Meccanismo di replicazione del DNA e trascrizione dell'RNA - Prof. Gamberi, Appunti di Biologia

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Corso di Laurea in Biotecnologie BIOLOGIA GENERALE Elementi di Genetica Russo Leonardo A.A. 2022/23 G Enhancer……………………………………………………………………………………………………………………………..104 Silencer……………………………………………………………………………………………………………………………….104 Gli elementi di risposta sul DNA coordinano l’espressione di geni non adiacenti…………………………….104 Controllo post-trascrizionale…………………………………………………………………………………………………………..106 Controllo traduzionale…………………………………………………………………………………………………………………….107 MicroRNA…………………………………………………………………………………………………………………………….108 siRNA……………………………………………………………………………………………………………………………………108 Ribointerruttori…………………………………………………………………………………………………………………..109 Controllo post-traduzionali……………………………………………………………………………………………………………..110 DIVISIONE CELLULARE – SCISSIONE BINARIA E CICLO MITOTICO………………………………………………………111 Divisione cellulare procariota………………………………………………………………………………………………………….111 Mitosi……………………………………………………………………………………………………………………………………………..111 Interfase……………………………………………………………………………………………………………………………..112 Ciclo cellulare mitotico………………………………………………………………………………………………………..113 Fase M – Profase…………………………………………..…………………………………………………………114 Fase M – Prometafase………………………………………………………………………………………………115 Fase M – Metafase……………………………………………………………………………………………….….116 Fase M – Anafase……………………………………………………………………………………………………..116 Assemblaggio del fuso e attacco dei cromosomi…………………………………………..117 Allineamento e separazione dei cromosomi…………………………………………………117 Proteine motrici e movimenti cromosomici………………………………………………….119 Telofase e citodieresi……………………………………………………………………………………………….120 Citocinesi nelle cellule animali……………………………………………………………………..120 Citocinesi nelle cellule vegetali…………………………………………………………………….121 Evoluzione della mitosi……………………………………………………………………………………………………….121 DIVISIONE CELLLULARE – REGOLAZIONE DEL CICLO MITOTICO…………………………………………………………122 Punti chiave di transizione……………………………………………………………………………………………………………..122 Transizione G1-S…………………………………………………………………………………………………………………122 Transizione G2-M……………………………………………………………………………………………………………….123 Transizione Metafase-Anafase……………………………………………………………………………………………123 Complessi CdK-ciclina…………………………………………………………………………………………………………………….123 Fosforilazione delle CdK…………………………………………………………………………………………………………………124 APC/C…………………………………………………………………………………………………………………………………………….126 Meccanismi di regolazione dei punti di transizione e fattori di trascrizione…………………………………..126 G1-S……………………………………………………………………………………………………………………………………126 Danni al DNA: p53………………………………………………………………………………………………………………………….127 DIVISIONE CELLULARE – MEIOSI E VARIABILITÀ GENETICA……………………………………………………………….128 Processo meiotico………………………………………………………………………………………………………………………….130 Profase I……………………………………………………………………………………………………………………………..131 Metafase I…………………………………………………………………………………………………………………………..132 Anafase I……………………………………………………………………………………………………………………………..133 Telofase I e citocinesi………………………………………………………………………………………………………….134 Meiosi II………………………………………………………………………………………………………………………………134 Confronto tra mitosi e meiosi…………………………………………………………………………………………………………135 Variabilità genetica: segregazione e assortimento degli alleli………………………………………………………….136 Principi di genetica mendeliana………………………………………………………………………………………………………136 Crossing-over……………………………………………………………………………………………………………………………………140 GAMETOGENESI E CICLO VITALE DELL’UOMO………………………………………………………………………………………….141 Gametogenesi maschile: spermatogenesi…………………………………………………………………………………………141 Spermioistogenesi………………………………………………………………………………………………………………….144 Fase del Golgi……………………………………………………………………………………………………………..144 Fase del cappuccio…………………………………………………………………………………………..………….144 Fase dell’acrosoma………………………………………………………………………………………………………144 Fase di maturazione…………………………………………………………………………………………………….145 Regolazione ormonale dell’attività riproduttiva maschile………………………………………………………..146 Gametogenesi femminili: oogenesi…………………………………………………………………………………………………….147 Ciclo ovarico…………………………………………………………………………………………………………………………….149 Regolazione ormonale del ciclo riproduttivo femminile…………………………………………………………..150 Fase pre-ovulatoria………………………………………………………………………………………………………150 Fase post-ovulatoria…………………………………………………………………………………………………….151 Fecondazione……………………………………………………………………………………………………………………………………..152 Localizzazione delle cellule staminali e differenziamento cellulare……………………………………………………..155 MEIOSI E MUTAZIONI GENOMICHE…………………………………………………………………………………………………………….156 Trisomia 21 – Sindrome di Down………………………………………………………………………………………………………..157 Trisomia 18 – Sindrome di Edwards…………………………………………………………………………………………………….157 Trisomia 13 – Sindrome di Patau……………………………………………………………………………………………………….157 Trisomia XXY – Sindrome di Klinefelter………………………………………………………………………………………………..158 Trisomia XYY e XXX………………………………………………………………………………………………………………………………158 Monosomia X – Sindrome di Turner……………………………………………………………………………………………………158 VIRUS……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………159 Scoperta dei virus……………………………………………………………………………………………………………………………….159 Componenti strutturali dei virus………………………………………………………………………………………………………….160 Caratteristiche del genoma virale…………………………………………………………………………………………….161 Spettro d’ospite……………………………………………………………………………………………………………………….161 Riconoscimento della cellula ospite…………………………………………………………………………………………161 Regolazione dei batteriofagi……………………………………………………………………………………………………………….162 Ciclo litico……………………………………………………………………………………………………………………………….162 Ciclo lisogenico……………………………………………………………………………………………………………………….162 Infezioni virali animali……………………………………………………………………………………………………………………….163 Replicazione virus animale……………………………………………………………………………………………………..163 Virus animale a dsDNA……………………………………………………………………………………………………………164 Virus animale a ssRNA(+)…………………………………………………………………………………………………………164 Virus animale a ssRNA(-)………………………………………………………………………………………………………….165 Retrovirus……………………………………………………………………………………………………………………………….165 BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 3 • Filtrarono ed omogeneizzarono il tutto per poi andare a distruggere selettivamente una singola tipologia di macromolecola. Una volta ottenute le varie miscele aggiunsero ai campioni delle colture di batteri di ceppo R. Quello che osservarono era che solo nelle miscele dove il DNA era rimasto intatto i batteri di ceppo R era stati geneticamente modificati in batteri del ceppo S. Esperimento di Alfred Hershey e Martha Chase • I batteriofagi sono virus che infettano i batteri. Alcuni dei fagi meglio studiati sono il T2, il T4 e il T6, che infettano il batterio Escherichia coli. I tre fagi T pari hanno strutture simili. • La testa del fago è rappresentata da una capsula proteica, modellata come un icosaedro, cavo con all’interno il materiale genetico (DNA nella maggior parte dei casi). • La testa è attaccata a una coda proteica utilizzata per ancorarsi a un batterio e iniettarvi il DNA. Quando i fagi sono mescolati con cellule batteriche che crescono in un terreno liquido e poi la miscela viene distribuita su un terreno solido all’interno di una piastra Petri, si producono macchie chiare chiamate placche. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 4 • Le macchie chiare appaiono nello strato di batteri sulla piastra perché le cellule batteriche in quella posizione sono state uccise dalla replicazione della popolazione fagica. Il processo inizia con l’adsorbimento di una particella fagica alla parete della cellula batterica e inietta il proprio DNA al suo interno. • Quando il DNA è entrato nella cellula batterica, l’informazione genetica del fago e le proteine del capside si auto assemblano a costruire centinaia di nuove particelle fagiche. • Tra i fagi che infettano E.coli, uno dei più studiati è il batteriofago T2. Nel 1952, Alfred Hershey e Martha Chase allestirono un esperimento per stabilire quale tipo di molecola trasporta l’informazione genetica che innesca la riproduzione di nuove particelle fagiche. • Esistevano solo due possibilità dato che il T2 è costituito da DNA e proteine. Per distinguere queste due alternative i due scienziati di avvalsero del fatto che le proteine del virus T2, come la maggior parte delle proteine, contengono zolfo (nella metionina e la cisteina) ma non il fosforo, mentre il DNA virale contiene fosforo ma non zolfo. • Quindi, Hershey e Chase prepararono due aliquote di particelle virali T2 con differenti tipi di marcatura radioattiva. In un’aliquota, le proteine fagiche erano marcate con l’isotopo radioattivo 35S; nell’altra aliquota, il DNA fagico era marcato con l’isotopo radioattivo 32P. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 5 • Usando gli isotopi radioattivi in questo modo, Hershey e Chase furono in grado di seguire il destino delle proteine e del DNA durante il processo di infezione. Dapprima essi mescolarono i fagi radioattivi con le cellule batteriche intatte, permettendo l’adesione delle particelle fagiche alla superficie dei batteri e l’iniezione del loro materiale genetico all’interno della cellula. • A questo punto, Hershey e Chase scoprirono che era possibile rimuovere facilmente, mediante agitazione della sospensione in un normale frullatore, gli involucri proteici vuoti dei fagi e recuperare mediante centrifugazione le cellule batteriche. • Quindi misurarono la radioattività nel surnatante liquido e nel sedimento di cellule batteriche sul fondo della provetta. I risultati ottenuti mostrarono che la maggior parte (65%) del 32P rimaneva nelle cellule batteriche, mentre la quasi totalità dello zolfo (80%) era rilasciato nel mezzo circostante. • Poiché il 32P marcava il DNA virale, mentre lo 35S marcava le proteine virali, conclusero che il DNA, ma non le proteine, era stato iniettato nelle cellule batteriche e che quindi il DNA doveva rappresentare il materiale genetico di T2. Composizione chimica del DNA • Anche se i risultati di Avery avevano avuto un’accoglienza abbastanza fredda, essi influenzarono significativamente il lavoro di altri scienziati, tra cui Erwin Chargaff, il quale era interessato a studiare la composizione in basi del DNA. • Fra il 1944 e il 1952, Chargaff utilizzò metodi cromatografici per separare e quantificare le quantità relative delle quattro basi: adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosina (C). Per prima cosa lo scienziato dimostrò che il DNA isolato da cellule diverse di una data specie mostra la stessa percentuale di ognuna delle quattro basi, e questa percentuale non varia in individui e tessuti diversi, o al variare dell’età, dello stato nutrizionale o dell’ambiente. • Inoltre, Chargaff osservò che la composizione in basi del DNA varia da specie a specie. Analizzando i suoi risultati è possibile dedurre che il DNA estratto da specie strettamente correlate mostra una composizione in basi molto simile (ed è ciò che ci si aspetta per una molecola che immagazzina l’informazione genetica). • La più importante osservazione fatta da Chargaff fu la scoperta che, per ogni campione di DNA esaminato, il numero delle adenine è uguale al numero delle timine e il numero delle guanine e lo stesso delle citosine. Ciò significa che il numero delle purine è uguale a quello delle pirimidine (A+G=C+T). Il significato di questa equivalenza rimase sconosciuta fino a quando, nel 1953, fu proposto da Watson e Crick il modello della doppia elica del DNA. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 8 • I legami a idrogeno che stabilizzano la doppia elica sono massimizzati solo quando si forma fra la base adenina di un filamento e la base timina dell’altro, o la base guanina da una parte con la base citosina dell’altra. Ciò significa che la sequenza delle basi di un filamento determina quella del filamento opposto; i due filamenti della doppia elica sono quindi definiti complementari. • Nella figura a pagina 138 viene mostrato come i legami fosfodiesterici che uniscono il carbonio 5’ di un nucleotide al carbonio 3’ del nucleotide adiacente, hanno orientamento opposto nei due filamenti di DNA. Pertanto, un filamento avrà un’estremità 3’ libera in basso e un’estremità 5’ libera in alto, l’opposto si presenterà nel filamento complementare. Denaturazione del DNA: oltre ad alterare la conformazione del DNA, le cellule possono anche controllare la separazione di ciascun filamento. Anche in laboratorio, i due filamenti di una molecola di DNA possono essere facilmente separati l’uno con l’altro aumentando la temperatura o il pH, poiché sono tenuti uniti da legami deboli. Quando i due filamenti del DNA sono separati sperimentalmente, il fenomeno è conosciuto come denaturazione del DNA; il processo inverso, che ripristina la doppia elica partendo da due filamenti separati, è definito rinaturazione del DNA. Quando la denaturazione viene indotta aumentando lentamente la temperatura, il DNA inizialmente mantiene la sua struttura a doppia elica, o nativa. Aumentando ulteriormente la temperatura, molta parte del DNA si separa nei singoli filamenti fino a che l’intero spezzone di DNA non si fonde. Il processo di fusione è facile da monitorare in quanto le strutture di DNA a doppio filamento e a singolo filamento differiscono nelle loro proprietà di assorbimento della luce. La temperatura alla quale si ottiene il 50% dell’aumento dell’assorbanza è in genere definita temperatura di fusione del DNA (Tm), o punto medio di denaturazione termica. Un fattore che influenza questa temperatura è la percentuale di DNA che contiene le basi guanina e citosina. Le coppie di basi GC hanno tre legami ad idrogeno e sono più resistenti alla separazione. I due filamenti si avvolgono tra loro così da creare un solco maggiore e un solco minore. Le proteine di regolazione spesso si legano al solco maggiore e riconoscono specifiche sequenze di nucleotidi senza la necessità di svolgere tutta l’elica. Un’altra caratteristica importante è l’orientamento antiparallelo dei due filamenti di DNA. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 9 Organizzazione del DNA • La quantità di DNA che una cellula deve contenere è altissima, anche per organismi con genomi di modeste dimensioni. Le cellule eucariote, a differenza delle procariote, si trovano di fronte ad un problema maggiore dato che il loro DNA è notevolmente più grande. I procarioti, cromosomi e plasmidi batterici: in passato si pensava che il genoma dei procarioti fosse costituito da una molecola di DNA “nudo” privo cioè di qualsiasi organizzazione complessa e con solo un’infinitesima quantità di proteine associate. Oggi, i genetisti che studiano i batteri si riferiscono alla struttura che contiene il principale genoma batterico come cromosoma batterico. I batteri possono possedere uno o più cromosomi, la disposizione più comune è una singola molecola di DNA circolare a doppio filamento legata a piccole quantità di proteine e localizzata in una regione speciale della cellula chiamata nucleoide. Il DNA batterico posizionato in questa regione costituisce una massa filiforme di fibre impacchettate in modo da mantenere un confine netto fra il nucleoide e il resto della cellula. Questo DNA è superavvolto48 e ripiegato in una serie di anse, con una lunghezza media di 20000 bp (paia di basi). In aggiunta al suo cromosoma, una cellula batterica può contenere uno o più plasmidi. I plasmidi sono molecole di DNA circolare relativamente piccole che contengono geni sia per la loro replicazione autonoma sia, spesso, per uno o più funzioni cellulari (normalmente non essenziali). 48 Si pensa che le anse siano tenute in posizione da RNA e molecole proteiche. Evidenze del ruolo strutturale dell’RNA all’interno del cromosoma batterico derivano da studi che dimostrano come il trattamento con la ribonucleasi (un enzima che degrada l’RNA), rilasci alcune forme di anse, benché non riesca ad alterare tutto il superavvolgimento. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 10 Quasi tutti i plasmidi sono superavvolti, il che induce una struttura compatta e condensata. Benché i plasmidi si replichino in modo autonomo, la loro replicazione è di solito sufficientemente in sincronia con quella del cromosoma batterico, il che assicura, da una generazione all’altra, il passaggio di un numero approssimativamente compatibile di plasmidi. In generale il DNA si può interconvertire fra lo stato di superavvolto e lo stato rilassato. Se si fornisce alla struttura un avvolgimento destrorso aggiuntivo, la struttura diventa superavvolta e origina ciò che viene definito uno stato di superavvolgimento positivo. Al contrario, se si imprime un avvolgimento nella direzione opposta rispetto a quella in cui i due filamenti sono avvolti, si origina uno stato di superavvolgimento negativo. Gli eucarioti, la cromatina e i cromosomi: ogni cromosoma eucariota è costituito da una singola molecola di DNA lineare di enorme lunghezza. Un’ulteriore differenza che intercorre con l’avvolgimento del DNA batterico è l’associazione del DNA eucariota con un maggior numero di proteine. Quando è associato a queste ultime, il DNA è conosciuto come cromatina, che forma fibre con un diametro che va da 10 a 30 nm. Le proteine che svolgono il ruolo più importante nella struttura della cromatina sono gli istoni, un gruppo di proteine relativamente piccole, il cui elevato contenuto di amminoacidi basici come arginina e lisina, dà loro una forte carica positiva. L’interazione tra istoni e DNA (carico negativamente), è quindi stabilizzata da legami ionici. Nella maggior parte delle cellule, la cromatina contiene una massa circa uguale di istoni e DNA. Gli istoni sono suddivisi in cinque classi maggiori, identificate come H1, H2A, H2B, H3 e H4. La cromatina contiene un’uguale quantità dei quattro istoni (H2A, H2B, H3 e H4) ma una quantità dimezzata dell’H1. In aggiunta agli istoni, la cromatina contiene anche un gruppo di proteine non istoniche che svolgono un’ampia gamma di ruoli, che includono quelle strutturali, enzimatici e relatori. Il DNA contenuto nel nucleo, se completamente disteso può misurare un metro e più, mentre il diametro del nucleo va da 5 a 10 μm. Negli anni ’60 del XX secolo, quando gli studi di diffrazione ai raggi X effettuati da Maurice Wilkins rivelarono che le fibre purificate di cromatina mostravano una subunità strutturale ripetuta (non osservata nel DNA o negli istoni singolarmente), si arrivò alla conclusione che gli istoni imponevano al DNA un’organizzazione strutturale ripetuta. In seguito tramite degli esperimenti si notò come il filamento di DNA fosse avvolto alle proteine istoniche a formare una “collana di perle”. Si definì nucleosoma l’insieme dell’istone e del segmento di DNA ad esso avvolto. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 13 La maggior parte dell’eterocromatina che abbiamo trattato finora può essere convertita in eucromatina e viceversa. Tale eterocromatina è conosciuta come eterocromatina facoltativa. Quest’ultima varia con le particolari attività che la cellula sta svolgendo, e sembra quindi rappresentare regioni cromosomiche che sono state specificamente rese inattive in una determinata cellula. La formazione dell’eterocromatina facoltativa svolge un ruolo importante nell’inattivazione di interi blocchi di geni durante lo sviluppo embrionale, incluso l’inattivazione di un cromosoma X nelle femmine di mammifero. Altra eterocromatina, tuttavia, è permanentemente compattata e svolge una funzione strutturale all’interno dei cromosomi. Tale eterocromatina è nota come eterocromatina costitutiva. Due importanti tipi di questa categoria sono i centromeri e i telomeri. Centromeri: al microscopio i centromeri appaiono come strozzature dei cromosomi condensati durante la mitosi. Il DNA centromerico è legato a un complesso di proteine e svolge due importanti funzioni. In primo luogo, prima della separazione dei cromatidi fratelli, i centromeri li mantengono coesi. In secondo luogo, durante la metafase, i centromeri sono i siti di assemblaggio dei cinetocori, che sono cruciali per l’ancoraggio dei cromosomi ai microtubuli del fuso mitotico o meiotico. I centromeri sono caratterizzati da un’elevata quantità di sequenze ripetute. Telomeri: i telomeri sono posizionati all’estremità dei cromosomi e contengono sequenze di DNA altamente ripetute (la loro azione è di protezione nei confronti della degradazione delle estremità cromosomiche). I telomeri contengono da 250 a 1500 copie della sequenza TTAGGG. Tutti i vertebrati studiati finora posseggono la stessa identica sequenza. Altri eucarioti possiedono sequenze simili, tra cui gli eucarioti unicellulari. Oltre al loro ruolo nella replicazione, i telomeri reclutano proteine che sembrano essere coinvolte nella protezione strutturale delle estremità dei cromosomi. I cromosomi mitotici visualizzati con il microscopio ottico possono essere distinti semplicemente in base alle loro dimensioni e alla posizione del centromero. Negli anni ’60 e ’70 del 1900, sono state sviluppate tecniche di colorazione dei cromosomi mitotici per tutta la loro lunghezza utilizzando coloranti. La colorazione che ne deriva produce una serie di bande cromosomiche chiare e scure, dette bande G. Il corredo cromosomico di un individuo è il suo cariotipo. GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 14 Sequenze di DNA ripetute: la presenza di sequenze ripetute nell’eterocromatina costitutiva, come centromeri e telomeri, secondo alcuni scienziati, contribuiscono alla lunghezza del DNA impacchettato nei loro cromosomi. Utilizzando particolari sistemi di sequenziamento, i ricercatori sono stati in grado di derivare le sequenze fondamentali di diversi tipi di sequenze ripetute e di classificarle in due classi principali: DNA ripetuto in tandem: una delle principali categorie di DNA ripetuto è nota come DNA ripetuto in tandem, poiché le copie multiple sono organizzate l’una dietro l’altra in fila. Rientrano in questa categoria telomeri e centromeri. In un tipico genoma di mammifero, il DNA ripetuto in tandem ammonta a circa il 10/15 % del genoma. Il DNA altamente ripetuto in tandem è stato inizialmente definito DNA satellite, perché in molti casi la sua particolare composizione in basi causa, utilizzando la tecnica di centrifugazione con gradiente di densità, la sua comparsa come banda “satellite” separata dal resto del DNA genomico. DNA ripetuto intersperso: la seconda classe è rappresentata dal DNA ripetuto intersperso. Piuttosto che essere organizzato in blocchi di ripetizione in tandem, le unità di ripetizione di questa classe sono distribuite singolarmente all’interno di tutto il genoma. Il DNA ripetuto intersperso costituisce fino al 25/50% della maggior parte dei genomi di mammifero. Una grande percentuale delle sequenze ripetute intersperse è costituita da elementi trasponibili (trasposoni), sequenze di DNA in grado di muoversi all’interno dei genomi e di lasciare copie di sé stesse nei punti in cui si fermano. DNA Extranucleare: non tutto il DNA delle cellule eucariote è contenuto esclusivamente nel nucleo. Benché il DNA nucleare rappresenti la maggior parte dell’informazione genetica cellulare, anche i mitocondri e i cloroplasti contengono il loro DNA, insieme ai meccanismi necessari per replicare, trascrivere e tradurre le informazioni in esso contenute. Sono in genere circolari e privi di istoni, in altri termini, assomigliano ai genomi dei procarioti, ulteriore prova della teoria endosimbiotinca di questi organuli. I genomi di mitocondri e cloroplasti tendono a essere di dimensioni relativamente piccole, compatibili alle dimensioni di un genoma virale. Vengono definiti organuli semi-autonomi perché il DNA in essi contenuto è in grado di codificare per alcune delle loro proteine, ma dipendono dal genoma nucleare per la codifica della maggior parte delle rimanenti. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 15 Nonostante tutto, questi genomi rappresentano un contributo genetico vitale; infatti, tra le molecole codificate dall’DNA mitocondriale sono inclusi gli RNA ribosomiali dei mitocondri, tutti gli RNA transfer necessari per la sintesi proteica mitocondriale e 13 delle subunità polipeptidiche del sistema di trasporto degli elettroni. Queste includono subunità del complesso I, III e IV. Il mitocondrio contiene normalmente 16500 bp di DNA mentre i cloroplasti arrivano a circa 120000 bp. In aggiunta agli RNA ribosomiali e di trasferimento, e alle proteine coinvolte nella sintesi proteica, il genoma dei cloroplasti codifica anche per un numero di proteine specificamente coinvolte nella fotosintesi. Queste includono parecchi componenti polipeptidici del fotosistema I e II e una delle due subunità del rubisco. Territori Cromosomici: al di fuori della divisione cellulare, le fibre di cromatina tendono a essere molto estese e disperse, a livello di tutto il nucleo. La cromatina di ogni cromosoma possiede una sua propria localizzazione definita. Attraverso una serie di esperimenti si è visto che le fibre di cromatina corrispondenti ai singoli cromosomi occupano compartimenti distinti definiti territori cromosomici. Replicazione del DNA • I meccanismi alla base della replicazione del DNA dipendono in modo cruciale dalla struttura a doppia elica del DNA. Gli stessi Watson e Crick, dopo aver pubblicato l’articolo sulla struttura del DNA, ne pubblicarono uno sulla sua possibile replicazione. • Il modello proposto da Watson e Crick suggeriva che uno dei due filamenti di ciascuna molecola di DNA neoformata è un filamento parentale, mentre l’altro è sintetizzato ex novo. Questo modello è detto semi-conservativo. • Sebbene la struttura di Watson e Crick suggerisca questo modello semiconservativo, sono concepibili almeno due altri modelli: il modello conservativo e il modello dispersivo. Nel primo, la doppia elica parentale di DNA rimane intatta e viene prodotta una seconda copia completamente nuova. Nel secondo, ciascun filamento di entrambe le molecole figlie contiene una miscela di segmenti vecchi e neosintetizzati. Esperimento di Meselson e Stahl • A cinque anni dalla pubblicazione di Watson e Crick, Meselson e Stahl realizzarono un esperimento che dimostrò la correttezza del modello di replicazione semiconservativa del DNA. Per la loro ricerca utilizzarono due isotopi dell’azoto, 15N e 14N, per distinguere i filamenti di DNA neosintetizzati dai vecchi. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 18 Meccanismo di Replicazione Semiconservativa • Sebbene la replicazione semiconservativa (basata sull’appaiamento delle basi complementari), sembri semplice e lineare, il processo è altamente regolato e richiede l’impiego di un complesso molecolare costituito da proteine ed enzimi. • Molti degli aspetti essenziali della replicazione sono universali, tuttavia esistono numerose differenze tra procarioti ed eucarioti a causa della diversa organizzazione del DNA in queste cellule. Infatti, nella maggior parte delle cellule batteriche, come per esempio E. coli, il DNA si trova come un’unica molecola a doppia elica circolare, mentre ogni cromosoma eucariotico non duplicato è costituito da una singola molecola a doppia elica lineare, associata a proteine. • Il processo di replicazione del DNA richiede un grande numero di proteine con funzioni differenti, molte delle quali sono organizzate in complessi multimolecolari. • La replicazione del DNA inizia a livello di siti specifici sulla molecola di DNA, detti origini di replicazione (zone ORI), dove piccoli segmenti della doppia elica si svolgono. Le DNA elicasi, enzimi che destabilizzano l’elica, si legano al DNA in corrispondenza delle zone ORI e rompono i legami ad idrogeno50, separando in tal modo i due filamenti. I due filamenti di DNA si replicano contemporaneamente a livello della giunzione tra i filamenti separati, che è una struttura a forma di Y detta forca di replicazione. L’elicasi si muove lungo l’elica aprendo la doppia elica. • • Una volta che i due filamenti sono stati separati dall’elicasi, le proteine che legano il DNA a singolo filamento (SSB), si legano ai singoli filamenti e li stabilizzano, evitando in tal modo che si riformi la doppia elica durante la duplicazione. • Watson e Crick affermano che nel loro modello a doppia elica i due filamenti di DNA sono avvolti come fili di una corda e quindi, se si tenta di separare i due fili, la corda potrebbe anch’essa ruotare oppure avvolgersi in spire più strette. • Possiamo pensare che eventi simili accadano anche quando i due filamenti complementari del DNA si separano per replicazione. Nel momento in cui i filamenti di DNA si separano per la replicazione, in un’altra regione della molecola di DNA si genera un superavvolgimento (torsione eccessiva). 50 Le zone ORI sono principalmente in corrispondenza dei legami A=T dato che sono presenti meno legami ad idrogeno e l’elicasi (funzionando ad ATP) consuma meno energia. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 19 • Speciali enzimi, chiamati topoisomerasi, operano dei tagli nel DNA e poi saldano i filamenti in modo che siano liberi da superavvolgimenti e da nodi che impedirebbero la replicazione. Esistono due modalità con cui le topoisomerasi riducono i superavvolgimenti: 1. TOPOISOMERASI I: producono una rottura temporanea nello scheletro polinucleotidico di un singolo filamenti di DNA, fanno passare quel filamento attraverso la regione eccessivamente avvolta e infine saldano la rottura. 2. TOPOISOMERASI II: tagliano entrambi i filamenti di DNA, fanno passare una parte dell’elica tra le estremità recise e risaldano la rottura. • Indipendentemente dalle loro modalità di azione, le topoisomerasi conferiscono al DNA in replicazione una configurazione rilassata. • Gli enzimi che catalizzano il legame fra i vari nucleotidi sono chiamati DNA polimerasi; essi sono in grado di aggiungere nucleotidi solamente al terminale 3’ di una catena polinucleotidica in corso di sintesi, che deve essere perfettamente appaiata al filamento che viene copiato. • Come substrato per le reazioni di polimerizzazione vengono utilizzati nucleotidi trifosfato. Quando i nucleotidi vengono legati assieme, due gruppi fosfato vengono eliminati; queste reazioni sono fortemente esoergoniche e quindi non richiedono ulteriore energia. • Poiché la nuova catena polinucleotidica si allunga attraverso il legame tra il gruppo fosfato in posizione 5’ dello zucchero del nucleotide e il gruppo ossidrilico in posizione 3’ dello zucchero presente all’estremità della catena, il filamento di DNA cresce sempre in direzione 5’→3’ (rispetto al filamento nuovo). • Come già detto, le DNA polimerasi possono aggiungere nucleotidi solamente all’estremità 3’ di una catena polinucleotidica preesistente. Per iniziare la replicazione una volta aperta la bolla, è necessario un punto di innesco che disponga l’estremità 3’-OH libera. Fig. Topoisomerasi I Fig. Topoisomerasi II BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 20 • Il punto di innesco è dato da un piccolo tratto di RNA (detto primer) che è dato da una sequenza di 5-14 nucleotidi. L’acido ribonucleico è un polimero di acido nucleico formato da subunità nucleotidiche che possono appaiarsi per complementarità col DNA stampo a singolo filamento. • Il primer di RNA è sintetizzato a opera di un enzima che prende il nome di DNA primasi, capace di iniziare un nuovo filamento di RNA su un piccolo pezzo di filamento di DNA. Dopo pochi nucleotidi aggiunti, la primasi viene sostituita dalla DNA polimerasi, che a questo punto può aggiungere le subunità all’estremità 3’ del primer di RNA. • La sintesi del DNA può procedere solamente in direzione 5’→3’, il filamento che viene copiato deve perciò essere letto in direzione 3’→5’. Si potrebbe pensare che un filamento venga copiato partendo da un’estremità della doppia elica e l’altro partendo dall’estremità opposta. Alcuni virus replicano il loro DNA in questo modo, ma un tale sistema di replicazione risulta essere poco efficiente per le lunghissime molecole di DNA che costituiscono i cromosomi eucariotici. • La replicazione inizia a livello delle ORI, ed entrambi i filamenti vengono replicati contemporaneamente. La posizione della forza di replicazione cambia costantemente al procedere della replicazione. Due molecole identiche di DNA polimerasi sono responsabili della replicazione. • Una di queste aggiunge nucleotidi all’estremità 3’ del nuovo filamento che cresce sempre verso la forca replicativa. Poiché questo filamento è sintetizzato in maniera continua e senza interruzioni, esso viene chiamato filamento guida. • Una seconda molecola di DNA polimerasi aggiunge nucleotidi all’estremità 3’ dell’altro filamento di nuova sintesi, chiamato filamento in ritardo, il quale si allunga sempre nella direzione opposta all’avanzamento della forcella di replicazione. • Possono essere sintetizzati soltanto dei corti frammenti perché, se la DNA polimerasi aggiungesse continuamente nucleotidi all’estremità 3’ del filamento, dovrebbe allontanarsi di molto dalla forca di replicazione. Questi frammenti di 100-2000 nucleotidi sono chiamati frammenti di Okazaki. • La DNA primasi catalizza periodicamente la sintesi di un nuovo primer di RNA sul filamento in ritardo man mano che il suo filamento stampo viene svolto dall’elicasi. La sintesi di ogni frammento di Okazaki viene iniziata da un primer di RNA e procede verso l’estremità 5’ del filamento sintetizzato precedentemente dalla DNA polimerasi. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 23 • Un ulteriore sito presente nella DNA polimerasi III è quello utilizzato per l’attività esonucleasica (E). Data la complessità di questo modello di sintesi, ci si chiede perché non si sia evoluto un enzima capace di sintetizzare in direzione 3’→5’. Una possibile risposta è legata alla necessità di correzione degli errori durante la replicazione del DNA. Durante la replicazione, circa 1 su 100000 nucleotidi incorporati è appaiato in modo scorretto con il filamento stampo del DNA, un tale tasso di errori causerebbe più di 120000 appaiamenti scorretti ogni volta che una cellula umana replica il proprio materiale genetico. La maggior parte di questi errori viene eliminata da un meccanismo di correzione delle bozze, che utilizza la stessa DNA polimerasi III. La correzione delle bozze è possibile per il fatto che, oltre a catalizzare la sintesi del DNA, quasi tutte le DNA polimerasi III hanno anche un’attività esonucleasica 3’→5’. • Le esonucleasi sono enzimi che degradano gli acidi nucleici a partire da un’estremità. La loro azione è quindi diversa da quella delle endonucleasi, che tagliano il DNA al suo interno. L’attività esonucleasica 3’→5’ stacca singoli nucleotidi dall’estremità 3’ di un nuovo filamento nucleotidico. Questa capacità di rimuovere nucleotidi scorretti fa aumentare enormemente la fedeltà della replicazione del DNA. • Le DNA polimerasi, come la III e la I, hanno come già visto, una forma che per certi versi ricorda quella di una mano. Quando avviene un errore nella replicazione, le risultanti basi sbagliate non riescono a stabilire il corretto legame ad idrogeno. Questo provoca lo spostamento del filamento neosintetizzato dal sito attivo in cui è catalizzati la polimerizzazione in un secondo sito in cui si compie l’attività esonucleasica. NB. Se le cellule possedessero un enzima capace di sintetizzare il DNA in direzione 3’→5’, la correzione delle bozze non potrebbe funzionare, in quanto un filamento di DNA che cresce in questa direzione, avrebbe all’estremità 5’ un nucleotide trifosfato. Se l’ultimo nucleotide aggiunto all’estremità 5’ fosse sbagliato e dovesse essere rimosso, verrebbe eliminato anche il gruppo trifosfato che fornisce l’energia utilizzata dalla DNA polimerasi per aggiungere i nucleotidi al filamento crescente. NB. Oltre ad assolvere una funzione biologica all’interno delle cellule, le DNA polimerasi sono utilizzate per importati applicazioni pratiche nel campo biotecnologico. Nella tecnica conosciuta come PCR (reazione a catena della polimerasi), la DNA polimerasi è sfruttata per allungare velocemente piccoli frammenti di DNA. BIOLOGIA GENERALE Sequenza — Primo ciclo: bersaglio 2 molecole prodotte AA. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. Secondo ciclo: Terzo ciclo: 8 molecole 4 molscole prodotte dott: —____— prodotte > —— @_ 6, = e > I <@ > < II — e — > > >» > > > FIGURA 21A.2 PCR: tre cicli di amplificazione. Sono evidenziati i prodotti che consistono rella sola seguenza bersaglio. LELGIERVA Proteine importanti nella replicazione del DNA nei procarioti e negli eucarioti Proteina Tipo cellulare Attività principale e/o funzioni Proteine iniziatrici Entrambi Si legano all'origine di replicazione e iniziano lo svolgimento della doppia elica del DNA DNA polimerasi | Batteri Sintesi del DNA; esonucleasi 3' + 5' (correzione delle bozze); esonucleasi 5' + 3°; eliminazione e rimpiazzo degli primer (inneschi) di RNA necessari per la replicazione del DNA (funziona anche nel meccanismo di riparazione per escissione dei danni al DNA) DNA polimerasi Il Batteri Sintesi del DNA; esonucleasi 3' — 5' (correzione delle bozze); usata nella sintesi di entrambi ifilamenti di DNA DNA polimerasi a (alfa) £ucarioti Sintesi del DNA nucleare; forma un complesso con la primasi e inizia la sintesi di entrambi, ifilamenti di DNA a partire dall'estremità 3° dei primer di RNA di entrambi filamenti anticipato e ritardato (funziona anche nella riparazione del DNA) DNA polimerasi-y (gamma) £ucarioti Sintesi del DNA mitocondriale DNA polimerasi 5 (delta) £ucarioti Sintesi del DNA nucleare; esonudleasi 3' + 5' (correzione delle bozze); coinvolta nella sintesi di entrambi filamenti anticipato e ritardato (funziona anche nella riparazione del DNA} DNA polimerasi « (epsilon) £ucarioti Sintesi del DNA nucleare; esonucleasi 3' — 5' (correzione di bozze); si pensa sia coinvolta nella sintesi di entrambi filamenti anticipato e ritardato (funziona anche nella riparazione del DNA) Primasi Entrambi Sintesi dell'RNA; sintesi di oligonucleotidi di RNA usati come primer per la sintesi del DNA DNA elicasi Entrambi Svolge la doppia elica del DNA Pinza a scorrimento Entrambi Lega le subunità core della polimerasi e le mantiene sul DNA (PCNA negli eucarioti) Proteine leganti i singolo Entrambi Silegano al DNA a singolo filamento; stabilizzano i filamenti del DNA svolto filamento (SSBP nei batteri) in una configurazione estesa che facilita l'accesso di altre proteine DNA topoisomerasi Entrambi Esegue tagli nel DNA a filamento singolo (tipo 1) o doppio (tipo II); induce e/o elimina (tipo letipo ll) isuperawolgimenti del DNA; può fare da perno per prevenire le torsioni che precedono la forcella di replicazione del DNA; può separare i DNA circolari che restano legati alla fine della replicazione del DNA DNA girasi Batteri DNA topoisomerasi di tipo Il che fa da perno per rilassare i superavvolgimenti che precedono la forcella di replicazione in £. coli DNA ligasi Entrambi Forma legami covalenti per unire filamenti di DNA adiacenti, come i frammenti di Okazaki nel filamento ritardato e i segmenti di DNA nuovi e vecchi nel meccanismo di riparazione per escissione del DNA Telomerasi Eucarioti Usando una molecola di RNA (parte integrante dell'enzima) come stampo, sintetizza DNA estendendo i telomeri (sequenze alle estremità del DNA cromosomico) RNA endonucleasi (RNasi H), —’Eucarioti La RNasi H riconosce filamenti di RNA/DNA eli taglia; successivamente FENI digerisce I'RNA RNA esonucleasi (FEN1) pag. 24 BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 25 Replisomi • Le varie proteine coinvolte nella replicazione del DNA sono tutte strettamente associate in un grosso complesso, chiamato replisoma, che ha all’incirca le dimensioni di un ribosoma. L’attività e il movimento del replisoma sono alimentati dall’energia derivata dall’idrolisi dei nucleotidi trifosfati. • Spostandosi lungo la molecola di DNA nella direzione della forcella di replicazione, il replisoma deve riuscire a sintetizzare i due nuovi filamenti di DNA in direzioni opposte lungo lo stampo. Un elemento fondamentale del replisoma è il ripiegamento dello stampo del filamento ritardato in un’ansa. Questo modello di funzionamento del replisoma è spesso chiamato modello a trombone. • La funzione dell’ansa è quella di consentire la sintesi dei due filamenti in maniera coordinata, anche se i filamenti stampo sono orientati con polarità opposta. • Tra le caratteristiche principali del replisoma, ve ne sono due fondamentali. In primo luogo, il replisoma si basa sull’assemblaggio di un complesso proteico costituito da più unità, noto come oloenzima. • Nel caso della DNA polimerasi III batterica, l’oloenzima della polimerasi sembra includere tre subunità catalitiche che eseguono la polimerizzazione del DNA, collegate tra loro dalle proteine τ. Un’altra componente chiave è la proteina caricatore della pinza, che contiene cinque subunità. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 28 • La telomerasi è un enzima insolito perché è una proteina ma contiene anche RNA. Nel protozoo Tetrahymena, dal quale fu isolata la prima telomerasi, la componente di RNA dell’enzima contiene la sequenza 3’-AACCCC-5’, complementare alla sequenza ripetuta 5’-TTGGG-3’ presente nei telomeri del protozoo. • Questo RNA associato all’enzima serve da stampo per la formazione della sequenza ripetuta di DNA che è aggiunta alle estremità telomeriche. In molti eucarioti, l’estremità 3’ del DNA può ripiegarsi all’indietro e appaiarsi con il filamento di DNA opposto, creando un’ansa chiusa che pare proteggere l'estremità telomerica. • Negli organismi multicellulari, la telomerasi è attiva quasi esclusivamente nelle cellule germinali, da cui si originano gli oociti e gli spermatozoi, e in pochi altri tipi di cellule in attiva proliferazione (anche tumori). La presenza della telomerasi consente alle cellule germinali di dividersi indefinitamente senza che i telomeri si accorcino. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 29 • Nella maggior parte delle cellule, tuttavia, la telomerasi è inattiva. Questo pone un limite al numero di volte in cui tale cellula si può dividere, poiché a ogni divisione successiva i telomeri diventano sempre più corti. Per le cellule in coltura primaria, questo fatto limita il numero di volte in cui la cellula può dividersi, cioè per quante generazioni le cellule possono essere propagate. Questo limite, che per molte cellule corrisponde a 50/60 generazioni, è detto limite di Hayflick. • Se una cellula va incontro a numero sufficiente di divisioni, nelle cellule della discendenza i telomeri rischiano di scomparire completamente, mentre il DNA codificante rischia di essere eroso. Questo pericolo potenziale è rilevato da una via di distruzione cellulare, che viene messa in moto dall’accorciamento dei telomeri del DNA, conosciuta come apoptosi51. Mutazioni • Affinché l’informazione contenuta nel DNA sia mantenuta inalterata da una generazione all’altra, non è sufficiente che la replicazione del DNA sia accurata, ma è anche necessario che esista la possibilità di riparare i danni che possono insorgere spontaneamente o essere indotti da fattori ambientali. • Una certa variabilità del DNA però è necessaria dato che le modifiche nella sequenza di basi del DNA, le mutazioni, costituiscono la variabilità genetica e cioè la materia prima dell’evoluzione. Il tasso netto con cui gli organismi accumulano mutazioni è piuttosto basso: secondo alcune stime, un gene accumulano (in media), una sola mutazione ogni 200000 anni52. Mutazioni Spontanee Le mutazioni possono avvenire spontaneamente, senza essere indotte dall’esposizione delle cellule ad agenti chimici, fisici o biologici. Gli errori commessi dalla DNA polimerasi vengono in genere riparati attraverso l’attività intrinseca di correzione delle bozze dell’enzima. Tali mutazioni spontanee si generano in uno di tre modi principali: Disappaiamento spontaneo delle basi con formazione transitoria di tautomeri: i tautomeri sono rare strutture alternative di risonanza delle basi azotate che li porta a non appaiarsi in maniera standard con la base complementare. 51 Si ritiene che il processo di morte cellulare indotto dall’accorciamento dei telomeri sia uno dei fattori che causano nell’uomo alcune patologie degenerative associate all’invecchiamento. 52 In realtà il tasso è ancora più basso dato che parte di queste modifiche vengono immediatamente riparate e non trasmesse alla generazione successiva. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 30 Slittamento durante la replicazione; Danni spontanei di singole basi; Mutazioni Chimiche Un altro tipo di reazione che può avvenire spontaneamente coinvolge la modificazione chimica di una base. Le più comuni reazioni di questo tipo sono le reazioni di depurinazione e deaminazione: reazioni di idrolisi spontanea causata dall’interazione casuale tra il DNA e le molecole di acqua circostanti. Depurinazione: si tratta della perdita di una base purinica (adenina o guanina) per idrolisi spontanea del legame glicosidico che la lega al desossiribosio. Questo legame glicosidico è intrinsecamente instabile ed è talmente soggetto a idrolisi che il DNA di una cellula umana perde ogni giorno migliaia di basi puriniche. Quando la DNA polimerasi in sito apurinico, l’enzima aggiunge in genere un’adenina al filamento nuovo portando ad un cambiamento di base. Deaminazione: si tratta della rimozione di un gruppo amminico da una base. Come la depurinazione, anche la deaminazione è un processo di idrolisi. Questo tipo di alterazione, che può riguardare la citosina, l’adenina o la guanina, modifica le proprietà di appaiamento della base interessata. Delle tre basi, la citosina è la più soggetta a deaminazione (trasformandosi in uracile). BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 33 • L’RNA coinvolto nella sintesi proteica (o traduzione) è di tre tipi: RNA ribosomiale (parte integrante dei ribosomi), l’RNA di trasferimento (per il trasporto degli amminoacidi nei ribosomi) e l’RNA messaggero che costituisce il prodotto della trascrizione dei geni codificanti per le proteine. • Il principio della direzionalità del flusso informazionale dal DNA all’RNA alle proteine è noto come dogma centrale della biologia molecolare. • Nello schema visibile a pagina 1 osserviamo che la freccia è unidirezionale. In realtà negli ultimi anni il dogma è stato leggermente modificato aggiungendo un percorso a ritroso di sintesi, dall’RNA al DNA, ad opera della trascrittasi inversa. • Un principio base è che non tutta l’informazione trascritta, come visto, viene poi trasformata in proteine. Gran parte dei prodotti di trascrizione fungono da molecole regolatrici ed hanno ruoli funzionali. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 34 • I passaggi principali e i dettagli molecolari fondamentali del flusso dell’informazione genetica sono simili nei procarioti e negli eucarioti, ma esistono importanti differenze nel sito in cui si verificano la trascrizione e la traduzione. • Poiché i procarioti non hanno un involucro nucleare, il loro DNA non è fisicamente segregato dai ribosomi e dal “macchinario” di traduzione. Al contrario, la compartimentazione delle cellule eucariote porta alla separazione spaziale dei due processi. • La mancanza del nucleo nei procarioti consente che la traduzione di un mRNA cominci prima che la sua trascrizione sia completa. Trascrizione Trascrizione Batterica • Il primo stadio di questo processo è la trascrizione di una sequenza nucleotidica di DNA in una sequenza nucleotidica di RNA. Questo processo coinvolge quattro stadi: legame dell’RNA polimerasi, inizio, allungamento e terminazione. • Durante questo processo, la RNA polimerasi non ha bisogno di alcun primer dato che è in grado di unire due nucleotidi tramite legame fosfodiesterico senza aver bisogno dell’estremità 3’-OH libera. Il tutto si conclude dopo aver raggiunto una sequenza di basi che prende il nome di sequenza di terminazione. • K • L • L • Nella figura a fianco viene presa in considerazione la trascrizione di un segmento di DNA (unità trascrizionale) per dare origine ad una sola molecola di RNA. Il processo è condotto dall’enzima RNA polimerasi, che catalizza la sintesi dell’RNA usando l’acido desossiribonucleico come stampo. • La trascrizione inizia con il legame della RNA polimerasi a una sequenza promotrice, che induce un locale srotolamento (denaturazione dei legami ad idrogeno della doppia elica). Utilizzando uno dei due filamenti del DNA come stampo, una volta iniziata la sintesi, si genera quella che prende il nome di bolla di trascrizione. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 35 Fase 1 – Legame tra RNA polimerasi e sequenza promotrice • La prima fase della sintesi dell’RNA è rappresentata dal legame dell’RNA polimerasi nel sito promotore a una specifica sequenza di DNA composta da parecchie dozzine di coppie di basi, che determina dove la sintesi dell’acido ribonucleico debba iniziare e quale filamento del DNA debba essere utilizzato come stampo. • Ogni unità trascrizionale ha un sito promotore localizzato vicino all’inizio della regione codificante. Per convenzione, le sequenze del promotore sono descritte in direzione 5’→3’ sul filamento codificante. • I termini a monte e a valle sono utilizzati per identificare la posizione delle varie sequenze rispetto al segmento codificante. Il legame della RNA polimerasi al promotore è mediato dalla subunità σ e provoca lo srotolamento di un breve tratto della doppia elica di DNA, nella regione in cui inizierà la trascrizione, esponendo i due filamenti separati. • Le sequenze del promotore sono state identificate tramite diverse tecniche. Tali tecniche hanno permesso di rivelare che nelle unità di trascrizione batteriche i siti di DNA del promotore sono significativamente diversi tra loro. • La domanda che può sorgere è come un solo tipo di RNA polimerasi possa riconosce diversi tipi di promotori. È stato evidenziato che il riconoscimento e il legame dell’enzima dipendono solo da molte corte sequenze localizzate in specifiche posizioni all’interno di ciascun sito promotore. Il tipo di nucleotidi che compongono il resto del promotore sono irrilevanti per questo fine. • La figura sovrastante evidenzia le sequenze essenziali di un tipico promotore procariota. Il punto di inizio della trascrizione è praticamente sempre rappresentato da una purina (spesso l’adenina). Approssimativamente 10 base a monte del punto di inizio è presente una sequenza composta da sei nucleotidi, TATAAT, chiamata sequenza -10 o pribnow box. • Per convenzione, i nucleotidi sono numerati dal punto di inizio della trascrizione (+1), con numeri positivi verso destra e con numeri negativi verso sinistra. Il nucleotide -1 è immediatamente a monte del punto di inizio della trascrizione (non esiste un nucleotide 0). Alla posizione -35, o in sua prossimità, è presente un’altra sequenza di sei nucleotidi, TTGACA, chiamata sequenza -35. • Le sequenze -10 e -35 sono state conservate durante l’evoluzione, ma non sono identiche in tutti i promotori batterici, e nemmeno in tutti i promotori di un singolo genoma. Come con le origini di BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 38 • Mentre la catena di RNA cresce, gli ultimi nucleotidi aggiunti rimangono appaiati al filamento di DNA stampo, formando un corto ibrido RNA-DNA, lungo circa 8/9 paia di basi. Intanto la polimerasi continua ad avanzare, il DNA davanti all’enzima si srotola per permettere la formazione dell’ibrido DNA-RNA, quello alle sue spalle invece si riavvolge in una doppia elica. NB. Il superavvolgimento che verrebbe a generarsi in seguito a questo processo di srotolamento e riavvolgimento viene rilasciato dall’azione delle topoisomerasi, proprio come avviene durante la replicazione del DNA. NB. Tutti e due i filamenti del DNA possono fare da stampo per la trascrizione, ognuno in un’orientazione diversa, ma per ogni tratto di DNA si trova solo un promotore, in una delle due catene. La trascrizione è di conseguenza un processo unidirezionale. Fase 4 – Terminazione della sintesi dell’RNA • L’allungamento della catena di RNA nascente procede fino a quando la RNA polimerasi copia una particolare sequenza, chiamata segnale di terminazione, che induce la fine della trascrizione. Nei batteri si distinguono due classi di segnali di terminazione, che differiscono per il fatto che richiedano o meno la partecipazione di una particolare proteina, chiamata fattore rho (ρ). • Le molecole di RNA terminate senza l’aiuto del fattore rho contengono una corta sequenza ricca in GC seguita da molti residui U vicino all’estremità 3’. Questa configurazione facilita la terminazione nel modo seguente: la regione GC contiene sequenze complementari le une con le altre, in grado di determinare la formazione all’interno della molecola di RNA di un hairpin loop (struttura a forcina), che tende a separare la molecola di RNA dal DNA e causa un arresto della polimerasi. • I pochi legami ad idrogeno fra le sequenze dei residui U e il DNA stampo sono rotti, rilasciando la molecola di RNA appena formata. Al contrario, le molecole di RNA che non formano una forcina ricca in GC, perché avvenga la terminazione richiedono la partecipazione del fattore rho. • Il fattore rho si lega al filamento di RNA sintetizzato ed avanza verso la bolla di trascrizione. Fino a che la RNA polimerasi non incontra la sequenza di terminazione (che la rallenta), il fattore ρ “rincorre” l’enzima. Quando quest’ultimo rallenta, la proteina si lega al complesso e si occupa di destabilizzare il legame ibrido RNA-DNA. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 39 Trascrizione Eucariota • La trascrizione nelle cellule eucariote coinvolge le stesse quattro fasi descritte finora ma il processo è molto più complesso rispetto a quello che avviene nei batteri. Le differenze principali sono le seguenti: 1) Tre differenti RNA polimerasi trascrivono il DNA nucleare degli eucarioti. Ciascuna sintetizza una o più classi di RNA. 2) I promotori eucarioti sono più diversificati di quelli batterici. Non solo esistono differenti tipi di promotori utilizzati da ciascuna delle tre polimerasi ma, all’interno di ciascun tipo, specie tra quelli dei geni codificanti per proteine, esiste una grande variabilità. Inoltre, alcuni promotori eucarioti sono localizzati a valle del punto di inizio della trascrizione. 3) Il legame delle RNA polimerasi eucariote al DNA richiede la partecipazione di ulteriori proteine, dette fattori di trascrizione. A differenza del fattore σ batterico, i fattori di trascrizione eucarioti non sono parte integrante della molecola di RNA polimerasi. Alcuni di essi devono legare il DNA prima che l’RNA polimerica si leghi al promotore e inizi la trascrizione. Sono quindi i fattori di trascrizione, piuttosto che l’RNA polimerasi stessa, a determinare la specificità della trascrizione negli eucarioti. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 40 4) Le interazioni proteina-proteina hanno un ruolo prominente nella prima fase della trascrizione negli eucarioti. Benché alcuni fattori di trascrizione si leghino direttamente al DNA, molti interagiscono con altre proteine, siano essi altri fattori di trascrizione o l’RNA polimerasi stessa. 5) Le molecole di RNA eucariote di nuova sintesi sono normalmente sottoposte a un’intensa maturazione (modificazione chimica), sia durante che dopo la trascrizione. Tipologie di RNA polimerasi nella cellula eucariota • RNA polimerasi I: risiede nel nucleolo ed è responsabile della sintesi delle molecole di RNA precursore di tre dei quattro tipi di rRNA presenti nei ribosomi eucarioti (28S, 18S, 5.8S). La sua associazione con il nucleolo non è ancora chiara, in quanto il nucleolo è la sede della sintesi dell’RNA ribosomiale e dell’assemblaggio delle subunità ribosomiali. • RNA polimerasi II: si trova nel nucleoplasma e sintetizza i precursori degli mRNA, la classe di molecole di RNA che codifica per le proteine. Oltre a produrre i precursori dell’mRNA, l’RNA polimerasi II sintetizza la maggior parte degli snRNA, piccoli RNA nucleari coinvolti nella maturazione post-trascrizionale, e i microRNA. Questa polimerasi differisce dalle altre due per la sua estremità C-terminale, dove possiede amminoacidi addizionali. L’estremità C-terminale può essere fosforilata in diverse posizioni, per formare quello che talvolta viene chiamato “codice di fosforilazione”. Questo codice condiziona notevolmente le funzioni della polimerasi II rendendola la più versatile delle tre. • RNA polimerasi III: è un enzima che si trova nel nucleolo ma sintetizza una piccola varietà di RNA, compresi i precursori dei tRNA e l’rRNA 5S. RNA polimerasi Localizzazione Prodotti principali I Nucleolo Precursore per rRNA 28S, rRNA 18s, rRNA 5.8S II Nucleoplasma Pre-mRNA, snRNA e microRNA III Nucleolo Pre-tRNA, rRNA 5S e altri piccoli RNA Mitocondriale Mitocondrio RNA dei mitocondri Cloroplastica Cloroplasto RNA dei cloroplasti • Strutturalmente, le RNA polimerasi I, II e III sono abbastanza simili le une alle altre, così come al core della RNA polimerasi procariota. Le RNA polimerasi dei mitocondri e dei cloroplasti assomigliano strettamente a quelle procariote, ulteriore prova della teoria endosimbiontica. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 43 trascrizione, così che possa iniziare la sintesi dell’RNA. Contemporaneamente, l’attività elicasi del TFIIH inizia a svolgere il DNA, in modo da permettere alla polimerasi di procedere. • La regione della RNA polimerasi che è fosforilata da TFIIH è importante per la regolazione del funzionamento dell’enzima. La grande subunità della RNA polimerasi II ha un dominio C-terminale (CTD) che funge da “coda”. Il CTD è molto più lungo della porzione core della polimerasi ed è la regione dove avviene la fosforilazione. • TFIID, il fattore di trascrizione che per primo si lega alla sequenza promotore, possiede una particolare subunità detta TATA-binding proteine (TBP), che si combina con un numero variabile di subunità aggiuntive a formare il TFIID. • Nonostante il suo nome, la capacità della TBP di legare il DNA, non è limitata ai promotori che contengono la TATA box, inclusi i promotori usati dalle RNA polimerasi I e III. A seconda del tipo di promotore, TBP si associa con diverse proteine e, per promotori privi di TATA box, la maggior parte della specificità di TBP probabilmente deriva dalla sua interazione con tali proteine. NB. TBP lega il solco minore del DNA, provocandone un’accentuata piegatura che favorisce l’attacco di altri componenti del complesso di pre-inizio. Fattori di Trascrizione Specifici • Oltre ai fattori di trascrizione generali e alla RNA polimerasi II, sono richiesti molti altri tipi di proteine per la trascrizione efficace e per l’attivazione regolata di specifici geni. Alcune di queste proteine sono coinvolte nella despiralizzazione della cromatina per facilitare il legame della RNA polimerasi al DNA. Altre proteine sono fattori di regolazione della trascrizione, che attivano specifici geni legandosi agli elementi di controllo prossimali e reclutando proteine coattivatrici. NB. Senza i fattori di trascrizione specifici, il complesso di pre-inizio tenderebbe a staccarsi subito dalla doppia elica. L’attivatore o il repressore si legano a specifiche sequenze del DNA distanti anche a 1000 basi dal promotore (alcune volte anche a valle rispetto al +1). La loro azione è quella di aumentare BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 44 (attivatore che si lega alla sequenza enhancer) o diminuire (repressore che si lega alla sequenza silencer) la trascrizione. Terminazione di trascrizione eucariota • I meccanismi di trascrizione nelle cellule eucariote sono diversi in base al tipo di RNA polimerasi che si considera. Effetto degli errori della RNA polimerasi • Quando l’errore risulta nel processo di replicazione del DNA, le cellule figlie ereditano un DNA mutato che in fase di trascrizione comporta la formazione di RNA contenenti tutti la mutazione. Nel caso in cui l’errore risulti nella fase di trascrizione, si parte con del DNA corretto quindi l’errore risulta nel singolo filamento di RNA. • Alcuni fattori specifici che si occupano della modifica chimica degli istoni rendono attiva la trascrizione dato che vanno a disassemblare il nucleosoma tramite acetilazione. Queste proteine specifiche procedono lungo il DNA stampo davanti al complesso proteico. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 45 NB. A differenza delle cellule eucariote, nelle procariote traduzione e trascrizione avvengono contemporaneamente all’interno del citoplasma anche attraverso l’utilizzo di più ribosomi. Non c’è un meccanismo che prevale sull’altro dato che i batteri necessitano di un metodo più rapido per affrontare i cambiamenti istantanei dell’ambiente mentre gli eucarioti applicando la compartimentazione regolano in maniera più minuziosa i vari problemi che possono avvenire. Tipologie di RNA e sue maturazioni • Una molecola di RNA appena prodotta dalla trascrizione, chiamata trascritto primario, spesso deve andare incontro a cambiamenti chimici prima che possa svolgere la sua funzione nella cellula. Si utilizza il termine di maturazione dell’RNA per definire tutte le modificazioni chimiche necessarie per produrre un RNA funzionale dal trascritto primario, che funziona da suo precursore. • La maturazione, di solito, implica la rimozione di regioni del trascritto primario, e può anche includere l’aggiunta o la modificazione chimica di specifici nucleotidi. Maturazione RNA messaggero • Nelle cellule eucariote, per convertire i trascritti primari in molecole mature di mRNA, nel nucleo avvengono delle sostanziali modificazioni chimiche, in seguito alle quale le molecole di RNA sono pronte per essere trasportate nel citoplasma e tradotte. • I trascritti primari sono spesso molto lunghi (2000-20000 nucleotidi). L’eterogeneità di dimensione è alla base del termine RNA eterogeneo nucleare (hnRNA), che è utilizzato per identificare tutto l’RNA (oltre al ribosomiale e di trasferimento) presente nei nuclei eucarioti. L’hnRNA è costituito da una miscela di molecole di mRNA e dei loro precursori (pre-mRNA). Vi sono quattro metodi di maturazione e sono i seguenti: capping, poliadenilazione, splicing e editing. Capping e Poliadenilazione: la maggior parte delle molecole di mRNA degli eucarioti mostra modificazioni caratteristiche a entrambe le estremità. All’estremità 5’, queste molecole posseggono un nucleotide modificato, chiamato cappuccio (cap) al 5’, mentre all’estremità 3’ esse normalmente posseggono un lungo blocco di ribonucleotidi adenina noto come coda di poli A. Un cappuccio al 5’ è semplicemente costituito da un nucleotide guanosina monofosfato (GMP) che viene metilato in posizione 7 nell’anello purinico e che è posto in orientamento opposto rispetto agli altri nucleotidi, in quanto il legame che lo unisce all’estremità 5’ della molecola di RNA è un legame 5’→5’, invece del normale legame 3’→5’. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 48 al punto di ramificazione55. Infine, un altro gruppo do snRNP (U4, U5 e U6) riunisce i due terminali dell’introne, formando uno spliceosoma maturo. 1) GRUPPO I: è presente nei genomi mitocondriali dei funghi, nei geni per gli rRNA e in quelli che codificano per alcuni componenti del sistema di trasporto degli elettroni. Gli introni di gruppo I sono presenti anche nei geni mitocondriali delle piante, nei geni di alcuni rRNA e tRNA dei cloroplasti. Questi introni vengono escissi come frammenti lineari di RNA. 55 Si tratta di una sequenza nucleotidica posta a monte del terminale 3’ dell’introne e contiene un residuo A. A questo stadio, il pre-mRNA è tagliato al sito di splicing al 5’ e l’estremità 5’ dell’introne appena rilasciata è unita covalentemente al residuo di adenina localizzato nella sequenza di ramificazione, creando una struttura a cappio chiamata lariat. Il sito di splicing al 3’ è quindi tagliato e le due estremità dell’esone sono unite, rilasciando l’introne che sarà successivamente degradato. Un complesso multiproteico chiamato complesso di giunzione dell’esone (EJC) viene deposto vicino al confine di ognuna delle giunzioni esone-introne appena formate. L’EJC serve a favorire l’esporto dell’mRNA dal nucleo e influenza vari eventi regolatori, tra cui la degradazione degli mRNA. Benché la partecipazione dello spliceosoma sia pressoché sempre richiesta per la rimozione degli introni, pochi tipi di geni posseggono introni self- splicing. Esistono due classi di introni in cui l’RNA intronico funziona come un ribozima per catalizzare la propria rimozione. INTRONI SELF-SPLICING DI CLASSE I INTRONI SELF-SPLICING DI CLASSE II BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 49 2) GRUPPO II: gli introni sono escissi come lariat in cui un’adenina all’interno dell’introne forma il punto di ramificazione, esattamente come accade nel meccanismo attuato dallo spliceosoma. Gli introni di gruppo II sono presenti in alcuni geni mitocondriali e cloroplastici di piante ed eucarioti unicellulari, nonché nei genomi di alcuni archeobatteri. Esiste un fenomeno, lo splicing alternativo, dove a partire da un mRNA comune, si ottengono degli mRNA maturi differenti dati da disattivazioni dei siti di splicing. Editing: durante il processo di RNA editing, ovunque all’interno di una sequenza codificante di mRNA possono essere inseriti, rimossi o chimicamente alterati da uno a centinaia di nucleotidi. Questi cambiamenti spesso creano nuovi punti di inizio o nuovi codoni di stop e possono alterare la cornice di lettura del messaggio. Esempio di editing è la deaminazione ovvero la rimozione di una molecola di ammoniaca per aggiunta di acqua che in molti casi porta la citosina a trasformarsi in uracile. ESEMPIO (Apolipoproteina-B) • Si tratta di un gene composto da 13692 nucleotidi che corrispondono a 4564 codoni. Nella zona centrale del gene, il codone 2153 ha una sequenza del tipo CAA che codifica per la glutammina. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 50 • Nelle cellule epatiche, mRNA non va incontro a editing e quando viene tradotto dà origine ad una proteina di 4563 amminoacidi detta apolipoproteina B-100. La sua funzione è quella di trasporto del colesterolo nel sangue. • Nelle cellule enteriche, l’mRNA va incontro a editing e tramite deaminazione la citosina viene trasformata in uracile producendo un codone di stop (UAA). Dopo la trascrizione otteniamo una proteina con 2152 amminoacidi detta apolipoproteina B-48. La sua funzione è quella di assorbire i lipidi nel tratto intestinale. Maturazione RNA ribosomiale • L’RNA ribosomiale è la forma più abbondante e stabile di RNA presente nelle cellule. Di norma, l’rRNA rappresenta circa il 70/80% dell’rRNA cellulare totale, il tRNA costituisce circa il 10/20% e l’mRNA meno del 10%. Negli eucarioti, i ribosomi citoplasmatici contengono quattro tipi di rRNA, normalmente identificati dalle loro differenti velocità di sedimentazione durante la centrifugazione. • La più piccola delle due subunità ribosomiali contiene una singola molecola di rRNA 18S; la subunità maggiore contiene tre molecole di rRNA, una 28S, una 5S e una 5.8S. Nei ribosomi batterici sono presenti solo tre tipi di rRNA: una molecola 16S associata alla subunità minore e molecole di 23S e 5S associate a quella maggiore. • Dei quattro tipi di rRNA presenti nei ribosomi degli eucarioti, i tre più grossi (28S, 5.8S, 18S) sono codificati da una singola unità trascrizionale, sintetizzata nel nucleolo dall’RNA polimerasi I come un unico trascritto primario chiamato pre-rRNA. Le sequenze di DNA che codificano per questi tre rRNA sono separate all’interno dell’unità trascrizionale da segmenti di DNA chiamati spaziatori trascritti. • La presenza di tre differenti geni per gli rRNA all’interno di una singola unità di trascrizione, assicura che la cellula produca questi tre rRNA in uguale quantità. La maggior parte di genomi eucarioti possiede copie multiple di unità di trascrizione per il pre-RNA, organizzate in uno o più blocchi di ripetizioni in tandem. Gli spaziatori non trascritti separano, all’interno di ciascun blocco di ripetizioni in tandem, le singole unità di trascrizione. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 53 • All’estremità 5’, una corta sequenza leader di 16 nucleotidi è rimossa dal pre-tRNA. All’estremità 3’, i due nucleotidi terminare del pre-tRNA sono rimossi e sostituiti con il trinucleotide CCA, che rappresenta una caratteristica strutturale comune di tutte le molecole di tRNA (in alcuni trascritti primari la sequenza CCA è già presente in posizione 3’). • In una tipica molecola di tRNA, circa il 10/15% dei nucleotidi viene chimicamente modificato durante la maturazione del pre-tRNA. Le principali modificazioni includono la metilazione di basi e zuccheri, nonché la formazione di basi insolite, come diidrouracile (D), ribotimina (T), pseudouridina (Ѱ) e inosina (I). Espressione Genica – Traduzione • Secondo il dogma centrale della biologia molecolare, il contenuto nucleotidico dell’RNA messaggero viene trasformato in proteine tramite il processo di traduzione. L’essenza dell’espressione genica è rappresentata dalla relazione tra la sequenza di basi nucleotidiche delle molecole di DNA e l’ordine lineare degli amminoacidi nelle molecole proteica. Scoperta della relazione Gene ↔ Enzima – Archibald Garrod • Nel 1908, il medico inglese Archibald Garrod ipotizzò che certe malattie ereditari fossero dovute all’incapacità di produrre un determinato enzima. Si occupò di una particolare patologia detta alcaptonuria (riconosciuta dall’insolito colore scuro delle urine). • Garrod chiamò queste malattie: errori congeniti del metabolismo. Capì quindi che le mutazioni di carattere ereditario potevano essere associate alla mancanza di un enzima. In questo caso la patologia è legata alla degradazione della tirosina (un amminoacido) che viene inizialmente trasformata in acido omogentisico. • In presenza di un enzima funzionale l’acido segue una via metabolica normale che porta ad avere come prodotti di scarto anidride carbonica e acqua. In assenza di questo enzima o in presenza di un La maturazione del tRNA per la tirosina di lievito è caratterizzata anche dalla rimozione di una sequenza interna di 14 nucleotidi (anche se non è richiesta dalla gran parte dei tRNA). Il meccanismo di taglio-riunione coinvolge due enzimi distinti, una RNA endonucleasi e una RNA ligasi, che sono molto simili in ogni organismo, anche fra specie molto distanti da un punto di vista evolutivo. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 54 difetto, l’acido non viene demolito e trasportato tramite le urine, diventando nero quando esposto all’aria. • L’enzima difettoso è l’omogentisato 1,2-diossigenasi. Videro che questa malattia si presentava in soggetti nati da genitori consanguinei che a loro volta presentavano la malattia, di conseguenza doveva esistere una relazione tra il materiale genetico e l’enzima. Scoperta della relazione 1 Gene ↔ 1 Enzima – Beadle e Tatum • La relazione fra le mutazioni geniche e le proteine fu rivelata sperimentalmente da George Beadle e Edward Tatum nei primi anni ’40 del XX secolo, utilizzando una muffa dal nome Neurospora crassa. Quest’ultima è un organismo relativamente autonomo che può crescere in terreno minimo contenente solo zucchero, sali inorganici e la vitamina biotina. • Da questi pochi ingredienti, le vie metaboliche di Neurospora producono tutto ciò di cui l’organismo ha bisogno. Per studiare l’influenza dei geni su queste vie metaboliche, Beadle e Tatum trattarono le colture di Neurospora con raggi X per indurre mutazioni genetiche. • Questi trattamenti generarono dei ceppi mutanti che persero la capacità di sopravvivere in terreno minimo, benché fossero in grado di crescere su un terreno completo addizionato con una varietà di amminoacidi, nucleosidi e vitamine. Queste osservazioni suggerivano che i mutanti di Neurospora avevano perso la capacità di sintetizzare alcuni amminoacidi o vitamine e potevano quindi sopravvivere solo se questi nutrienti venivano aggiunti al mezzo di coltura. • In base alle richieste nutrizionali, identificarono tre classi di mutanti, ognuna delle quali aveva un deficit sul funzionamento di un particolare enzima di una via catabolica responsabile della sintesi dell’arginina. Questa osservazione rivelava la corrispondenza diretta fra ogni mutazione genetica e la perdita di uno specifico enzima richiesto nella catena metabolica. • La teoria un gene – un enzima valse ai due scienziati il premio Nobel per la medicina nel 1958. La radiazione andava a modificare una particolare sequenza nucleotidica che portava, in fase di traduzione, alla formazione di un particolare enzima. Man mano che venivano aggiunti i prodotti intermedi e l’arginina, capirono quale dei tre enzimi era stato danneggiato. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 55 Scoperta della relazione Gene-Proteina – Linus Pauling • Linus Pauling, negli anni ’50 del XX secolo, scoprì che la proteina emoglobina veniva alterata nei pazienti affetti da anemia falciforme, una malattia ereditaria. I globuli rossi degli individui malati mostravano una struttura anomala a forma di “falce”, a causa dell’intrappolamento e danneggiamento delle cellule quando queste passavano attraverso i piccoli vasi sanguigni. • Usando l’elettroforesi, Pauling scoprì che l’emoglobina delle cellule falciformi migrava con velocità diversa rispetto all’emoglobina normale. Pauling propose che la differenza tra le due emoglobine dipendesse dalla loro composizione amminoacidica. Dimostrare ciò era molto dispendioso, perciò, l’unica relazione esprimibile era quella tra gene e proteina. Scoperta della relazione 1 Gene-1 Polipeptide – Vernon Ingram • Un ingegnoso stratagemma messo a punto da Vernon Ingram rese possibile identificare gli amminoacidi anomali ’dell’emoglobina delle cellule falciformi senza determinare la completa sequenza amminoacidica. Ingram utilizzò la proteasi tripsina per tagliare l’Hb in frammenti peptidici. • Quando Ingram analizzò il quadro peptidico dell’emoglobina normale e delle cellule falciformi scoprì che le due proteine differivano per un solo peptide. L’analisi del peptide anomalo rivelò che nell’emoglobina delle cellule falciformi, un acido glutammico era stato sostituito da una valina. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 58 • Una mutazione (–) può essere spiegata in modo simile, in quanto la delezione di una singola lettera causa anch’essa lo scivolamento della cornice di lettura. Tali mutazioni frameshift sono effetti tipici delle acridine e di altri mutageni che causano l’inserzione o la delezione di singole coppie di basi. • Da sole, le mutazioni (+/-) causano sempre lo scivolamento della lettura dell’mRNA. Quando una mutazione (+) e una (–) cadono in stretta prossimità nello stesso gene, possono facilmente sopprimersi l’un l’altra, specie se sono vicine. In questi casi, l’inserzione causata dalla mutazione (+), è compensata dalla delezione causata dalla mutazione (–). • Bisogna però sapere che esistono delle mutazioni doppie ma omonime del tipo (+/+) e (-/-) che non si annullano ma alterano ancora di più il messaggio. Evidenza del Codice a triplette • Quando Crick e Brenner generarono i fagi T4 mutanti con la proflavina, ottennero risultati simili a quelli dell’esempio ipotetico riportato sopra. Essi trovarono mutanti (-), che mostravano un fenotipo anomalo, ma che potevano tornare ad un fenotipo pseudo wilde-type tramite una seconda mutazione. • La seconda mutazione era sempre un’inserzione localizzata in un sito diverso, ma prossimo, alla delezione originale. I mutanti, quindi, ritornavano al fenotipo wilde-type esibendo un quadro (-/+)57. Crick e Brenner ottennero anche tripli mutanti dello stesso tipo (+/+/+ o -/-/-) e trovarono che molti di questi tornavano al fenotipo wilde-type. • Applicando questo concetto del codice a tre lettere al DNA, Crick e Brenner conclusero che l’aggiunta o la perdita di una coppia di basi fa scivolare la cornice di lettura del gene da quel punto in poi, così come una seconda mutazione dello stesso tipo. Dopo un terzo cambiamento dello stesso tipo, viene recuperata l’espressione del gene e l’unico frammento del gene tradotto in modo scorretto è quello tra la prima e la terza mutazione. NB. Questi errori possono spesso essere tollerati quando il messaggio genetico è tradotto in una proteina, se la regione interessata è corta e i cambiamenti nella sequenza amminoacidica non danneggiano la funzione proteica. • Basandosi sull’osservazione che i fenotipi wylde-type erano spesso mantenuti in presenza dell’inserzione (o delezione) di tre coppie di basi, ma non in presenza di una o due, Crick e Brenner conclusero che i nucleotidi di uno stesso filamento di DNA sono letti a gruppi di tre, ovvero in triplette. 57 Crick e Brenner osservarono molti esempi di mutanti -/+ (o +/-) che avevano un fenotipo wilde-type ma quando per ricombinazione ottenevano doppi mutanti +/+ (o -/-), non ottenevano mai questo tipo di fenotipi. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 59 • Dato che così tanti dei loro tripli mutanti erano vitali, Crick e Brenner dedussero un’ulteriore conclusione: molte delle 64 possibili triplette dovevano specificare per amminoacidi, anche se le proteine sono composte da soli 20 tipi diversi di AA. • Se solo 20 delle 64 possibili combinazioni di nucleotidi fossero codificanti, la probabilità di comparsa di triplette prive di significato sarebbe elevata. Queste triplette dovrebbero chiaramente interferire con la sintesi proteica e di conseguenza i fenotipi wilde-type dovrebbero tornare molto più raramente. • Crick e Brenner trovarono molti pseudo wilde-type e dedussero quindi che molte delle 64 possibili triplette dovevano codificare per un amminoacido. Dal momento che esistono soltanto 20 amminoacidi, questo significa che il codice genetico è degenerato58, ovvero un singolo amminoacido può essere codificato da più triplette. • Un’ulteriore conclusione è che il codice è non sovrapposto. In un codice sovrapposto, la cornice di lettura dovrebbe avanzare lungo il filamento di DNA solo per uno o due nucleotidi alla volta, così che ogni nucleotide venga letto due o tre volte. • Considerando un codice sovrapposto di questo tipo, l’inserzione o la delezione di una singola coppia di basi nel gene, porterebbe all’inserzione o alla delezione di un amminoacido in un punto del polipeptide e cambierebbe alcuni amminoacidi adiacenti, ma non avrebbe effetto sulla cornice di lettura della rimanente porzione del gene → NON si otterrebbero le mutazioni frameshift. Esperimento di Niremberg e Matthaei • Nel 1961, Marshall Niremberg e Heinrich Matthaei, utilizzarono un sistema acellulare (cioè estrassero solo i componenti necessari da una cellula) per lo studio della sintesi proteica. Con questi sistemi, la sintesi proteica può essere studiata al di fuori delle cellule, mescolando ribosomi isolati, AA, fonte di energia e un estratto cellulare contenente i componenti solubili del citoplasma. 58 La degenerazione svolge una funzione utile nell’aumentare l’adattabilità del sistema di codificazione. Se la funzione codificante fosse assegnata solo a 20 triplette, qualsiasi mutazione nel DNA che porta alla formazione di ognuna delle altre 44 possibili triplette, dovrebbe interrompere il messaggio in quel punto. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 60 • I due ricercatori scoprirono che l’aggiunta di RNA al sistema acellulare aumentava la velocità della sintesi proteica; suggerendo che le molecole di RNA aggiunte funzionassero come messaggeri. Per mettere alla prova questa ipotesi, essi decisero di aggiungere al sistema molecole di RNA sintetiche con composizione in basi nota, per verificare se queste potessero influenzare il tipo di proteina sintetizzata. • I loro esperimenti iniziali furono facilitati dall’utilizzo di un enzima chiamato polinucleotide fosforilasi. Al contrario degli enzimi coinvolti nella trascrizione cellulare, la polinucleotide fosforilasi non richiede uno stampo, ma semplicemente unisce casualmente i nucleotidi disponibili in una sequenza lineare. • La molecola di RNA più semplice si ottiene quando viene utilizzato un solo tipo di nucleotide, poiché l’unico prodotto possibile è un omopolimero di RNA. Per esempio, quando l’enzima è incubato con UTP (uracile- trifosfato) come unico substrato, il prodotto è un omopolimero di uracile, chiamato poli(U). • Riuscirono ad ottenere poli(U), poli(A) e poli (C) ma non poli(G) dato che quest’ultimo in fase di sintesi tendeva a ripiegarsi per via dei ponti ad idrogeno. Quello che ottenne tramite l’inserimento dei tre polinucleotidi fu una serie di omo-polipeptidi dati da un caratteristico amminoacido (uno codificato dalla sequenza AAA, uno la CCC e uno la UUU). Esperimento di Gobind Khorana • H. Gobind Khorana mise a punto nel suo laboratorio un nuovo metodo di sintesi dei polimeri. L’approccio del ricercatore era simile a quello di Niremberg e Matthaei, ma con la differenza importante che i polimeri sintetizzati avevano una sequenza definita. • Ciò che ottenne fo una serie di triplette che potevano codificare per alcuni amminoacidi, non capì però quale sequenza corrispondesse a quale amminoacido. • Per capire l’effettiva corrispondenza tra tripletta e amminoacido bisognerà attendere l’esperimento di Leder e Niremberg. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 63 mitocondriale e nello stroma dei cloroplasti. Nel citoplasma degli eucarioti, i ribosomi sono presenti sia liberi nel citosol sia legati alle membrane del reticolo endoplasmatico e alla membrana esterna dell’involucro nucleare. I ribosomi dei procarioti hanno dimensioni più piccole di quelli eucarioti, benché molte proteine ribosomali, fattori di crescita e tRNA usati dagli Archea assomigliano maggiormente alla controparte eucariota che alla componente batterica. Come tutti i ribosomi, quelli procarioti sono costituiti da due subunità dissociabili, chiamate subunità maggiore e subunità minore. Sia i ribosomi procarioti sia quelli eucarioti sono composti da un grande numero di proteine e di rRNA. Un ribosoma procariota completo, con un coefficiente di sedimentazione di circa 70S, è costituito da una subunità minore di 30S e da una subunità maggiore di 50S. Il suo equivalente eucariota è di 80S e le due subunità sono di 40S e 60S. Il ribosoma batterico contiene meno proteine, è sensibile a diversi inibitori della sintesi proteica e contiene molecole di rRNA più piccole (e un RNA in meno) rispetto ai ribosomi eucarioti. Gli RNA ribosomali e le molecole proteiche si assemblano spontaneamente a formare le subunità maggiore e minore che si uniscono solo dopo il legame all’mRNA. Nel ribosoma, quattro siti sono particolarmente importanti per la sintesi proteica. Questi siti sono un sito di legame per l’mRNA e tre siti dove si lega il tRNA: un sito A (amminoacilico) che lega ogni tRNA nuovo carico, un sito P (peptidilico) dove risiede il tRNA che porta legata la catena polipeptidica in allungamento, e un sito E (uscita) dal quale i tRNA lasciano il ribosoma dopo che hanno scaricato i loro amminoacidi. RNA di trasferimento (tRNA): poiché la sequenza dei codoni nell’mRNA determina la sequenza degli amminoacidi nella catena polipeptidica, deve esistere un meccanismo che permette ai codoni di organizzare gli amminoacidi nell’ordine appropriato. Nel 1957 Francis Crick postulò che gli amminoacidi non potevano riconoscere la sequenza delle basi nucleotidiche e che, di conseguenza, qualche ipotetico adattatore doveva mediare l’interazione fra amminoacido e mRNA. Egli predisse anche che ogni molecola adattatrice doveva possedere due siti, uno che legava l’AA e l’altro che riconosceva nell’mRNA la sequenza di basi che codificava per quell’amminoacido. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 64 Negli anni successivi Mahlon Hoagland scoprì una famiglia di molecole adattatrici che mostrava queste presupposte caratteristiche. Hoagland concluse che gli amminoacidi erano inizialmente legati a piccole molecole di RNA, le quali quindi portavano gli AA al ribosoma per il successivo inserimento nella catena polipeptidica in corso di sintesi. Le piccole molecole di RNA scoperte da Hoagland furono definite RNA di trasferimento (tRNA). In accordo con il loro ruolo da intermediari tra AA e mRNA, le molecole di tRNA posseggono due tipi di specificità. I tRNA sono legati ai loro specifici amminoacidi mediante un legame estere che unisce l’amminoacido al gruppo 2’ o 3’-OH del nucleotide adenina localizzato all’estremità 3’ di tutte le molecole di tRNA. Per ogni tRNA la selezione del corretto amminoacido è responsabilità degli enzimi che catalizzano la formazione del legame estere. Per convenzione, il nome dell’amminoacido che si lega a un dato tRNA viene indicato con un esponente a tre lettere. Quando l’amminoacido si è attaccato, il tRNA viene definito amminoacil-tRNA. In queste condizioni, il tRNA viene definito carico e l’amminoacido si dice attivato. Le molecole di tRNA possono riconoscere i codoni dell’mRNA, in quanto ogni tRNA possiede un anticodone, una particolare sequenza trinucleotidica localizzata all’interno di una delle anse della molecola di tRNA. L’anticodone di ogni tRNA è complementare a uno o più codoni di mRNA che specificano l’amminoacido che deve essere trasportato da quel particolare tRNA. Gli anticodoni permettono alle molecole di tRNA di riconoscere i codoni nell’mRNA mediante appaiamento di basi complementari. Per convenzione i codoni dell’mRNA sono scritti in direzione 5’→3’, mentre gli anticodoni del tRNA vengono normalmente rappresentati nell’orientamento 3’→5’. Quindi, uno dei codoni per l’alanina è 5’-GCC-3’ e il corrispondente anticodone nel tRNA è 3’-CGG-5’. Poiché il codice genetico utilizza 61 codoni diversi per specificare gli amminoacidi, ci si dovrebbe aspettare che nella sintesi proteica siano coinvolti 61 differenti molecole di tRNA, ognuna responsabile del riconoscimento di un differente codone. Però, poiché molti tRNA riconoscono più di un codone, il numero di tRNA effettivi è circa cinquanta. I codoni che differiscono nella terza base spesso codificano per lo stesso amminoacido. Per esempio, UUU e UUC codificano entrambi per la fenilalanina oppure UCU, UCC, UCA e UCG codificano tutti per la serina. In questi casi, lo stesso tRNA si può legare a più di un codone senza introdurre errori. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 65 Queste considerazioni hanno portato Crick a proporre che l’mRNA e il tRNA si affacciano sul ribosoma in modo tale da permettere una certa flessibilità di appaiamento, o vacillamento, fra la terza base del codone e la corrispondente base nell’anticodone. In accordo con l’ipotesi del vacillamento, la flessibilità di appaiamento codone-anticodone permette alcuni inattesi appaiamenti fra le basi. Il vacillamento deriva dal fatto che non vi è un’esatta complementarità che generi interazioni ad idrogeno molto stabili ma sono sufficienti a mantenere ancorato il tRNA all’mRNA. Prima che una molecola di tRNA possa portare il suo appropriato amminoacido al ribosoma, tale amminoacido deve essere legato covalentemente al tRNA. Gli enzimi responsabili del legame degli AA alle corrispondenti molecole di tRNA sono chiamati amminoacil-tRNA sintetasi. Le cellule tipicamente contengono 20 differenti amminoacil-tRNA sintetasi, una per ognuno dei 20 amminoacidi utilizzati comunemente nella sintesi proteica. Le cellule che utilizzano il 21esimo e il 22esimo amminoacido, selenocisteina e pirrolisina, contengono anche i tRNA speciali e le amminoacil- tRNA sintetasi per questi amminoacidi. Le amminoacil-tRNA sintetasi catalizzano l’unione di un AA al corrispondente tRNA mediante la formazione di un legame estere, accompagnata dall’idrolisi di ATP ad AMP e pirofosfato. L’energia che permette la reazione è fornita dall’idrolisi del pirofosfato a 2Pi. Nel risultato prodotto dotato di carica, un amminoacil-tRNA, il legame estere che lega l’amminoacido al tRNA viene definito ad alta energia. Questo significa semplicemente che l’idrolisi del legame rilascia sufficiente energia per guidare la formazione del legame peptidico. Il processo di amminoacilazione di un tRNA è quindi definito anche attivazione dell’amminoacido, poiché non solo lega l’AA al corrispondente tRNA, ma lo attiva per la successiva formazione del legame peptidico. In che modo le amminoacil-tRNA sintetasi riconoscono per ogni AA il corretto tRNA? Differenze della sequenza di basi dei diversi tRNA sono alla base di questo specifico riconoscimento e non è mediato solo dall’anticodone. Modificazioni nella sequenza nucleotidica della tripletta dell’anticodone o dell’estremità 3’ del tRNA possono cambiare l’amminoacido a cui un tRNA viene legato. Durante il processo di selezione dell’AA da legare a un particolare tRNA, le amminoacil-tRNA sintetasi riconoscono i nucleotidi localizzati in almeno due differenti regioni delle molecole di tRNA. Quando per BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 68 Questa sequenza consiste di un tratto di 3/9 nucleotidi purinici (spesso AGGA) localizzati poco a monte del codone di inizio. Queste purine dell’mRNA formano un appaiamento di basi complementari con una sequenza ricca in pirimidine presente all’estremità 3’ dell’rRNA 16S, che quindi costituisce nel ribosoma il sito di legame dell’mRNA. Il legame dell’mRNA al suo sito, localizzato sulla subunità ribosomale minore, posiziona il suo codone di inizio AUG sul sito P del ribosoma, dove può successivamente legarsi all’anticodone dell’appropriato tRNA. La prima dimostrazione che un particolare tRNA è coinvolto in questo passaggio è derivata dalla scoperta che approssimativamente la metà delle proteine di E. coli contiene la metionina all’estremità N-terminale. Le cellule batteriche contengono due differenti tRNA per la metionina. Un tRNA, designato tRNAMet, trasporta la normale metionina destinata alle posizioni interne delle catene polipeptidiche. L’altro tRNA, designato tRNAfMet , trasporta una metionina che dopo il suo legame al tRNA viene convertita in N-formilmetionina. Quest’ultima ha il gruppo amminico bloccato, di conseguenza non permette la polimerizzazione da quel lato. Il fattore IF2 è in grado di distinguere l’iniziatore tRNAfMet dagli altri tipi di tRNA. Questa caratteristica di IF2 aiuta a spiegare perché il codone di inizio AUG si leghi all’iniziatore tRNAfMet, mentre i codoni AUG localizzati in altre posizioni dell’mRNA legano il tRNAMet non iniziatore. Quindi, la N-formilmetionina può essere posizionata all’estremità N-terminale di una catena polipeptidica, suggerendo che il tRNAfMet funzioni come un tRNA iniziatore. Questa ipotesi fu confermata quando nelle prime fasi dopo la sintesi, le catene polipeptidiche presentavano all’estremità N-terminale la formilmetionina. In seguito al completamento della catena polipeptidica, il gruppo formilico e la stessa metionina sono enzimaticamente rimossi. Durante l’inizio, il tRNA iniziatore con legata la fMet è unito, dall’attività del fattore di inizio IF2 (legato a GTP), al sito P della subunità 30S. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 69 Quando il tRNAfMet entra nel sito P, il suo anticodone si appaia con il codone di inizio AUG dell’mRNA, ed è rilasciato IF3. A questo punto, la subunità 30S con associati IF1, IF2-GTP, mRNA e N-formilmetionil- tRNAfMet costituisce il complesso di inizio 30S. Una volta che IF3 è stato rilasciato, il complesso di inizio 30S può legare una subunità 50S libera, generando il complesso di inizio 70S. La subunità maggiore promuove l’idrolisi del GTP legato a IF2, e il rilascio di IF2 e IF1. Per quanto riguarda la traduzione degli eucarioti, ci limitiamo a dire che sono necessari più fattori proteici e più passaggi. Lo schema sottostante riassume la traduzione negli organismi eucarioti: FATTORE FUNZIONE NELLA FASE DI INIZIO IF1 Promuove la dissociazione dei ribosomi in subunità separate IF2 Lega il fMet-tRNA, incrementa il legame del fMet-tRNA alla subunità minore; idrolizza il GTP IF3 Stabilizza la subunità minore nella dissociata, previene la riassociazione delle due subunità; denatura la forcina terminale 3’-OH dell’rRNA 16S. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 70 Fase di Allungamento (procarioti): nei batteri, la fase di allungamento della sintesi dei polipeptidi implica la ripetizione di un passaggio a tre fasi: 1) Il legame di un amminoacil-tRNA al ribosoma porta un nuovo amminoacido nella posizione appropriata per essere legato alla catena polipeptidica, 2) La formazione del legame peptidico unisce questo amminoacido alla catena polipeptidica in corso di sintesi 3) L’mRNA viene fatto avanzare di una distanza corrispondente a tre nucleotidi con il meccanismo della traslocazione. Legame dell’amminoacil-tRNA: all’inizio della fase di allungamento, il codone di inizio AUG dell’mRNA è posizionato a livello del sito P del ribosoma, e il secondo codone è posizionato nel sito A. L’allungamento inizia quando un amminoacil-tRNA, il cui anticodone è complementare al secondo codone, si lega al sito A. Il legame di questo nuovo amminoacil-tRNA al codone presente nel sito A richiede l’intervento di due fattori di allungamento proteici, EF-Tu e EF-Ts, ed è guidato dall’idrolisi di GTP. Il ruolo di EF- Tu, con il GTP legato, è quello di convogliare l’amminoacil-tRNA al sito A del ribosoma. Il complesso EF-Tu/GTP promuove il legame di tutti gli amminoacil-tRNA al ribosoma, con l’eccezione del tRNA iniziatore. Appena l’amminoacil-tRNA è trasferito sul ribosoma, il GTP viene idrolizzato e il complesso EF-Tu/GDP viene rilasciato. Il ruolo di EF-Ts è di riformare EF-Tu/GTP da EF-Tu/GDP, per il successivo ciclo di allungamento. I fattori di allungamento non riconoscono i singoli anticodoni. Deve esistere un meccanismo che assicuri il corretto trasporto dell’amminoacil-tRNA. Se l’anticodone dell’amminoacil-tRNA in ingresso non è complementare al codone dell’mRNA esposto sul sito A, l’amminoacil-tRNA non rimane legato al ribosoma abbastanza a lungo affinché si verifichi l’idrolisi del GTP. Formazione del legame peptidico: dopo che il corretto amminoacil-tRNA si è legato al sito A del ribosoma, il passo successivo è rappresentato dalla formazione del legame peptidico fra il gruppo amminico dell’amminoacido nel sito A e il gruppo carbossilico con il quale l’amminoacido iniziale è legato al tRNA nel sito P. La formazione di questo legame peptidico causa il trasferimento della catena polipeptidica in allungamento dal tRNA localizzato nel sito P a quello localizzato nel sito A. È l’unico passaggio che non richiede l’utilizzo di fonti di energia o fattori proteici. L’energia si ottiene dalla rottura del legame tra AA e tRNA. Per anni si è pensato che il legame peptidico fosse dato da una proteina detta peptidil-transferasi. Nel 1992, Harry Noller, dimostrarono che la subunità maggiore dei ribosomi batterici mantiene un’attività peptidil-transferasica anche dopo la rimozione di tutte le proteine ribosomali. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 73 Mutazioni • In senso ampio, il termine mutazione identifica qualsiasi cambiamento nella sequenza nucleotidica di un genoma. Sono stati presi in considerazione parecchi tipi di mutazioni, tra cui quella che causa l’anemia falciforme. Questo allele si forma con un tipo di mutazione chiamata sostituzione di una coppia di basi. • In questo caso, una coppia di basi AT è sostituita da TA; come conseguenza nell’mRNA troveremo una tripletta del tipo GUA e non GAA, e nel polipeptide (β-globina) un acido glutammico è sostituito da una valina. Questa singola sostituzione è sufficiente a cambiare la conformazione della β-globina e, di riflesso, anche quella del tetramero emoglobina. • Questo risultato altera il modo in cui le molecole di emoglobina si impacchettano nei globuli rossi, producendo cellule con struttura anomala, che rimangono intrappolate e danneggiate quando passano attraverso piccoli vasi sanguigni. Questa variazione prende anche il nome di mutazione missenso o non sinonima (ovvero il codone è mutato ma continua a codificare seppur per un amminoacido errato). • Alternativamente, la sostituzione di una coppia di basi può creare una mutazione non stop che converte un codone di stop in un codone che codifica per un amminoacido o, al contrario, una mutazione non senso che converte un codone codificante per un codone di stop. • I codoni non senso, non stop e missenso possono originarsi anche da inserzioni e delezioni di coppie di basi, conosciuta collettivamente come indel, che causano mutazioni frameshift. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 74 • Non sempre il cambiamento di un AA altera totalmente la funzionalità di una proteina. Se la struttura tridimensionale della proteina rimane sufficientemente invariata, l’attività biologica potrebbe non essere alterata59. • Le caratteristiche del codice genetico minimizzano gli effetti delle singole sostituzioni di coppie di basi, poiché molte possono essere mutazioni silenti o mutazioni sinonime, che cambiano la sequenza nucleotidica senza cambiare il messaggio genetico. • Oltre alle mutazioni che alterano una o poche coppie di basi, alcune coinvolgono regioni più lunghe di DNA. In pochi casi, le alterazioni sono così estese che il cambiamento a livello del DNA può essere rilevato con l’analisi dei cromosomi al microscopio ottico. • Una duplicazione comporta la ripetizione in tandem di un segmento di DNA, mentre l’inversione consiste nell’escissione di un segmento di DNA e nella sua reinserzione nello stesso sito in orientamento opposto. Una traslocazione coinvolge lo spostamento di un segmento di DNA dalla sua localizzazione originale in un’altra dello stesso cromosoma o in uno differente. Destino Post-Traduzionale delle Proteine Folding delle Proteine • Prima che le molecole polipeptidiche neosintetizzate possano svolgere la loro funzione biologica, devono essere conformate nella loro appropriata struttura tridimensionale. La struttura primaria di una proteina è sufficiente per specificare la sua struttura nativa; infatti, in vitro tendono a ripiegarsi spontaneamente. • A livello cellulare, il ripiegamento delle proteine è facilitato da proteine chiamate chaperon molecolari. Infatti, l’appropriato ripiegamento di alcune proteine richiede l’attività di differenti chaperon, che agiscono in sequenza, a partire dal momento in cui la catena polipeptidica in crescita comincia a emergere dal tunnel del ribosoma. 59 La sostituzione di un amminoacido con un altro dello stesso tipo (per esempio, valina con isoleucina) è presumibile non alteri la funzionalità della proteina. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 75 • La funzione primaria degli chaperon molecolari è legare le catene polipeptidiche durante le fasi iniziali del ripiegamento, prevenendo così la loro interazione con altri polipeptidi prima che le catene appena ripiegate abbiano acquisito l’appropriata conformazione. • Se il processo di ripiegamento è sbagliato, gli chaperon possono talvolta recuperare le proteine ripiegate in modo scorretto e aiutarle a conformarsi propriamente; in alternativa, tali proteine possono semplicemente essere distrutte. Tuttavia, alcuni tipi di catene polipeptidiche ripiegate incompletamente o in modo non corretto tendono ad associarsi, formando aggregati insolubili che possono interferire con le funzioni cellulari. • Gli chaperon sono presenti in tutti gli organismi viventi. In una proteina matura, completamente ripiegata, le regioni idrofobe si trovano in profondità all’interno della molecola proteica. In un polipeptide non ripiegato, queste regioni idrofobe sono esposte all’ambiente acquoso circostante, creando una condizione di instabilità in cui i polipeptidi tendono ad aggregarsi. • Gli chaperon rilevano questi residui idrofobici e riparano le proteine mal ripiegate interagendo con loro in modo ATP-dipendente. Due delle famiglie di chaperon più diffuse sono chiamate Hsp70 e Hsp60. Il termine “Hsp” deriva dall’identificazione iniziale di queste proteine come “proteine heat-shock”, poiché esse sono prodotte nei batteri in condizioni di stress (come alte temperature) andando a riparare le proteine danneggiate. • Le proteine Hsp70 legate all’ATP possono attaccarsi alle proteine neoformate, a quelle parzialmente ripiegate o mal ripiegate. L’idrolisi dell’ATP è quindi accoppiata ai cambiamenti nel ripiegamento delle proteine. La liberazione dell’ADP legato permette quindi il rilascio della proteina ripiegata correttamente. • Le proteine Hsp60 funzionano in modo diverso. Nella figura (b) sottostante è relativa a quella dei batteri ma negli eucarioti il funzionamento è molto simile. Nella figura (c): 1)Un polipeptide parzialmente ripiegato o mal ripiegato entra a un’estremità del complesso GroEL/GroES. 2)Una subunità di GroES si attacca poi all’estremità aperta; questo evento, accoppiato all’idrolisi dell’ATP, provoca un cambiamento nella conformazione della subunità GroEL, che genera un ambiente idrofilo favorevole al corretto ripiegamento della proteina. 3)Infine, la proteina correttamente ripiegata viene rilasciata e una subunità GroES si attacca all’estremità opposta di GroEL, completando il ciclo. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 78 • Altri gruppi di proteine sintetizzate nel RE rugoso sono destinati all’incorporazione nella membrana plasmatica o al rilascio all’esterno della cellula. Il successivo convogliamento di queste proteine dal RE alla loro destinazione finale è effettuato da varie vescicole membranose e dall’apparato del Golgi. • Mentre i ribosomi del RE rugoso sintetizzano le proteine, queste entrano nel lume del RE, dove si verificano le fasi iniziali della glicosilazione. Le vescicole di transizione trasportano le proteine glicosilate e i lipidi neosintetizzati al CGN. I lipidi e le proteine si spostano attraverso le cisterne della pila del Golgi. • Al TGN, alcune vescicole gemmano per dare origine alle vescicole secretorie che rilasciano per esocitosi i loro contenuti nella membrana plasmatica. Altre vescicole gemmano dal TGN per formare gli endosomi che, a loro volta, contribuiscono alla formazione dei lisosomi. • Contemporaneamente, proteine e altre sostanze vengono internalizzate nella cellula per endocitosi, formando quindi vescicole di endocitosi che si fondono con gli endosomi precoci. Questi ultimi, che contengono sostanze destinate alla digestione, maturano formando endosomi tardivi e poi i lisosomi. Indirizzamento delle Proteine – Importazione co-Traduzionale nel RE • L’importazione co-traduzionale nel RE rappresenta il primo passaggio della via di distribuzione delle proteine neosintetizzate in varie localizzazioni del sistema di endomembrane. Le proteine destinate alla distribuzione mediante questo meccanismo, sono sintetizzate da ribosomi che si associano alle membrane del RE. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 79 • Attraverso una serie di esperimenti, si riuscì a vedere che alcuni polipeptidi neoformati passavano nel lume del RE durante la loro sintesi, permettendo il loro successivo indirizzamento da parte del RE verso la corretta destinazione. • Come fa la cellula a determinare quali polipeptidi devono entrare direttamente nel lume del RE? Nel 1971, Gunter Blobel e David Sabatini ipotizzarono l’ipotesi del segnale. Quest’ultima stabilisce che, nel caso di polipeptidi destinati al RE, il primo segmento a essere sintetizzato (N-terminale) contiene una sequenza segnale per il RE, che indirizza il complesso ribosoma-mRNA-polipeptide verso la superficie del RER, dove viene ancorato. • Le proteine che contengono tali sequenze sono spesso definite preproteine. Studi di sequenziamento hanno rivelato che, pur essendo la composizione amminoacidica delle sequenze segnale per il RE sorprendentemente variabile, sono identificabili parecchie caratteristiche unificanti. • Le sequenze segnale per il RE sono lunghe normalmente 15/30 AA e contengono tre domini: una regione N-terminale carica positivamente, una regione centrale idrofobica e una regione polare vicino al sito dove avverrà il taglio della proteina matura. • L’estremità carica positivamente può promuovere l’interazione con l’esterno idrofilico della membrana del RE, mentre la regione idrofobica può favorire l’interazione della sequenza segnale con l’interno lipidico della membrana stessa. • Una volta stabilita l’esistenza delle sequenze segnale per il RE, diventa chiaro che i polipeptidi in corso di sintesi si devono associare alla membrana del RE prima che la maggior parte del polipeptide emerga dal ribosoma. Se la traduzione continua senza che avvenga l’adesione al RE, il ripiegamento del polipeptide in sintesi può nascondere la sequenza segnale. • Il contatto con il RE è mediato da una particella di riconoscimento del segnale (SRP) che riconosce e si lega alla sequenza segnale del polipeptide in formazione e successivamente aderisce alla membrana del RE. • La struttura della SRP è molto articolata e comprende sei differenti polipeptidi complessati con una molecola di RNA (RNA 7S). Le componenti proteiche posseggono tre siti attivi principali: uno che riconosce e lega la sequenza segnale, uno che interagisce con il ribosoma per bloccare l’ulteriore traduzione e uno che lega la membrana del RE. • Il processo inizia quando un mRNA che codifica per un polipeptide destinato al RE inizia a essere tradotto su un ribosoma libero. La sintesi procede finchè la sequenza segnale non è stata prodotta e non emerge dalla superficie del ribosoma. • A questo punto, la SRP lega la sequenza segnale e blocca l’ulteriore traduzione. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 80 • La SRP inizialmente si lega al recettore per SRP, permettendo al ribosoma di rimanere attaccato al suo recettore. Successivamente, il legame di GTP al complesso SRP-recettore, rimuove il blocco della traduzione e causa il trasferimento della sequenza segnale alla proteina del poro. • Il core del poro è formato da tre subunità che formano il complesso Sec61; quest’ultima presenta un canale centrale che si apre non appena vi si inserisce la sequenza segnale. Il GTP viene idrolizzato e la SRP rilasciata. • Man mano che si allunga, il polipeptide finisce nel lume del RE e la peptidasi del segnale taglia la sequenza segnale, che è poi rapidamente degradata. Quando la sintesi è finita, il polipeptide finale è rilasciato nel lume, il canale del traslocone si chiude e il ribosoma si stacca dal RE. NB. Affinché la proteina non si ripieghi durante il passaggio nel lume del RE, sono presenti delle proteine denominate NAC (Complesso proteico Associato al peptide Nascente). • La maggior parte delle proteine sintetizzate sui ribosomi adesi al RE sono glicoproteine. Le reazioni iniziali di glicosilazione avvengono nel RE, spesso mentre il polipeptide in allungamento è ancora in corso di sintesi. Dopo che i polipeptidi sono stati rilasciati nel lume, glicosilati e ripiegati, essi sono inviati per mezzo di diversi tipi di vescicole di trasporto alle loro destinazioni. • La prima “fermata” di questa via è l’apparato di Golgi, dove può avvenire un’ulteriore glicosilazione e maturazione dei gruppi glucidici. Per le proteine solubili, la via normale di smistamento comporta il loro trasporto verso il Golgi e successivamente nella membrana plasmatica per la loro secrezione. • La SRP, quindi, lega il ribosoma a una speciale struttura della membrana del RE, chiamata traslocone, poiché effettua la traslocazione del polipeptide attraverso la membrana. • Il traslocone è un complesso proteico composto da parecchi componenti coinvolte nell’importazione co-traduzionale, che includono: un recettore per SRP al quale si lega la SRP, un recettore per il ribosoma, una proteina del poro che forma un canale attraverso il quale il polipeptide entra, e una peptidasi del segnale (enzima che rimuove la sequenza segnale). BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 83 NB. Il pH basso dell’endosoma tardivo (circa 5,5) causa la dissociazione dell’enzima dal recettore. Indirizzamento delle Proteine –Dal RER • La composizione proteica del RE è mantenuta sia impedendo che le proteine sfuggano dal compartimento quando le vescicole gemmano dalla sua membrana, sia recuperando le proteine che hanno lasciato il RE raggiungendo la zona cis del Golgi (CGN). • Non è chiaro come le proteine vengano trattenute dal RE ma una teoria suggerisce che si vengano a creare dei complessi fisicamente troppo grandi per essere secreti tramite vescicole. Diverse proteine localizzate nel RE contengono la sequenza tripeptidica Arg-X- Arg che sembra promuovere la ritenzione nel RE (marcatore di ritenzione). • Il recupero, che avviene tramite il flusso retrogrado delle vescicole di trasporto dal CGN al RE, è maggiormente noto ai ricercatori. Molte proteine solubili RE-specifiche contengono marcatori di recupero che si legano a specifici recettori transmembrana rivolti verso il lume dell’apparato di Golgi. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 84 • I segnali sono brevi sequenze di amminoacidi situate al C-terminale della proteina come KDEL (Lys- Asp-Glu-Leu) o KKXX (dove X indica un qualsiasi amminoacido). Quando una proteina contenente un tale segnale si lega al suo recettore, quest’ultimo subisce un cambiamento conformazionale e il complesso ligando-recettore viene chiuso in un una vescicola e spedito nel RE. Indirizzamento delle Proteine – Importazione post-Traduzionale nel Nucleo • Per avere un’idea dell’intensità del traffico attraverso i pori nucleari, è necessario considerare il flusso di subunità ribosomali dal nucleo al citosol. I ribosomi sono parzialmente assemblati nel nucleo come due classi di subunità, ognuna delle quali è costituita da un complesso di RNA e proteine. • Queste subunità si spostano verso il citosol e, quando sono necessarie per la sintesi proteica, si combinano per formare dei ribosomi funzionali. In una cellula mammifera (che contiene circa 3000/4000 pori nucleari) le subunità ribosomali devono essere trasportate nel citosol a una velocità di 5/6 subunità per minuto per poro. • Nel percorso inverso, in fase di replicazione, sono richiesti circa 100 molecole di istoni per poro per un totale di circa 300000 molecole al minuto. Oltre al trasporto di macromolecole devono far fronte al trasporto odi particelle e molecole più piccole e ioni. Diffusione semplice di piccole molecole attraverso i pori nucleari: a seguito di diversi esperimenti ci si rese conto che piccole particelle possono muoversi liberamente avanti e indietro attraverso i pori nucleari. La velocità di ingresso delle particelle nel nucleo era inversamente proporzionale al diametro, più una molecola è larga più lento è il suo ingresso nel nucleo. Particelle con un diametro maggiore di c.a. 10nm erano totalmente escluse ma dato che il diametro di un poro nucleare era molto più largo di tale misura, si concluse che il complesso del poro contiene minuscoli canali acquosi di diffusione attraverso i quali piccole particelle e molecole possono muoversi liberamente. Il diametro calcolato dai ricercatori è di circa 9nm (considerando i tempi di diffusione di molecole radioattive con diverse dimensioni). Si pensa che questi canali acquosi siano liberamente permeabili a ioni e piccole molecole (piccole proteine e nucleotisidi trifosfato). Trasporto attivo di grosse proteine e di RNA attraverso i pori nucleari: alcune proteine nucleari sono molto grosse: gli enzimi della sintesi di RNA e DNA, gli mRNA (che sono legati a proteine) e le subunità ribosomali. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 85 Un grande numero di evidenze suggerisce che le particelle e le molecole di grandi dimensioni attraversino i pori nucleari con un meccanismo di trasporto attivo selettivo. Questo trasporto attivo richiede energia e coinvolge un legame specifico della sostanza da trasportare con proteine della membrana (parti integranti della struttura del poro nucleare). Queste proteine posseggono uno o più segnali di localizzazione nucleare (NSL), costituiti da sequenze amminoacidiche che permettono alla proteina di essere riconosciuta dalle nucleoporine FG e quindi trasportata attraverso il poro nucleare. Un tipico NSL è lungo 8/30 amminoacidi e normalmente contiene prolina, così come gli amminoacidi carichi positivamente come lisina e arginina. Tramite degli esperimenti è stato scoperto che il massimo diametro per un trasporto attivo attraverso l’involucro nucleare sembra essere di 26nm. Importazione nucleare attraverso la via Ran/Importina: molte proteine citoplasmatiche contenenti il segnale NSL sono importate nel nucleo attraverso un tipo particolare di proteina recettoriale, chiamata importina, che si lega al segnale NSL e media il movimento della proteina verso il poro nucleare. Nella fase 1, una proteina del citosol contenente il segnale NSL è riconosciuta da un’importina. Nella fase 2, il complesso importina-proteina-NSL è trasportato all’interno del nucleo dal trasportatore, localizzato al centro del complesso del poro nucleare (NPC). Arrivata nel nucleo, la molecola di importina si associa con un proteina che lega il GTP, detta Ran, interazione che permette il rilascio della proteina cargo (che verrà sfruttata nel nucleo). Successivamente, il complesso Ran-GTP-importina viene ritrasportato nel citosol attraverso il poro nucleare (fase 4), dove l’importina è rilasciata per essere riutilizzata, in un passaggio accompagnato dall’idrolisi del GTP legato a Ran (fase 5). BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 88 • Successivamente, la sequenza di transito presente all’estremità N-terminale del polipeptide si lega alla componente recettoriale del complesso TOM. Le proteine chaperon sono rilasciate in concomitanza con l’idrolisi dell’ATP, mentre il polipeptide viene traslocato attraverso i pori del TOM e del TIM. • Non appena la sequenza di transito emerge nella matrice, è rimossa dalla peptidasi di transito. L’ingresso della parte restante del polipeptide nella matrice è accompagnato dal legame transitorio con le proteine chaperon mitocondriali Hsp70. • Il successivo rilascio di Hsp70 richiede l’idrolisi dell’ATP, che si ritiene traini il processo di traslocazione. Infine, in molti casi le proteine chaperon mitocondriali Hsp60 si legano al polipeptide e lo aiutano a raggiungere la sua conformazione nativa. NB. Il mitocondrio, come il cloroplasto, hanno diversi comparti. Le proteine destinate a zone diverse rispetto alla matrice hanno, oltre alla sequenza segnale per il mitocondrio, anche sequenze segnale aggiuntive. Modificazioni post-traduzionali • Spesso, dopo che le catene polipeptidiche sono state sintetizzate, devono essere modificate chimicamente prima di poter svolgere la loro funzione. Tali modificazioni sono note come modificazioni post-traduzionali. • Nei batteri il gruppo formilico localizzato all’estremità N-terminale delle catene polipeptidiche è normalmente rimosso. Inoltre, la metionina alla quale era legato è spesso anch’essa rimossa, così come quella che è presente all’inizio dei polipeptidi eucarioti. Come risultato, si osserva che relativamente pochi polipeptidi maturi mostrano la metionina al loro N-terminale, anche se iniziavano tutti con questo aminoacido. • A volte, interi blocchi di amminoacidi sono rimossi dalle catene polipeptidiche. Per esempio, certi enzimi sono sintetizzati come precursori inattivi che devono essere attivati mediante la rimozione di una specifica sequenza a una delle due estremità (taglio proteolitico). Anche il trasporto delle proteine attraverso le membrane può richiedere la rimozione o l’aggiunta di sequenze amminoacidiche o gruppi glucidici (ex. sequenze segnale). BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 89 • Altri eventi comuni di maturazione includono la modificazione chimica di singoli gruppi di amminoacidi, per esempio mediante reazioni di metilazione, fosforilazione e acetilazione. Inoltre, un polipeptide può essere glicosilato (aggiunta di catene glucidiche laterali) o può essere aggiunto un gruppo prostetico (ex. gruppo eme dell’emoglobina). • In aggiunta ai tipi di modificazione post-traduzionale già descritti, alcune proteine canno incontro allo splicing proteico, analogo al fenomeno dello splicing dell’RNA. Specifici segmenti di amminoacidi, chiamati inteine, sono rimossi dalla proteina e le rimanenti regioni, dette esteine, sono unite a formare la proteina matura. • Lo splicing proteico è normalmente intramolecolare, coinvolgendo l’escissione di un’inteina da una singola catena polipeptidica mediante un meccanismo autocatalitico. Tuttavia, lo splicing può avvenire anche tra due catene polipeptidiche diverse, derivate da due molecole distinte di mRNA. EX. (Maturazione dell’insulina) La proteina insulina matura è costituita da due subunità unite tra loro da ponti disolfuro; queste due subunità derivano da una singola proteina più lunga, nota come preproinsulina. Quest’ultima è soggetta a diversi eventi di maturazione. Il primo è la rimozione dei “pre- “amminoacidi per produrre la proinsulina. Si formano dei legami disolfuro (sono presenti amminoacidi cisteinici) tra quelle che diventano la subunità A e B della proteina matura. Infine, gli amminoacidi interposti (“pro- “) vengono rimossi per formare la proteina insulina matura. Glicosilazione: l’elaborazione delle proteine effettuata all’interno del RE e dell’apparato di Golgi comporta il ripiegamento delle proteine, il controllo qualità e la glicosilazione con formazione delle glicoproteine. Nelle cellule si osservano due tipi generali di glicosilazione: Glicosilazione legata a N (N-glicosilazione): implica l’aggiunta di una specifica unità oligosaccaridica all’atomo di azoto del gruppo amino-terminale di alcuni residui di asparagina; Glicosilazione legata a O (O-glicosilazione): implica l’aggiunta di un oligosaccaride all’atomo di ossigeno dei gruppi ossidrilici di alcuni residui di serina o di treonina e, in rari casi, di tirosina. NB. Ciascuna fase della glicosilazione è strettamente dipendente dalle modificazioni precedenti. Un errore in una fase, dovuto magari a un enzima difettoso, può bloccare l’ulteriore modificazione di una catena laterale glucidica e può causare malattie all’organismo. Dopo che i polipeptidi sono stati rilasciati nel lume del RE, essi si ripiegano per assumere la loro conformazione nativa definitiva, il ripiegamento e l’associazione sono facilitati dai chaperon. BIOLOGIA GENERALE A.A. 2022/23 Prof.ssa: T. Gamberi. pag. 90 Uno dei più abbondanti chaperon presenti nel lume del RE è un membro della famiglia di chaperon Hsp70 chiamata BiP. Come gli altri chaperon Hsp70, BiP si lega alle regioni idrofobiche delle catene polipeptidiche, in particolare a quelle ricche di AA triptofano, fenilalanina e leucina. Il legame del BiP alle regioni idrofobiche dei polipeptidi non ripiegati che emergono nel lume del RE li stabilizza impedendone l’aggregazione con altri polipeptidi non ripiegati. Quindi, il rilascio dei polipeptidi da parte di BiP, accompagnato dall’idrolisi di ATP, offre agli stessi polipeptidi una piccola opportunità di ripiegarsi correttamente. Spesso il ripiegamento è accompagnato dalla formazione dei ponti disolfuro fra le cisteine localizzate in differenti regioni della catena polipeptidica. Questa reazione è facilitata dalla proteina disolfuro isomerasi. Le prime fasi della N-glicosilazione avvengono sulla superficie del RE rivolto verso il lato citoplasmatico, mentre le successive si verificano nel lume del RE. Nonostante la varietà di oligosaccaridi presenti nelle glicoproteine mature, tutte le catene laterali glucidiche aggiunte alle proteine nel RE hanno inizialmente una struttura comune, chiamata oligosaccaride core (due unità di N-acetilglucosammina, nove unità di mannosio e tre unità di glucosio). La glicosilazione inizia quando il dolicolo fosfato, un trasportatore di oligosaccaridi, è inserito nella membrana del RE. I gruppi GlcNAc e mannosio sono aggiunti al gruppo fosfato del dolicolo fosfato. L’oligosaccaride core crescente viene successivamente traslocato dal citosol al lume grazie ad una flippasi. All’interno del lume del RE vengono aggiunte altre unità di mannosio e glucosio. L’oligosaccaride core completo è trasferito, come un’unità singola, dal dolicolo a un residuo di asparagina della proteina ricevente. Infine, l’oligosaccaride core attaccato alla proteina è aggiustato e modificato. In genere l’oligosaccaride core viene aggiunto alla proteina mentre il polipeptide è in corso di sintesi su un ribosoma legato alla membrana del RE. Questo meccanismo di glicosilazione cotraduzionale contribuisce a promuovere il corretto ripiegamento delle proteine. L’aggiunta di una singola unità di glucosio permette alle proteine del RE di interagire con le glicoproteine di nuova sintesi per garantire un ripiegamento ottimale.