecola di NADH che entra, ma entrano solo gli e-. Ci devono essere due sistemi di trasporto e due transamilasi. Uno è un trasportatore malato-alfa-chetoglutarato mentre l’altro è un trasportatore glutammato-aspartato che trasporta 2 AA. Attraverso due reazioni di transamminazione, l’aspartato e l’alfa-chetoglutarato attraverso l’enzima aspartato-amminotransferasi si convertono nello spazio intermembrana (citosol) in ossalacetato e glutammato. Quindi alfa-chetoacido + alfa-AA che dà alfa-chetoacido + alfa-AA. —> reazione di transamminazione. A questo punto interviene la malato deidrogenasi in forma citosolica che fa l’opposto del ciclo di Krebs, riduce ossalacetato a malato riossidando NADH che può arrivare dalla glicolisi. A questo punto il sistema di trasporto malato alfa-chetoglutarato prende il malato appena prodotto lo porta nella matrice mitocondriale esportando contemporaneamente alfa-chetoglutarato che serve per un’altra reazione. di 45 91 Nel mitocondrio il malato entrerà nell’ultima reazione del ciclo di Krebs, che produce NADH e quindi abbiamo ottenuto il risultato netto di aver spostato NADH. Ossalacetato non può uscire in quanto non ha un sistema di trasporto dal mitocondrio ma deve uscire o come malato o come aspartato. Siccome dobbiamo rigenerare aspartato per fare il meccanismo precedente, l’aspartato- amminotransferasi in forma mitocondriale effettua la stessa reazione di prima ma nel verso inverso, in quanto le reazioni di transamminazione sono reazioni all’equilibrio, quindi a seconda delle esigenze del metabolismo decidiamo la direzione di reazione. Prendo ossalacetato e il glutammato riotteniamo alfa-chetoglutarato e aspartato il quale viene esportato mentre viene importato il glutammato e rincomincia il ciclo. Quindi per riuscire ad importare gli equivalenti di riduzione prodotti nel citosol sotto forma di NADH dobbiamo mettere in gioco due forme dello stesso enzima, una che sta nel mitocondrio e una nel citosol, e due trasportatori diversi che stanno a cavallo della membrana mitocondriale. Solo per trasportare gli equivalenti di riduzione da fuori a dentro. Questo consente di sfruttare tutti gli equivalenti di riduzione della glicolisi. Tutto questo è regolato dai vari livelli di malato, ossalacetato, etc. Controllo respiratorio —> sistemi che regolano la velocità di trasporto degli e- all’interno del mitocondrio | Limitazione nella velocità di trasporto dalla disponibilità di ADP. Come la disponibilità di ADP vada a bloccare il trasporto degli e-. Se si mette un inibitore dell’ATP sintasi si ha un blocco di consumo di O2 il che vuol dire che blocco la catena di trasporto. Se si mette il disaccoppiante stimolo il consumo di O2 ma non produco ATP. Questo significa che mettendo inibitori dell’ATP sintasi e quindi non producendo ATP ma avendo un accumulo di ADP. Non si ha un’inibizione diretta del trasporto di e- ma tutto passa dalla disponibilità di ADP. Se ho ADP in eccesso devo limitare la velocità di trasporto in quanto va in blocco la sintesi di ATP. Il disaccoppiante provoca lo stimolo di sintesi di O2 ma non produce ATP in quanto disaccoppio il passaggio dei protoni dalla sintesi di ATP, è come un buco nella membrana che fa si che i protoni passino senza passare dall’ATPsintasi, ecco perchè stimolo il consumo di O2 perché comunque riequilibrio il gradiente, quindi posso continuare a trasportare e- e quindi posso continuare a riportare i protoni dal lato dello spazio intermembrana. Se inibisco ATP sintasi non sintetizzo più ATP. In assenza di disaccoppianti si blocca il consumo di O2 perchè si blocca il trasporto di e- perché se ATPsintasi è bloccata il gradiente non viene riequilibrato il quale diventa così alto da non consentire più il passaggio contro gradiente dei protoni dalla matrice allo spazio intermembrana perché sono talmente troppi che il sistema non riesce a spostarli tutti. Per far si che gli e- continuino a fluire in favore di condizioni termodinamiche non si deve generare un gradiente protonico troppi elevato in quanto ci vorrà un’energia enorme per portare ancora più protoni dove ce ne sono già tanti e a quel punto neanche la riduzione di O2 a diventare H2O, nemmeno il deltaE tra NADH e O2 sarà più sufficiente per farlo. Ecco perchè se metto un inibitore di ATP sintasi blocco la catena respiratoria. Se ho poco ADP vuol dire che ho tanto ATP a questo punto blocco il consumo di O2 perchè è inutile ossidare NADH per fare ATP quando ne ho già tanto. Se il gradiente diventa troppo alto il sistema non ce la fa più a spostare altri protoni. Il trasporto degli e- è libero ma se per portare protoni contro gradiente ho bisogno di energia maggiore di quella liberata dal trasporto di e-, non ce la fa più a farlo. Se non si riequilibra il gradiente, diventa cosi elevato che portare protoni contro gradiente diventa impossibile anche per il flusso di e- della catena di trasporto. Quindi ad un certo punto si blocca tutto, unico modo per bloccare ATPsintasi bisogna non avere più ADP così che il sistema si blocca. di 46 91 Utilizzo di un disaccoppiante (termogenina) che ha la funzione di disaccoppiare la sintesi di ATP dalla dissipazione del gradiente protonico. Il suo scopo è quello di generare calore, presente nel grasso bruno, presente in quegli animali che durante l’inverno abbassano la loro temperatura corporea e quindi quando si devono svegliare devono far risalire velocemente la temperatura utilizzando questa proteina disaccoppiante. Introduce un ulteriore canale nella matrice mitocondriale attraverso il quale i protoni possono passare secondo gradiente senza produrre ATP, l’energia liberata viene convertita in calore. LA VIA DEI PENTOSI FOSFATI È una via che serve per ottenere energia ma anche potere riducente per le vie biosintetiche. È una via preparatoria per le biosintesi però è una via che ossida glucosio. Lo scopo non è tanto quello di ottenere energia ma ottenere potere riducente e precursori per la sintesi di nucleotidi. Se sintetizzo nucleotidi è perchè voglio sintetizzare DNA. Il potere riducente è NADPH. Enzimi che servono per le vie biosintetiche il cui cofattore è appunto il NADPH. Il precursore dei nucleotidi è il ribosio 5P. Dobbiamo usare molecole già attivata e l’attivazione viene fatta fosforilando le molecole. Sia ha una forte richiesta di sia di ATP e NADPH nelle cellule ma si ha anche una forte richiesta di ribosio 5P nelle cellule che stanno andando incontro alla crescita cellulare. Per soddisfare richiesta di NADPH e di ribosio 5P. 1 —> fase ossidativa 2 —> fase non ossidativa dove abbiamo scambi tra monosaccaridi a 3/5/6 atomi di C che si scambiano tra di loro attraverso reazioni di epimerizzazione e isomerizzazione fino a ritornare a intermedi della glicolisi che possono essere riutilizzati per recuperare atomi di C stessi. Scopo —> sintesi di potere riducente di NADPH e di precursori dei nucleotidi sotto forma di ribosio 5P. La prima reazione è la produzione di NADPH |__> il glucosio 6P che deriva già dal glucosio attivato, viene ossidato a 6P-gluconato e contemporaneamente viene ridotto il NADP+ a NADPH dall’enzima glucosio 6P deidrogenasi che si chiama deidrogenasi anche se il suo cofattore non è il NAD+ ma è il NADP+. Dopo si ha una rottura idrolitica “spontanea” in cui il fattore ciclico non stabile tende a scindersi nella sua forma lineare 6P-gluconato. Il C in posizione 1 diventa un buon gruppo uscente e se ne va come CO2. Grazie all’azione dell’enzima 6P-gluconato deidrogenasi che è una deidrogenasi NADP+ dipendente, viene ossidato a ribulosio 5P. Non viene ossidato il C1 ma se facciamo uscire questo atomo di C non otteniamo uno zucchero perchè manca il gruppo carbonilico e quindi funziona in modo da produrre non un aldoso ma un chetoso a 5 atomi di C quindi pentoso. Produce il cheto-pentoso fosfato che è appunto il ribulosio 5P. Abbiamo finito la fase ossidativa —> abbiamo ridotto NADP+ a NADPH. Le prime due reazioni sono reazioni di ossidazione, la seconda è una decarbossilazione ossidativa, in quanto tolgo un C carbossile e ossido la molecola. A questo punto non abbiamo il precursore in quanto quello vero è il ribosio 5P e non il ribulosio 5P quindi necessario che si abbia una conversione isomerizzazione dalla forma chetonica alla forma alcolica. Quindi si ha l’enzima fosfopentosoisomerasi che attraverso un intermedio enediolico, converte il ribulosio 5P in ribosio 5P. di 47 91 Se il prodotto di partenza e quello di arrivo sono gli stessi, la reazione non è l’inverso in quanto se questa è irreversibile devo trovare un modo per aggirarla e quindi spendo energia. Le altre due reazioni: nella reazione diretta consumo ATP mentre nell’altra idrolizzo un fosfato. Queste due sono effettuate da enzimi diversi —> fruttosio 1,6-bisfosfatasi e glucosio 6-fosfatasi. Dobbiamo spostarci dal mitocondrio al citosol. Per passare da piruvato a fosfoenolpiruvato dobbiamo usare 2 tappe, una avviene nel mitocondrio mentre l’altra nel citosol. Questa via metabolica viene usata quando siamo in carenza di glucosio e per mantenere i livelli di glucosio costanti nel sangue. Questa via viene usata anche per recuperare lattato prodotto dal metabolismo anaerobico nei muscoli che nel fegato viene riconvertito a glucosio 6P e portato a glucosio 1P e utilizzato per un eventuale sintesi del glicogeno. Sforzo fisico, i muscoli producono il lattato che viene riconvertito a piruvato e poi glucosio alla fine. Se in quel momento però abbiamo finito lo sforzo muscolare non ho più bisogno di consumare glucosio e quindi ho un eccesso di glucosio ottenuto da un recupero del lattato attraverso la gluconeogenesi che il fegato può convertire in glicogeno. A seconda delle condizioni metaboliche il fegato deciderà cosa fare, se continua a servire glucosio continuerà a produrlo, se invece deve recuperare lattato prodotto da un intenso sforzo muscolare e non è più necessario glucosio, allora posso mettere da parte un po’ di glucosio sotto forma di glicogeno perché nel frattempo il fegato ha fatto anche la demolizione del glicogeno insieme alla gluconeogenesi per mantenere sempre elevato il livello di glucosio ematico. Lo scopo è recuperare il lattato per ricostituire le riserve di glucosio sotto forma di glicogeno. Quindi il centro di tutto questo è il glucosio 6P. 1° reazione —> dal piruvato la reazione della piruvato carbossilasi prende CO2 sotto forma di HCO3- e consumando ATP carbossila l’ossalacetato. Il deltaG è molto basso. Sono regolate dai livelli di substrati e prodotti, è un elemento negativo perchè consumo 1ATP quindi abbiamo un idrolisi. DeltaG negativo è Pyr + HCO3- + ATP, in questo modo abbiamo riconvertito il piruvato a fosfoenolpiruvato. Questa è l’inverso dell’ultima reazione della glicolisi. Il deltaG sarebbe positivo ma è reso negativo con l’ATP. È un meccanismo BIOTINA dipendente. | Dobbiamo trasportare ossalacetato fuori dal mitocondrio utilizzando il trasportatore del malato attraverso lo scambio tra malato deidrogenasi mitocondriale e la malato deidrogenasi citosolica che è la solita reazione vista quando abbiamo parlato degli scambi tra citosol e mitocondrio. Non è ossalacetato che esce direttamente dal mitocondrio ma viene ridotto in malato che viene esportato nel citosol dove viene riossidato a ossalacetato. Nel citosol continua la reazione di gluconeogenesi. La seconda parte della reazione avviene nel citosol. In questo modo possiamo vedere la reazione della fosfoenolpiruvato chinasi ? come una sorta di reazione che serve ad attivare il piruvato carbossilando. Dal punto di vista energetico questo aiuta la reazione successiva. La decarbossilazione serve per conservare parte dell’energia di ATP, quindi comunque devo sprecare ATP ma la conservo sotto forma di CO2 carbossilato e poi la recupero quando decarbossilo. di 50 91 Tutte le reazioni che arrivano fino al fruttosio 6P erano reazioni di equilibrio, quindi quello che succede è che si va al contrario compreso il consumo di ATP. Le due reazioni finali sono la conversione del fruttosio 1,6-bisP a fruttosio 6P catalizzato dalla fruttosio 1,6-bisfosfatasi. I due deltaG sono entrambi negativi in quanto questa non è la reazione inversa in quanto qui c’è il consumo di ATP. La differenza è proprio il 30 dell’ATP. Se consideriamo l’inverso di questa reazione ADP + fruttosio 1,6bisP a ATP+ fruttosio 6P avrei un deltaG positivo. Quindi le due reazioni per avvenire devono avere per forza un deltaG negativo. Utilizzare il consumo di ATP e non riottenere la sintesi di ATP altrimenti dal punto di vista termodinamico non potremmo fare questa reazione. Eliminazione del fosfato da glucosio 6P a glucosio. Idrolizziamo un fosfato e anche qui abbiamo un deltaG negativo. Avviene solo in quegli organi che devono esportare glucosio nel sangue —> fegato I muscoli devono usare il glucosio per se stessi e quindi non si mettono a defosforilarlo per rifosforilarlo un’altra volta, ma prendono direttamente il glucosio 6P. Il glucosio 6P deve essere defosforilato per essere trasportato nel sangue in quanto non esistono trasportatori per gli esosi fosfati. Esistono diversi trasportatori per il ribosio fosfato ma non per il glucosio fosfato in quanto il glucosio 6P è troppo prezioso per lasciarselo scappare. Il bilancio totale per far si che venga complessivamente negativo devo usare 6ATP di cui 2 sotto forma di GTP, quindi per risintetizzare glucosio a partire da piruvato ho una spesa netta di 4ATP, è netta perché se penso che poi il glucosio deve essere riutilizzato per dare il piruvato ne ottengo 2ATP, ne consumo 6ATP. È costoso ma necessario in quanto non posso permettermi di far scendere il livello di glucosio ematico. Viene consumato anche NADH che viene sottratto alla sintesi di ATP nella fosforilazione ossidativa. Le principali molecole che usiamo per ottenere glucosio sono: il lattato (principale precursore gluconeogenetico in quanto ottenuto dalla glicolisi anaerobia nei muscoli, nel fegato viene riconvertito a piruvato attraverso il ciclo di Cori e poi viene risintetizzato a glucosio e questo avviene in seguito alla produzione in eccesso di lattato vogliamo recuperare il lattato prodotto e metterlo via quindi recuperarlo sotto forma di glucosio), alanina (AA) che deriva dalle proteine che attraverso una reazione di transamminazione può essere convertita a piruvato direttamente (un po’ di proteine vengono demolite per ottenere alanina durante ad esempio uno sforzo fisico). Insieme all’alanina possiamo ottenere piruvato da altri AA sempre attraverso reazioni di transamminazione e otteniamo un pochino di glucosio anche dai grassi. Il principale prodotto della beta ossidazione degli acidi grassi è l’acetil-CoA che non può tornare indietro. Il glicerolo deriva dalla demolizione dei trigliceridi ed è quella piccola parte di molecola di grasso che possiamo usare attraverso una fosforilazione a glicerolo 3P, la conversione a diidrossiacetone P per fare entrare nella glicolisi. Il propionil-CoA (C3) è un intermedio metabolico che deriva dalla beta ossidazione degli acidi grassi a numero dispari di atomi di C. Una piccola frazione di tutti gli acidi grassi hanno un numero dispari di atomi di C. Il propionil-CoA viene convertito a metilmalonil-CoA a 4C il quale viene convertito a succinil-CoA dove arriviamo poi all’ossalacetato. di 51 91 CICLO DI CORI È quel ciclo lattato-piruvato (glucosio) che coinvolge muscolo-sangue-fegato in quanto nel muscolo succede che il glucosio viene convertito a piruvato attraverso la glicolisi. Se siamo in uno sforzo muscolare intenso i nostri muscoli fanno glicolisi anaerobia formando lattato che viene trasportato nel sangue al fegato il quale viene riconvertito a piruvato e poi a glucosio. Il costo metabolico è 4ATP. MECCANISMO DI CONTROLLO A parte la prima reazione della piruvato carbossilasi che avviene a livello del mitocondrio nelle cellule del fegato tutte e due le vie metaboliche avvengono nel citosol quindi è necessario che quando è attivata una via venga inibita l’altra, altrimenti avverrebbe un ciclo futile in cui io consumo glucosio per ottenere piruvato, mi prendo piruvato per ottenere glucosio sprecando per ogni molecola 4 molecole di ATP. Allora gli enzimi che catalizzano le 3 reazioni irreversibili delle due vie vengono catalizzati in modo opposto: esochinasi viene inattivata dal glucosio 6P mentre eccesso di glucosio 6P attiva la glucosio 6 fosfatasi che fa la reazione opposta e questo è un controllo da parte del livello del substrato. Si può inibire la glicolisi con una carica energetica alta e quindi la stessa carica energetica alta (elevato livello di ATP) viene utilizzato per attivare la via gluconeogenetica. Per esempio se c’è eccesso di acetil-CoA vuol dire che c’è un blocco a livello del ciclo di Krebs quindi è necessario ottenere ossalacetato per riattivare il ciclo di Krebs in modo da consumare acetil-CoA che andrà a reagire con ossalacetato a dare citrato. La regolazione ormonale della fosfofruttochinasi e la fruttosio 1,6-bisfosfatasi che agiscono in modo opposto. Regolazione alternata della fosfofruttochinasi1 enzima glicolitico e della fruttosio 1,6- bisfosfatasi enzima gluconeogenetico che vengono regolate in modo opposto dallo stesso intermedio che il fruttosio 2,6-bisfosfato. Quindi lo stesso intermedio metabolico, lo stesso composto fruttosio 2,6-bisfosfato è il regolatore del principale punto di regolazione da un lato attiva la fosfofruttochinasi 1 dall’altro disattiva l’enzima che fa la reazione opposta. Quindi con una singola molecola io attivo una via e inibisco l’altra. In questo modo si evita che entrambi gli enzimi funzionino contemporaneamente. Capire come funziona la regolazione ormonale della sintesi di fruttosio 2,6-bisfosfato. 2 grafici che fanno vedere l’effetto della presenza del fruttosio 2,6-bisfosfato sull’attività dei due enzimi (fosfofruttochinasi 1 glicolitico e fruttosio bisfosfatasi 1 gluconeogenetico) |__> funzionano all’opposto, quindi se c’è fruttosio 2,6-bisfosfato funziona quello della glicolisi viceversa se non c’è funziona quello della gluconeogenesi. Il controllo allosterico di due enzimi diversi, la stessa sostanza agisce da regolatore allosterico su due enzimi differenti in due reazioni “opposte” in modo opposto. Possiamo utilizzare intermedi della via glicolitica per la biosintesi di molte altre molecole. Da glicerolo che deriva dalla degradazione di trigliceridi otteniamo glicerolo 3P e poi viene ossidato ottenendo il diidrossiacetone fosfato. BIOSINTESI DEL GLICOGENO: Otteniamo in fondo glicogeno n + glucosio —> glicogeno n+1 |__> dove n sa per numero di molecole di glucosio | Reazione non reversibile di 52 91 dell’azione del secondo messaggero. Ecco perchè la caffeina ha un effetto eccitante e agisce a livello nervoso. Adrenalina è un ormone che funziona come glucagone, attiva la sintesi di cAMP. Quindi se inibisco la degradazione di cAMP prolungo l’effetto di ad esempio della caffeina. Il messaggio che porta cAMP è che si deve attivare un enzima PKA che serve a legare dei gruppi fosfato a delle proteine bersaglio consumando ATP. La presenza di cAMP attiva la proteina chinasi alfa che comincia a fosforilare tutta una serie di proteine bersaglio le quali daranno diverse risposte metaboliche. Quindi il primo messaggero attraverso tutto questa cascata di eventi provoca l’attivazione o la disattivazione di una proteina. Quindi fosforilare delle proteine bersaglio che in seguito alla fosforilazione possono venire attivate o disattivate dando diverse risposte metaboliche. cAMP centra con la glicolisi e gluconeogenesi in quanto il composto chiave che regola le due vie in modo opposto è il fruttosio-2,6-bisfosfato il quale viene sintetizzato o degradato dallo stesso enzima che però agisce in modo opposto a seconda che sia defosforilato sul residuo di resina oppure fosforilato. Se l’aumento di cAMP in cellula provoca la fosforilazione di alcune proteine, una di queste è proprio questo enzima bifunzionale che quindi da attività fosfofruttochinasica passa ad attività fruttosio 2,6-fosfatasi facendo diminuire la concentrazione del fruttosio 2,6- bisfosfato e attivando di conseguenza la gluconeogenesi inibendo la glicolisi. In assenza di cAMP l’enzima bifunzionale è presente nella sua forma defosforilata che funziona da fosfofruttochinasi 2 catalizzando la sintesi del fruttosio-2,6-bisfosfato attivando la glicolisi e disattivando la gluconeogenesi. Quindi il segnale ormonale provoca un singolo effetto su un enzima bifunzionale che va ad attivare una via e disattivare quell’altra. Cosa centra tutto questo col metabolismo del glicogeno? Lo stesso segnale ormonale può fare esattamente la stessa cosa sugli enzimi che sintetizzano e demoliscono il glucosio. Lo stesso segnale ormonale attiva la demolizione del glucosio inibendo la sua sintesi. Il glucagone è presente quando siamo a digiuno, attivo la gluconeogenesi proprio perché ho poco glucosio e il tutto avviene a livello del fegato, il quale ha come scopo quello di mantenere il livello di glicemia. Quindi se c’è poco glucosio nel sangue il nostro organismo deve sintetizzare il glucosio nel fegato per essere esportato nel sangue quindi devo attivare la gluconeogenesi ed inibire la glicolisi nel citosol epatico. Ecco il significato di regolazione da parte di cAMP. Attivo la gluconeogenesi per mantenere elevato il livello di glucosio ematico. La stessa identica regolazione funziona sugli enzimi che sintetizzano le molecole di glicogeno. Insulina fa l’opposto quindi inattiva la gluconeogenesi, attiva la glicolisi, attiva la sintesi di glicogeno e anche la sintesi di acidi grassi. Insulina non agisce attraverso i recettori legati alla proteina G. 13.12.21 La biosintesi e demolizione del glicogeno —> glicogeno endogeno Glicogeno che noi mangiamo, la sua digestione non è sottoposta a regolazione come anche quella dell’amido. Tutto ciò che noi mangiamo viene digerito dai vari enzimi e viene demolito a glucosio. La regolazione riguarda il glicogeno endogeno perchè a seconda delle esigenze dell’organismo è necessario che il fegato si occupi di sintetizzare glicogeno, immobilizzarlo, etc. di 55 91 Via di trasduzione del segnale coinvolta nel metabolismo energetico ed è quella dell’adenilato ciclasi e cAMP. Primo evento che si scatena dall’arrivo del messaggero è la dissociazione del trimero alfa, beta e gamma di proteina G che in seguito al legame col recettore viene attivato. La proteina G va incontro a un ciclo di associazione e dissociazione che corrisponde al ciclo di attivazione e inattivazione. Quando le 3 subunità interagiscono tra di loro e legano GDP la proteina è nel suo stato inattivo. Il legame del ligando con il recettore attiva lo scambio di nucleotidi, quindi entra GTP ed esce GDP e questo provoca l’attivazione della proteina G e la dissociazione della subunità alfa dalla beta+gamma. Subunità alfa che scivolando nella membrana va ad interagire con l’effettore adenilato ciclasi, la quale sintetizzando ATP sintetizza cAMP. Tutti i segnali ormonali sono segnali temporanei. Così come il segnale viene attivato deve essere anche spento quando non serve più. Quindi di fatto c’è un’idrolisi spontanea/lenta del GTP legato alla subunità alfa a GDP e questo fa si che la subunità alfa ritorni nella sua forma inattiva e si dissoci dalla adenilato ciclasi. Quest’ultima ritorna ad essere inattiva e quindi smette di sintetizzare cAMP. La subunità alfa legata al GDP tornerà ad interagire con la subunità beta-gamma e tutto ritorna nella situazione iniziale. Questo è un modo per regolare queste vie. Perchè è necessaria tutta questa serie di eventi a cascata (cascata di amplificazione del segnale)? Per l’amplificazione del segnale. Una molecola di ormone che si lega a una molecola di recettore e che va a fosforilare una proteina provoca un evento con una certa intensificazione. Ad ogni singolo passaggio c’è un effetto di amplificazione del segnale, una singola molecola di ormone provoca l’effetto su molte molecole finali. Quindi l’effetto a cascata è fondamentale perchè mi basta una pochissima quantità di ormone per generare una quantità di molecole notevole. L’adrenalina è l’ormone della risposta di attacco-fuga. Il glucagone fa la stessa cosa dell’adrenalina. Quest’ultima aumenta la pressione sanguigna, la frequenza del battito cardiaco, attiva tutta una serie di risposte che facilita il trasporto di molecole. L’amplificazione del segnale è uno dei modi per rispondere in modo immediato all’effetto. Si ha anche una regolazione del segnale dopo l’amplificazione. Posso intervenire per incrementare o diminuire l’effetto del segnale. cAMP non rimane perennemente presente. Idrolisi spontanea da GTP a GDP che spegne l’effetto dell’alfa GTP sull’effettore che è adenilato ciclasi nel momento in cui l’ormone non c’è più. |__> prima regolazione Anche cAMP va incontro ad idrolisi spontanea ma non basta, per spegnere più rapidamente il segnale c’è anche una fosfodiesterasi che idrolizza cAMP in 5’AMP e che quindi spegne ulteriormente il segnale, lo spegne più in fretta. Sostanze che inibiscono questa fosfodiesterasi mantengono più attivo il sistema di trasduzione del segnale come caffeina. La caffeina mantiene un po’ più a lungo il segnale dell’adrenalina perchè funziona come inibitore della fosfodiesterasi e quindi prolunga l’effetto di questo segnale. Tossine del colera e della pertosse —> tossi-infezioni, infezioni prodotte da due batteri. Si chiamano tossi-infezioni perchè oltre che l’infezione batterica in sé producono delle tossine (come il tetano o botulino), le quali inibiscono la inattivazione spontanea della subunità alfa GTP e questo è un altro modo per mantenere attivo il complesso dell’adenilato ciclasi. Quindi continuano a prolungare il segnale di sintesi di cAMP. Questo avviene però non necessariamente agendo sul metabolismo del glucosio. Le vie di trasduzione del segnale legate alle G proteine fa anche altre cose come il trasporto di H2O nel lume dell’intestino. Il batterio del colera stimola continuamente il trasporto di H2O nel lume dell’intestino. Ciò che provoca la morte è una massiva perdita di liquidi a livello intestinale e questo perché mantiene attiva questa via. di 56 91 Il batterio della pertosse ha come cellule bersaglio quelle dell’apparato respiratorio. Ognuno di questi passaggi è soggetto a regolazione e quindi posso sia amplificare sia regolare tutta la mia cascata di eventi a seconda di quello che mi serve. Tanto maggiore sono il numero di passaggi, tanto più raffinirà è la regolazione. cAMP agisce sulla proteina chinasi. Protein chinasi A è un eterotetramero (2 catalitiche C e 2 regolatorie R) In assenza di cAMP la proteina chinasi A è nella sua forma inattiva. cAMP una volta sintetizzato si lega al dimero di subunità regolatorie che si stacca dalle subunità catalitiche e questo le attiva, quindi di nuovo abbiamo un sistema di regolazione. Una proteina inattiva che in seguito alla presenza di un effettore viene attivata. Le due subunità catalitiche ottenute cominceranno a fosforilare le proteine bersaglio. Fosfofruttochinasi 2 è un enzima bifunzionale, se fosforilato fa una cosa e se defosforilato ne fa un’altra. La proteina chinasi fosforila delle proteine bersaglio che possono essere attivate o inattivate dalla fosforilazione. Adrenalina = epinefrina (ciò che sta sopra al rene) —> prodotta dal surrene La PKA attiva fosforila la glicogeno sintasi (sintetizza glicogeno endogeno) inattivandola. E quindi blocca, diminuisce la sintesi del glicogeno. Dall’altra parte fosforila la fosforilasi chinasi che ha il compito di fosforilare la glicogeno fosforilasi. Quindi la PKA agisce fosforilando un enzima (fosforilasi chinasi che va a fosforilare la fosforilasi e quindi si mette a fosforilare la glicogeno fosforilasi che dalla sua forma B inattiva diventa forma A fosforilata attiva. Quindi la fosforilasi del glicogeno demolisce il glicogeno producendo glucosio 1P che poi passa a glucosio 6P e se c’è bisogno e siamo nel fegato passa a glucosio) che da inattivo diventa attivo. Quindi da un lato lo stesso segnale ormonale inattiva la sintesi di glicogeno e dall’altro attiva la demolizione/mobilizzazione del glicogeno endogeno. Il primo pezzo della via è comune e poi a livello degli effettori finali, glicogeno sintasi e fosforilasi chinasi, si abbia l’effetto opposto, una viene disattivata e una viene attivata. Sottoposta ad altre regolazioni come gli ioni Ca (coinvolti nella trasduzione del segnale anche dell’insulina). Fosfoproteina fosfatasi 1—> regolazione in più, è l’opposto delle protein chinasi quindi fa esattamente la cosa opposta di cAMP. È un altro modo per modulare quindi spegnendo il segnale di cAMP. Agisce modulando l’azione dell’ormone, quindi evita che l’ormone agisca troppo. |__> secondo punto di controllo della biosintesi e della demolizione del glicogeno in quanto la PP1 è a sua volta soggetta all’inibizione da parte di uno specifico inibitore fosforilato. Quindi bisogna defosforilare l’inibitore per attivare la PP1 che andrà a defosforilare la glicogeno sintasi attivandola, quindi la fosforilazione dell’inibitore inibisce quell’enzima che defosforila la sintasi impedendo la sintesi del glicogeno. Un nuovo punto di regolazione della sintesi basato sullo stesso segnale. Tutto questo può essere soggetto a molte patologie, in quanto deficienze di enzimi coinvolti nel metabolismo del glicogeno provocano mutazioni genetiche e quindi patologie. Figura riassuntiva che rappresenta cosa succede in presenza di glucagone (ormone del digiuno). Anche la piruvato chinasi ha un controllo sulla fosforilazione. La glicogeno sintasi si chiama D perchè è attiva solo quando la concertazione di glucosio 6P è elevata, quindi D sta per dipendente dalla concentrazione di glucosio 6P. di 57 91 A questo punto viene perso di nuovo un acetil-CoA e si ottiene l’aceta acetato (beta chetoacido) che per decarbossilazione spontanea esce CO2 e si forma acetone che è un composto volatile e non viene considerato come un vero e proprio corpo chetonico che non viene utilizzato dal cervello per ottenere energia, quello che può succedere quindi è un’ossidazione dell’acetoacetato a beta-idrossibutirrato. Quindi questo gruppo chetonico viene ridotto a gruppo idrossilico con concomitante ossidazione di NADH. Si formano questi corpi chetonici per un eccesso di acetil-CoA. E si formano perché essendo solubili nel sangue possono essere facilmente trasportati in quantità adeguata al cervello che li può usare in alternativa al glucosio. Gli acidi grassi non solo solubili nel sangue, sono trasportati attraverso proteina ma a bassa concentrazione, non passano mai la barriera ematoencefalica e il cervello non se li può mangiare. Quando il cervello prende corpi chetonici, fa la via inversa quindi risintetizza acetil-CoA e fa il ciclo di Krebs. Tutto questo perchè il cervello non può assumere acidi grassi e quindi il fegato ha il compito di preparare il “cibo” (che è acetoacetato-beta-idrossi-glutirrato) al cervello in modo che il cervello possa utilizzarlo direttamente per i suoi scopi. È necessario che il SNC venga mantenuto in perfetta efficienza anche in condizioni di digiuno. 14.12.21 Ciclo alimentazione-digiuno può essere diviso in 3 parti: La parte a sinistra è il ciclo fisiologico quando passiamo a una situazione di glucosio ematico alto ad una di glucosio basso ed è necessario mettere in atto meccanismi per mantenere il livello di glucosio ematico. In condizioni normali dopo un certo numero di ore sentiamo lo stimolo della fame in quanto si attivano tutti quegli ormoni della fame che sentendo le varie modificazioni metaboliche che segnalano una carenza energetica ci avvisano. Dal punto di vista biochimico nell’intervallo tra un pasto e l’altro alcuni organi iniziano ad aumentare il consumo di acidi grassi e altri organi si occupano sempre aumentano il consumo di acidi grassi ma anche di mantenere elevato il livello di glucosio ematico per il cervello in quanto non può utilizzare acidi grassi. Il tessuto adiposo libera acidi grassi, glicerolo nel sangue, che vengono ripresi nel fegato e altri organi che sono in grado di utilizzarli come carburanti. Fegato per il rifornimento di glucosio e tessuto adiposo per il rifornimento di trigliceridi e poi acidi grassi che verranno utilizzati da tutti tranne che dal cervello. Quello che succede a mano a mano che si va avanti con il digiuno è che il consumo eccessivo di acidi grassi provoca la produzione dei corpi chetonici che sono l’unico carburante alternativo che può essere usato dal SNC essendo solubili nel sangue, il cervello li trasforma in acetil-CoA che poi utilizza come punto di partenza per il ciclo di Krebs. Tessuto nervoso non ha modo di usare altro se non glucosio e corpi chetonici. Corpi chetonici sono un sotto prodotto della produzione eccessiva di acetil-CoA, il quale non deriva solo dall’eccessivo consumo di acidi grassi ma anche dal fatto di entrare in carenza di ossalacetato se non assumiamo sostanze nutritive. Ciclo di Krebs inizia con ossalacetato che reagisce con acetil-CoA per dare citrato. Ci sono numerosi intermedi, come alfa chetoglutarato, ossalacetato, che possono essere utilizzati per ottenere altri composti o è necessario riempire i vuoti che si creano negli intermedi del ciclo dell’acido citrico usando altre sostante, tra questi ci sono gli AA e le reazioni di transamminazione. L’acido citrico si blocca quando andiamo in carenza di ossalacetato. C’è sempre un gioco di reazioni anaplerotiche e cataplerotiche che servono a mantenere nel giusto equilibrio la concentrazione dei diversi intermedi del ciclo di Krebs. Questo di 60 91 dipende anche dal corretto rifornimento di AA. Ma se sono a digiuno non c’è più il corretto rifornimento di AA. A mano a mano che si va avanti col digiuno si ottiene uno squilibrio con blocco di ciclo acido citrico e eccesso di acetil-CoA e formazione di corpi chetonici. Abbiamo bisogno di assumere un certo numero di proteine perché ogni giorno cellule devono essere ricambiate per invecchiamento, esigenze metaboliche e quindi il bilancio dell’azoto è un qualcosa di abbastanza delicato. Ogni giorno si ha la produzione di diversi ATP, glicogeno, proteine, AA da trasformare etc. Quindi il digiuno va ad interferire con tutto questo in modo consistente. Nei primi tempi del digiuno non introduciamo più le proteine ma continua il normale ricambio quindi noi consumiamo proteine, non si tende a consumare grasso perché accorgendoci che non stiamo introducendo AA utilizziamo quegli AA per fare tutto. Però ci sono dei segnali che indicano di mobilitare i grassi di riserva. Quando si procede col digiuno viene attivata la proteolisi di proteine per ottenere AA e produrre corpi chetonici che vanno a coprire gli intermedi del ciclo di Krebs. 6 curve di accumulo di glicogeno in 6 persone diverse. In circa 30 ore vengono consumate quasi tutte le riserve di glucosio, quelle del glicogeno epatico durano circa 24 ore. Il metabolismo comincia a spostarsi verso un diverso utilizzo delle varie sostanze a disposizione per adattarsi nella migliore condizione possibile al digiuno. Fino a due giorni il livello di corpi chetonici rimane abbastanza basso, il livello di glucosio tende a scendere abbastanza rapidamente ma non può scendere al di sotto del suo valore soglia. Ci vogliono circa 3 giorni di digiuno per far si che si abbassi il glucosio e il cervello inizia proprio qui ad utilizzare i corpi chetonici. Eccesso di acetil-CoA venisse convertito in qualcosa che potesse essere utilizzato dal cervello. Dopo i 2 giorni si iniziano ad avere effetti patologici. Si avrebbe uno squilibrio metabolico gravissimo. Si ha la chetoacidosi metabolica e questo fa diminuire grandemente il pH del sangue e questo è pericoloso. Si ha necessità di compensare acidosi metabolica e quindi una persona cerca di conseguenza di muoversi il meno possibile per consumare il meno possibile di energia. DIABETE | Diabete di tipo 1 detto giovanile perchè dipende dal fatto che la persona è incapace di produrre o del tutto l’insulina o insufficiente. Insalino dipendente perché questo tipo di diabete può essere curato prendendo l’insulina. | Diabete di tipo 2 insorge in età adulta ed è insilino-resistente e non dipendente, ciò che manca è la corretta trasduzione del segnale dell’insulina nelle cellule muscolari e adipose. Le cellule del muscolo e dei grassi diventano insensibili all’insulina nonostante ci sia. Quindi deve essere curato con altri farmaci che mimano quello che fa l’insulina. È collegato all’obesità e alla sindrome metabolica dovuta a tutta una serie di patologie che comprendono obesità, ipertensione, iperglicemia, etc, (siti ectopici sono i siti dove grasso non si dovrebbe accumulare). Non ci dovrebbe essere grasso nei muscoli e nel fegato. Il fegato grasso è uno dei sintomi di obesità che può degenerare in cirrosi epatica dovuta anche ad alcolismo —> morte di cellule epatiche sostituite da tessuto cicatriziale e perdono di funzionalità. di 61 91 Diabete è una malattia che può essere difficile da trattare, si presenta in forme diversissime. Si può andare incontro a scompensi metabolici che ricordano quelli che si hanno durante il digiuno. Succede che la carenza di insulina o la non la mancata risposta delle cellule all’insulina blocca l’entrata del glucosio nelle cellule muscolari e negli epatociti. Cellule si comportano come se pensassero che abbiamo poco glucosio e quindi mettono in atto tutte le risposte metaboliche che si hanno nel digiuno. Anche il diabete non controllato adeguatamente può andare incontro a crisi metabolica. Le cellule muscolari pensando di essere a digiuno cominciano a demolire le proprie proteine corrispondente a una mancanza energetica. Il nostro organismo è come se sentisse di essere in carenza di glucosio ma in realtà ce n’è tantissimo. Quindi il primo sintomo di diabete è iperglicemia, quando si supera la soglia consentita e quindi si ha escrezione di glucosio a livello renale. Si ha dunque una minzione molto abbondante e si ha una sete intensa, tutto ciò provoca il dimagrimento. Il diabete viene chiamato MELLITO che indica miele e quindi dolce questo perchè se viene escreto glucosio con le urine, queste hanno un sapore dolce. Quindi il diabete è questa sorta di digiuno nell’abbondanza e può provocare danni anche abbastanza gravi. Diabete non compensato provoca la produzione in eccesso di corpi chetonici e se questi sono tanti aceto-acetato comincia a decarbossilare producendo acetone che è un liquido volatile quindi passa facilmente alla fase vapore. Acetone viene eliminato con espirazione e avendo anche lui un sapore dolciastro a volte ricorda l’alito delle persone ubriache in quanto acetone deriva da etanolo. ETANOLO a livello metabolico a bassi livelli non fa tanti danni se non a digiuno, in quanto etanolo scombina diverse cose. Bere durante un pasto va bene anche perchè viene assorbito in poco mentre berlo in eccesso a digiuno va a contrastare gli effetti che il nostro organismo deve fare per il digiuno. Etanolo ossidato ad acetaldeide nel fegato da un enzima che si chiama alcol deidrogenasi (non specifico per etanolo ma funziona anche per altri alcol). Intossicazione da metanolo —> ossidato in formaldeide dunque molto tossico soprattutto a livello della retina in quanto provoca cecità. Cura è somministrare al paziente etanolo in quanto funge da substrato e quindi poi il metanolo viene espulso esternamente. Capita anche a chi fa dei distillati in casa. L’acetaldeide viene presa nel fegato dall’enzima aldeide deidrogenasi e ossidata ad acetato consumando un’altra molecola di NAD+. Acetato convertito con consumo di ATP ad acetil-CoA. Consumo eccessivo + digiuno —> eccessivo acetil-CoA Aumenta il rapporto di NADH/NAD+ e sposta il rapporto verso la forma ridotta. Spostamento della reazione della LDH e della malato DH epatiche verso la produzione di lattato e malato. Sposto la malato DH verso la sintesi del malato. Si ha quindi un rischio di ipoglicemia con inibizione di gluconeogenesi, etanolo è ad altissima energia ma non lo possiamo utilizzare per ottenere energia. Aumento del rapporto di NADH/NAD+, inibisce anche la beta ossidazione degli acidi grassi e stimolo la sintesi. Calorie dovute all’etanolo vengono definite calorie povere/vuote e quindi è come se avessi un eccesso di acidi grassi, dall’etanolo non posso ottenere glucosio. Etanolo ha gli effetti acuti ma anche cronici se si continua a consumare etanolo per anni e anni quello che succede è che magari non ho problemi di ipoglicemia perché il consumo non va oltre un certo livello ma il consumo di etanolo viene indirizzato verso la sintesi di grasso e quindi abbiamo la steatosi epatica che può finire anche in cirrosi epatica. Accumulo di corpi chetonici per eccesso di Ac-CoA provoca acidosi metabolica. Etanolo contiene un sacco di calorie. di 62 91 se l’energia corrisponde all’esatta transizione tra i due livelli degli orbitali molecolari del complesso antenna, questo può essere assorbito. La nostra sostanza ha assorbito l’energia del fotone e si è spostato in un stato eccitato che può essere più alto o più basso a seconda dell’energia se rossa o meno. Però lo stato eccitato è instabile, il complesso antenna deve restituire l’energia in quanto non può stare nello stato eccitato. Si può avere emissione di fluorescenza, o si può avere una conversione tra i diversi sotto livelli e quindi viene in un certo senso persa senza emissione di radiazione, oppure si può avere un trasferimento di un eccitone e la fotossidazione che sono i due fenomeni che danno il via a tutta la catena di trasporto degli e- del cloroplasto. Il trasferimento dell’eccitone non prevede lo spostamento dell’e- ma trasferisce l’energia, quindi quando il fotone casca sul pigmento antenna che lo può assorbire questo deve ricevere l’energia da un complesso antenna vicino e suo avvertire attraverso il trasferimento della sola energia assorbita, attraverso l’eccitone. Quindi le molecole antenna si passano energia assorbita da una molecola all’altra, a un certo punto l’eccitone finisce per arrivare a una coppia di pigmenti che sono 2 molecole di clorofilla a che fanno da trappola di e- e sono le clorofille del centro di reazione. Si trovano ad un livello energetico inferiore. Il trasferimento avviene tra molecole che vengono eccitate da un livello energico sempre un pochino più basso rispetto a quello che ha eccitato la molecola iniziale. L’eccitone finisce nella coppia di molecole del centro di reazione perchè è quello che viene eccitato con un livello energetico minore. Questa coppia di molecole ha un livello energetico così basso perchè è fatto da 2 clorofille che si trovano in un ambiente adatto fatto da proteine che stanno nel complesso antenna, a loro volta complessate con composti lipidici, quindi sono dei complessi lipoproteici grandi, e fanno si che le clorofille del centro di reazione possano eccitarsi con un livello energetico minore. FOTOSISTEMI grossi complessi proteici e sono di due tipi: 1 e 2. Eccitone casca sulla molecola del centro di reazione fotosintetico. Quando arriva al centro di reazione non è più il semplice trasferimento di energia ma si ha un vero e proprio trasferimento elettronico, è l’e- che esce e viene buttato fuori dalla clorofilla ed è l’evento scatenante che da il via al trasferimento elettronico nei cloroplasti. Vengono ceduti gli e- delle clorofille del centro di reazione. Anche la catena di trasporto fotosintetica dei cloroplasti funziona secondo gradiente termodinamico ma per avere il primo evento è necessario l’intervento della luce solare. Abbiamo e- che si è spostato fisicamente dalla clorofilla al primo trasportatore. A questo punto abbiamo la clorofilla col buco elettronico e l’e- che si deve spostare attraverso la catena di trasporto fotosintetica. Ci sono due fotosistemi che lavorano in serie il primo dei quali interagisce con H2O e strappa e- all’O2 dell’H2O producendo O2 molecolare, il secondo dei quali riceve e- da un trasportatore mobile che a sua volta li prende da quelli iniziale. P680 e P700 sono i centri di reazione fotosintetici del fotosistema 2 e 1, il numero indica il picco massimo di assorbimento. Quando un fotone dopo essere passato dai complessi antenna arriva sul centro di reazione del P680 e passa al primo accettore di e- che è la feofitina e lo passa a 2Q che sono dei chinoni. Siamo ancora all’interno del fotosistema quindi abbiamo un trasferimento di e-. Se rimane col buco elettronico non può più trasferire e-, quindi il P680 è il centro di reazione che attraverso un intermedio oxygen evolving complex = centro che sviluppa O2, viene riridotta dagli e- dell’H2O. di 65 91 E- esce dal fotosistema 2 e incontra un chinone che si chiama plastochinone che interagisce con un complesso che non è un fotosistema che riceve gli e- dal coenzima Q e li cede a un trasportatore mobile che si chiama plastocianina (cianina perchè contiene un gruppo tetrapirrolico ma è complessata con il rame e quindi ha un colore azzurro). Chinone e plastocianina si passano e- attraverso dei centri ferro-zolfo e dei circuiti che stanno all’interno del citocromo b6f (in quanto contiene un citocromo b6, un ferro-zolfo e un citocromo f) passando attraverso un ciclo Q analogo per la catena di trasporto mitocondriale. La plastocianina è un trasportatore mobile solubile nel lume del tilacoide che si sposta dal citocromo b6f al fotosistema 1 e cede il suo e- al P700 che è il centro di reazione che spara fuori e- che viene mandato ad una serie di intermedi all’interno di trasportatori elettronici intermedi all’interno del fotosistema 1 fino ad arrivare ad un centro ferro-zolfo. P700 si trova dunque con un buco elettronico che viene riempito dall’e- della plastocianina. E- strappati all’H2O sono arrivati al fotosistema 1, quindi sono necessari 2 fotoni. E- del centro ferro-zolfo viene trasferito ad un’altra proteina piccola e solubile che è la ferredossina che a sua volta attraverso l’azione dell’enzima ferredossina NADP+ reduttasi (flavoproteina) cede e- all’accettore finale che è il NADP+ con prodotto finale che è NADPH. Quindi l’energia per sintetizzare NADPH viene data dall’assorbimento dell’energia della luce, e- vengono assorbiti dall’H2O. A livello della membrana tilacoidale si ha la liberazione di 4H+ nel lume del tilacoide, e in tutto il passaggio di e- nel citocromo b6f si ha lo spostamento di 8H+ dallo stroma del cloroplasto al lume della membrana tilacoide con il risultato che si forma un gradiente protonico in cui H+ sono tanti all’interno del lume. Membrana tilacoide è impermeabile, H+ che possono passare la membrana attraverso il complesso ATPsintasi composta da subunità CF1 e CF0. |__> FASE LUMINOSA con sintesi di ATP e NADPH e dipende dalla luce Ci vogliono 2 fotoni. Dobbiamo accoppiare 4e- che vengono strappati a H2O contemporaneamente. Ci deve essere un qualcosa che accoppia lo strappare 4e- con la cessione di 1e- per volta. SCHEMA A Z —> ci dice quali sono i livelli energetici dei vari componenti della catena di trasporto fotosintetica. Sull’asse delle ordinate è riportato il potenziale redox. Il P680 è localizzato un po’ più in basso del P700. Le coppie ridotte e ossidate di ciascuna delle due semicoppie stanno più in basso. Quando la clorofilla del centro di reazione si ossida perde e- e schizza ad un livello energetico di potenziale redox molto negativo e quindi è un potentissimo ossidante. Quindi il P680 svuotato di e- riesce a trasferire e- a tutti i trasportatori a valle secondo gradiente, e- passano spontaneamente dalla semicoppia a potenziale minore a quella maggiore, quindi dall’alto verso il basso quindi questo passaggio è spontaneo. Quando il P680 è ossidato gli e- passano da un trasportatore all’altro secondo gradiente, fino ad arrivare alla plastocianina con 8H+ spostati dallo stroma al lume dei tilacoidi. Il P680 svitato di e- deve avere un potenziale positivo da riuscire a strappare gli e- ad un altro ed è messo più in basso rispetto al livello dell’O2, è fatto in modo che quando e- viene sparato fuori dalla clorofilla si generi un ossidante potente da riuscire a strappare e- dall’H2O. Livello energetico della sua controparte ridotta non è sufficiente per ridurre NADPH. Interviene un secondo fotone che da un altro colpo a un secondo centro di reazione la cui controparte ridotta è un riducente sufficientemente potente per ridurre NADP+ a NADPH. di 66 91 Plastocianina deve cedere i suoi e- al P700 che quando passa nella sua forma ridotta riesce a ridurre dei trasportatori di e- che hanno un potenziale più negativo rispetto a quelli ridotti dal fotosistema 2. Si ha anche qui un passaggio di e- secondo gradiente fino ad arrivare a ferredossina che riduce NADP+ a NADPH. Energia di un solo fotone non è sufficiente per generare sia un ossidante potente per strappare e- a H2O sia un riducente potente da ridurre il NADP+ a NADPH. Per avere la fotosintesi ossigenica ho bisogno di 2 fotosistemi che lavorino in serie ciascuno dei quali assorba un fotone. Ecco perchè ci sono microrganismi che non fanno fotosintesi ossigenica perché questi hanno un solo fotosistema e quindi quel tipo di fotosistema non è in grado di ossidare H2O e deve ossidare qualcosa di meno ossidante di O2 come zolfo che viene ossidato da solfuro a zolfo molecolare. Quindi l’invenzione di 2 fotosistemi ha consentito l’utilizzo della fotosintesi ossigenica. Bilancio energetico si vede bene dallo schema Z in quanto vengono riportati tutti i valori. L’energia dei due fotoni viene convertita in energia chimica sotto forma di equivalenti di riduzione sotto forma di NADPH e sotto forma di energia chimica sotto forma di ATP. COMPLESSO CHE EVOLVE O2 funziona un po’ come la riduzione di O2, è un qualcosa che comprende diversi atomi di metalli di transizione che sono atomi di manganese in più c’è uno ione Ca quindi è un complesso manganese-calcio che essendo legato a dei polipeptidi cicla fra 5 differenti stati di ossidazione in ognuno dei quali si trova al livello di ossidazione differente. In questo modo succede che i 4 e- di H2O possono essere ceduti tutti insieme a questo complesso che li accetta tutti insieme che passa dal suo stato più ossidato S4 al suo stato più ridotto S0. Dopodiché questo cederà uno alla volta gli e- a 4 P680 ossidati riducendoli uno alla volta. Quindi e- di H2O passano tutti su questo OEC tutti insieme in questo modo abbiamo liberazione di O2 e 4H+. S0 è completamente ridotto e si ossida gradualmente cedendo e- uno per volta a 4 centri di reazione fotosintetici ossidati del P680. P700 non funziona così. Si formano dei legami intermedi tra i diversi atomi di manganese. Plastochinone e chinone ? stanno nella membrana Si genera una forza protonmotrice. I protoni escono secondo gradiente e sintetizzano ATP. FASE OSCURA non dipendente direttamente dalla luce. TRASPORTO CICLICO DI E- —> PSI Ci sono condizioni metaboliche della cellula per cui serve una maggiore quantità di ATP rispetto a NADPH. Il trasporto genera una certa quantità di ATP e una di NADPH. Si è evoluto un sistema che fa si che e- invece che essere ceduti a FNR, quando arrivano alla ferredossina questa torna indietro e riceve gli e- al complesso del citocromo bf e questo si chiama appunto PSI dove abbiamo gli stessi e- che ciclano continuamente tra questi componenti, citocromo bf, plastocianina, P700, ferredossina. Succede che non si ha sviluppo di O2 perchè gli e- che girano sono sempre quelli, non vengono ceduti a nessuno e quindi non si produce NADPH. Ma viene generato un gradiente protonico. Questo è un modo per separare sintesi di NADPH, il trasporto elettronico dalla sintesi di ATP e avviene quando la cellula ha più bisogno di ATP che di NADPH. Gli e- che ciclano sono sempre quelli però quello che deve succedere è che i fotoni continuino a cadere sul fotosistema 1, altrimenti energia non esisterebbe. Quindi P700 continua a passare dalla sua forma ridotta a quella ossidata (eccitata). di 67 91 La rubisco è un enzima abbastanza scarso dal punto di vista cinetico, ha un’attività bassa, funziona male. In più ha un’attività fastidiosa, non è solo una carbossilasi ma è una carbossilasi ossigenasi. In condizioni di bassa concentrazione di CO2 e alta concentrazione di O2 può succedere che la RUBISCO invece di reagire con CO2 reagisce con O2 e attraverso tutta una serie di intermedi invece di produrre 2 molecole di 3 fosfoglicerato, produce una molecola uguale e una ma ossidata che si chiama fosfoglicolato. Non è entrata CO2 e quindi non abbiamo 2 prodotti a 3 atomi di C ma ne abbiamo uno a 3C e uno a 2C e sono tutti e due ossidati in quanto ingresso di O2 ossida il composto a 5C provocando scissione del legame e la conseguente ossidazione. Questo è un problema in quanto la pianta non sa cosa fare del 3P-fosfoglicolato. Il recupero di 3P-fosfoglicolato costa molto. Il 3 fosfoglicolato viene defosforilato senza recuperare ATP per ottenere glicolato. Questo viene trasportato attraverso trasportatori in un altro organello che è il perossisoma (contiene un certo numero di enzimi ossidanti), quindi dal cloroplasto passa nel perossisoma, dove attraverso l’enzima glicolato ossidasi. Attraverso questo enzima consuma un’altra molecola di O2 per trasformare il glicolato in gliossilato. Ossigenasi = enzima che reagisce con O2 e fa entrare nel prodotto entrambi gli atomi di O2 Ossidasi = enzima che reagisce con O2 ma O2 non entra nel prodotto ma genera H2O2 (acqua ossigenata) —> specie reattiva di O2 che va eliminata immediatamente. Catalasi = catalizza la dismutazione dell’H2O2 a dare O2 e H2O, O2 che poi magari potrà rincominciare a fare il ciclo. Il gliossilato tramite una reazione di transamminazione viene convertito in glicina, gliossilato è un alfa-chetoacido e quindi può fare una transamminazione, consumando una molecola di serina che dal mitocondrio passa nel perossisoma generando così idrossipiruvato che viene convertito in glicerato attraverso il consumo di un NADH il quale viene importato di nuovo nel cloroplasto e attraverso il consumo di un’altra ATP rigenera 3P glicerato che rientra nel ciclo di Calvin. Abbiamo consumato O2, sprecato 2ATP e non abbiamo fissato niente. La glicina viene poi decarbossilata nel mitocondrio per dare serina che poi è quella che viene esportata per dare idrossipiruvato. La FOTORESPIRAZIONE serve a sprecare ATP, consumare O2 e liberare CO2. È rimasta quest’attività della rubisco in quanto fissare CO2 è una cosa complicata. Attività parassitaria della rubisco è presente anche nelle piante tropicali. Piante che vivono in condizioni in cui intensità della luce è molto alta è c’è tanta concentrazione di O2. Hanno organizzato la struttura della loro foglia in modo tale da avere delle cellule del mesofillo (in mezzo alla foglia) e delle cellule della guaina del fascio (stanno intorno alla vena centrale che trasporta la linfa). Queste cellule sono specializzate, nella cellula del mesofillo avviene la fissazione della CO2 in un ciclo di intermedi a 4C (da cui nome ciclo C4) che prevede CO2 prelevata dall’aria grazie all’enzima PEP carbossilasi si lega al fosfoenolpiruvato producendo ossalacetato. Ossalacetato viene ridotto a malato in quanto ossalacetato non può uscire dalle cellule, esce il malato che viene trasportato nella cellula della guaina del fascio dove avviene una reazione opposta in cui si produce NADPH e CO2 e piruvato il quale torna indietro, viene fosforilato a PEP e riparte il ciclo. Trasporto della CO2 dal mesofillo alla guaina del fascio. Gli enzimi del ciclo di Calvin sono presenti nella guaina del fascio e non nelle cellule del mesofillo. Questo serve a spostare CO2 dalla cellula del mesofillo, dove viene fissata ma rischierebbe in presenza di enzimi del ciclo di Calvin di dare il via anche all’attività ossigenasica, alla cellula della guaina del fascio. La RUBISCO non può avere la sua attività ossigenasica nelle cellule della guaina del fascio perchè queste sono lontane dagli stomi e quindi sono lontane dal contatto con di 70 91 aria, quindi non c’è O2 qui. Ecco che evitano l’azione parassitaria aumentando enormemente l’efficienza della fotosintesi. Ci sono anche le piante CAM che sono le classiche piante del deserto. Il loro problema è il fatto di vivere in un ambiente dove l’umidità è bassissima, quindi ciò che manca è l’acqua. Per far entrare CO2 le piante del deserto devono tenere aperti gli stomi, ma se fuori c’è poca umidità perdono acqua velocemente, l’unico modo per non perdere acqua è tenere chiusi gli stomi ma se questi rimangono chiusi di giorno non entra neanche CO2. Dunque hanno inventato un loro metabolismo (metabolismo delle piante CAM) dove tengono aperti gli stomi di notte, entra CO2 e perdono poca H2O. Però non posso fare la fotosintesi di notte e allora CO2 viene conservata in un ciclo C4 in acidi come ossalacetato e viene liberata di giorno quando la pianta pur tenendo chiusi gli stomi riutilizza CO2 immagazzinata durante la notte in intermedi C4. ATP e NADPH sono regolati dalla concentrazione e sono quelli che devono scambiare energia in modo molto rapido, quindi possono essere immagazzinati momentaneamente sotto forma di acidi ma non sotto forma di ATP e NADPH. METABOLISMO DELL’AZOTO e DEI COMPOSTI AZOTATI Il ciclo dell’azoto è un po’ strano in quanto azoto è un elemento per il quale non si è mai riusciti a sviluppare dei depositi, anche le proteine di riserva dei semi servono per fare altre proteine. Quindi il ciclo dell’azoto è un ciclo che non prevede delle riserve e questo è un problema in quanto significa che siamo sottoposti ad un continuo turnover delle proteine quotidiano che fa si che tutti i giorni dobbiamo assimilare un tot di proteine. Azoto è l’elemento più abbondante nell’atmosfera ma è presente in una forma refrattaria e noi non siamo in grado di assimilarlo in questa forma. Gli animali devono assumere azoto sotto forma di ammoniaca, quindi azoto ammoniacale. Azoto atmosferico ha numero di ossidazione 0, mentre l’azoto dell’ammonio ha -3, quindi devo ridurlo con 3 e- e questo costa energicamente. Nitriti (+3), nitrati (+5). In tutto ciò vengono coinvolti tutti gli organismi viventi. Gli animali possono assimilarlo sotto forma ammoniacale, le piante anche sotto forma di nitrato. Esistono organismi azoto fissatori nel suolo, batteri nitrificanti che passano da ammoniaca a nitriti o da nitriti a nitrati o denitrificanti che invece rimettono in circolo l’azoto nell’atmosfera. In tutto ciò centrano anche i combustibili fossili, il vulcano, la pioggia. Al momento da quando l’uomo ha iniziato a sintetizzare l’ammoniaca a partire da azoto, il 50% dell’azoto immesso nel ciclo dell’azoto deriva dai concimi chimici. Prima c’era quello fissato dai fulmini e i microrganismi azoto-fissatori. Tutti gli organismi possono assimilare azoto ammoniacale per sintetizzare tutti quei composti come AA, nucleotidi, etc. Se ossido azoto, i batteri possono ottenere energia, mentre per ridurre a nitrato e nitrito ho bisogno di energia. Riusciamo a fare la riduzione industriale dell’azoto atmosferico attraverso condizioni di reazioni estreme, quindi con temperature alte e catalizzatori. O, H e P sono facilmente disponibili, fissazione di CO2 costosa, N2 costa ancora di più. Fissazione = riduzione ma non organicazione e costa tantissimo Per fissare 1 molecola di azoto atmosferico devo usare 16ATP e 8e- in quanto insieme alla riduzione dell’azoto ho anche la produzione di un H ridotto. Tutto questo avviene nei microrganismi, in particolare i rizobi (formano noduli e sono simbionti delle leguminose) e cianobatteri. di 71 91 La NITROGENASI è l’enzima chiave per la fissazione della CO2 e costituito da 2 componenti: 1 nitrogenasi che riduce N2 e 1 nitrogenasi riduttasi che trasferisce e- dalla ferredossina ridotta alla nitrogenasi. Ciclo della NITROGENASI ricorda un po’ quello che succede con un manganese e O2. Dobbiamo cedere e- uno per volta all’N2, ridurre gradualmente azoto prendendo e- uno per volta. La nitrogenasi reduttasi = enzima che riduce enzima nitrogenasi |__> cede e- uno per volta prelevandoli dalla ferredossina ridotta e consumando ATP alla nitrogenasi vera e propria che contiene l’intermedio molibdeno il quale ad un certo punto nello stato di ossidazione iniziale lega N2 atmosferico. Iniziano ad entrare gli e- uno per volta e piano piano il nostro N2 inizia ad essere ridotto. Passiamo da un triplo legame ad un legame singolo, entra un H+, si sposta H e questo viene ridotto a livello amminico, entra un secondo H+ e si libera la prima molecola di ammoniaca. Rimane legato il secondo atomo di N che però è ancora completamente ossidato. Quindi bisogna avere 3e- per far uscire la seconda molecola di ammoniaca. Deve succede che si ricostituisce il complesso iniziale in quanto all’inizio il molibdeno è legato a 3H e per legare N2 deve perdere due di questi atomi di H e contemporaneamente ridurli ad H2. Quindi da qui in poi abbiamo una sorta di rigenerazione della nitrogenasi che deve essere ridotta aggiungendo H al molibdeno centrale. Quindi è necessario l’ingresso di altri 3e- sempre derivanti dalla nitrogenasi riduttasi. Il tutto ci costa idrolisi di 2ATP per ogni e- il che ci porta al bilancio di 16ATP totali. In quanto 8e- di cui 6 che vanno all’N2 e 2 all’H2. Da nitrato a nitrito dobbiamo avere una riduzione e come agente riducente viene usato NADH o NADPH. Gli enzimi come nitrato riduttasi è un enzima FAD dipendente legato in modo covalente e contiene 4 centri Fe e 4 S e il molibdeno come cofattore iniziale. Da nitrito ad ammoniaca abbiamo la nitrito riduttasi che contiene il Fe siroeme un eme particolare il quale prevede l’interazione con atomi di S. Noi dobbiamo assimilare ammonio attraverso enzimi, assimilarlo come molecole azotate e le principali sono: carbammil fosfato, asparagina, glutammato, glutammina. Da questi rispettivamente otteniamo: arginina pirimidine urea, altri AA, purine triptofano istidina AAzuccheri. Tutto questo viene effettuato da enzimi chiave. Il primo è la glutammina sintetasi che consuma ATP. Viene aggiunta una molecola di NH3 a una molecola di glutammato per sintetizzare glutammina. Il glutammato deve essere attivato da ATP a formare il gamma-glutammilfosfato, quindi quello che si passa è un intermedio in cui si ha una forma attivata del glutammato che è legato a un gruppo fosfato. Il fosfato viene sostituito dal gruppo amminico che viene liberato come fosfato libero. Risultato netto è il consumo di 1ATP. L’enzima e glutammina sintetasi che non può funzionare al contrario. Il glutammato viene sintetizzato dalla glutammato deidrogenasi e questa pur essendo una reazione che coinvolge un’alfaAA a destra e un’alfa chetoacido a sinistra non è una transamminazione ma è amminazione riduttiva ed è reversibile. Negli animali abbiamo reazione spostata verso la formazione di alfa chetoglutarato e serve nei processi di riduzione di N2 e quindi è una reazione catabolica. Nei batteri viene utilizzato per l’assimilazione di NH3 e quindi è una reazione anabolica. La reazione prevede che ammoniaca in combinazione con NADH o NADPH ridotto venga legata all’alfa-chetoglutarato per formare glutammato. L’atomo di C carbonilico di alfa- di 72 91 CICLO DELL’UREA Urea viene sintetizzata nel fegato dopodiché viene trasportata nel sangue e viene escreta tramite le urine nei reni. Tutte le transamminazioni avvengano nel fegato il quale è il centro di quasi tutto il nostro organismo. Se si ha insufficienza epatica si ha anche insufficienza renale. Urea per essere sintetizzata richiede energia e viene sintetizzata durante la via ciclica dell’urea che inizia e termina con un particolare AA che è l’ornitina che funge da trasportatore di urea. Quindi attraverso tutto un ciclo a un certo punto arginina libera urea per dare ornitina. Arginina è un normalissimo AA che fa parte anche delle proteine, non come citrullina. Il ciclo dell’urea avviene nel fegato ma un po’ nel citoplasma e un po’ nella matrice del mitocondrio. I 2 atomi di N e il C che costituiscono urea arrivano dal carbammil fosfato attraverso l’enzima carbammil fosfato sintetasi 1 che è la forma mitocondriale di questo enzima. Il secondo atomo di N arriva dall’arginina attraverso l’enzima arginina succinato sintetasi e argininao succinasi. Esce come arginina ma entra come aspartato. Quindi atomi di N arriva dall’aspartato attraverso arginina e carbammil fosfato. La reazione che sintetizza urea è quella che da arginina attraverso una reazione di idratazione catalizzata dall’enzima arginina idratasi che rompe il legame terminale ossidando l’atomo di C dando urea e formando alfa AA ornitina che di nuovo non è un AA delle proteine. I due composti che attraversano la membrana interna del mitocondrio, che si spostano da matrice al citosol, sono ornitina e citrullina. Nel mitocondrio il glutammato reagisce con l’acetil-CoA attraverso l’enzima N acetil glutammato sintasi sintetizza appunto N acetil glutammato che si può considerare come una forma attivata del glutammato stesso. Quindi per legare l’atomo di N che arriva da ammoniaca libera e CO2 libera è necessario avere sia una forma attivata di un AA (che contiene già energia perché ho investito acetil- CoA) sia il diretto consumo di ATP. La carbammilfosfato sintetasi consuma 2ATP sintetizzando il carbammilfosfato. Vengono evidenziati quegli atomi che poi finiranno per diventare urea, quindi CO2, il gruppo ammonio che diventa amminico formano il primo pezzo della molecola di urea. Il donatore della CO2 è sotto forma di carbonato. La citrullina esce dal mitocondrio e attraverso l’enzima arginino succinato sintetasi che consuma dell’ATP, abbiamo 2 legami ad alta energia perchè diventa AMP + pirofosfato il che porta a destra la reazione perchè rappresenta dell’enzima pirofosfatasi elimina il prodotto pontando reazione verso destra, sintetizzando arginino succinato che arriva dalla reazione della citrullina che porta il primo pezzo della molecola di urea con l’aspartato che è il secondo donatore dell’atomo di N dell’urea. |__> citrullina + aspartato ad opera di arginino succinato Aspartato arriva da un ciclo di scambio tra alfa chetoglutarato e il glutammato il quale viene a sua volta sintetizzato dalla glutammato deidrogenasi convertendo alfa- chetoglutarato in glutammato consumando un altro atomo di N. Quindi anche il secondo atomo di N deriva dal gruppo amminico in origine solo che non viene inserito direttamente nella citrullina ma viene inserito a livello dell’arginino succinato dopo essere passato dall’aspartato. Ossalacetato deriva dall’ultima reazione del ciclo di Krebs, perché arginino succinato attraverso l’azione dell’enzima arginino succinasi (idrolasi) sintetizza arginina e fumarato il quale rientra nel mitocondrio per dare malato e ossalacetato e rincominciare il ciclo. Arginina attraverso enzima arginina idratasi perde i suoi atomi terminali dando ornitina e urea la quale viene trasportata nel sangue fino ai reni e ornitina può rincominciare il ciclo. di 75 91 È connesso ad un altro ciclo che serve per rigenerare continuamente l’accettore dell’ammonio che lo farà entrare nell’urea come aspartato e dall’altra parte è collegato sempre nel mitocondrio all’ingresso sia del secondo atomo di N e C attraverso lo scambio col glutammato. L’ammonio che finisce nell’urea arriva da un atomo di N che entra come ammonio attraverso l’azione del glutammato e della N acetil glutammato sintasi e la sintesi del carbammil fosfato che entra a livello del glutammato che comprende sia un pezzo del ciclo di Krebs ma anche la glutammato deidrogenasi e la glutammico ossalacetico transamminasi. Il tutto ci costa 4ATP perchè 2 vengono idrolizzati ad ADP e 1 viene idrolizzato ad AMP, per sintetizzare 1 sola molecola di urea. Viene riportato 1 solo ammonio perchè l’altro è già inserito a livello dell’aspartato, il quale deriva da un ammonio libero che entra con il glutammato attraverso glutammato deidrogenasi e finisce in aspartato attraverso la glutammico ossalacetico transaminasi. Quindi il ciclo dell’urea è: ornitina + carbammil fosfato —> citrullina + aspartato —> arginino succinato si scinde in —> arginato + arginina —> arginina che in presenza di acqua (arginasi) elimina urea. Ciò che succede nell’organismo dipende dalle esigenze dell’organismo stesso, quindi se siamo in eccesso di AA, arginina non ci serve per fare proteine e quindi entra a far parte del ciclo dell’urea. Arginina è il donatore degli atomi che poi finiscono in urea. Una volta sintetizzata nel fegato, ammoniaca finisce nel sangue come urea e viene escreta nei reni. Come si trasporta ammoniaca nel fegato per la sintesi di urea? Ci sono 2 modi per far arrivare ammonio al fegato, uno attraverso enzima glutammina sintetasi il quale consuma ATP facendo entrare ammonio nel glutammato per dare glutammina, non fil glutammato ad essere trasportato ma la glutammina, quindi il trasportatore di ammonio è la glutammina che va nel sangue, arriva al fegato e attraverso l’enzima glutamminasi riperde ammonio che aveva preso e arriva a livello della sintesi dell’urea rigenerando glutammato. Il muscolo fa il ciclo glucosio-alanina. Ammonio nel muscolo viene trasportato come alanina attraverso il ciclo glucosio alanina che viene utilizzato anche per utilizzare alanina nei muscoli per sintetizzare glucosio attraverso gluconeogenesi. Quindi quando siamo a digiuno e usiamo le proteine muscolari per sintetizzare glucosio abbiamo anche il problema di eliminare atomo di N dell’alanina che viene convertita a piruvato. Quindi non solo demoliamo i muscoli ma sovraccarichiamo anche il fegato della produzione di piruvato. Figura che mostra come dagli AA primari si ottengono altri AA. Le vie canoniche sono aspartato e glutammato. Dal glutammato si ottengono glutammina, prolina e arginina, dall’aspartato asparagina, metionina, treonina e lisina, anche la serina ottenuta dal 3 fosfoglicerato per dare glicina e cisteina mentre dal piruvato otteniamo alanina, valina, isoleucina e leucina. METABOLISMO DEI LIPIDI Lipidi —> triacilgliceroli Accumulo e mobilizzazione degli acidi grassi di riserva per produrre energia. |__> metabolismo diviso in 2 parti —> biosintesi e demolizione attraverso beta ossidazione degli acidi grassi Metabolismo dei grassi che riguarda acidi grassi che vengono immagazzinati come triacilglicerolo. di 76 91 Lo storage = immagazzinamento a lungo termine viene fatto sotto forma di lipidi perché a parità di peso i grassi hanno un contenuto più elevato dei lipidi e perchè sono anidri, ovvero non interagiscono con H2O. Glicogeno è idratato. I grassi non si portano dietro nessun peso di H2O, in quanto anidri ecco perché sono stati scelti per immagazzinamento di energia. Triesteri di acidi grassi con glicerolo che possono essere con la stessa o diversa catena |__> triacilgliceroli immagazzinati in adipociti. Sali biliari aumentato la digestione e il loro assorbimento. Sali biliari derivano dal colesterolo e sono di diverso tipo e facilitano la digestione perché emulsionano i grassi formando l’interfaccia tra lipasi pancreatica e i triacilgliceroli. Sale biliare presenta una parte idrofobica e una parte idrofilica che interagiscono con le lipasi pancreatiche. Lipasi sono enzimi che digeriscono i triacilgliceroli e non gli acidi grassi, quindi sono delle idrolasi che rompono a livello dell’atomo di O generando glicerolo e acido libero. Lipasi non sono regolate, tutti i grassi vengono trasportati e digeriti come acidi grassi e glicerolo. Dal lume intestinale vengono emulsionati, presi come micelle, inseriti, modificati nel Golgi e trasportati come chilomicroni i quali sono le prime forme di trasporto dei grassi nel sangue. Il problema dei grassi è che non essendo solubili in H2O non possono essere trasportati come tali e quindi si devono associare a delle lipoproteine, che sono composte da lipidi, quindi sia triacilgliceroli ma anche da esteri del colesterolo, ma anche dalle apolipoproteine che sono di dimensione e composizione differente e che insieme ad altre proteine contribuiscono formando le lipoproteine a bassa, media o alta densità. Densità molto bassa, bassa, intermedia e alta, significa che tanto maggiore è la densità delle lipoproteine tanto maggiore è la loro composizione in proteine. Dipende dalla loro composizione in proteine. Differenze a livello della composizione in lipidi. Ognuna di queste ha diverse apolipoproteine diverse. | Digestione del trasporto nei lipidi nel sangue Utilizzo de lipidi è un po’ come la mobilizzazione del glicogeno che è un processo rigorosamente sottoposto a regolazione ormonale. Il glucagone anche negli adipociti provoca la sintesi di cAMP il quale attiva la protein chinasi A e negli adipociti la PKA attiva un triacilglicerolo lipasi ormone sensibile la quale comincia, attraverso l’azione PKA fosforila attivando e questo fa si che i triacilgliceroli possano essere trasportati dalla goccia lipidica per essere attaccati dalla lipasi ormone sensibile attivata a sua volta dalla PKA. Ciò che viene trasportato nel sangue sono gli acidi grassi che poi vengono importati nei miociti o altre cellule che possono usarli per la beta ossidazione o ciclo di Krebs utilizzando acetil-CoA. Il composto centrale nel metabolismo dei lipidi è acetil-CoA in quanto dagli acidi grassi attraverso beta ossidazione otteniamo molecole ridotte, simil a come succede nel ciclo di Krebs, solo che ne otteniamo molte durante il ciclo di Krebs. Visto che l’azione della piruvato deidrogenasi è irreversibile non riusciamo ad ottenere zuccheri dagli acidi grassi. In condizioni normali acetil-CoA diventa il prodotto di partenza per la sintesi di colesterolo ed è anche il prodotto di partenza per la sintesi dei corpi chetonici quando siamo a digiuno. Acetil-CoA finisce nel ciclo di Krebs per ottenere NADH, FADH2, etc. In condizioni di digiuno andiamo in eccesso di acetil-CoA. La beta ossidazione avviene all’interno dei mitocondri. Acidi grassi vengono trasportati attivamente attraverso un sistema di trasporto. Acidi grassi entrano nelle cellule per di 77 91 CHETOGENESI Si ha quando siamo a digiuno, acetil CoA viene ossidato per energia nel fegato, ma in eccesso vengono prodotti corpi chetonici che vengono trasportati nel flusso sanguigno che vengono assunti dal cervello, riconvertiti ad acetil CoA per riconvertirlo per ottenere energia. Acidi grassi quando in eccesso vengono trasportati anche da albumina. L’eccesso di acetil-CoA fa si che reagiscano tra di loro per dare acetoacetil-CoA che è l’inverso dell’ultima reazione della beta ossidazione. Se ossidiamo qualsiasi acido grasso a numero pari di atomi di C, all’ultimo passaggio arriveremo all’acetoacetil-CoA che viene scisso in dall’enzima tiolasi in due molecole di acetil-CoA. La reazione successiva è catalizzata da idrossimetil glutaril-CoA sintasi e non sintetasi in quanto non consuma energia, provoca la sintesi del beta-idrossi-beta-metilglutaril-CoA che consuma una terza molecola di acetil CoA che viene scisso a dare acetil CoA e aceto acetato, il quale viene ridotto a beta idrossi glutirrato dalla beta idrossi glutirrato deidrogenasi. L’utilizzo dei corpi chetonici è l’inverso della produzione, il beta-idrossi glutirrato ritorna all’acetoacetato per ossidazione a partire dallo stesso enzima beta-idrossi glutirrato deidrogenasi, l’acetoacetato torna ad essere acetoacetil-CoA e il donatore di CoA è il succinil-CoA. l’acetoacetil-CoA dà 2 acetil-CoA attraverso l’enzima tiolasi che nel cervello entreranno poi nel ciclo di Krebs. Quindi il cervello non fa altro che riconvertire i corpi chetonici in acetil-CoA per poi utilizzarli per fare energia. Questo succede perchè gli acidi grassi non possono essere trasportati a livello del sangue perchè non sono solubili ma devono associarsi ad altre molecole e soprattutto non passano la barriera ematoencefalica. Per sintetizzare acidi grassi devo spendere energia. Il prodotto di partenza è sempre acetil-CoA. La biosintesi degli acidi grassi avviene nel citosol e acetil CoA non passa la membrana interna e quindi per essere trasportato nel citosol deve essere convertito in citrato dal ciclo di Krebs il quale esce dalla membrana interna, va nel citosol e viene riscisso in ossalacetato e acetil CoA. Enzima che rompe il citrato ad ossalacetato e acetil CoA si chiama ATP citrato liasi consumando quindi ATP. Ossalacetato rientra poi nel mitocondrio sotto forma di malato. Ossalacetato non passa la membrana mitocondriale interna ma viene scambiato attraverso il trasportatore del malato che agisce in sintonia con citrato. Per sintetizzare acidi grassi serve 1 NADPH allora c’è la conversione del malato a piruvato attraverso una decarbossilazione NADP+ dipendente che provoca la riduzione di NADP+ a NADPH (la via dei pentosi fosfati produce NADPH). Se ossidando acidi grassi ottengo NADH e FADH2 per sintetizzare acidi grassi devo consumare FADH2. La via di sintesi degli acidi grassi passa attraverso intermedi ma ci sono notevoli differenza. La biosintesi avviene nel citoplasma mentre beta ossidazione nei mitocondri. I trasportatori di e- sono diversi abbiamo FAD e NAD+ come accettori di e- nella beta ossidazione, abbiamo NADPH come donatore di e- nella biosintesi. Intermedio —> L-beta idrossiacil nella beta ossidazione mentre nella biosintesi abbiamo D-beta idrossiacil. Quindi gli enzimi sono diversi, e in questo caso sintetizza un intermedio in configurazione D. Il trasportatore dei gruppi acili che in un caso è il CoA nell’altro caso si chiama ACP (acil carrier protein). di 80 91 Se nella beta ossidazione abbiamo un’unità a 2 atomi di C che è acetil CoA, nella biosintesi abbiamo un’unità che dona atomi di C ma è a 3C ed è il malonil CoA. Le decarbossilazioni spostano le reazioni verso i prodotti quindi verso destra. Il malonil CoA è la forma ulteriormente attivata dell’acetil CoA. È catalizzata dall’acetil CoA carbossilasi (contenente biotina) consumando ATP. È il primo punto di controllo della via di sintesi degli acidi grassi, in quanto se blocco la via metabolica all’inizio impedisco tutto il consumo energetico. Il citrato che è un precursore stimola la reazione, gli acil CoA inibiscono la reazione tramite feedback negativo. La fosforilazione provoca inibizione di molecole. La fosforilazione è inattivata dal glucagone, in quanto a livello di bassa glicemia non vuole che vengano sintetizzati gli acidi grassi perchè vuol dire che siamo in carenza di energia e così come inibisce la glicolisi inibisce anche la sintesi degli acidi grassi. Acidi grassi non servono per mantenere elevati i controlli di glucosio nel sangue. Questo segnale ormonale agisce sugli adipociti e non sulle cellule epatiche. Come avviene la sintesi di acidi grassi: Caricamento legame del malonil CoA o dell’acetil CoA al carrier che non è il CoA ma acil carrier protein. Esiste enzima malonil acil-CoA ACP transacetilasi che lega a ACP. Deve portare legato allo stesso complesso enzimatico entrambe le sostanze. Il prodotto è il malonil ACP o acil carrier protein legata all’acil. Tutte e due attraverso il legame tioestere, tutte e due legate attraverso il residuo di fosfopanteteina. L’acil carrier protein e il CoA legano gli acili nello stesso modo a livello dell’estremità sulfidrilica nel residuo di fosfopanteteina. CoA ha un pezzo fosfato e poi adenosina, ACP porta il residuo di fosfopanteteina legato covalentemente alla proteina stessa attraverso un residuo di serina. La ACP è una sorta di centro del complesso multienzimatico che si chiama acido grasso sintasi. La sintesi di acidi grassi è catalizzata da un enorme commesso multifunzionale che è la somma, l’insieme di tutte le attività enzimatiche riunite in un enorme polipeptide. Quindi la differenza è che la beta ossidazione ognuna fatta da una proteina diversa qui è riunita in un enorme complesso. Al centro di tutto ciò c’è ACP. Gruppi tiolici di fosfopanteteina che si passano i gruppi acilici da uno all’altro. Quindi in realtà sono due le subunità in quanto devono coordinarsi per passarsi i substrati e prodotti. I due residui acilici sono uno il gruppo nascente, quello che si sta allungando, e l’altro è il gruppo entrante è sempre il gruppo acetile, vengono trattati da due residui di fosfopanteteina. Il gruppo entrante è sempre acetile ma che deriva dal malonile. Quindi sui due bracci in uno viene portato l’acetile mentre nell’altro il malonile. Già attivato dalla malonil acil carrier protein transacetilasi. La prima cosa che succede è la decarbossilazione del malonile CoA e il trasporto del gruppo acetile del malonile sul residuo di fosfopanteteina. È il carbossile del malonile che esce. Il gruppo CO2 che è un buon gruppo uscente produce un enolato che attacca atomo di C e quindi si allunga la catena di 2C grazie a beta chetoacil ACP sintasi il quale è un enzima condensante ma al posto di H2O esce CO2. Devo ridurre il gruppo carbonile quindi interviene la prima riduttasi NADPH dipendente che si chiama beta chetoacil ACP riduttasi che da gruppo carbonile riduce il C beta a livello idrossile consumando NADPH. A questo punto abbiamo una deidratazione da beta idrossiacil a enoile in trans, quindi si forma enoil ACP che deve essere di nuovo ridotto dall’enzima enoil ACP riduttasi che di 81 91 consuma di nuovo NADPH. Quindi questa reazione rispetto a beta ossidazione ci costa di più, in quanto consumando NADPH spendiamo 2,3 ATP. Abbiamo allungato di 2 C la catena entrambi legati al residuo di fosfopanteteina. A questo punto la catena nascente si sposta sul secondo residuo e il ciclo rincomincia, legherà un nuovo malonile e rincomincia il tutto. Quindi il primo gruppo acile è un gruppo acetile, ma per far si che inizi la reazione non posso far reagire due gruppi acetile tra loro ma uno dei due deve essere attivato a malonile (che è la forma attivata di acetil-CoA) in quanto per far si che avvenga l’attacco dell’atomo di C all’atomo di C dell’acetile si deve avere un intermedio enolato che si ottiene durante la decarbossilazione di malonile. Quindi il punto di partenza è: gruppo acetile su uno dei due residui di fosfopanteteina e gruppo malonile entrante ma come acetile sull’altro. Dopodiché le reazione sono l’inverso di quelle della beta ossidazione: riduzione dal carbonile a idrossile, deidratazione a formare enoil, riduzione per formare il legame saturo. Tutto ciò ci costa: Tutto ciò è regolato a livello ormonale. Qui vediamo anche la funzione dell’insulina in quanto una sua carenza non ci fa sintetizzare acidi grassi in quanto attiva trasporto di glucosio negli adipociti e cellule muscolari e attiva anche la sintesi di acidi grassi perché attraverso la stimolazione della piruvato deidrogenasi stimola la sintesi di acetil CoA che è il prodotto di partenza della sintesi di acidi grassi. Abbiamo non un accumulo di acetil CoA perché ci manca ossalacetato del ciclo di Krebs ma abbiamo un accumulo di acetil-CoA perché abbiamo tanto glucosio e passiamo quindi alla sintesi di acidi grassi che viene attivata grazie all’attivazione della citrato liasi che consegue ad un’esportazione dell’acetil-CoA nel citosol. La piruvato deidrogenasi è nel mitocondrio mentre la sintesi di acidi grassi avviene nel citosol quindi devo attivare l’esportazione dell’acetil-CoA nel citosol e l’attività della citrato liasi per liberare lo stesso acetil CoA nel citosol che non passa la membrana mitocondriale ma la passa sotto forma di citrato. Acetil CoA + ossalacetato —> citrato il quale esce nel citosol che viene riconvertito dalla citrato liasi ad acetil-CoA. L’insulina catalizza anche la polimerizzazione dell’enzima acetil CoA carbossilasi che è quello che sintetizza il malonil CoA a partire da acetil CoA. È un enzima che in seguito all’azione dell’insulina passa da una forma monomerica inattiva ad una forma polimerica filamentosa attiva. Quindi è proprio la presenza di insulina che spinge la sintesi di acidi grassi. Il malonil CoA è il punto di partenza della sintesi di acidi grassi, otteniamo acil- CoA che andrà ad inibire la polimerizzazione e quindi l’attività dell’enzima che dà il via alla sua sintesi. Il glucagone blocca l’attività della stessa acil CoA carbossilasi attraverso una sua fosforilazione quindi riporta acil CoA carbossilasi verso la sua forma inattiva bloccando la sintesi di acidi grassi. Quindi insulina e glucagone agiscono anche sul glucosio. Insulina è considerata una sorta di ormone della crescita ma non dell’organismo bensì un ormone che segnalando la situazione di ricchezza di nutrienti e quindi di energia stimola tutte le vie metaboliche che portano alla crescita cellulare, sia come duplicazione delle cellule sia come accumulo delle sostanze di riserva. Il glucagone agisce con cAMP mentre insulina no, agisce con i recettori tirosin chinasici. di 82 91 Il doppio filamento nel filamento guida, a mano a mano che si svolge, la DNA polimerasi può andare avanti senza problemi. Dall’altra parte non funziona così perché la DNA polimerasi non può sintetizzare il DNA in questa direzione e quindi deve iniziare dalla parte opposta ma non può perchè siamo ancora a doppia elica. Quindi la sintesi del filamento ritardato viene sintetizzato a pezzetti i quali vengono poi riuniti da un altro enzima con consumo di ATP che è DNA ligasi. Il templato per la sintesi del filamento ritardato viene fuori pezzo a pezzo. Il filamento guida prevede un solo primer all’inizio, in quello ritardato ci deve essere la sintesi di più primer per ciascuno dei frammenti sintetizzati e quindi c’è bisogno di un altro enzima che sintetizza i primer di RNA e si chiama primasi. C’è bisogno di qualcosa che rimuove i filamenti di DNA. Lo srotolamento espone le regioni a singolo filamento, la primasi sintetizza innesco di RNA, polimerasi procedendo nella direzione 5’-3’ sintetizza il filamento complementare facendo i frammenti di Okazaki che però non sono legati tra di loro. La sintesi viene definita discontinua. Lo stampo è in direzione 3’-5’, il filamento di nuova sintesi è in direzione 5’-3’. Polimerasi rimuove il primer dei frammenti di Okazaki sintetizzati in precedenza. Quindi polimerasi 3 estende il frammento di Okazaki a partire dall’innesco ma è la polimerasi 1 (molto lento) elimina l’innesco di RNA a valle mediante il processo di Nick translation. Infine la DNA ligasi unisce i vari frammenti di Okazaki. Nel frattempo il sistema si è spostato più avanti. La DNA polimerasi 1 è una catena polipeptidica unica, nel senso che non è un complesso, ma contiene in sé 3 attività enzimatiche diverse: - Attività polimerasica —> 5’-3’ - Attività 3’ esonucleasica —> serve per riuscire a togliere nucleotidi scorrettamente appaiati dall’estremità 3’, funzione di correzione di bozze in quanto la fedeltà nella replicazione del DNA è importante. - Attività 5’ esonucleasica —> per riparazione di DNA e rimozione di inneschi di RNA nei frammenti di Okazaki. Klenow fragment —> dalla struttura della DNA polimerasi 1 si ottiene questo frammento che ha perso l’attività 5’-3’ esonucleasica quindi non è più capace di mangiare gli innesti di RNA. Non sono 3 polipeptidi diversi ma è un singolo polipeptide con 3 domini diversi: un dominio N terminale dominio centrale 3’-5’ esonucleasico e un dominio C terminale 5’-3’ esonucleasico. Attraverso una proteolisi riesce a staccare una parte e si ottiene questo frammento. Molto utile per le sue attività polimerasiche. La struttura della DNA polimerasi è una specie di palmo. Enzimi che devono avere un ampio sito di legame per DNA stampo. Processività —> capacità di continuare la sintesi senza interrompersi La polimerasi 1 ha una processività bassissima, non sarebbe mai capace di sintetizzare. DNA polimerasi 3 fatta da almeno 10 subunità, di queste alcune costituiscono il core (alfa, epsilon e teta). Quello che genera l’elevatissima processività sono le pinze scorrevoli e il caricatore della pinza che è fatto a sua volta da delta, tau e gamma. Costituita quindi da numerose subunità diverse ognuna delle quali ha la sua funzione. La subunità beta è quella che serve per aumentare la processività della polimerasi stessa. Il DNA inserito all’interno dell’enzima e la pinza a scorrimento serve a chiudere il DNA dentro per far si che il complesso completo non riesca a staccarsi dal DNA. Nella DNA polimerasi 1 tutto questo non c’è. Oloenzima comprende tutto con la pinza ma non il caricatore della pinza perché si stacca. di 85 91 DNA ligasi consuma ATP, la sintesi del filamento ritardato ci costa di più della sintesi del filamento leader perché ogni volta che dobbiamo unire due frammenti di Okazaki dobbiamo consumare 1ATP. Esce il pirofosfato degradato in due gruppi fosfato quindi consumo di due legami ad alta energia. La fedeltà della replicazione è molto elevata. L’attività di correzione di bozze è una questione cinetica nel senso che il sito esonucleasico si trova nell’enzima ad una distanza di 8 nucleotidi al sito polimerasico. Quando DNA polimerasi scorre sul filamento e trova un errore c’è un ritardo e quindi dal punto di vista cinetico rallenta l’attività della polimerasi stessa. Il ritardo permette la denaturazione spontanea e quindi l’errore finisce nel sito esonucleasico che viene a questo punto tagliato. La presenza dell’appaiamento scorretto fa si che l’attività polimerasica venga ritardata di quel tanto che basta per far spostare l’estremità scorretta e farla finire nel sito esonucleasico dove viene tagliata e quindi l’errore viene rimosso. L’attività polimerasica in presenza di un nucleotide scorretto è più lenta dello svolgimento che avviene spontaneamente. Se il filamento crescente non viene allungato, la parte terminale tende a svolgersi. Se c’è questo ritardo nell’attività polimerasica, lo svolgimento fa cadere l’estremità 3’ nel sito esonucleasico che taglia. Quindi l’enzima non legge l’errore ma il sistema fa si che il ritardo nella polimerizzazione dovuto all’errore provochi la scissione dell’errore stesso. Quindi se il nucleotide è corretto l’allungamento è più rapido dello svolgimento e il filamento continua, se il nucleotide è scorretto l’allungamento rallenta consentendo lo svolgimento. Negli eucarioti ci sono più polimerasi e più enzimi. TRASCRIZIONE E SINTESI PROTEICA | Da DNA a mRNA Meccanismo: - Inizio - Allungamento - Fine Complesso della RNA polimerasi con sigma e il legame non è specifico e l’oloenzima della RNA polimerasi si sposta sul DNA fino ad arrivare in una zona dove c’è il promotore e si lega ma è un legame a bassa affinità ovvero che non si lega specificamente in un punto particolare. Quando arriva alla zona del promotore inizia essenziale il fattore sigma in quanto in prossimità del promotore RNA polimerasi si ferma e si ha l’apertura del DNA. Quindi si ha apertura del DNA e questo avviene grazie all’interazione tra RNA polimerasi e delle sequenze specifiche del promotore. Promotore è una sequenza specifica del DNA che serve per dire alla RNA polimerasi di fermarsi qui perchè un po’ più a valle c’è l’inizio di un gene. A questo punto si ha un legame ad alta affinità. L’inizio si ha con il legame di una purina. Nella RNA polimerasi ci sono due siti di legame per nucleotidi e ripassa dallo stato iniziale a bassa affinità ad uno stato ad alta affinità in cui avviene l’allungamento. Sigma non si è ancora staccata, si stacca quando la polimerasi ha già cominciato a sintetizzare l’mRNA quindi quando la polimerasi ha già preso il via e siamo già in fase di allungamento. La maggior parte degli eventi di inizio sono abortivi con il rilascio di oligonucleotidi. di 86 91 Quando si ha il distacco di sigma il complesso diventa stabile e continua fino ad arrivare alla terminazione. Inizio della sintesi è dato dall’interazione a bassa affinità di una purina e l’affinità aumenta durante l’allungamento quando si stacca sigma. Solo uno dei due filamenti di DNA viene trascritto che è quello che funge da stampo. Ci sono delle regioni che sono più difficili da trascrivere e in queste regioni si ha un tempo più lungo di sosta. Anche qui abbiamo la bolla di trascrizione in qui il DNA deve essere a doppio filamento. Le sequenze consenso sono delle sequenze particolari che contengono un’informazione, sono sequenze che indicano la presenza di un dominio di legame per i nucleotidi quindi sono una sequenza di AA che ci indicano che in quel tratto di proteina potrà fare quella determinata cosa. Sono sequenze di basi nel DNA e sono divise essenzialmente in due regioni —> a -35 e a -10 chiamata Pribnow box —> situate più a monte del sito di inizio della trascrizione e queste sono contenute nel promotore. Sequenza consenso è la sequenza più presente più comune è quella che è più presente numericamente. Quella a -35 è la TATA box. Bolla di replicazione —> quando si formano delle anse ricche in sequenze di GC, quello che succede è la terminazione fattore dipendente perché non interviene nulla se non la struttura di DNA che viene trascritto. Si forma una specie di struttura stelo ansa dove le C interagiscono con le G formando delle sequenze stabili. G e C formano 3 legami a idrogeno quindi struttura tridimensionale seguita da poli A che favorisce il rilascio del nuovo RNA, e questo indica la fine della sintesi. | Terminazione fattore dipendente dipende dalla presenza della proteina rho. Proteina rho si lega al suo sito di riconoscimento e tende a scivolare verso estremità 3’ e questo indebolisce l’interazione tra il DNA e il trascritto stesso e qui si provoca il distacco sia dell’RNA che della RNA polimerasi. I geni vengono trascritti se e solo se il prodotto di quel gene serve in quel momento alla cellula. | OPERONE LAC —> è fatto da 3 enzimi che consentono l’utilizzo del lattosio come fonte energetica. Quando i batteri crescono su lattosio (disaccaride costituito da galattosio e glucosio) hanno la capacità di produrre 3 enzimi diversi che ne consentono il suo utilizzo. È la presenza del lattosio stesso che fa si che vengano sintetizzati quegli enzimi necessari per il suo utilizzo. Tutto questo avviene attraverso una complicata reazione che prevede la presenza del repressore che è un gene regolatore, presenza del promotore (detto anche operatore) che consente utilizzo del lattosio stesso. In assenza di lattosio viene prodotto un mRNA del repressore che produce una proteina che reprime l’espressione degli enzimi che serve per l’utilizzo del lattosio. In presenza di lattosio viene soppressa la repressione con lo stesso lattosio che inattiva il repressore, il quale non si lega al promotore il quale può essere riconosciuto dalla RNA polimerasi e portare alla sintesi mRNA per l’utilizzo del lattosio stesso. Operoni sono i sistemi con cui vengono regolate le proteine da produrre. Gli RNA sono rimaneggiati pesantemente dopo la trascrizione. rRNA e mRNA sono molecole che vengono rapidamente degradate perchè ci deve essere un rapido adattamento ai fattori ambientali. di 87 91 I siti P, A e E vengono formati dall’interazione con le due subunità. La formilmetionina viene sintetizzato da un enzima specifico dopo la sintesi di metionil-tRNA, quindi viene sintetizzato dopo che il complesso è formato. Quindi il distacco delle due subunità ribosomali serve a far entrare mRNA. La differenza tra Met-tRNA portato da IF2 e altri è che lui si deve legare quando ribosoma è aperto mentre gli altri quando ribosoma è chiuso. Entrano in gioco dei fattori di allungamento. EF-Tu è instabile alla temperatura e lega AA- tRNA e GTP (simile a IF2). Quando EF-Tu si lega inserisce AA-tRNA che porta nel sito A. Il complesso GTP + AA-tRNA si lega al ribosoma, cede AA-tRNA al ribosoma, idrolizzando GTP e rendendo necessaria la rigenerazione del complesso GTP + EF-Tu per far si che si leghi AA successivo. Ogni volta che allunghiamo la catena consumiamo un legame ad alta energia sempre sotto forma di GTP. Non direttamente nella sintesi ma nella rigenerazione del fattore di allungamento che deve caricare AA-tRNA. A questo punto si può formare il legame peptidico e la catena nascente viene legata sull’AA nuovo. A questo punto deve esserci la traslocazione dell’AA dal sito A al sito P con consumo di energia, il ribosoma si sposta a destra del codone e quello che succede è che il peptide nascente legato al sito A si sposta sul sito P, il tRNA scaricato dal sito P va nel sito E e si libera il sito A per il nuovo AA. Tutto questo avviene grazie a EF-G che interagisce con il ribosoma e catalizza, fornisce energia per lo spostamento del ribosoma di una tripletta e la conseguente traslocazione del peptidil-tRNA grazie ad un’altra molecola di GTP consumata per spostare appunto il ribosoma. L’azione di controllo è fatta sulla terza base, se c’è qualcosa di sbagliato quindi se non c’è corrispondenza tra codone e anticodone si ha il rilascio di tRNA. Per avere la rigenerazione dell’EF-Tu legato al GP deve interagire con EF-TS perchè EF- Tu può legare GTP solo in seguito al legame con EF-TS. Quindi nel momento in cui si lega a GTP si ha il rilascio di EF-TS. La formazione del legame peptidico è una reazione di peptidil transferasi. La rottura del legame tra C e O e la formazione del vero e proprio legame peptidico, quello tra C e N, tra AA del sito A e il peptide del sito P. EF-G è importante per traslocazione con consumo di GTP. EF-G è uguale a EF-Tu. Per allungare di una sola unità ho consumato 2 molecole di GTP. Terminazione dove quello che succede è che ci sono dei fattori di rilascio ognuno dei quali è specifico per alcuni codoni di stop. RF1 riconosce UAA e UAG mentre RF2 riconosce UAA e UGA. Si lega un fattore di rilascio o 1 o 2 a seconda del codone che in seguito all’interazione con un terzo fattore di rilascio che è legato al GDP che forma un complesso terminale che causa il distacco del peptide. Lo scambio GTP —> GDP avviene quando bisogna rilasciare RF 1 o 2 cosa che avviene in seguito allo scambio tra GTP e GDP sull’RF3. La formazione del complesso non necessità dell’idrolisi di GDP ma ciò che necessita dell’idrolisi di GDP Scambio dei nucleotidi serve per provocare il rilascio di RF 1 o 2 dal sito A del ribosoma, quindi con altro consumo di GTP. RF3 non si lega al sito amminoacidico ma se ne va dopo avere di nuovo idrolizzato GTP a GDP e pronto per rincominciare da un’altra parte. Interviene un altro fattore che è RRF che centra con la dissociazione delle due subunità del ribosoma perché è una sorta di dissociazione di emergenza provocata dall’interazione di RRF con un fattore di allungamento. Sullo che succede è che per provocare la dissociazione e il conseguente legame die complessi di inizio è necessario questo scambio tra GDP e GTP. A questo punto il ribosoma è pronto per rincominciare. Per ogni AA che devo inserire in una proteina devo consumare 4 legami ad alta energia. Molti antibiotici agiscono sulla sintesi proteica. di 90 91 Antibiotici agiscono per definizione su procarioti. Il bersaglio preferito dei batteri è la sintesi proteica. I batteri si scambiano materiale genetico sia verticalmente che orizzontalmente e questo provoca la resistenza agli antibiotici. La resistenza dei batteri agli antibiotici sta diventando un problema. Poliribosomi si legano a diversi punti di inizio. RNA vengono rimaneggiati post trascrizionalmente e la stessa cosa succede anche alle proteine. Negli eucarioti la sintesi proteica avviene nel citosol ma non tutte le proteine stanno nel citosol e quindi bisogna indicare dove devono andare le proteine. Ci sono dunque le sequenze segnale che indicano alla cellula il target verso dove deve andare la proteina. Sequenze segnale per esportazione —> secrezione della proteina fuori dalla cellula stessa. La sequenza segnale viene tagliata da una specifica peptidasi in quanto non serve nella proteina finale ma solo per indicare dove deve andare. di 91 91