Appunti di Biologia Cellulare, Appunti di Biologia Cellulare

Scarica Appunti di Biologia Cellulare e più Appunti in PDF di Biologia Cellulare solo su Docsity! Gli atomi costituiscono la materia, ogni elemento è costituito da un solo tipo di atomi. alcuni elementi (H, C, N, O) costituiscono il 99 percento del numero totale di atomi della materia vivente. alcuni di essi sono necessari in tracce mentre altri sono ESSENZIALI. Le molecole vengono classificate in base ai gruppi funzionali che conferiscono specifiche proprietà alle molecole. Le quattro principali famiglie di molecole organiche presenti nelle cellule e che formano le subunità della maggior parte delle macromolecole sono: -ZUCCHERI detti anche POLISACCARIDI -ACIDI GRASSI -AMMINOACIDI o PROTEINE -NUCLEOTIDI o ACIDI NUCLEICI. Una generica CELLULA BATTERICA è formata al 70 percento di acqua (H2O) e al 30 percento da composti chimici. ACQUA è una molecola polare e tende ad associarsi con altre molecole di acqua; molti composti sono insolubili in acqua. Essa regola le reazioni di condensazione ed idrolisi. CONDENSAZIONE è energicamente sfavorevole (inserisci immagine) IDROLISI è energicamente favorevole (immagine) Picco le mo leco le , i monomer i , s i l egano covalentemente fra loro per formare macromolecole che a loro volta si assemblano tramite legami non covalenti per formare complessi macromolecolari. GLI ZUCCHERI detti anche glucidi o carboidrati, sono fonte di energia • forniscono scheletri carboniosi per la costruzione di strutture e l'espletamento di funzioni biologiche. | TRIOSI (tre atomi di carbonio) | PENTOSI (cinque atomi di carbonio) -ribosio e desossiribosio | ESOSI (sei atomi di carbonio) -glucosio e fruttosio Si dividono in: |polisaccaridi--> amido, cellulosa |disaccaridi |monosaccaridi sono una categoria eterogenea di composti • hanno una natura idrofobica |IDROFOBICA sono sostanze apolari, incapaci di formare legami idrogeno con l'acqua I LIPIDI • forniscono energia • sono componenti base di strutture cellulari e messaggeri chimici. I TRIGLICERIDI sono esteri del glicerolo • sono coposti da glicerolo ed acidi grassi |ESTERE legame tra un acido ed un alcol |TRIGLICERIDI DI ORIGINE ANIMALE contengono più acidi grassi saturi e sono solidi a temperatura ambiente |TRIGLICERIDI DI ORIGINE VEGETALE sono in prevalenza liquidi • in quelli saturi le catene possono avvicinarsi molto fino ad impacchettarsi I FOSFOLIPIDI costituiscono le membrane cellulari • a differenza dei trigliceridi, il terzo gruppo alcolico è esterificato con una molecola di acido fosforico a cui si aggiunge una molecola carica come serina, colina o etanolammina. |DOPPIA NATURA polare-non polare, che in ambiente acquoso risulta nella formazione delle membrane. |FOSFOLIPIDI E MEMBRANE la fluidità della membrana dipende dalla quantità di acidi grassi saturi ed insaturi presenti; • più sono saturi, meno sono fluidi STRUTTURA ha una testa polare e due code apolari. Possiamo avere st rut ture a doppio st rato fosfolipidico, a micella e a monostrato fosfolipidico. [2] VARI TIPI DI STRUTTURE FOSFOLIPIDICHE 1 BIOLOGIA CELLULARE INTRODUZIONE [1] FOSFOLIPIDE |LIPOSOMA è una struttura a doppio strato immersa in acqua, che può avere solo forma ciclizzata. GLI SFINGOLIPIDI si trovano nelle membrane e hanno come molecola di base la sfingosina. GLI STEROIDI sono lipidi biologicamente importanti • a temperature basse aumenta la fluidità mentre a temperature alte impedisce che le membrane diventino troppo liquide/fluide • alcuni steroidi sono il colesterolo e i suoi derivati. COLESTEROLO da esso derivano gli ormoni steroidei è presente nella membrana cellulare STRUTTURA DI BASE è l'anello policiclico del ciclopentano fenantrene. ACIDI NUCLEICI • DNA e RNA sono costituiti da unità monomeriche di nucleotidi • i singoli nucleotidi sono uniti fra loro da legami fosfodiestere |LEGAME FOSFODIESTERE si formano tra lo zucchero di un nucleotide ed il fosfato del nucleotide successivo. |i nucleotidi sono formati da: -una base azotata -uno zucchero pentoso -uno o più fosfati (acido fosforico) DNA è una molecola a doppio filamento, con le due catene polinucleotidiche tenute insieme da legami idrogeno che si formano tra le basi azotate. • i due filamenti hanno direzione opposta • è una molecola puramente informazionale poichè contiene il patrimonio genetico • è formato da desossiribbonucleotidi |PATRIMONIO GENETICO è codificato nella sequenza delle basi presenti nei suoi filamenti. [3] STRUTTURA DNA RNA consiste in una sola catena polinucleotidica, quindi a filamento singolo • ha molteplici funzioni e differenti molecole diverse • è composto da ribonucleotidi [4] STRUTTURA RNA DIVERSE MOLECOLE DI RNA |RNA TRANSFER o tRNA è l'RNA di trasporto, principalmente di amminoacidi durante la traduzione; ha una struttura a trifoglio |RNA MESSAGGERO o mRNA è importante per il trasporto dell'informazione genetica |PICCOLI RNA (citoplasmatici, nucleari e nucleolari) fanno parte di strutture che partecipano a vari processi ES. le particelle ribonucleoproteiche deputate allo splicing e alla telomerasi SPLICING maturazione degli RNA messaggeri TELOMERASI processo di allungamento delle estremità dei cromosomi |RNA RIBOSOMALE componente dei ribosomi che assemblano le proteine. L'RNA può formare strutture a più filamenti nonostante abbia un filamento singolo: |STRUTTURA PRIMARIA è una sequenza di nucleotidi |STRUTTURA SECONDARIA ha la capacità di appaiarsi su sé stessa per formare molte regioni. COMPOSIZIONE DEI NUCLEOTIDI abbiamo visto che i nucleotidi sono formati da: -base azotata -zucchero pentoso -acido fosforico 2 [11] |Un'enzima accelera la reazione; in corrispondenza del valore massimo della velocità della reazione catalizzata, in ogni istante tutte le molecole dell'enzima sono combinate con le molecole di substrato [12] |Per creare ordine, le cellule svolgono una serie di reazioni chimiche. Esse devono produrre piccole molecole e devono usare le piccole molecole per produrre macromolecole. Quindi ogni cellula è una minuscola fabbrica chimica che svolge milioni di reazioni al secondo. GLI ENZIMI sono proteine che si legano a molecole, chiamate substrati, riuscendo ad abbassare l'energia di attivazione per una reazione, rendendola quindi possibile. [13] [16] IMMAGINI sono prese anche dalle slide |Nella cellula abbiamo la glicolisi e la respirazione cellulare che producono energia. Esse avvengono esternamente al mitocondrio. Dopo queste reazioni si ha la produzione di 32 molecole di ATP. 5 L'ORIGINE DELLA VITA La vita ha preso avvio da sistemi non viventi, 4 miliardi e mezzo di anni fa. Da delle sostanze semplici si è passato a macromolecole complesse tramite l'interazione tra molecole. Le macromolecole si trovano segregate in membrane chiuse. Si originano le prime cellule. GLI ORGANISMI VIVENTI quelli attualmente viventi/esistenti sono: • procarioti: batteri, eubatteri e archebatteri • eucarioti: uomo, piante ed animali. Il patrimonio genetico dei procarioti non è racchiuso nel nucleo. Analizzando delle sequenze di RNA ribosomale dei batteri, si possono vedere le differenze tra uomo e batteri. INNOVAZIONE GENETICA Il gene pò subire delle mutazioni favorevoli o sfavorevoli. La mutazione è la modalità di innovazione genetica più comune, sebbene ne esistano delle altre: • rimescolamento di segmenti di DNA • mutazione intragenica • duplicazione genica • trasferimento orizzontale |Man mano che un corpo si accresce dimensionalmente, il suo volume aumenta più rapidamente della sua superficie. Per garantire un adeguato metabolismo, è indispensabile che il rapporto tra superficie e volume sia elevato: ciò spiega perché le cellule che costituiscono gli organismi debbano essere numerosissime e minuscole piuttosto che poche e voluminose. Proprietà della materia vivente La materia vivente ha delle proprietà particolari e fondamentali che la distinguono dalla materia non vivente e che sono: |Complessità strutturale: grande quantità di informazioni contenute nel DNA e l'unità fondamentale sono le cellule |Capacità di accrescersi: aumentare la propria massa grazie al metabolismo |Capacità di autoriprodursi |Capacità di adattarsi all'ambiente |Capacità di reagire agli stimoli: reattività |Capacità di produrre e utilizzare energia |Capacità di creare e mantenere un ordine: in un universo che tende al disordine. LA CELLULA è l'unità fondamentale degli essere viventi. • tutti gli esseri viventi sono costituiti da una o più cellule. • ogni cellula deriva da una divisione di una cellula preesistente e tutte le cellule si moltiplicano per divisione binaria. |PRIMO SGUARDO ALLA STRUTTURA La cellula contiene una porzione di soluzione acquosa, il citosol, delimitata da una membrana a doppio strato lipidico, la membrana plasmatica. • contiene almeno una molecola di acido desossiribonucleico DNA che contiene l'informazione genetica • contiene l'insieme di enzimi necessari alla replicazione del genoma e all'espressione dell'informazione genetica. |Le cellule si dividono in cellule procariotiche e cellule eucariotiche. • CELLULE PROCARIOTICHE sono le cellule più semplici che non hanno il nucleo • CELLULE EUCARIOTICHE hanno un organizzazione più complessa e hanno il nucleo che contiene il patrimonio genetico. IL PATRIMONIO GENETICO e DNA è fondamentale; è presente in una cellula uovo- fecondata e determina la natura dell'intero organismo. |IL DNA costituisce il patrimonio genetico. • è una molecola informazionale che contiene le informazioni che servono alla cellula; • è costituito da 4 nucleoitidi, ognuno contenente uno zucchero fosfato e una base, che si alternano a formare un filamento; • ha una struttura a doppia elica poichè è costituito da due filamenti [17] 6 |REPLICAZIONE DEL DNA La cellula prima di riprodursi deve replicare il suo DNA. Questo avviene tramite polimerizzazione su stampo: la sequenza di nucleotidi esistente controlla la sequenza in cui i nucleotidi vengono uniti in un nuovo filamento: • i due filamenti si staccano tra di loro • un filamento funge da stampo per il secondo: si parte da una doppia elica di DNA detta doppia elica parentale. • T si accoppia con A e G si accoppia con C. [18] FLUSSO DELL'INFORMAZIONE GENETICA |REPLICAZIONE Il DNA deve essere replicato ma anche espresso. Quando si esprime significa che vengono prodotte delle molecole che vanno a determinare delle specifiche funzioni. Tra gli acidi nucleici troviamo anche l'RNA che serve a trasportare l'informazione. |TRASCRIZIONE è la trascrizione dell'informazione presente nel DNA in un'altra molecola,l'RNA, in cui avviene la sintesi RNA messaggero. |TRADUZIONE è in sostanza la sintesi di una proteina, in cui l'mRNA porta l'informazione e viene poi tradotto in una proteina. In questo processo, i nucleotidi con le loro basi determinano quali amminoacidi dovranno costituire la proteina, poichè a tre nucleotidi corrisponde uno dei 20 particolari amminoacidi che costituiscono le proteine cellulari. [19] |Quando abbiamo la trascrizione, abbiamo tante molecole di RNA, necessarie alla sintesi di tante proteine. Ogni molecola di RNA può essere tradotta più volte. [20] |Il flusso dell'informazione genica è utilizzato, anche nell'ingegneria genetica, per modificare un gene che ha delle modificazioni, intervenendo a livello di uno dei processi descritti. Ad esempio si può agire sulla sintesi di una proteina che porta ad una patologia specifica. Il metodo più efficace ma anche più difficile sarebbe l'intervento sul DNA, in modo tale da bloccare la produzione di mRNA e quindi la sintesi di una data proteina. LE CELLULE PROCARIOTE [21] Sono i batteri (eubatteri e archebatteri); • hanno una struttura semplice con pochi organelli. PRIMO SGUARDO ALLA STRUTTURA • citosol dove sono presenti i ribosomi e il patrimonio genetico • nucleoide zona specifica dove possiamo trovare il DNA; è diverso dal nucleo poiché non è delimitato da membrana come negli eucarioti • membrana plasmatica o membrana cellulare • parete cellulare struttura tipica dei batteri e delle cellule vegetali • capsula struttura non presente in tutti i batteri 7 |BATTERI FOTOTROFICI sono quelli che ricavano energia dalla luce; • formano lunghi filamenti pluricellulari. V= cellule che fanno fotosintesi H= cellule che fissano l'azoto S= spore |SPORE alcuni batteri sono sporigeni, cioè sono in grado di formare delle spore; • sono delle forme di resistenza, in grado quindi di resistere anche a condizioni ambientali particolari o sfavorevoli. [31] |BATTERI LITOTROFICI usano come nutrienti dei composti inorganici; • fissano il carbonio dall'anidride carbonica; • ottengono energia ossidando H2S (acido solfidrico); • troviamo per questo depositi di zolfo all'interno di questi batteri [32] |CAPSULA è una struttura che si trova all'esterno della parete cellulare o della membrana esterna di Gram-positivi o Gram-negativi; • è formata da materiale polisaccaridico; • ha attività antifagocitaria, cioè i batteri che la presentano non vengono fagocitati; • protegge dagli antibiotici; • non si trova in tutti batteri, ma solo in alcune specie. [33] il batterio è il bacillo; la capsula è l'alone circostante |FAGOCITOSI avviene perché le cellule fagocitiche del sistema immunitario [negli eucarioti superiori] oppure cellule amebe che per mangiare fagocitano batteri, riconoscono i batteri; Questo processo è specifico, cioè la cellula ingloba il batterio che viene riconosciuto da specifici recettori. I recettori si trovano sulla membrana della cellula e riconoscono molecole che si trovano sulla membrana/parete della cellula da fagocitare. La capsula copre il batterio, nascondendo le proteine che permetterebbero di riconoscerlo e fagocitarlo. |ALTRE STRUTTURE PRESENTI sono strutture accessorie: • pili e fimbrie sono strutture che partono dalla membrana esterna; |servono per l'adesione a superfici o a cellule; |servono per la coniugazione, cioè la comunicazione fra due batteri; è un processo tramite cui i batteri scambiano materiale genetico. [34] coniugazione • flagelli hanno struttura complessa, che arriva fino al citosol; |il flagello è elicoidale e spesso |è in grado di ruotare su se stesso, potendo così muoversi in un fluido [35] flagello |IL MOVIMENTO • non tutti i batteri possono muoversi; • quando i flagelli si muovono, si uniscono a formare un ciuffo che spinge il batterio in avanti |Il movimento permette al batterio di muoversi in luoghi che gli interessano: • chemiotassi, andando verso o lontano da gradienti di nutrienti • fototassi, vanno verso la luce, per la fotosintesi • aerotassi tipica di batteri anaerobi, aerobi e microaerofili. 10 BATTERI PATOGENI |I GENI DI VIRULENZA cioè quelli che definiscono la patogenicità, possono essere: • confinati in un plasmide di virulenza • presenti nelle isole di patogenicità all'interno del genoma del batterio. In generale i geni che rendono il batterio patogeno, [possono essere eliminati] sono stati identificati per molti batteri come Escherichia Coli, salmonella. Questi geni non sono quindi sparsi nel genoma, ma sono raggruppati in delle regioni. [36] batteri patogeni |PROCESSI CARATTERISTICI DEI BATTERI |TRASFORMAZIONE si intende il processo tramite cui un batterio può ricevere materiale genetico da un altro batterio: • in alcuni batteri è un processo naturale, poiché essi contengono già dei processi per far avvenire la trasformazione per cui essi vengono detti trasformabili naturalmente; • in altri casi non succede e quindi è un processo utilizzato per far esprime dei geni immessi in un batterio tramite l'introduzione in laboratorio di DNA • trasformazione tumorale: quando si ha una cellula animale normale che diventa una cellula tumorale. I VIRUS detti anche batteriofagi o fagi, infettano le cellule batteriche. Essi inniettano il loro materiale genetico nella cellula, per poterne prendere il controllo e produrre altri virus, poichè essi non hanno sistemi metabolici e non possono autoriprodursi. I virus non sono cellule, per cui non si accrescono in dimensioni né si dividono, ma vengono montati cioè i vari componenti virali si assemblano nella cellula infettata. Questo può portare a degli errori che potrebbero per esempio portare il virus a prendere pezzi di DNA della cellula che ha infettato. Andando poi ad infettare un'altra cellula, il virus trasferirà anche il DNA acquisito. Ecco perchè parliamo di trasduzione. |TRASDUZIONE processo tramite cui un batterio acquisisce materiale genetico tramite i virus. • in alcuni casi si parla anche di trasduzione del segnale, cioè le cellule sono in grado di segnalarsi, avvisarsi, tra loro di alcune situazioni. (segnalazione cellulare). |CONIUGAZIONE processo in cui alcune fibre particolari collegano due batteri potendo così scambiare materiale genetico. [37] PROCESSI BATTERI LE CELLULE EUCARIOTE [38] |STRUTTURA DELLA CELLULA si caratterizza per: |NUCLEO è ben definito, • struttura che contiene e racchiude tramite membrane il DNA • è circondato da due membrane |NUCLEOLO si trova nel nucleo, • è una struttura al cui interno si assemblano le subunità ribosomali, che poi vengono trasportate nel citoplasma dove si trsfaormano in ribosomi • i ribosomi servono per la sintesi delle proteine. |PORI NUCLEARI sono strutture che interrompono il nucleo. |RETICOLO ENDOPLASMATICO si trova oltre il nucleo e può essere: • liscio • ruvido quando sopra vi sono i ribosomi |MEMBRANA NUCLEARE è una struttura che si trova in continuità con il reticolo endoplasmatico. 11 |ALTRI ORGANELLI possiamo trovare: • i mitocondri, • l'apparato del Golgi • le vescicole, deputate all'integrazione di materiale dall'esterno. |Nelle cellule eucariotiche animali non vi è la parete cellulare come nei batteri o nelle eucariotiche vegetali. |CITOSCHELETRO è una sorta di scheletro proprio della cellula; • è importante per sostenere, far muovere e dare forma alla cellula. • se lo inibiamo o facciamo in modo che sia distrutto, la cellula diventa tondeggiante e perde la sua forma è costituito da differenti ''classi'' • citoscheletro di tubulina • citoscheletro di actina filamenti di actina che vanno dal centro del nucleo verso la periferia della cellula • i filamenti intermedi di proteine presenti in tutte le cellule, ma non tutte le loro proteine sono presenti. [39] SCHEMA CELLULA ANIMALE DIMENSIONI DEL GENOMA Le cellule eucariotiche animali possono avere varie forme, in particolare le cellule emapoietiche quindi quelle che si trovano nel tessuto de sangue hanno forma tondeggiante mentre le altre hanno tutte forme differenti. Non sempre la dimensione del genoma prevede un avanzamento nella scala evolutiva: • il genoma dell'uomo è più piccolo in dimensioni di genomi di altre specie viventi. |FORMAZIONE DELLA CELLULA La cellula eucariotica si distingue dalla procariotica e dai batteri per la presenza del nucleo. All'inizio c'era una cellula procariotica che è riuscita a dare un compartimento al materiale genetico, portando alla formazione del nucleo. • a partire da un archibatterio anaerobo, si sviluppa un nucleo primitivo; • ingloba un batterio aerobico • questo porta alla nascita dei mitocondri, che si pensa siano batteri inglobati dalla cellula (poiché in essi si trova DNA diverso da quello cellulare); • infine si forma la cellula eucariotica aerobica, che ha quindi bisogno di ossigeno per la presenza dei mitocondri. [40] FORMAZIONE DELLA CELLULA |Nella cellula eucariotica, oltre al citoscheletro, troviamo una serie di compartimenti delimitati da membrane: • reticolo endoplasmatico • apparato del Golgi • endosomi • lisosomi • perossisomi La presenza di questi organelli nella cellula, non è costante. es. cellula pancreatica ha una quantità di reticolo endoplasmatico liscio 16 volte inferiore rispetto ad un epatocita, o ancora una quantità 2,5 volte superiore di membrana plasmatica. Le proporzioni nella cellula sono quindi diverse e dipendono dalla funzione della cellula: molta secrezione di proteine ci sarà molto reticolo endoplasmatico e Golgi. |COME SI MANTENGONO I COMPARTIMENTI è necessario che gli organelli siano ben definiti, non si devono mescolare tra loro e scambiare contemporaneamente materiale. IL RUOLO DELLE PROTEINE Svolgono un ruolo centrale nel mantenimento dei compartimenti. Esse, a seconda che vengano sintetizzate a livello dei ribosomi o del reticolo endoplasmatico, avranno diverse localizzazioni all'interno della cellula • avviene tramite processi di smistamento. (RIF. FLUSSO INFORMAZIONE GENETICA) 12 DIAGNOSI INFEZIONE DA VIRUS I virus non sono visibili al microscopio ottico; • la loro identificazione può avvenire solamente in maniera indiretta (effetto citopatico). INFEZIONE DA MICOPLASMA Anch'essi non sono visibili al microscopio ottico. In genere l'infezione si manifesta con segni di deterioramento della coltura quali: 1) modificazioni delle caratteristiche di crescita 2) modificazioni del metabolismo 3) modificazioni antigeniche La diagnosi di infezione si fa con tecniche colturali colorimetriche, immunologiche e molecolari. TECNICHE COLORIMETRICHE Si basano sull'uso di coloranti fluorescenti che colorano il DNA in modo specifico. • i coloranti vengono assunti dalle cellule; • se oltre alla fluorescenza nucleare, si evidenziano delle particelle, dei foci fluorescenti, anche nel citoplasma e negli spazi intercellulari, si ha la contaminazione; • rivela solo contaminazioni pesanti; [47] micoplasma TECNICHE IMMUNOLOGICHE Utilizzano anticorpi specifici per le proteine del micoplasma. • se l'anticorpo si lega, si rivela il micoplasma. TECNICHE MOLECOLARI Rivelano il DNA dei micoplasmi. • sono una delle tecniche più potenti perché usano il PCR, una tecnica tramite cui si amplifica una porzione di DNA. COLTURE CELLULARI ANIMALI Si suddividono in due tipi principali: |COLTURE IN ADESIONE o in MONOSTRATO • cellule che per crescere hanno bisogno di aderire ad supporto, la cui forma dipende dall'adesione tramite spreading. |COLTURE IN SOSPENSIONE • cellule non hanno bisogno di un supporto; • cellule emopoietiche. [48] COLTURE L'IMPORTANZA DELL'ADESIONE L'adesione è importante e necessaria alle cellule in monostrato, perchè altrimenti non sopravvivrebbero (neuroni o cellule muscolari). Le tappe per l'adesione sono differenti: • cellule in contenitori di plastica carichi tramite agenti chimici o radiazioni; • secrezione di proteine della matrice extracellulare e di proteoglicani da parte delle cellule; • adesione della matrice a substrati carichi ancora tondeggianti; • legame delle cellule alla matrice attraverso specifici recettori • spreading cioè le cellule si allungano sul substrato, acquisendo la loro forma, con successiva proliferazione CRESCITA DI UNA LINEA CELLULARE La curva di crescita di una linea cellulare prevede: 1) FASE DI LATENZA o FASE LAG le cellule non aumentano in numero, vi è una fase di riparazione e attacco al substrato; 2) FASE DI CRESCITA ESPONENZIALE o FASE LOG crescita; 3) FASE STAZIONARIA confluenza, quiescenza; una fase stabile senza modificazioni. 4) FASE DI DECADIMENTO morte. [49] Curva di CRESCITA 15 |La crescita delle cellule non continua perchè finiscono i nutrienti o lo spazio, oppure entrambi. La curva si può applicare sia a cellule eucariotiche che procariotiche: |nelle cellule procariotiche • la fase di latenza può o non può esserci perchè dipende dal terreno di coltura; • se si danno terreni poveri a batteri abituati a terreni ricchi, ci sarà la fase di latenz perhcè si dovranno abitare al nuovo habitat; |nelle cellule eucariotiche • in adesione, la fase di latenza rappresenta il tempo per aderire e per lo spreading. • cambia per quelle in sospensione. LE LINEE CELLULARI |linee cellulari a vita finita dopo un certo numero di passaggi entrano in fase di senescenza (invecchiamento) e poi di morte; • hanno un corredo cromosomico diploide; • dipendono dai fattori di crescita presenti nel siero |linee cellulari continue possono dividersi senza fine (cellule immortali) e possono derivare: • dalle colture primarie; • dalle linee cellulari a vita finita (spontaneamente o artificialmente); • da cellule ottenute da un tumore. • tutte le linee cellulari continue sono aneuploidi cioè hanno un corredo cromosomico anormale. EVOLUZIONE DI UNA COLTURA Avviene secondo una curva che spiega cosa succede quando si prelevano delle cellule da un tessuto o da un organo e le mettiamo in coltura per arrivare a creare noi una linea cellulare. [50] schema di una coltura In questa curva si evidenziano le subcolture. |SUBCOLTURE le cellule di un terreno di coltura, vengono prelevate e poste in un nuovo terreno; • sono quindi cellule a cui viene dato nuovo spazio e nuovi nutrienti; • la prima subcoltura rappresenta una transizione importante per la coltura: da una coltura primaria eterogenea emerge una linea cellulare, che si fa omogenea dopo poche subcolture. ANALIZZARE L'EVOLUZIONE DI UNA COLTURA I passaggi sono differenti: PRIMO PASSAGGIO: |separare le cellule del tessuto tra loro e dalla matrice • si tratta il tessuto con degli enzimi (proteasi) che degradano le proteine e distruggono la matrice e i contatti tra le cellule; • si possono usare gli alorolionasi per degradare (manca una parte poco chiara) |diminuzione del numero delle cellule • avviene dopo la disconnessione delle cellule, • è dovuto al danneggiamento delle cellule ma anche al cambio di ambiente che subiscono le cellule nel trattamento precedente; |aumento del numero di cellule • successivamente vi è un'aumento del numero di cellule • si parla di coltura primaria COLTURA PRIMARIA si ha quando le cellule vengono prelevate dal tessuto o dall'organo e vengono messe in coltura. Sono colture eterogenee con differenti tipi cellulari. SECONDO PASSAGGIO: |le cellule vengono passate • quando le cellule arrivano a confluenza (o quasi), vengono ''passate'', cioè vengono diluite in una nuova piastra; • qui si ha la linea cellulare primaria • queste cellule vengono passate in continuazione (subcoltura) quando arrivano quasi a confluenza; LINEA CELLULARE PRIMARIA Sarà omogenea poiché in pochi passaggi prevaricheranno le cellule che proliferano ad una più alta velocità (potenziale di replicazione maggiore) arrivare a confluenza: occupare tutta la piastra TERZO PASSAGGIO: |fase stazionaria e senescenza • dopo tre passaggi si arriva alla fase stazionaria, con successiva senescenza; • le cellule vanno incontro a morte perché invecchiano e non perché mancano i nutrienti o lo spazio (come succede nella curva di crescenza); • può capitare che la crescita riparta: se succede è perché vi è una linea cellulare secondaria. LINEA CELLULARE SECONDARIA avrà la capacità di dividersi senza fine. 16 CENNI DI NOMENCLATURA |PASSAGGIO: quando la linea viene subcoltivata. |GENERAZIONE: ogni raddoppiamento cellulare |NOME DELLA LINEA CELLULARE: codice che esprime il tessuto di provenienza, nome del paziente se tumorale, numero del clone etc. SUBCOLTURA DI CELLULE ADERENTI [51] COME STACCARE CELLULE IN ADESIONE 1. NRK cell dopo il lavaggio con PBS prima della tripsinizzazione; 2. immediatamente dopo l'aggiunta di tripsina; 3. 1 minuto dopo l'aggiunta di tripsina. Se le cellule sono in adesione, come le NRK (Newborn Rat Kidney), si utilizza la tripsina per staccarle. Si nota che, dopo poco tempo dall'uso della tripsina, ritornano ad avere una forma tondeggiante. Si usa a volte il PBS, soluzione salina bilanciata dove le cellule sopravvivono un po', perché a volte vengono trattate con siero, il quale ha spesso inibitori della tripsina e quindi il PBS toglie quel siero che può inibire la tripsina. Dopo poco si potranno prelevare le cellule e spostare in un nuovo terreno. BHK baby hamster kidney: rene di criceto neonato. Vi sono due modalità di svolgimento: |Produzione di cellule in proliferazione continua è assicurata dalla bassa densità cellulare e dall'apporto di nutrienti e fattori di crescita, che vengono passate più volte. |Mantenimento delle funzioni specializzate è assicurato dalla coltivazione su substrati che riproducono l'ambiente in vivo: in questo caso si favorisce lo sviluppo di funzioni specializzate, non la proliferazione continua. ANTICORPI MONOCLONALI Le colture sono utili per la produzione di anticorpi monoclonali, proteine in grado di riconoscere gli antigeni, in particolare i domini. • sono prodotti dalle cellule del sistema immunitario; • una delle cellule che produce gli anticorpi, ne produce solo un tipo [52] Gli anticorpi infatti possono dividersi in: |ANTICORPI POLICLONALI (più cloni) • si mette la proteina in un animale e si recupera il siero (avrà gli anticorpi contro la proteina prodotti dall'animale); • potremo avere un anticorpo policlonale composto da diversi cloni cellulari, ognuno produce diversi anticorpi e riconosce diverse parti della proteina; • questi anticorpi sono unici e non caratterizzati in quanto lo stesso esperimento prodotto su un altro animale produce un anticorpo policlonale differente. |ANTICORPI MONOCLONALI (un solo clone) • si ha un solo tipo di anticorpo che riconosce un dominio della proteina; • questo anticorpo si può avere in quantità illimitate ed è sempre lo stesso anticorpo. ESEMPIO DI PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI • si mettono insieme cellule tumorali di topo (linee continue) e cellule che producono anticorpi prelevate dal siero di un topo al quale sono state iniettate le cellule tumorali (questo produce gli anticorpi); • le induciamo alla fusione per formare cellule chiamate chiamate ibridomi (poichè derivano dalla fusione di due cellule diverse) in un terreno selettivo in cui sopravvivranno solo gli ibridomi (detti anche eterocarionti poiché hanno due nuclei) che conserveranno la capacità di dividersi senza fine (cellule tumorali) e la capacità di produrre anticorpi. 17 CLONE CELLULARE è un gruppo di cellule che deriva da una cellula di partenza e producono lo stesso anticorpo dividendosi. In realtà l'RNAsi è un caso particolare ed il ripiegamento è mediato dall'attività di altre proteine, CHAPERON MOLECOLARI che catalizzano il ripiegamento, aiutando il processo di autoassemblaggio: • legano e stabilizzano i polipeptidi parzialmente ripiegati o svolti (cioè gli intermedi); • impediscono aggregazioni o ripiegamenti non corretti; • molte di queste proteine sono identificate come proteine dello shock da calore poiché espresse dopo l'esposizione delle cellule ad alte temperature o altri stress ambientali; • sono molto conservate nell'evoluzione. Le due famiglie principali sono: |Hsp70 (Heat shock protein 70) si legano alla proteina mentre si sta traducendo e la mantengono nella forma non ripiegata, fin quando la proteina non viene del tutto tradotta e assume la forma finale; • avviene sicuramente quando la proteina passa dal citoplasma agli organelli; • la proteina deve mantenersi svolta per attraversare le membrane dei mitocondri ed entrare negli organelli poiché potrebbe ripiegarsi in maniera errata. |Hsp60 (Heat shock protein 60) sono formati da tante subunità (7 sopra e 7 sotto) ed una struttura a doppia ciambella con cavità dove le proteine svolte possono entrare per ripiegarsi; • ci sono anche dei ''coperchi'' che si chiudono quando la proteina entra; • raggiunta la conformazione finale, la proteina esce dalla struttura. Quando gli Hsp70 si staccano, o la proteina si ripiega da sola o si usufruisce degli Hsp60 Ci sono delle tappe di ripiegamento; se una viene sbagliata o la proteina viene PAROLA dagli chaperon verso la via corretta, oppure viene riconosciuta e degradata. Importante è che queste si degradino perché possono portare a delle patologie. MODIFICAZIONI Nella cellula quasi tutte le proteine sono modificate chimicamente dopo la loro sintesi sui ribosomi. Le modificazioni possono alterare l'attività, la vita media e la localizzazione cellulare delle proteine. Le alterazioni delle proteine possono essere distinte in due categorie: |MODIFICAZIONI CHIMICHE comprendono il legame di un gruppo chimico e possono essere in molti casi reversibili; • ACETILAZIONE (CH3CO al gruppo amminico N- terminale) è la forma più comune di modificazione e sembra sia presente nell'80% delle proteine (proteine non acetilate vengono rapidamente degradate). Sembra abbia capacità stabilizzante; è reversibile perchè le eproteine possono essere de- acetilate; • IDROSSILAZIONE aggiunta di un gruppo idrossile; • METILAZIONE aggiunta di un gruppo metile CH3; • CARBOSSILAZIONE aggiunta gruppo carbossile COOH; • GLICOSILAZIONE aggiunta di zuccheri; • AGGIUNTA di LIPIDI • FOSFORILAZIONE aggiunta gruppo fosfato. 20 GLICOSILAZIONE è l'aggiunta di zuccheri più o meno ramificati ad una proteina; • è una modificazione co-traduzionale che serve per la stabilizzazione della struttura della proteina, per il suo ripiegamento e influenza la sua attività; • ha un ruolo nel ripiegamento con le proteine di membrana: queste si legano ai carboidrati e aiutano la proteina a ripiegarsi correttamente. • N-glicosilazione (RE): aggiunta di una catena glucidica di 14 zuccheri su N di un'asparagina • O-glicosilazione (Golgi): aggiunta di zuccheri uno alla volta su O di serina, treonina o idrossilisina. CO-TRADUZIONALE avviene o può avvenire durante la traduzione. Non in tutti i casi è così. N-glicosilazione è l'aggiunta di 14 zuccheri sull'azoto di un'asparagina; • avviene nel reticolo endoplasmatico mentre la proteina si sta traducendo; • i 14 zuccheri possono essere modificati quindi aggiunti, tolti etc. Tra i 14 zuccheri ci sono mannosio, glucosio e N-acetilglucosammina. Una proteina può essere glicosilata in vari punti (dove si trova l'asparagina). Nella O-glicosilazione gli zuccheri sono aggiunti uno per volta, mentra in questo caso vi è l'aggiunta di una catena di zuccheri. |La glicosilazione è importante nel ripiegamento perché a livello del reticolo ci sono due proteine (carreeticulina e carrexina) che si legano ai carboidrati, bloccano la formazione della proteina e favoriscono il corretto ripiegamento. AGGIUNTA LIPIDICA è una modificazione che può avvenire: |nel citosol • N-miristilazione aggiunta di acido miristico (acido grasso) ad una glicina N-terminale; • prenilazione aggiunta di un gruppo fenile: farnesile o geranil-geranile ad una cisteina C-terminale; • palmitilazione aggiunta di palmitato ad una cisteina interna; |nel reticolo endoplasmatico • aggiunta di un'ancora di glicosilfosfatidilinositolo (GPI) aggiunta al gruppo carbossilico terminale delle catene polipeptidiche. Queste modificazioni mediano l'attacco alle membrana cellulari delle proteine non di membrana. I lipidi entrano nella membrana e le proteine restano ancorate nel loro compartimento alla membrana, solo grazie ai lipidi. MIRISTILAZIONE è l'aggiunta di un acido grasso; • la metionina iniziale viene rimossa durante la miristilazione (avviene una modificazione di mutazione); • la glicina si lega all'N-terminale della catena polipeptidica diventando il primo amminoacido; • viene poi aggiunto l'acido miristico che è un acido grasso a 14 atomi di carbonio. |Se non vi è la glicina, la proteina non si può miristilare, non si può attaccare alla membrane e quindi non potrà funzionare correttamente. PALMITILAZIONE si aggiunge il palmitato (acido grasso a 16 carboni) alla catena laterale di un residuo interno di cisteina. PRENILAZIONE anche nella farnesilazione vi sono più modificazioni. |Le proteine farnesilate terminano con un residuo di cisteina (Cys), seguito da due amminoacidi alifatici (A) ed un amminoacido di qualunque tipo (X) al C- terminale; • si aggiunge un gruppo farnesilico, a 15 atomi di carbonio, alla catena laterale della cisteina; • si ha poi la rimozione proteolitica dei 3 amminoacidi C-terminali; • infine si ha la metilazione della cisteina, che si troverà così al C-terminale. 21 |Quelle ancore farnesilate etc. non attraversano tutta la membrana ma solo una parte del doppio strato lipidico. gruppi di proteine differenti IMPORTANZA DELLE MODIFICAZIONI LIPIDICHE Le modificazioni servono ad ancorare le proteine alla membrana, influenzandone le funzioni. PROTEINE RAS è una proteina oncogenica, che regola la proliferazione delle cellule; • è coinvolta nella generazione di una cellula tumorale (oncogenica); • è una GTPasi, una proteina che lega ed idrolizza il GTP (nucleotide trifosfato); • queste proteine sono anche chiamate interruttori molecolari perché sono proteine che passano uno stato attivo, quando legate al GTP ad uno stato inattivo quando legate al GDP (nucleotide difosfato); |Di solito legano il GTP quando serve la proliferazione e lo idrolizzano legandosi al GDP quando non serve: poiché legate al GDP sono inattive. Nelle cellule tumorali si ha una proteina RAS sempre attiva, poiché è mutato il gene muta anche la proteina, che non è più in grado di idrolizzare il GTP, continuando la proliferazione all'infinito. La proteina RAS è farnesilata, si ancora alla membrana plasmatica e stimola la proliferazione. Esse alternano forme attive legate a GTP a forme inattive legate aL GDP. La differenza è l'alterazione della conformazione di due regioni della molecola, designate interruttori I e II. FARNESIL-TRANSFERASI se si usano gli inibitori della farnesil-transferasi su cellule tumorali, si evita che le proteine si leghino alla membrana e si blocca la proliferazione, impedendo la crescita tumorale. L'ANCORA GPI Il GPI (glicosilfosfatidilnositolo) è un glicolipide. L'aggiunta dell'ancora GPI avviene a livello del reticolo: • si attacca ad una parte della proteina che attraversa la membrana. FOSFORILAZIONE è l'aggiunta di un gruppo fosfato ad una proteina; avviene da parte di un'enzima chinasi o fosfatasi; prevede l'attivazione o disattivazione di una proteina: • le chinasi provvedono alla fosforilazione; • le fosfatasi rimuovono i gruppi fosfato. L'aggiunta di un fosfato avviene ad una catena laterale polare come quella degli amminoacidi serina, treanina o tirosina. Può essere reversibile. Le GTPasi sono enzimi e vengono regolati da altre proteine come: • GEF (guanine exchange factor) che stimola lo scambio nel nucleotide della proteina G; • GAP stimola l'idrolisi del GTP da parte della proteina G e quindi l'attività glicosidica. fine discorso modificazioni chimiche |MODIFICAZIONI DI MATURAZIONE prevede la rimozione di segmenti peptidici, quindi vengono eliminate delle parti di proteine, ed è generalmente irreversibile. Quella più comune è il taglio proteolitico. TAGLIO PROTEOLITICO è un meccanismo comune utilizzato per la rimozione di un peptide segnale; • è catalizzato dagli enzimi proteasi; • molto importante per l'attivazione e inattivazione di enzimi; • viene effettuato principalmente per le sequenze segnale, un gruppo di amminoacidi che funzionano come indirizzo della proteina. alcuni esempi sono enzimi coinvolti nella coagulazione del sangue, enzimi digestivi, ormoni (insulina, EGF) Quando la proteina si trova in un certo compartimento, la sequenza non serve più e viene quindi rimossa ed eliminata. MATURAZIONE DELL'INSULINA La molecola matura dell'insulina consiste di due catene polipeptidiche unite da legami disolfuro. Essa è sintetizzata come un polipeptide precursore (prepoinsulina) che contiene una sequenza segnale amminoterminale che viene tagliata durante il trasferimento della catena polipeptidica al reticolo endoplasmatico, per essere secreta. Questo taglio produce la proinsulina che viene convertita in insulina da un'ulteriore proteolisi che rimuove il polipeptide interno di connessione. 22 |UBL (ubiquitin like) • SUMO è una proteina simile all'ubiquitina (small ubiquitin-related modifier); -controlla il ciclo cellulare, la trascrizione e la struttura della cromatina. • ATG8 e ATG12 (sono due UBL) coinvolte nell'autofagia; -il substrato di ATG8 è ATG5, una proteina coinvolta nelle prime fasi dell'autofagia; -il substrato di ATG12 è la fosfatidietanolammina. UBIQUITINA Ogni ubiquitina ha 7 lisine, tra cui sono ubiquitinate solo la lisina 29, 48 e 63. Ogni ubiquitina si lega ad un'altra tramite lisine che trovano tutte nella stessa posizione; in base al tipo di catena variano anche le funzoni: • Poli K (29): degradazione mediata dal lisosoma; • Poli K (48): degradazione mediata dal proteasoma -ogni monomero è legato alla lisina 63 del monomero precedente; • Poli K (63): modificazione della funzione di specifiche proteine, riparo del DNA, sintesi proteica, endocitosi. |29, 48 e 63 modificano la posizione della lisina all'interno della sequenza amminoacidica. PROTEINE SUMO I substrati delle proteine sumo possono avere differenti funzioni: • possono essere proteine nucleari; • possono essere fattori di trascrizione; • inibire l'entrata del glutammato, stimolando il recettore GluR6; • co-regolazione; • riparare o replicare il DNA. La sumoilazione dei canali ionici di membrana, K2P1 e Kv1.5, ne inattiva parzialmente la funzione. LE MODIFICAZIONI Molte proteine sono modificate su siti multipli. |Uno stesso sito può essere modificato in molti modi: • es. una lisina può essere acetilata, metilata, ubiquitinata. |Le modificazioni sono spesso sequenziali. |Una modificazione ne può prevenire un'altra. Nella cellula esistono principalmente la degradazione UPS e quella lisosomale. Lisosomi sono degli organelli degradatori (o digestivi) e presentano degli enzimi detti idrolisi acide. Essi tutto quello che arriva da lui. Idrolisi acide funzionano a pH acido, come nel lisosoma. |La differenza con la degradazione UPS è che seleziona le proteine in base alle sequenze: per questo quella lisosomale è stata definita non- selettiva. |Il materiale che giunge dal lisosoma, deriva prettamente dall'esterno tramite endocitosi |ENDOCITOSI internalizzazione di materiale tramite vescicole o compartimenti delimitati da membrana. L'endocitosi si divide in: • PINOCITOSI: ''il bere della cellula''; -vengono internalizzati i fluidi extracellulari con molecole varie; -alcune forme di pinocitosi sono state chiamate endocitosi; • FAGOCITOSI: ''il mangiare della cellula'' -viene internalizzato il materiale particolato, come cellule batteriche o pezzi di cellule. |Qualsiasi cosa entri tramite pinocitosi o fagocitosi, viene degradata dal lisosoma. AUTOFAGIA tramite l'autofagia si eliminano frammenti cellulari o altro: -perchè non sono più utili; -per risparmiare energia. Quindi anche questo processo degrada materiali cellulari. |Fornisce energia in caso di problemi • se in coltura non ci sono amminoacidi, la cellula si riempirà di autofagi per produrre nutrienti e poter sopravvivere; AUTOFAGOSOMA: STRUTTURA E FUNZIONI Presenta due membrane (al contrario dell'endosoma o del fagosoma che hanno una membrana che deriva da quella plasmatica) che derivano da una membrana di isolamento. Membrana di isolamento va a richiudersi intorno all'organello (es. mitocondrio) che effettua l'autofagia. Idrolisi acide hanno pH=5 e sono: • nucleasi • proteasi • glicosidasi • lipasi • solfatasi • fosfolipasi. Quelli ad essere acidi sono i compartimenti tramite cui si giunge al lisosoma. L'acidità è dpvuta alla pompa protonica, enzima con protoni H+ che vengono introdotti nei lisosomi per farne abbassare il pH. |La degradazione lisosomale non è propriamente non-selettiva, dato che alcune proteine dal citosol vengono inviate ai lisosomi per essere degradate. 25 |Nelle cellule di mammifero: • previene l'invecchiamento; • elimina strutture vecchie o aberranti; • serve per il differenziamento e lo sviluppo; • difende dai patogeni; • difende dai tumori; • gioca un ruolo nel rimodellamento cellulare; • permette la sopravvivenza in condizioni nutrizionali sfavorevoli; • è coinvolta nella morte cellulare programmata. I patogeni, solitamente, sfuggono alle difese del'organismo e si dirigono verso le cellule (per i nutrienti e la protezione). Solitamente si fanno fagocitare e dal fagosoma si dirigono nel citosol. Tramite l'autofagia, il batterio può essere inglobato e portato verso il lisosoma per la degradazione ma esso non riuscirà ad evadere per via delle membrane. PROCESSO DI MACROAUTOFAGIA • la membrana di isolamento si espande utilizzando vescicole o piccole cisterne per inglobare porzioni di citoplasma contenenti organelli, formando l'autofagosoma; • l'autofagosoma, con il contributo prima degli endosomi precoci e tardivi, e poi dei lisosomi, diventa autolisosoma cioè un organello in grado di digerire il materiale che è contenuto al suo interno. |La macroautofagia consiste nella degradazione di porzioni di citoplasma e organelli, in un organello specifico chiamato autolisosoma. |La microautofagia consiste nell'inglobamento diretto da parte dei lisosomi di organelli che saranno poi degradati. |Nell'autofagia mediata da chaperon molecolari, proteine citosoliche, normalmente non indispensabili, vengono indirizzate (con l'aiuto degli chaperon) ai lisosomi per essere degradate in caso di deprivazione dei nutrienti. IMPORTANZA DI RIPIEGAMENTO E DEGRADAZIONE • le proteine ripiegate in modo anomalo sono implicate nelle malattie a sviluppo lento; • normalmente l'errato ripiegamento di una proteina comporta perdita delle normali funzioni e rende la proteina bersaglio per la degradazione proteolitica; • l'accumularsi di frammenti proteolitici può contribuire all'instaurarsi di malattie degenerative caratterizzate dalla presenza di placche proteiche insolubili in vari organi (es. fegato, cervello etc.) Morbo di Alzheimer caratterizzato dalla formazione di placche e matasse intracellulari nel cervello che derivan dal'attività proteolitica di proteine naturali presenti in abbondanza. Malattie prioniche dovute all'accumulo di proteina prionica (variante conformazionale di una normale proteina cerebrale). SEGNALAZIONE CELLULARE La segnalazione cellulare è la capacità delle cellule di percepire segnali, sia interni che esterni alla cellula, e rispondere correttamente. Essa consente quindi di dare risposte giuste. Quando nei fluidi è presente una certa molecola, essa può legarsi ad un recettore posto sulla membrana. La molecola è una molecola segnale, mentre il recettore è un recettore proteico, una proteina che attraversano la membrana e hanno un dominio. COME AVVIENE LA SEGNALAZIONE • la molecola si lega al recettore; • il recettore attiva altre proteine a cascata (proteine di segnalazione); L'ultima della catena agisce su altre proteine (enzima metabolico, proteina regolatrice della trascrizione, proteine del citoscheletro), dette proteine effettrici. Queste proteine svolgono determinate funzioni: • enzima metabolico: altera il metabolismo; • proteina del citoscheletro: altera la forma/ movimento cellulare; • proteina della trascrizione: altera l'espressione genetica. La funzione è scelta e dettata dal segnale mandato: SEGNALAZIONE SEMPLICE DI TIPO INTRACELLULARE. 26 SEGNALAZIONE INTERCELLULARE Esistono 4 tipi di segnalazione intercellulare (tra cellule) che sono: • dipendente da contatto richiede che le cellule siano in contatto. C'è una cellula segnale, che espone una proteina sulla membrana, e la cellula bersaglio, che ha il recettore che si lega alla precedente molecola e sarà quella che cambierà alcune funzioni. •paracrina la cellula segnale produce molecole secrete all'esterno e le molecole si legheranno ai recettori posti sulle cellule bersaglio. Le molecole secrete sono dette mediatori locali e si legheranno solo alle cellule vicine (non attaccate). • sinaptica chiamata così per via della presenza dei neuroni. Essi, con le sinapsi, passano il segnale ad un altro neurone o un'altra cellula. Nota bene: I neuroni hanno un corpo cellulare ed un assone che può arrivare ad essere lungo 1 metro (neurone periferico). Alla fine dell'assone vi è un bottone sinaptico in cui si accumulano i neurotrasmettitori. Se si deve inviare il segnale, i neurotrasmettitori vengono rilasciati e si legheranno ai soliti recettori della cellula bersagli. I neurotrasmettitori sono rilasciati a lunga distanza dal corpo cellulare. •endocrina dipende dalle cellule endocrine, che producono ormoni che finiscono nel sangue per arrivare a cellule molto distanti dalla cellula endocrina di partenza. I recettori sono di 2 tipi: •DI SUPERFICIE proteine di membrana che riconoscono le molecole segnale; • INTRACELLULARI si trovano all'interno della cellula (o nel citosol o nel nucleo). Le molecole che vengono riconosciute, entrano all'interno della cellula ma prima di entrare si dissociano dalla proteina trasportatrice. Alcuni tipi di segnali che vengono inviati sono: •sopravvivi; •cresci e dividiti; •differenziati: induzione ad esprimere caratteristiche per funzioni specifiche; •muori: avviene in assenza di segnale. |La cellula è sempre sottoposta a più segnali, che si sommano per dare un unico messaggio. I tipi di morte cellulare sono convenzionalmente 2: • NECROSI: la cellula muore perchè sottoposta ad agenti tossici e va incontro a lisi. • APOPTOSI la cellula programma di morire (causa inutilità o vecchiaia) quindi si parla di suicidio della cellula. |Nella necrosi, il materiale interno alla cellula fuoriesce e danneggia le cellule vicine, mentre nell'apoptosi la cellula si frammenta in corpi apoptici delimitati da membrana (per non danneggiare le cellule vicine). Vengono poi fagocitate da altre cellule, digerite e distrutte. Si pensa che l'apoptosi sia dovuto alla mancanza di segnale. |La segnalazione cellulare può servire anche: • esempio A: si riduce il ritmo di contrazione del cuore quando la cellula pacemaker risponde all'acetilcolina (molecola segnale); • esempio B: si ha la secrezione se una cellula di ghiandole salivarie risponde all'acetilcolina; • esempio C:si ha la contrazione se una cellula del muscolo scheletrico risponde all'acetilcolina. 27 Il batteriofago ha una struttura complessa: • la testa che contiene il patrimonio genetico; • un collo ed altre strutture che le permettono di attaccarsi alle cellule. ↳ in circa un'ora possono far produrre centinaia di virus e portare la cellula alla morte (avviene la lisi). INVOLUCRO MEMBRANOSO È caratteristico di alcuni virus animali. • proviene dalla membrana plasmatica o da altre membrane della cellula ospite (RE, nucleo, Golgi), modificate con proteine virali dette spine ↳ SPINE sono strutture proteiche che sporgono e permettono al virus di infettare. ↓ Nel virus dell'influenza si trovano due tipi di spine: HA spina emoagglutinina per l'attacco del virone alla superficie della cellula ospite; NA spina neuroaminidasi per la liberazione dei nuovi vironi dalla cellula ospite. Ci sono alcuni virus animali che differiscono per forma e dimensione: • herpesvirus • papillomavirus • adenovirus • coronavirus • HIV • virus della rabbia • virus della parotite Ovviamente possono avere diversi tipi di spine. Alcuni virus possono scegliere modalità differenti per infettare. IL CICLO LITICO DI UN BATTERIOFAGO Si ha una cellula batterica, ad esempio Escherichia Coli, che ha un DNA a doppio filamento e viene infettato da un T4 virus batterico. Si ha: • virus libero che riconosce il batterio; • inietta il DNA • il DNA viene trascritto in RNA, tradotto in proteine virali e poi replicato. Il processo avviene ad opera della cellula, poiché i virus liberi non sono virus viventi; 1. Il patrimonio genetico del virus prende il controllo della cellula e i virus vengono montati per interazioni tra macromolecole; 2. la cellula si rompe perché non ha più il suo DNA e non svolge più le sue funzioni, se non la sola produzione di proteine virali. I virus non possono infettare qualsiasi tipo di cellula perché ci deve essere interazione tra virus e batterio, in particolare tra proteine del virus e recettori delle cellule (T4 infetta solo Escherichia Coli). IL CICLO LISOGENICO È un'alternativa al ciclo litico; ↳ il virus lamba può scegliere se infettare E. Coli con ciclo litico oppure lisogenico. Questo ciclo prevede che il virus sia in grado di integrare il suo patrimonio genetico con quello della cellula (invece che creare subito proteine virali): ogni volta che la cellula si dividerà e replicherà il proprio patrimonio genetico, nelle cellule figlie replicherà anche quello del virus. ↳ il virus si presenta quindi in tante cellule |Si può comunque passare dal ciclo lisogenico a quello litico. Parliamo di provirus quando il patrimonio genetico del virus si integra a quello della cellula. Il ciclo lisogenico serve ad infettare tante cellule con poco sforzo. CICLO NEI VIRUS ANIMALI prevede: 1. ADSORBIMENTO DEL VIRUS ALLA CELLULA ↳ riconoscimento dei recettori da parte del virus i recettori danno la specificità di un'infezione. 2. INGRESSO NELLA CELLULA vi sono delle reazioni se ↳ il virus ha membrana: entra nella cellula, fondendo la membrana virale con quella plasmatica; successivamente il nucleo-capside entra nel citoplasma, si rompe il capside e l'acido nucleico si libera. ↳ il virus non ha membrana: si ha l'endocitosi (o fagocitosi), processo tramite cui la cellula internalizza il materiale esterno, attraverso le vescicole o compartimenti chiusi da membrana. 30 3. LIBERAZIONE DELL'ACIDO NUCLEICO ↳ il patrimonio genetico viene liberato e agisce: a livello del citoplasma (virus a RNA); a livello del nucleo (virus a DNA). 4. TRASCRIZIONE DEL GENOMA VIRALE 5. TRADUZIONE ↳ sintesi proteica; nelle cellule si sintetizza una proteina per volta, ma nei virus si può avere la produzione di poliproteine; queste vengono poi tagliate dalle proteasi per dare proteine virali. Ci sono degli studi per impedire alle proteasi di effettuare il taglio e bloccare quindi l'infezione. 6. REPLICAZIONE DELL'ACIDO NUCLEICO 7. ASSEMBLAGGIO NUOVI VIRONI ↳ i virus vengono montati per interazione tra macromolecole. Le proteine virali che vengono create possono servire: prendere il controllo della cellula; avere funzione strutturale, ovvero le proteine del capside. Ci sono delle fasi che stabiliscono quali proteine vengono prodotte (sono le fasi del ciclo): precoci tardive 8. LIBERAZIONE DELLE PARTICELLE VIRALI avviene tramite ↴ lisi cellulare riguarda virus senza involucro; gemmazione riguarda virus con involucro; esocitosi riguarda virus con involucro. Un virus che esce per gemmazione, si porta un po' di membrana quindi porta comunque alla lisi cellulare. Questo vale anche per l'esocitosi, ovvero il processo secondo cui entrano in una via secretoria e vengono portati, passivamente, verso l'esterno. CICLO DI UN VIRUS ANIMALE A DNA ingresso nella cellula e perdita del rivestimento; trascrizione del DNA e replicazione in DNA virale; assemblaggio di nuove particelle virali; uscita dalla cellula. RICORDA I virus che entrano per endocitosi, devono necessariamente uscire dalle vescicole o dai compartimenti, poiché, se dovessero procedere in quella via, finirebbero nei lisosomi dove sarebbero poi distrutti. STRATEGIE DI INGRESSO DEI VIRUS • il virus dell'AIDS, l'HIV ↳ entra nella cellula tramite la fusione della propria membrana con quella plasmatica, con successiva distruzione del capside e liberazione dell'acido nucleico; • il virus dell'influenza ↳ utilizza l'endocitosi: -una volta entrato nel citoplasma, il pericapside si fonde con la membrana e il capside viene distrutto; • il poliovirus ↳ utilizza l'endocitosi con successiva distruzione del capside e formazione di un poro; • l'adenovirus ↳ entra per endocitosi: -quando si trova nel citoplasma, lisa l'endosoma in cui è contenuto, si porta verso il nucleo e libera il DNA al suo interno; Ci sono dei virus che escono dalla cellula per gemmazione, quindi escono gemmando dalla membrana plasmatica. Un esempio è il virus del morbillo. GEMMAZIONE DEI VIRUS ANIMALI Abbiamo detto che i virus che hanno un involucro membranoso (con una o più membrane intorno al capside) prendono queste membrane dalle cellule che infettano e queste sono membrane cellulari modificate da proteine virali. ↳ sono le spine. Quando abbiamo parlato delle proteine e dei vari processi di smistamento, abbiamo detto che le proteine possono essere sintetizzate: -sui ribosomi del citosol; -sui ribosomi adesi al reticolo endoplasmatico. ↳ le proteine qui sintetizzate, vengono poi inserite nel reticolo: a livello del lume del reticolo (per poi andare nel Golgi, nelle vescicole o secrete all'esterno); alla membrana del reticolo (per poi andare nelle corrispettive membrane del Golgi..). 31 Se guardiamo le proteine virali sintetizzate a partire dall'mRNA virale, vedremo che anche esse potranno essere sintetizzate: su ribosomi adesi al reticolo su ribosomi del citosol ↳ si inseriranno nella membrana del reticolo e arriveranno fino alla membrana della cellula. Le proteine virali che sono state inserite nella membrana della cellula, sono dette proteine transmembrana virali (le spine); ↳queste proteine possono essere di più tipi e servono ai virus per entrare o per uscire dalla cellula. Si ha la cellula infettata ↳ le proteine virali hanno modificato la membrana plasmatica , nel citoplasma ci sono tanti patrimoni genetici virali e tante proteine virali (tra cui quelle del capside). Le proteine virali si formano per montaggio: ↳ le proteine del capside interagiscono con il patrimonio genetico virale e si forma il nucleo-capside. Questo è un virus dotato di involucro, quindi il suo nucleocapside non basta (se messo a contatto con cellule, non reagirà). Le proteine virali sono PROTEINE TRANSMEMBRANA, per cui hanno: un dominio extracellulare; un dominio citosolico; ↳ in questo dominio hanno un sito per l'interazione con le proteine del capside; ↳ se la cellula è piena di nucleocapsidi, essi si legheranno al dominio citosolico delle proteine virali un dominio transmembrana. Quando arrivano altre proteine che si legano al nucleo capside, si fermano tutte intorno ad esso e creano un incurvamento della membrana. A questo punto si ha la gemmazione del virus che porta con sé la membrana plasmatica della cellula, insieme alle proteine virali. VIRUS DELL'HERPES si assembla come nucleocapside nel nucleo. Dopo il virus gemma dalla membrana nucleare e si ritrova nel reticolo endoplasmatico. Questo virus, dopo essere gemmato, esce dal reticolo per fusione e ritorna nel citoplasma come nucleocapside. Gemma di nuovo ma si ritrova nel Golgi. In questo caso si dice che il virus esce per esocitosi, poiché, una volta entrato nel Golgi, viene trasportato passivamente per poi essere secreto. VIRUS VACCINICO cambia la sua forma e prende delle membrane per poi ritrovarsi con tre membrane. Uscirà, tramite fusione con la membrana plasmatica, e si ritroverà con solo due membrane. CLASSIFICAZIONE DEI VIRUS ANIMALI In generale è molto difficile classificare i virus; la prima divisione fu fatta tra: virus animali, virus vegetali e virus batterici. Un'altra classificazione fu fatta in base alla patologia che causano, non essendo efficace al 100% poiché molti virus hanno sintomi simili. I virus animali vengono classificati in base: • al genoma • modalità di produzione di mRNA virale. Vi sono sei differenti classi: 1° CLASSE ↳ virus a DNA a doppio filmento; ↳ si ha il classico processo di trascrizione. 2° CLASSE ↳ virus a DNA a singolo filamento; ↳ si ha la produzione di una copia. I due filamenti sono marcati: + (riferito all'mRNA) o - 3° CLASSE ↳ virus ad RNA a doppio filamento 4° CLASSE ↳ virus ad RNA a singolo filamento positivo; ↳ usa come stampo un filamento negativo per formare tanti mRNA. 5° CLASSE ↳ virus ad RNA a singolo filamento; ↳ è usato come stampo per gli mRNA. 6° CLASSE ↳ retrovirus con RNA a singolo filamento positivo ↳ viene copiato in un filamento di DNA negativo che viene copiato in un doppio filamento di DNA. Quest'ultimo è detto processo di retrotrascrizione ed è gestito dall'enzima di trascrittasi inversa. 32 Nella membrana troviamo anche: TRASPORTATORI ⇪ molecole a complessi proteici che di alternano tra due conformazioni così che il sito di legame per il soluto sia accessibile sequenzialmente su un lato e poi sull'altro del doppio strato lipidico. PROTEINE CANALE ⇪ formano un poro pieno di acqua, per mezzo del quale possono diffondere soluti specifici. I vari tipi di trasporto sono: TRASPORTO PASSIVO ⇪ avviene lungo un gradiente di concentrazione o elettrochimico; ↳ avviene spontaneamente per diffusione e non ha bisogno di energia; ⇪ avviene nei casi in cui vi sono trasporti mediati da canale o da trasportatori. TRASPORTO ATTIVO ⇪ avviene contro il gradiente di concentrazione o elettrochimico; ↳ c'è bisogno di energia; ⇪ avviene quando si va contro il gradiente di concentrazione. Il gradiente elettrochimico influisce sul trasporto di un soluto carico (uno ione) e si deve tenere conto anche del potenziale di membrana. A volte, serve considerare la differenza di potenziale tra citosol e spazio extracellulare, sempre a livello della membrana. [All'interno si hanno prevalentemente cariche negative e all'esterno prevalentemente cariche positive]. Ovviamente, se uno ione esterno ha carica positiva, riuscirà ad entrare più facilmente; viceversa avrà più difficoltà. Un trasportatore, nelle sue varie fasi, può essere: APERTO VERSO L'ESTERNO ⇪ sarà in grado di legare il soluto e, a seconda del gradiente di concentrazione, sarà in grado di rilasciarlo; CHIUSO; APERTO VERSO L'INTERNO. I trasportatori facilitano l'entrata delle molecole: • la velocità della diffusione semplice o mediata da canali, è proporzionale alla concentrazione di soluto; • la velocità mediata da trasportatori raggiunge il massimo quando il trasportatore è saturo. [Km → costante di legame del trasportatore per il soluto] TRASPORTO ATTIVO si va contro il gradiente di concentrazione; ⇪ l'energia necessaria per il trasporto può venire dalla luce o dall'idrolisi dell'ATP. Ci può essere un TRASPORTO ACCOPPIATO: ⇪ si sfrutta il trasporto passivo o che va verso il gradiente di concentrazione per raggiungere la parte opposta ad esso; ⇪ esso sfrutta l'energia prodotta dal trasporto passivo da parte del trasporto attivo che utilizzerà quell'energia per trasportare la molecola in senso contrario al gradiente di concentrazione. TRASPORTO ATTRAVERSO TRASPORTATORI UNIPORTO ⇪ quando c'è un'unica molecola trasportata; SIMPORTO ⇪ quando delle molecole vengono trasportate nella stessa direzione; ANTIPORTO ⇪ quando delle molecole vengono trasportate in due direzioni diverse. 35 TRASPORTO DEL GLUCOSIO Quando il trasporto si apre verso l'esterno, si lega al sodio e aumenta l'affinità di legame con il glucosio; si lega anche al glucosio e poi si chiude. ⇪ il legame Na+ e glucosio è cooperativo, cioè il il legame di un ligando aumenta l'affinità per l'altro. La transizione a stato chiuso occupato avviene solo quando sia Na+ che glucosio sono legati. Può avvenire che: se si apre verso l'esterno, non succede niente perché oramai Na+ e il glucosio sono legati; se si apre verso l'interno, Na+ si dissocia velocemente [poiché nel citosol la sua concentrazione è bassa] e ciò favorisce anche la dissociazione del glucosio. GLI ORGANELLI CELLULARI Le cellule animali sono compartimentate. • c'è il nucleo con il DNA, contornato dall'involucro nucleare [due membrane con uno spazio nel mezzo] che è in continuazione con il reticolo endoplasmatico [liscio o rugoso]; • ci sono i mitocondri [hanno delle creste interne], al cui carico c'è la respirazione cellulare; • dal reticolo endoplasmatico e dal Golgi parte la via secretaria; • la via eucariotica parte dagli endosomi e lisosomi [prima ancora dal reticolo]; • i perossisomi hanno degli enzimi per effettuare reazioni e per detossificare la cellula. In generale una cellula animale ha dimensioni di 20-30 um. RELAZIONI TRA I COMPARTIMENTI È importante capire le relazioni topologiche tra i compartimenti di una cellula, che dipendono anche da come si sono evoluti i compartimenti. L'EVOLUZIONE DELLA CELLULA Gli archei anaerobici hanno una parete cellulare; ⇪ la perdita di questa parete facilita il trasferimento genico orizzontale. La fagocitosi è la digestione di altri procarioti: ⇪ aumenta enormemente il trasferimento genico orizzontale, accelerando i processi evolutivi. Il nucleo viene racchiuso dalle membrane [che rappresentano topologicamente l'estern della cellula]. ⇪ con il citosol, rappresentano l'interno della cellula. Successivamente un batterio aerobico viene inglobato e vive come un promitocondrio [si dice che i mitocondri si siano originati proprio da questi batteri] ⇪ lo sviluppo di più mitocondri fornisce energia per l'evoluzione di ulteriori sistemi di membrana e di cellule molto più grandi. Le prime cellule eucariotiche sono aerobiche. I compartimenti sono detti TOPOLOGICAMENTE EQUIVALENTI se possono comunicare gli uni con gli altri, cioè se le molecole possono passare dall'uno all'altro senza attraversare la membrana. ⇪ -nucleo e citosol [interno della cellula]; -reticolo, Golgi, lisosomi etc. [esterno della cellula]. TIPI DI TRASPORTO TRA COMPARTIMENTI REGOLATO ↳ dal citosol al nucleo e viceversa; ⇪ non vi è attraversamento di membrana poiché ci sono i pori nucleari; TRANSMEMBRANA ↳ dal citosol: - al reticolo endoplasmatico; - ai plastidi; - mitocondri; -perossisomi; ⇪ si deve attraversare la membrana; VESCICOLARE ↳ abbiamo un compartimento di partenza da cui gemma una vescicola che si fonde con il compartimento bersaglio e trasporta tutto il suo contenuto; ⇪I compartimenti devono essere topologicamente equivalenti poiché c'è trasporto di membrana. I compartimenti sono: il Golgi; il reticolo endoplasmatico; l'endosoma; i lisosomi; la superficie cellulare. 36 NUCLEO Si presenta come la caratteristica strutturale prominente di molte cellule eucariotiche ↳ è una struttura pressoché sferica, che occupa prevalentemente la regione centrale della cellula. [A] In arancione il nucleo di una cellula di mammifero; in verde i microtuboli. [B] nucleo con cromatina e nucleolo. INVOLUCRO NUCLEARE È in continuità con il reticolo endoplasmatico. è composto da membrana nucleare interna ed esterna e spazio perinucleare; le membrane nucleari interna ed esterna sono unite a livello del poro nucleare. ⇪ Anche se sono in continuità, il reticolo è diverso dall'involucro [che può presentare i ribosomi]. LAMINA NUCLEARE È una struttura a rete che sostiene il l nucleo; se si distrugge, il nucleo si disassembla. NUCLEOLO È la zona in cui vengono assemblate le subunità ribosomali; è una zona più elettrodensa; il numero dei nucleoli in una cellula, varia in funzione dello stato in cui si trova la cellula; ↳ le cellule in rapida crescita presentano ben più di un nucleolo. PORI NUCLEARI Sono il punto dal quale le molecole entrano o escono dal nucleo; possono essere osservati al microscopio. La struttura proteica del poro è molto elaborata; le interruzioni del poro non sono vuote, ma contengono il COMPLESSO DEL PORO. I pori hanno: una struttura che si lega all'involucro nucleare; una struttura a canestro rivolta verso il nucleo. Il complesso del poro ha dimensioni enormi [30 volte più grandi dei ribosomi]; sono fatti da 50/100 proteine differenti [in base al tipo di cellule]; la grandezza dell'apertura del poro è stimata tra 9 e 26 mm; il numero di pori aumenta se aumenta l'attività trascrizionale; ↳ una cellula per proliferare deve dividersi e quindi produrre tante proteine; ↳ questa produzione aumenta il trasporto nucleo-citosol e quindi il numero di pori. TRASPORTO ATTRAVERSO I PORI NUCLEARI Se le molecole che devono passare dai pori sono più grandi delle dimensioni sostenute dal poro, devono seguire certe regole e possono subire solo trasporto attivo; si dice che subiscono un TRASPORTO REGOLATO. IMPORTAZIONE NUCLEARE di NUCLEOPLASMINE La nucleoplasmina è una proteina con 5 teste e 5 code. L'importazione nucleare di questa proteina fu uno dei primi studi di questo tipo: gli studiosi hanno preso ovociti di uno Xenopus e hanno iniettato nel citoplasma la nucleoplasmina purificata e resa radioattiva: ↳ videro che la proteina entrava tutta nel nucleo. Per capire come questo fosse possibile: separarono le teste e le code; ↳ dopo aver reso anch'esse radioattive, notarono che quando veniva iniettate, la coda conteneva il segnale per raggiungere il nucleo. Successivamente presero particelle di oro TERMINE e videro che: se iniettate nel citosol, non si muovevano; se venivano tappezzate di code di nucleoplasmina, entravano nel nucleo tramite i pori nucleari. Le code di nucleoplasmina contengono un segnale necessario e sufficiente per il trasporto al nucleo. 37 ▹ SE QUESTA PROTEINA DEVE ENTRARE NEL NUCLEO per svolgere una certa funzione, a livello cellulare: [ad esempio questo potrebbe essere un fattore di trascrizione che deve funzionare nel processo della trascrizione e deve essere libero dall'importina] 1. l’importina viene legata da Ran-GTP; 2. nel nucleo Ran è attiva (legata a GTP) e si lega all'importina; ↪ legandosi all’importina fa in modo che questa cambi la sua conformazione e non sia più in grado di legare la proteina cargo 3. la proteina cargo, che si trova nel nucleo, viene quindi rilasciata nel nucleo. L’importina è poi libera di tornare nel citoplasma per andare a prendere un'altra proteina cargo; ↪ è però legata a RaN-GTP ma, abbiamo visto che assume una conformazione tale che non consente più il legame del segnale NLS. ▹ COSA SUCCEDE NEL CITOSOL 1. RaN-GTP idrolizza il GTP e diventa Ran-GDP. 2. Questo non è attivo e non è più in grado di legarsi all'importina, quindi si stacca da questa si ricomincia da capo con questa importina in grado di legare un'altra molecola cargo da trasportare nel nucleo. ↪la funzione di Ran come interruttore molecolare è importante perché questo livello serve a far staccare il carico dall’importina (dal recettore per il trasporto) ed a fare in modo che questo recettore per il trasporto sia di nuovo pronto per legarsi meglio a nuovo segnale di localizzazione nucleare e, quindi, portare un'altra proteina. |ESPORTAZIONE NUCLEARE: COSA SUCCEDE L'esportazione nucleare va dal nucleo al citoplasma. Anche in questo caso è coinvolta la proteina Ran, che può anche tornare indietro. I segnali monopartiti sono singole sequenze di amminoacidi contigue mentre nei segnali bipartiti la sequenza segnale è separata internamente in due parti da amminoacidi, non dal segnale. ▷SEGNALE NES Nell'esportazione nucleare vi è il segnale NES (Nuclear Export Sequence). Anche qui vi è una sequenza che serve per uscire dal nucleo, quindi le proteine per uscire dal nucleo devono avere questa sequenza di esportazione. Il segnale di esportazione nucleare NES, viene riconosciuto da una ESPORTINA, un recettore per il trasporto. ▷ESPORTINE Legano sia il segnale di localizzazione nucleare, sia la proteina Ran-GTP. Queste esportina lega entrambe le proteine e forma un COMPLESSO TRIMOLECOLARE DI CARICO trasporta tutto dal nucleo al citoplasma. ▹ TRASPORTO REGOLATO DA RAN 1. l’esportina prende contatto con il complesso del poro ed è in grado di trasportare tutto dal nucleo al citoplasma; 2. arrivati nel citoplasma, Ran-GTP idrolizza il GTP e viene prodotto Ran-GDP, che non è più in grado di legarsi all’esportina; 3. Ran-GDP si stacca, staccando anche la proteina cargo liberata nel citosol; 4. l'esportina, recettore per l'esportazione nucleare, viene poi riportata indietro perché possa continuare un altro ciclo. Nel nucleo la proteina Ran è sempre legata al GDP, mentre nel citoplasma è sempre legata al GTP. ▷PROTEINE G MONOMERICHE Le proteine g sono regolate da altre proteine; le proteine g legano e idrolizzano il GTP; questo tipo di proteine è formato da una sola subunità. sono anche dette piccole proteine g. Queste proteine sono in grado di legare il GTP e idrolizzarlo, ma sono regolate da altre proteine che si chiamano GEF e GAP. |GEF guanin exchange factor → fattore di scambio nucleotidico; nel nucleo; ↪ Ran, legata al GDP, viene stimolata a lasciare il GDP e prendere il GTP → idrolizza GDP. |GAP GTPase activating protein; nel citosolo; ↪ Ran, legata al GTP, viene stimolato a lasciare il GTP e prendere il GDP → idrolizza il GTP Molte delle proteine g monomeriche sono in grado di legare e idrolizzare il GTP ma vengono, indotte a farlo da altre proteine regolatorie: da una parte c'è il fattore di scambi che porta la proteina a lasciare il GDP e prendere il GTP; dall'altra c'è la proteina GAP che invece stimola l'idrolisi del GTP. Lo scambio del nucleotide e l'idrolisi vengono svolte dalla GTPasi (quindi in questo caso è Ran). ↪ per cui si chiamano Ran-GEF e Ran-GAP. 40 RAN-GEF è presente solo nel nucleo, mentre RAN-GAP è presente solo nel citosol. ▹ COSA SUCCEDE NEL NUCLEO 1. Ran-GDP inattiva ed entra nel nucleo; 2. quando entra nel nucleo c’è Ran-GEF, quindi lascia il GDP e si attiva. A livello nucleare è importante che si formi Ran-GTP, perché questo deve legarsi: o all'importina, permettendo il rilascio della proteina cargo [che deve andare nel citosol]; o all'esportina, così che questa possa legare. ▹ COSA SUCCEDE NEL CITOSOL 1. Ran-GTP arriva nel citosol, dove c'è Ran-GAP; 2. Ran-GAP induce l'idrolisi del GTP, quindi la proteina diventa inattiva ↪ c'è bisogno che Ran idrolizzi il GTP [in modo che l'importina venga rilasciata per prendere un'altra proteina] e diventi Ran-GDP [venga sia rilasciata l’esportina che la proteina cargo, che deve arrivare al citosol]. Quindi in realtà Ran è l'interruttore molecolare che regola il trasporto al nucleo e che, a sua volta, è regolato da queste due proteine che, essendo in due localizzazioni diverse della cellula, riescono a regolare questo processo. |REGOLAZIONE DELLA FUNZIONE DI UNA PROTEINA Le cellule possono regolare la funzione di una proteina regolandone la localizzazione intracellulare. Ad esempio, abbiamo visto che una proteina appena sintetizzata ancora non è attiva: perché deve essere modificata in modi differenti; deve assumere la sua corretta conformazione tridimensionale; devono essere aggiunti una serie di gruppi chimici; in alcuni casi deve essere pure tagliata (taglio proteolitico). Alla fine, quando è pronta, deve avere la giusta localizzazione. ESEMPIO Abbiamo detto che se mettiamo un enzima lisosomiale (enzima degradativo) nel citoplasma, non funzionerà ↪ questo perché gli enzimi lisosomiali sono idrolasi acide e funzionano solo a PH acido e, dato che il citoplasma non ha PH acido, l’enzima non funzionerà e non sarà in grado di svolgere la sua funzione. È molto importante, quindi, per l'attività di una proteina, la sua localizzazione. La cellula, in alcuni casi, regola l'attività di una proteina regolandone la localizzazione. ▷FATTORE DI TRASCRIZIONE Ad esempio un fattore di trascrizione. La trascrizione avviene nel nucleo ad opera di RNA polimerasi aiutate dai fattori di trascrizione. Un fattore di trascrizione funziona quando è nel nucleo, perché è qui che avviene la trascrizione e quindi è qui che può funzionare. Ne è un esempio il recettore per gli ormoni steroidei. |RECETTORE PER GLI ORMONI STEROIDEI è un recettore citosolico, quindi non è un recettore di membrana; questa proteina, oltre ad essere in grado di legare gli ormoni steroidei, è anche un fattore di trascrizione. Normalmente nella cellula troviamo questa proteina in una conformazione, cioè il recettore per gli ormoni steroidei si trova nel citoplasma legato ad hsp90. [le proteine hsp, hit shock proteine, le due famiglie più importanti sono hsp70 e hsp60 ma c’è anche hsp90]. Hsp90 si lega a questa proteina e copre due domini importanti nella proteina: il segnale di localizzazione nucleare (NLS); il dominio di legame al DNA perché essendo un fattore di trascrizione si lega anche al DNA per funzionare. Normalmente nel citoplasma troviamo questa proteina complessata con hsp90 che copre sia il segnale di localizzazione nucleare sia il dominio che può legare il DNA. In questa situazione ovviamente questa proteina non funziona perché sta nel citosol e non è in grado di svolgere il suo ruolo come fattore di trascrizione. Questa proteina però ha anche un altro dominio che è un sito di legame per gli ormoni steroidei 1. se arriva un ormone steroideo, si lega e questo legame fa cambiare la conformazione della proteina, quindi il legame con l’ormone steroideo fa staccare hsp90; 2. a questo punto il segnale di localizzazione nucleare viene esposto; 3. arriva l’importina, porta questo fattore di trascrizione nel nucleo e nel nucleo questo fattore di trascrizione si legherà al DNA e insieme alla polimerasi svolgerà la sua funzione. 41 Questo cosa ci dice? Che la cellula può regolare la funzione di una proteina, regolandone la sua localizzazione cellulare. Questo è importante perché in teoria ci sono anche altri tipi regolazione; ad esempio quando arriva l’ormone steroideo, la cellula potrebbe non avere il recettore e quindi potrebbe andare a sintetizzare il recettore che poi va nel nucleo e svolge la sua funzione ↪ una regolazione di questo tipo richiede tempo: 1. arriva l’ormone steroideo; 2. arriva il segnale 3. il gene per questo recettore dovrebbe essere trascritto ed il trascritto cioè l’mRNA deve essere tradotto in proteina 4. la proteina deve essere modificata, deve raggiungere la sua corretta localizzazione e poi può funzionare. Nel nostro caso, invece, abbiamo la proteina già pronta, il recettore per gli ormoni steroidei già pronto ↪ quindi arriva l’ormone steroideo e questo recettore entra nel nucleo e comincia la trascrizione. Regolare la localizzazione di una proteina per regolarne la funzione è molto efficiente perché consente una regolazione rapida: arriva l’ormone steroideo; si stacca hsp90; la proteina viene riconosciuta dall’importina; arriva nel nucleo e comincia la trascrizione. [È molto più rapido che ovviamente dover partire dal gene, sintetizzare mRNA e poi fare la proteina]. |TRAFFICO NUCLEO-CITOSOL Il traffico tra nucleo e citosol è molto intenso. I pori sono dei complessi macromolecolari enormi considerando che è stato calcolato che sono 30 volte più grandi di un ribosoma. Soprattutto se parliamo di “traffico”, questa importazione ed esportazione di RNA e proteine continua. È stato calcolato che in una cellula in attiva proliferazione si devono fare circa 10 milioni di ribosomi in 20 ore. Se abbiamo una cellula che si deve dividere, ovviamente deve riprodurre anche i suoi organelli, tra cui troviamo i ribosomi [importanti per la sintesi delle proteine]. Consideriamo che ogni ribosoma ha circa 80 proteine che vengono sintetizzate nel citoplasma e poi trasportate al nucleo Perché al nucleo? Nel nucleolo si assemblano le sub-unità ribosomali che sono fatte da proteine ed RNA: le proteine vengono fatte nel citosol dai ribosomi, dopo di che devono entrare nel nucleo e quindi nel nucleolo e assemblarsi in sub-unità ribosomali insieme all’RNA ribosomale; successivamente queste sub-unità ribosomali devono andare nel citosol perché si devono assemblare i ribosomi e funzionare come ribosomi. ↪ per fare questo in una cellula che si deve dividere, solo per l’importazione di proteine ribosomali, ne devono entrare circa 10mila per secondo. Le proteine possono avere sia il segnale NLS che il segnale NES. Questo perché? Consideriamo che le proteine vengono sintetizzate nel citosol: ↪ una proteina che ha un segnale NES va dal nucleo al citosol, ma se è sintetizzata nel citosol sta nel citosol. Quindi come fa ad andare dal nucleo al citosol? Dovrebbe essere prima entrata nel nucleo. Quindi tutte le proteine che hanno il segnale NES devono avere anche il segnale NLS: da una parte ci sono proteine che vanno nel nucleo; dall’altra parte ci sono proteine che devono uscire dal nucleo ↪ per uscire dal nucleo devono essere prima entrate. Quindi le proteine che hanno il segnale NES hanno anche il segnale NLS e sono spesso dette PROTEINE ''NAVETTA'' proprio perché entrano nel nucleo ma poi escono anche perché hanno entrambi i segnali. |TRASPORTO NUCLEARE: mRNA Ci sono altri tipi di molecole che devono per esempio uscire dal nucleo o entrare nel nucleo. Un esempio è dato dagli RNA messaggeri perché la trascrizione avviene nel nucleo, ma l’mRNA deve uscire dal nucleo: 1. viene allora complessato da alcune proteine che hanno il segnale di esportazione nucleare, che trasportano l’mRNA (in celeste). Queste proteine sono ad esempio ribonucleo proteine che hanno il segnale di esportazione nucleare: alcune rimangono nel nucleo, altre invece hanno il segnale di esportazione nucleare e accompagnano l’mRNA nel citoplasma. Non ci sono solo proteine che devono essere trasportate ma anche altre molecole come l’RNA messaggero. Il meccanismo è simile a quello che abbiamo visto perché di fatto l’mRNA viene complessato con proteine, sono queste proteine che vengono trasportate fuori dal nucleo e poi l’mRNA viene liberato per essere tradotto. 42 Come entrano le proteine nella matrice dei mitocondri? Innanzitutto definiamo il segnale. La sequenza segnale per l’importazione nei mitocondri viene indicata come PRE SEQUENZA: è stata identificata come una sequenza all’estremità n-terminale della proteina; si tratta di una sequenza che ha una struttura particolare, formata da un certo numero di amminoacidi. La sequenza segnale nell'immagine è di 18 amminoacidi della citocromo ossidasi che è l’enzima prodotto dalla cellula del citosol, dai ribosomi, ma che poi deve entrare nei mitocondri. Questa sequenza segnale è fatta da 18 amminoacidi e forma una struttura ad elica dove i residui carichi positivamente (in rosso nell’immagine) sono tutti su una faccia dell’elica mentre quelli non polari sono sull’altra faccia dell’elica. Quindi la sequenza per l’importazione nel mitocondrio ha normalmente questa struttura. C’è anche il solito recettore per il trasporto, proteina che riconosce questo segnale per fare in modo che la proteina che ha questo segnale venga trasportata all’interno del mitocondrio. Il trasporto ai mitocondri, il trasporto al reticolo, il trasporto ai perossisomi sono tutti trasporti trans membrana, perché bisogna attraversare la membrana in quanto l'interno di questi organelli non è topologicamente equivalente al citoplasma. Nel caso dei mitocondri ci sono queste proteine traslocatrici delle membrane mitocondriali ↪ cioè per attraversare la membrana si passa all'interno di questi complessi traslocatori. Nei mitocondri abbiamo una membrana mitocondriale esterna e una interna e questi trasportatori vengono chiamati TOM e TIM perché si parla di outer e inner membrana sono traslocatori della membrana esterna e della membrana interna; hanno una caratteristica forma a botte ↪ all'interno sono vuoti e questo spazio vuoto è il canale di traslocazione attraverso il quale le proteine possono essere traslocate quindi passare attraversare la membrana. Come si studia il trasporto di proteine alla matrice dei mitocondri? Quando si vuole studiare una proteina che deve essere importata nei mitocondri, in particolare nella matrice del mitocondrio: 1. si può purificare questa proteina dalle varie copie, aggiungere i mitocondri e vedere che fine fa questa proteina; 2. si incubano insieme proteina e mitocondri e dopodiché si va a vedere se la proteine è entrata nella membrana. Per capire se la proteina è entrata o meno, dopo l'incubazione, il complesso di proteina e mitocondri viene trattato con la tripsina [un enzima che taglia le proteine]. Tuttavia la tripsina non riesce ad entrare nei mitocondri quindi, quando prendiamo questa proteina e la aggiungiamo nei mitocondri: se la proteina entra nei mitocondri aggiungendo la tripsina, la proteina non verrà tagliata perché la tripsina rimarrà all'esterno dei mitocondri ↪ non riesce a entrare nei mitocondri e quindi la proteina viene traslocata nei mitocondri; se invece la proteina non riesce ad entrare nei mitocondri resterà in soluzione fuori dai mitocondri e quando arriva la tripsina verrà distrutta. ▹ Andando poi a fare un gel per le proteine, si può vedere se la proteina è rimasta intatta oppure è stata tagliata e così si può definire se la proteina è entrata nei mitocondri ↪ questo è il tipo di esperimenti che vengono utilizzati per studiare il trasporto ai mitocondri. Tramite questi esperimenti si è stabilito: ▹ innanzitutto che per il trasporto di una proteina ai mitocondri, servono dei mitocondri funzionanti quindi respiranti; ▹ oltretutto questi esperimenti hanno permesso di definire la pre-sequenza cioè quali fossero gli amminoacidi che costituivano la pre-sequenza ↪ cioè la sequenza segnale utile all'importazione mitocondriale. Infatti se prendiamo questa proteina e mutiamo un amminoacido, la proteina non sarà più in grado di entrare nei mitocondri. Attraverso questi studi è possibile studiare il trasporto ai mitocondri [ovviamente si devono anche avere i giusti controlli, perché se prendiamo questa proteina, aggiungiamo mitocondri respiranti, aggiungiamo la tripsina e la proteina resta integra, può essere che la proteina sia entrata nei mitocondri o che la tripsina non abbia funzionato]. 45 In effetti il controllo appropriato in questo caso è: aggiungere la tripsina anche direttamente alla proteina (chiaramente un campione a parte); quindi una parte di questa proteina viene incubata coi mitocondri; solo successivamente un'altra parte viene direttamente incubata con la tripsina ▹ In questo caso deve essere tutta degradata → questo ci conferma che la tripsina ha funzionato; ▹ Se, invece, la proteina è entrata nei mitocondri, la tripsina non avrà svolto la sua funzione. IMPORTAZIONE MITOCONDRIALE Abbiamo una proteina che ha una sua sequenza e in particolare all' n-terminale avrà la sequenza segnale chiamata pre-sequenza per i mitocondri. questa sequenza viene riconosciuta da una proteina “recettore”, presente a livello della membrana mitocondriale esterna ▹ non è un recettore citosolico che porta la proteina al mitocondrio ma un recettore presente nella membrana esterna del mitocondrio, che è però associato ad una proteina traslocatrice Infatti si parla del complesso Tom in cui c'è: da una parte la proteina traslocatrice; dall'altra il canale di traslocazione; ↪ quindi i recettori vanno a legare la proteina mentre il canale di traslocazione servirà a traslocarla. la proteina con segnale di localizzazione mitocondriale, viene riconosciuta del recettore che fa in modo che questa proteina venga trasferita al canale di traslocazione e quindi cominci ad entrare ↪ il mitocondrio è complesso perché c'è una membrana esterna con spazio inter membrana e una membrana interna. Il complesso Tom e il complesso Tim sono in comunicazione con il loro canale di traslocazione: 1. la proteina passa attraverso il canale di traslocazione del complesso Tom; 2. poi arriva al complesso Tim e viene traslocata al livello della matrice mitocondriale. 3. il segnale di indirizzamento al mitocondrio, la pre sequenza, viene tagliata; 4. l'enzima peptidasi del segnale va a togliere questo segnale in questo caso il segnale deve essere tagliato in quanto non serve più; nel caso delle proteine nel nucleo abbiamo visto che: - entrano nel nucleo e poi dovranno rientrare [se le cellule vanno incontro a mitosi] - se sono proteine che poi devono entrare e uscire dal nucleo dovranno usare questo segnale più volte ↪ quindi generalmente il segnale d'importazione al nucleo non viene eliminato così come il segnale di esportazione nucleare. Nel caso della PRE SEQUENZA per andare alla matrice mitocondriale questa viene tagliata via perché non serve più in questo caso questa sequenza segnale viene tagliata; il peptide viene ridotto ad amminoacidi; gli aminoacidi vengono poi riutilizzati per la sintesi di un’altra proteina Gli chaperon molecolari servono al ripiegamento della proteina. ▹ In particolare quelli della famiglia Hsp70 servono a mantenere la proteina nella forma svolta, sia durante la traduzione, che durante il trasporto agli organelli; sono presenti sia nel citosol ↪ è importante che la proteina non si ripieghi prima di entrare nel canale di traslocazione, perché altrimenti non riuscirebbe ad essere traslocata nei mitocondri; ma anche nella matrice mitocondriale ↪ anche qui la proteina deve essere prima completamente traslocata per poi potersi ripiegare correttamente. ▹ Infatti, il ripiegamento, dipende da informazioni che sono presenti nella proteina e la proteina deve essere tutta disponibile; ↪ se la parte della proteina che entra nella matrice si ripiega, non avrà a disposizione le informazioni presenti nella proteina e potrà ripiegarsi magari in maniera non corretta. |RUOLO DELL'ENERGIA NELL'IMPORTAZIONE DI PROTEINE ALLA MATRICE MITOCONDRIALE Questo processo richiede energia utile innanzitutto agli chaperon molecolari ↪ infatti serve energia sotto forma di ATP che viene consumato ed idrolizzato ad ADP sia per gli chaperon molecolari citosolici che per quelli presenti a livello della matrice. La TRASLOCAZIONE della sequenza segnale nella matrice: 1. viene riconosciuta dal recettore del complesso Tom; 2. entra nel canale di traslocazione; 3. arriva al complesso Tim. 46 La sequenza, per essere traslocata nella matrice e quindi per entrare nel processo Tim, attraversare la membrana interna [tramite il complesso Tim] e arrivare alla matrice ha bisogno del potenziale di membrana, altrimenti il trasporto non andrebbe avanti. A questo punto non finisce la traslocazione, ma la proteina entra tutta nella matrice del mitocondrio e successivamente si ripiega. ▹ Alcune proteine sono in grado di ripiegarsi da sole dopo che sono state completamente traslocate e gli chaperon molecolari Hsp70 si sono staccati. ▹ Altre proteine, invece, hanno bisogno di chaperon molecolari della famiglia Hsp60 ↪ la proteina entra, si ripiega e gli Hsp60 sono anche presenti a livello della matrice dei mitocondri. |INSERZIONE DI PORINE NELLA MEMBRANA MITOCONDRIALE ESTERNA Sappiamo che non ci sono solo proteine che devono andare alla matrice dei mitocondri, ma anche proteine che devono andare alla membrana esterna, alla membrana interna oppure allo spazio inter membrana → come fanno? Vi è l’esempio dell’inserzione di porine nella membrana mitocondriale esterna: c'è il complesso Tom con il recettore che porta la proteina a traslocare nel canale di traslocazione ↪ invece di arrivare alla matrice, la proteina si ferma e viene traslocata nello spazio inter membrana nello spazio inter membrana troviamo degli chaperon che accompagnano la proteina; ↪ come se la proteina tornasse indietro → entra in un altro complesso trasportatore [complesso Sam] per inserirsi nella membrana mitocondriale esterna. |COME SI ARRIVA ALLO SPAZIO INTER MEMBRANA o ALLA MEMBRANA INTERNA Il trasporto avviene inizialmente grazie alla pre sequenza, che permette: di interagire col complesso Tom; di inserirsi nel traslocatore Tom; successivamente passare nel traslocatore Tim. Dato che questa proteina deve sistemarsi a livello della membrana interna, presenta una specie di secondo segnale ↪ dopo la sequenza segnale che è servita per entrare nel complesso Tom, nel complesso Tim e nel canale di traslocazione di questi complessi, c'è un'altra sequenza segnale (in celeste). La prima sequenza segnale viene tagliata; la seconda sequenza segnale viene anche chiamata SEQUENZA DI STOP DEL TRASFERIMENTO o SEQUENZA DI ANCORAGGIO ALLA MEMBRANA: quando la proteina entra nel canale di traslocazione e questa sequenza entra nel canale Tim, si blocca il trasferimento della proteina ↪ cioè la proteina non riesce ad andare oltre quindi a scorrere nel canale di traslocazione per arrivare alla matrice perché questa sequenza, con una particolare struttura, si blocca nel canale Tim; quindi la sequenza segnale viene tagliata e la sequenza di stop del trasferimento lo blocca; nel frattempo il resto della proteina continua ad essere traslocata dal complesso Tom; la proteina rimane ancorata alla membrana interna, tramite questa sequenza e poi sporge nello spazio inter membrana ↪ questa proteina viene definita PROTEINA DELLA MEMBRANA INTERNA |STOP DEL TRASFERIMENTO perché la struttura particolare di questa sequenza fa fermare la proteina a livello del trasportatore Tim |SEQUENZA DI ANCORAGGIO ALLA MEMBRANA perché il trasportatore Tim, dopo un po’ che la proteina è ferma nella stessa posizione, si apre lateralmente e la proteina si ritrova nella membrana. ↪ questi trasportatori hanno forma a botte, un canale di traslocazione e si possono aprire da un lato ▹ Per cui, quando per esempio la proteina si blocca all'interno del complesso, in corrispondenza della sequenza di stop del trasferimento, dopo un po’ può uscire, tramite questa apertura, dal canale di traslocazione e ritrovarsi invece ancorata alla membrana ↪ questa è una caratteristica di vari trasportatori, si possono vedere anche nel complesso Tom che è aperto, nel complesso Sam, nel complesso Tim 23, nel complesso Tim 22. Quello descritto è il modo in cui una proteina della membrana interna mitocondriale viene trasportata alla membrana interna mitocondriale. In questo caso ci sono due segnali: uno è la sequenza chiamata sequenza di indirizzamento alla matrice ↪ questa sequenza arriva sempre alla matrice; in questo caso, però, il trasferimento alla matrice si blocca e la proteina resta ancorata, come proteina della membrana mitocondriale interna. 47 ▹ Ci sono problemi a importare gli enzimi perossisomali dal citosol ai perossisomi. questa patologia è dovuta a mutazioni di almeno 10 geni diversi ↪ significa che ci sono diverse forme della patologia, ognuna caratterizzata dalla mutazione in un certo gene, però il risultato è sempre uguale → ci sarà una famiglia che avrà la mutazione di un gene X, una famiglia che avrà la mutazione del gene Y ecc. sono stati trovati altri geni che influenzano l'importazione di proteine nei perossisomi ↪ uno di questi geni è PTS1r o PEX 5 → significa che tutti gli enzimi perossisomali che hanno il segnale PTS1: -non vengono riconosciuti da questo recettore; -non vengono trasportati ai perossisomi per cui chiaramente non possono svolgere la loro funzione |BIOGENESI DEI PEROSSISOMI |PATRIMONIO GENETICO indica l'insieme dei geni che compongono una cellula e determinano tutto quello che una cellula è; questa affermazione è vera fino ad un certo punto, perché le cellule non possono costruire dal nulla i loro organelli ↪ se facciamo una cellula sintetica inserendo solo il DNA come patrimonio genetico, la cellula non sarebbe in grado di costruire i mitocondri o per esempio i perossisomi. Diciamo quindi che le cellule non possono costruire dal nulla i loro organelli perché hanno bisogno di informazioni che sono presenti nell’organello stesso; ↪ gli organelli è come se avessero una vita propria aumentano di dimensioni incorporando molecole; poi si dividono e sono distribuiti alle cellule figlie. Quindi, quello che sono dipende dai geni, ma è necessaria un’informazione epigenetica contenuta nella struttura dell’organello stesso. L'’informazione necessaria per costruire un organello non è presente solo nel DNA che codifica le proteine di quell’organello, ma vi è anche altra informazione contenuta nell’organello stesso → informazione genetica e epigenetica. I perossisomi si originano dal reticolo endoplasmico, acquisiscono molecole, in particolare proteine di membrana e del lume dei perossisomi tramite il trasporto dei perossisomi; ↪ possono anche dividersi, ingrandirsi e poi dividersi nuovamente da una parte vengono generati dal reticolo; dall’altra aumentano di dimensioni e sono in grado di dividersi e quindi di moltiplicarsi. RICORDA Abbiamo detto che le informazioni per generare un organello non sono semplicemente contenute nel DNA della cellula ma anche nell’organello stesso. L’informazione genetica, cioè quella presente nel nucleo della cellula, non è sufficiente a costituire un organello, per cui la cellula ha bisogno sia dell’informazione epigenetica che di quella genetica. ↪ quella aggiuntiva, ovvero quella epigenetica, è contenuta nell’organello stesso → in questo modo se abbiamo dei perossisomi possiamo farne altri. Se, contrariamente, pensiamo di avere una cellula senza mitocondri, questa cellula non sarà in grado di costituire altri mitocondri proprio perché la sua informazione genetica non è sufficiente. L’informazione genetica è importante e fondamentale ma serve anche l’informazione epigenetica. RETICOLO ENDOPLASMICO Il reticolo endoplasmico è un altro organello cellulare molto esteso e grande, che parte a livello della membrana nucleare ↪ avevamo già detto che la membrana, o involucro, nucleare è in continuità con il reticolo. Il reticolo endoplasmico può essere: • liscio • rugoso ↪ ci sono i ribosomi, organelli deputati alla sintesi delle proteine e, quindi, alla traduzione. Perché si chiama reticolo? La risposta diventa evidente guardando la cellula fotografata al microscopio a fluorescenze, dopo aver espresso una proteina fluorescente localizzata al livello del reticolo endoplasmico ↪ la proteina è una proteina della membrana del reticolo endoplasmico. Nella foto si vedrà un reticolo all’apparenza. 50 Come facciamo a studiare il reticolo e, in particolare, il trasporto al reticolo endoplasmico? Ricordiamo che per studiare il trasporto ai mitocondri, questi ultimi venivano purificati e incubati con una proteina (che doveva entrare nei mitocondri) e si andava a vedere se, effettivamente, entrava o meno. ↪ in questo modo si verifica il meccanismo con cui le proteine entrano nei mitocondri e si dispongono nei vari compartimenti. Se dobbiamo effettuare lo stesso esperimento sul reticolo, è logico pensare che per purificarlo, bisogna purificare gli organelli intracellulari. |PURIFICAZIONE degli ORGANELLI INTRACELLULARI Può avvenire in due modalità: I°- CENTRIFUGAZIONE IN UN GARDIENTE DI DENSIT si allestisce un gradiente di densità fatto con qualche molecola [ad esempio gradiente di saccarosio o percolo] ↪ centrifugando avremo sul fondo del tubo una maggiore concentrazione di quella molecola ed una minore concentrazione più in alto; su questo gradiente depositiamo il nostro lisato cellulare [cellule rotte in cui la membrana non è integra], che contiene tutti gli organelli cellulari (mitocondri etc.); centrifugando questo lisato possiamo effettuare una separazione isopicnica ↪ gli organelli della cellula si disporranno nel gradiente a seconda della loro densità, formando una banda a livello caratterizzato da una densità pari alla loro → per ogni organello si formeranno bande distinte; dopo aver separato i vari organelli, si possono raccogliere le varie frazioni in diversi tubi. I valori di densità più alti sono sul fondo del tubo e quelli meno alti saranno più in alto. II°- CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE le cellule vengono portate a lisi e si centrifugano a varie velocità; viene ripetuto più volte lo stesso processo, aumentando ad ogni step la velocità ↪ centrifugando ad una prima velocità avremo sul pellet gli organelli più grandi [per esempio i nuclei]; successivamente, prendiamo il sovra natante (dove ci sono gli organelli), centrifughiamo ad una velocità più alta e avremo sul pellet altri organelli. Con questi vari round di centrifugazione avremo varie frazioni della cellula dove otteniamo i vari organelli, che sono stati purificati. I° II° Ritornando al reticolo diciamo che: quando la cellula lisa, e vogliamo purificare il reticolo, i tubuli da cui è costituito il reticolo si frammentano; frammentandosi formano delle grosse vescicole che vengono chiamate microsomi, dove la polarità è mantenuta. ↪ l’interno delle vescicole corrisponde al lume del reticolo e questi microsomi possono essere ruvidi o lisci [definizione che deriva dalla loro provenienza → dal reticolo ruvido o liscio]; tramite centrifugazione possiamo separare i microsomi lisci (densità minore) dai microsomi ruvidi (densità maggiore). |TRASPORTO AL RETICOLO ENDOPLASMICO 1. si parte dal reticolo, molto ampio e complesso, le cellule vengono portate a lisi e si ottengono i microsomi; 2. i microsomi (lisci o rugosi) vengono incubati con delle proteine (che sappiano entrare nel reticolo) e si verifica che la proteina sia entrata nei microsomi o meno; Per vedere se entrano effettuiamo un esperimento come quello dei mitocondri: prendiamo i microsomi, li incubiamo con la proteina e vediamo se entra aggiungendo una proteasi. Se la proteasi taglia la proteina significa che questa è rimasta fuori, viceversa vuol dire che è entrata. È importante ricordare che quando si effettua un esperimento bisogna sempre utilizzare gli appropriati controlli; in questo caso il controllo si può fare: o aggiungendo la proteasi alla proteina (per vedere se la proteasi funziona); oppure, prima di trattare con la proteasi, trattiamo con dei detergenti. Cosa fanno i detergenti? I detergenti vanno a danneggiare l’integrità della membrana → se la membrana non è più integra la proteasi potrà entrare nei microsomi e digerire le proteine, anche se queste ultime sono entrate. Confrontando i due campioni (quello con i detergenti e quello senza), possiamo assicurarci che la proteasi abbia funzionato e, poi, possiamo leggere il risultato dell’esperimento nell’altro campione: se la proteina è rimasta fuori → viene degradata; se è entrata → non sarà degradata. 51 I ricercatori hanno cercato per tanto tempo di effettuare, in maniera simile a quella per i mitocondri, il trasporto in vitro di proteine all’interno dei microsomi e, quindi, del reticolo. 1. essi prendevano una proteina del reticolo e la incubavano con i microsomi. ↪ dopo tanti esperimenti non sono mai riusciti ad avere successo perché la proteina, in nessun modo, riusciva ad entrare nei microsomi; 2. hanno provato aggiungendo ATP come fonte di energia oppure provando con microsomi ruvidi o lisci ma, in nessun caso, riuscivano a riprodurre il trasporto al reticolo in vitro, come invece era stato fatto con i mitocondri. Come hanno risolto? Alcuni ricercatori, invece di utilizzare una proteina già tradotta, hanno purificato i microsomi ruvidi (cioè quelli con ribosomi) e hanno aggiunto l’RNA messaggero per una proteina del reticolo: come si aspettavano, la proteina è stata ritrovata all’interno dei microsomi ma essa era più corta di quanto si aspettassero ↪ questo perché: 1. l’RNA messaggero veniva tradotto in una proteina che aveva un segnale di indirizzamento al reticolo; 2. una volta entrata nel reticolo (nei microsomi) questa sequenza segnale veniva tagliata via. Con questi esprimenti hanno stabilito che il trasporto al reticolo è co-traduzionale |CO-TRADUZIONALE significa che avviene durante la traduzione. Ricordiamo, inoltre, che il trasporto al reticolo è un trasporto transmembrana, ovvero un trasporto i cui compartimenti non sono topologicamente equivalente (il reticolo corrisponde all’esterno della cellula). Questo è il primo modello per il trasporto al reticolo. RICAPITOLANDO abbiamo una proteina con una sequenza segnale per andare al reticolo; questa sequenza segnale viene riconosciuta e la proteina viene portata sulla membrana del reticolo, in corrispondenza di traslocatori; attraverso i traslocatori (similarmente per i mitocondri) la proteina viene inserita nel reticolo mentre si sta traducendo (a differenza di quanto avviene nel trasporto ai mitocondri). |PARTICELLA SRP Sappiamo che per andare in un certo compartimento dobbiamo avere un indirizzo, rappresentato dalla sequenza segnale [una sequenza di amminoacidi] e i recettori per il trasporto [altre proteine che riconoscono il segnale e la indirizzano]. La particella che si chiama SRP (Signal Recognition Particle) è, in questo caso, il recettore per il trasporto; è un complesso riboproteico formato da 6 proteine e 1 RNA (che tiene insieme il tutto); una delle proteine del complesso, P54, è una proteina G (ovvero una proteina che lega e idrolizza il GTP, detta anche interruttore molecolare). La sintesi delle proteine della cellula comincia su ribosomi liberi nel citosol: 1. c’è un RNA messaggero che viene tradotto in proteina; 2. quando la proteina è stato sintetizzata, i ribosomi si staccano e si vanno a riassemblare sopra un nuovo RNA per tradurlo. Nel caso delle proteine sintetizzate a ribosomi adesi al reticolo, la sintesi comincia sempre nello stesso modo: 1. un ribosoma libero traduce un RNA messaggero in proteina ↪ questa proteina, però, ha all’N-terminale (ovvero nella prima parte della proteina), una sequenza segnale di indirizzamento al reticolo endoplasmico [NOTA BENE: le proteine vengono sintetizzate dall’ N-terminale al C-terminale]. 2. qui interviene SRP, che ha un sito di riconoscimento per la sequenza segnale di indirizzamento al reticolo, che si lega non solo alla sequenza ma anche al ribosoma; 3. si lega, inoltre, anche al recettore presente sulla membrana del reticolo ↪ quindi trasporta tutto il complesso traduzionale (ribosoma, RNA messaggero e proteina che si sta traducendo) in corrispondenza del traslocone [struttura tramite cui la proteina verrà inserita a livello del reticolo endoplasmico]. 52 |GLICOSILAZIONE è l'aggiunta di zuccheri ad una proteina. GLICOSILAZIONE LEGATA AD N La glicosilazione legata ad N comporta l’aggiunta di un gruppo di 14 zuccheri [mannosio, glucosio ed N-acetilglucosammina], ad una catena laterale di asparagina; questo gruppo di 14 zuccheri viene attaccato direttamente alla proteina, a livello del lume del reticolo; alcuni dei 14 zuccheri vengono rimossi o modificati; questo processo di glicosilazione è diverso da proteina a proteina. La glicosilazione ha un ruolo nel ripiegamento delle proteine: ci sono proteine, come calnessina e calreticulina, che si legano ai carboidrati; o ci sono gruppi di zuccheri che sono attaccati alla proteina nel reticolo e bloccano la forma della proteina in certe strutture ben precise che aiutano il corretto ripiegamento. Per controllo di qualità si intende che il reticolo è in grado di controllare lo stato delle sue proteine ed, eventualmente, agire per cercare di correggere errori o risolvere situazioni non adatte. I - CALNESSINA in questo caso la proteina non è ripiegata ma glicosilata; successivamente, il glucosio viene tagliato (in particolare due di loro vengono tagliati e ne rimane solo uno) e la proteina inizia a ripiegarsi. ▹ La calnessina è in grado di legarsi ai carboidrati e aiuta la proteina a ripiegarsi ad un certo punto l'enzima glicosidasi, taglia via il glucosio facendo sì che la proteina non si possa più legare alla calnessina; la proteina si libera, assume la sua corretta conformazione ed esce dal reticolo. ▹ Se invece la proteina rimane nella conformazione che non è quella corretta, non le viene permesso di uscire dal reticolo: torna indietro grazie alla glicositrasferasi, che lega la proteina, aggiunge il glucosio e fa in modo che possa legarsi di nuovo alla calnessina, sperando che così si possa ripiegare correttamente. ▹ Perché serve studiare queste modificazioni e questo controllo del reticolo? È importante perché ci fa capire come funziona una cellula e come possiamo usare le proteine per farmaci o altro. ▹ La glicosilazione è importante perché: può favorire il ripiegamento delle proteine; anche perché ha delle ripercussioni importanti in ambito biotecnologico. AD ESEMPIO negli animali e nei batteri esiste un dimero galattosio- galattosio, che è il risultato della glicosilazione. In genere, esiste nei mammiferi (ma non nell’uomo) e nei batteri; questo dimero viene riconosciuto dal sistema immunitario, che produce degli anticorpi con questo dimero quando l’uomo viene a contatto con questo dimero. ▹ Questa è una delle cause principali per cui organi o proteine che vengono da animali vengono rigettati ↪ vengono rigettati perché questi organi o proteine [che vengono glicosilate], hanno questo dimero contro cui l’uomo presenta già degli anticorpi. Nel reticolo è aggiunta l’ancora di glicosilfosfatidilnositolo [che fa parte delle zattere lipidiche]: viene formata nella membrana del reticolo e poi si sostituisce al peptide che rappresentava il dominio trans membrana della proteina. |PROTEINE MAL RIPIEGATE o NON CORRETTAMENTE ASSEMBLATE Il reticolo endoplasmico fa il controllo di qualità e le proteine vengono fatte uscire dal reticolo, per procedere poi nella via secretoria al Golgi. Un esempio è quello degli anticorpi. Gli anticorpi sono proteine formate da: due catene pesanti; due catene leggere; un dominio che riconosce le molecole. Essi sono importanti per la risposta immunitaria dell’organismo verso molecole o microrganismi: si legano a queste entità, ne bloccano il funzionamento e ne inducono la distruzione. 55 Nel caso in cui dovessimo avere un anticorpo privo di uno di quegli elementi vedremmo l’intervento di Bip, che effettua il controllo di qualità: Bip si lega alle catene degli anticorpi, coprendo un segnale di uscita, fino a quando non sono correttamente assemblate; una volta completo, l'anticorpo può uscire dal reticolo ed essere secreto. Consideriamo un caso in cui ci sia un problema nel ripiegamento o nell’assemblaggio delle catene dell’anticorpo e non si riesca a riparare l’errore: il reticolo endoplasmico fa in modo che le proteine vengano trasportate nel citosol e degradate dal sistema ubiquitina-dipendente, che avviene ad opera del proteasoma; si ha una degradazione ERAD → Endoplasmic Reticulum Associated Degradation ↪ questo non significa che la degradazione avviene nel reticolo endoplasmico, ma che riguarda proteine che vengono dal reticolo endoplasmico. ▹ Se c’è una proteina mal ripiegata, che non si riesce a recuperare: essa viene accompagnata a dei traslocatori proteici; essi la traslocano nella direzione opposta rispetto alla precedente (dal citosol al reticolo); viene traslocata nel citoplasma; viene ubiquitinata; vengono tolti gli zuccheri e viene degradata. ▹ Ricordiamo che la degradazione è fondamentale perché fa in modo che non si accumulino frammenti o intere proteine mal ripiegate, che porterebbero ad un aumento della tossicità nella cellula e conseguenti patologie potenzialmente letali per l’organismo. Nella cellula ci sono una serie di risposte UPR → Unfolded Protein Response → risposta alle proteine non-ripiegate, grazie alla presenza di sensori posti al livello del lume del reticolo → IRE1, PERK ed ATF6 ↪ riescono a captare la presenza di proteine non ripiegate. ▹ Tramite il dominio citosolico questi sensori vanno a segnalare il problema e rispondo al problema con strategie diverse. ▹ Tutte queste strategie vanno a regolare la trascrizione perché producono proteine che: regolano la trascrizione [DNA si trascrive in RNA per poi produrre una proteina]; vanno ad attivare i geni che aumentano la capacità di ripiegamento delle proteine nel reticolo. ▹ Ciò significa che queste proteine regolano la trascrizione di chaperon molecolari e quindi ne attivano la produzione. RICORDA! Gli chaperon molecolari sono anche detti proteine di shock da calore → si era visto che se le cellule venivano sottoposte ad una temperatura elevata, venivano più espressi gli chaperon molecolari perché: se aumenta la temperatura, è più difficile ripiegare proteine e, di conseguenza, ci saranno più proteine mal ripiegate; questi sensori si attivano, attivando la produzione di proteine che regolano la trascrizione; inoltre attivano geni che aumentano la capacità di ripiegamento. In questo modo, le proteine regolano la trascrizione di chaperon molecolari e ne aumentano la produzione. Il reticolo dà dei segnali per produrre più chaperon molecolari, che aiuteranno le proteine a ripiegarsi. Diciamo che il reticolo svolge un ruolo importante anche nel controllo di qualità, proprio perché controlla che le proteine che intraprendono la via secretoria siano correttamente ripiegate, modificate e così via. A partire dal reticolo endoplasmico, da cui si apre la via secretoria, possiamo andare: al Golgi; alla plasma membrana; all’esterno della cellula; ai lisosomi. Il segnale iniziale di ogni proteina è quello di indirizzamento al reticolo ma, poi, ci devono essere altri segnali che indirizzino la proteina ad altri compartimenti. Le proteine che restano nel reticolo hanno dei segnali particolari: le proteine del lume del reticolo hanno, ad esempio, dei segnali KDEL; ↪ queste proteine entrano nel lume del reticolo con il meccanismo classico. ▹ Se questa proteina entra per sbaglio nel Golgi tramite il trasporto vescicolare, troverà un recettore KDEL che: 1. riconosce la sequenza; 2. si lega e riporta la proteina nel reticolo. |SEGNALE KDEL viene indicato come il segnale di ritenzione perché, al contrario degli altri segnali [ es. per andare al nucleo, ai perossisomi, ovvero segnali che portano ad un compartimento], questo aspetta che la proteina faccia un errore per riportare la proteina indietro e trattenerla nel reticolo. ▹ Per il Golgi si ritiene che vi siano dei segnali di ritenzione riconosciuti da recettori per il trasporto. 56 Dopo il Golgi ci sono vescicole che vanno verso la membrana plasmatica per la secrezione delle proteine. ▹ Oltre alla secrezione all’esterno, c’è il trasporto ai lisosomi. Sappiamo che tutte le proteine vengono tradotte dai ribosomi → liberi nel citosol o adesi al reticolo. ▹ Le proteine che devono andare ai lisosomi (sia al lume che alla membrana) sono sintetizzate dai ribosomi adesi al reticolo. Nella via secretoria abbiamo: il reticolo endoplasmico; il reticolo del Cis-Golgi → è un compartimento intermedio tra reticolo e Golgi; l’apparato del Golgi; il reticolo del Trans-Golgi → da cui partono vescicole che vanno o alla membrana plasmatica o agli endosomi ↪ dagli endosomi poi si arriva ai lisosomi. Le proteine che fanno questo percorso sono tutti gli enzimi lisosomiali, o le idrolasi acide, che funzionano a pH acido e giungono ai lisosomi tramite un segnale di indirizzamento ai lisosomi ↪ questo segnale, per la prima volta, non è una sequenza amminoacidica ma è uno zucchero: MANNOSIO-6-FOSFATO → un mannosio che ha un fosfato in posizione 6. Le proteine che hanno questo M6P vengono riconosciute dal recettore del M6P che, una volta portata la proteina agli endosomi (dagli endosomi le idrolasi acide vanno ai lisosomi), tornerà indietro per portare altre proteine. ▹ Se togliamo all’enzima M6P, l’enzima verrà secreto all’esterno. È importante aggiungere che: l’enzima lisosomiale è riconosciuto a sua volta da un enzima, l' N-acetilglucosamminafosfotrasferasi ↪ questo è un enzima che trasferisce l’Nacetilglucosammina con il gruppo fosfato in posizione 6 al mannosio; successivamente abbiamo un altro enzima che taglia l’N-acetilglucosammina, lasciando il mannosio marcato con il fosfato in posizione 6 ↪ questo enzima non aggiunge mannosio a tutti gli enzimi con fosfato ma SOLO agli enzimi lisosomiali perché hanno una zona segnale, ovvero una sequenza amminoacidica che viene riconosciuta N-acetilglucosamminafosfotrasferasi, che poi ci porta ad avere il mannosio-6-fosfato. ENDOCITOSI ed ESOCITOSI |ENDOCITOSI si intende l’internalizzazione di materiale dall’esterno all’intero della cellula tramite vescicole o compartimenti racchiusi da membrana; • molecole di vario genere possono entrare nella cellula tramite trasportatori o diffusione → questa non è definita endocitosi; • c’è un'invaginazione della membrana plasmatica della cellula che racchiude il materiale esterno alla cellula e lo porta all’intero. ▹ L'endocitosi è tutta la via endocitica, che porta poi il materiale internalizzato fino ai lisosomi per essere degradato. |ESOCITOSI è un processo diametralmente opposto: • si prende una vescicola, o un compartimento che contiene materiale proveniente dalla cellula, che va a fondere la sua membrana con quella cellulare ed il contenuto viene scaricato all'esterno. ▹ L'esocitosi è tutta la via esocitica, rappresentata dalla via secretoria. Sia la via endocitica che quella esocitica si basano sul traffico vescicolare, ovvero il trasporto di molecole da un compartimento ad un altro tramite vescicola: • il primo è il compartimento donatore; • il secondo è il compartimento bersaglio o accettore. |COSA SUCCEDE Gemma una vescicola dal primo compartimento che, con il suo contenuto, arriva al compartimento bersaglio andandosi a fondere e scaricando il contenuto. 57 I compartimenti interessati dal traffico vescicolare (reticolo, cis-Golgi reticulum, Golgi, trans-Golgi- Network, vescicole) così come i compartimenti della via endocitica, sono topologicamente equivalenti; il loro interno è equivalente all’esterno della cellula. ▹ La secrezione regolata vede la fusione della vescicola con la membrana (e quindi il rilascio del materiale all’esterno della cellula) in maniera non continua, ma solo dopo un certo stimolo. ▹ Nella costitutiva le vescicole si creano in continuazione e poi vanno a fondersi, senza pause, portando materiale all’esterno con costanza. ▹ Nella regolata invece, la vescicola (chiamata “secretoria” per distinguerla dalle altre) conserva al suo interno le proteine che devono essere secrete ma non va immediatamente a fondersi alla membrana, a meno che non arriva alla cellula un segnale. Il meccanismo di segnalazione è il seguente: • le vescicole secretorie vengono prodotte nella cellula; • qui si accumulano ma non si fondono fino a quando non arriva un ormone che si lega al recettore, facendo partire questa segnalazione intra cellulare che informa le vescicole di poter iniziare la fusione e la secrezione del contenuto; • arriva dunque un ormone, un fattore di crescita, un neurotrasmettitore, che legandosi ai loro rispettivi recettori attivano una trasduzione del segnale che stimola la fusione. Nell’immagine possiamo vedere diverse frecce poiché queste vie di segnalazione sono complesse e coinvolgono varie molecole e proteine. Abbiamo molto discusso anche dei segnali: • le proteine che vengono sintetizzate hanno uno o più segnali che consentono loro di raggiungere la loro corretta localizzazione. Quanti segnali deve avere una proteina che deve essere secreta? • deve avere il segnale per entrare nel reticolo endoplasmico, quindi la sequenza segnale; Dopo questo processo, come fa a sapere che deve essere secreta o restare nel reticolo, o nel Golgi, o andare ai lisosomi o nelle vescicole secretorie? • se la proteina deve restare nel reticolo, essa avrà un ulteriore segnale di ritenzione del reticolo. ▹ Abbiamo visto nelle scorse lezioni il funzionamento del segnale KDEL e del rispettivo recettore KDEL. Questo recettore lo troviamo al livello del reticolo del cis-Golgi e se vede una proteina segnale KDEL la prende e la riporta indietro nel reticolo. ▹ Per questo motivo viene denominato segnale di ritenzione, poiché serve per tenere le proteine nel reticolo. Ci sono però degli altri segnali che riguardano le proteine che devono rimanere nel Golgi: • una proteina che deve rimanere nel Golgi avrà il segnale per entrare nel reticolo e il segnale di ritenzione nel Golgi ↪ ciò significa che se una proteina deve essere secreta e dunque raggiungere l’esterno della cellula (partendo dal reticolo), non ha bisogno di segnali perché semplicemente verrà portata passivamente all’esterno della cellula; • se deve rimanere nel reticolo ci sono i segnali di ritenzione del reticolo come KDEL (per le proteine del lume) o la sequenza KKXX (dove X è un amminoacido qualsiasi) che serve per mantenere nel reticolo proteine di membrana del reticolo; • se le proteine devono rimanere nel Golgi avranno un altro segnale di ritenzione. ▹ A livello del trans-Golgi-Network vi è uno smistamento, infatti da esso partono vescicole di vario tipo che hanno funzioni e destinazioni diverse: • ci sono le vescicole della via secretoria costitutiva che ingloberanno alcuni tipi di proteine; • le vescicole che devono recarsi alla via endocitica per portare le proteine ai lisosomi attraverso gli endosomi; • vescicole che devono diventare delle vescicole secretorie e mediare poi la secrezione regolata. Dall’immagine è evidente come un unico compartimento (trans-Golgi-Network) contenga proteine di origine diversa, indicate nella rappresentazione con cerchietti rossi, verdi e da bastoncini celesti ↪ tre tipi di proteine (ovviamente nella realtà sono molti di più) che corrispondono a tre tipi di vescicole con tre contenuti diversi. Questo serve a farci comprendere che da un unico compartimento, quando parte una vescicola, seleziona il carico che non viene dunque preso casualmente. FINE RIASSUNTO FORMAZIONE VESCICOLE SECRETORIE |VESCICOLE SECRETORIE sono le vescicole della secrezione regolata; • in realtà anche quelle della secrezione costitutiva sono delle vescicole secretorie vista la loro funzione ma, per convenzione, si indicano in queste modo solo quelle della secrezione regolata Le vescicole secretorie sono facilmente distinguibili per microscopia elettronica poiché hanno un contenuto elettrondenso. 60 Nella figura sono rappresentate: • una vescicola secretoria immatura; • una vescicola secretoria matura. Perché creiamo questa differenza di maturità? Man mano che esse vanno a costituirsi e rimangono nella cellula, viene concentrato il carico ↪ questo si può notare in microscopia elettronica poiché diventano più scure, vista la crescita della concentrazione del carico nella vescicola. Come fa a concentrarsi? 1. al trans-Golgi Network partono delle vescicole che selezionano il carico (per esempio i neurotrasmettitori che devono essere presenti in queste vescicole); 2. una volta formata la vescicola, che ha al suo interno il materiale ma è ancora immatura e quindi non pronta alla secrezione, si formano delle vescicole di recupero (freccia celeste), che vanno a eliminare il contenuto in eccesso sia di membrana che di lume; 3. quindi portano indietro il materiale che non serve alla vescicola secretoria finale e che non va portato al di fuori della cellula; 4. una volta eliminato ciò che deve tornare indietro per essere recuperato, il carico della vescicola si concentra e essa diviene più scura ed elettron-densa. In ogni modo la fusione delle vescicole con la membrana segue la normale fusione. Nello schema: • la vescicola che va verso la membrana, si attracca alla membrana; • poi vi è la fusione della membrana plasmatica con la membrana della vescicola che fa in modo che il contenuto della vescicola sia secreto e che la membrana della vescicola diventi parte della membrana plasmatica. La foto al microscopio elettronico evidenzia la vescicola, il materiale concentrato (dà l’idea della maturità della vescicola), la fase di attracco, dove le due membrane sono vicine e infine la fase di secrezione dove il contenuto viene espulso. Per riassumere, via secretoria: • reticolo endoplasmico; • Golgi; • Trans-Golgi Network; • vescicole secretorie, di secrezione costitutiva o vescicole che vanno agli endosomi per portare le idrolasi acide lungo la via endocitica e quindi ai lisosomi. ▹ Fino ad ora abbiamo parlato di questi trasporti in cellule non polarizzate, ovvero: prendiamo un globulo rosso (tondeggiante e che risiede nel sangue) → esso non presenta una polarità poiché non presenta una testa e una coda. Una cellula mostra polarità se non è tutta uguale. |POLARIT FUNZIONALE può essere spiegata da un macrofago → cellula del sistema immunitario che “mangia” i corpi estranei e che migra nell’organismo ↪ essendo una cellula che si muove, il macrofago avrà una parte che andrà davanti e una che resterà indietro; • questa cellula sarà polarizzata funzionalmente nel momento in cui essa si muove poiché andrà in una certa direzione |POLARIT STRUTTURALE ci sono delle cellule che sono sempre polarizzate, indipendentemente dal movimento e che presentano questa polarità; ↪ ciò significa che hanno dei domini di membrana diversi (in composizione, struttura e funzione). I due esempi classici di cellule polarizzate sono: • le cellule epiteliali; • le cellule nervose (neuroni). |CELLULE EPITELIALI Abbiamo due cellule epiteliali che formano un epitelio; • esse hanno due domini di membrana diversi, in particolare il dominio baso laterale (in verde) e il dominio apicale (in rosa). ▹ Sono diversi in composizione perché presentano lipidi e proteine diverse o in quantità differenti. ▹ Sono diversi in struttura, come evidente ↪ la membrana apicale presenta i microvilli. ▹ Sono diversi in funzione poiché quello che avviene a livello della membrana apicale non avviene a livello della membrana baso laterale, e viceversa ↪ i microvilli servono ad aumentare la capacità di assorbimento, agevolando una serie di processi. |CELLULE EPITELIALI Anche la cellula nervosa presenta una sua polarità strutturale, visto che presenta: • il corpo cellulare → dove troviamo il nucleo; • delle protusioni → i dendriti; • un'altra protusione più lunga → l'assone tramite cui il neurone manda i suoi segnali nervosi. Anche qui dunque abbiamo due domini di membrana che sono differenti per composizione, struttura e funzione. 61 Il discorso delle cellule polarizzate serve ai fini della secrezione a comprendere un concetto fondamentale: ▹ se immaginiamo una cellula tonda che compie la secrezione, non è importante dove la vescicola va a fondersi, poiché è tutto uguale; ▹ ma se abbiamo una cellula polarizzata, la situazione cambia, poiché la secrezione è diversa. Riprendendo l’immagine: • se andiamo alla membrana apicale sversiamo il materiale in un luogo; • se andiamo alla membrana baso laterale sversiamo il materiale in un altro luogo. AD ESEMPIO nell’epitelio gastrico: • se la vescicola si va a fondere con la membrana apicale → il suo contenuto andrà all’interno dello stomaco; • se invece si fonde con la membrana baso laterale → il suo contenuto andrà nei fluidi extracellulari per poi arrivare al sangue. A partire dal trans-Golgi Network: • nelle cellule polarizzate ci deve essere qualche segnale che indichi alle proteine se andare dal lato apicale o baso laterale; • nel caso dei neuroni, se andare ai dendriti, all’assone o al corpo cellulare. Ci devono dunque essere degli ulteriori segnali. Una stessa proteina, dunque, può avere segnali diversi; AD ESEMPIO una proteina che deve essere secreta dal dominio apicale, deve avere: • il segnale per entrare nel reticolo ↪ arriverà dunque al trans-Golgi Network e alle vescicole successive; • il segnale che indichi il giusto inglobamento ↪ deve fare in modo che la proteina sia inglobata in vescicole che vanno al lato apicale e non a quello baso laterale. figura a cui fare riferimento Consideriamo che in questo caso i segnali non sono ancora chiarissimi, poiché probabilmente sono diversi e ci sono tante pubblicazioni a riguardo: per esempio, in tutta una serie di cellule noi abbiamo che dal trans-Golgi Network abbiamo due tipi di trasporto: • uno che va alla membrana baso laterale; • uno che va alla membrana apicale. Questi due domini sono separati da giunzioni dette GIUNZIONI STRETTE → servono a mantenere unite le cellule vicine e a non far passare materiale tra una cellula e l’altra; ↪ questa è la caratteristica degli epiteli con cellule tutte una vicina all’altra. Le vescicole che arrivano ai domini sono diverse (indicate in nero e in rosso le proteine nella figura). Devono dunque avere una sorta di segnale per poter essere riconosciute e trasportate alla giusta destinazione. Nell’ESEMPIO vediamo una proteina di membrana ma vale lo stesso discorso per le proteine del lume della vescicola che poi saranno secrete. Non tutte le cellule svolgono lo smistamento allo stesso modo: • negli epatociti tutte le proteine destinate alla secrezione vanno al lato baso laterale, quindi non ci sono vescicole che arrivano al lato apicale; • successivamente le proteine (indicate nella figura in rosso) che devono arrivare al lato apicale, vengono inserite in delle vescicole tramite endosomi e vengono recate a destinazioni. La ragione di questa diversità non è ancora conosciuta; lo smistamento ai due diversi domini aggiunge dunque un grado di complessità. |FORMAZIONE DI VESCICOLE SINAPTICHE |VESCICOLE SINAPTICHE sono vescicole di tipo particolare che sono presenti nelle cellule nervose e in alcune cellule endocrine; queste vescicole sono fatte per conservare e poi secernere neurotrasmettitori. il processo di formazione delle vescicole sinaptiche |COSA SUCCEDE Ci sono una serie di componenti sintetizzati sia dalla cellula che dal trans-Golgi Network, che arrivano poi fino alla membrana plasmatica 1. c'è la via secretoria e arriva alla membrana plasmatica (indicata dalla freccia rossa); 2. successivamente c’è l’endocitosi ↪ quindi abbiamo la cellula che va ad essere endocitata formando la vescicola, oppure si passa per l’endosoma. Il punto è che dalla membrana plasmatica si formano vescicole che poi si riempiono di neurotrasmettitori (indicati qui come puntini verdi); ↪ essi si concentrano ed entrano nelle vescicole. 62 ▹ Per cui, man mano che si forma il rivestimento che va ad incurvare la membrana ed a legare determinate proteine della membrana: • le proteine che non si legano ai complessi adattatori, si muoveranno nella zona in cui si sta formando la vescicola; • le proteine che si legano si fermano in questa posizione. ▹ In questo modo il rivestimento seleziona le proteine di membrana che faranno parte della vescicola; ↪ queste proteine di membrana possono essere, poi, recettori per altre molecole. • quindi, questa proteina, questo recettore, sarà legato dall’adattina e si bloccherà in questa posizione, che è la posizione in cui si sta formando la vescicola; • siccome questo è, a sua volta, un recettore, legherà quest’altra molecola e questa molecola verrà inclusa nella vescicola. Quindi il rivestimento, inteso come insieme delle proteine di rivestimento [in questo caso la creatina e delle proteine adattatrici] seleziona il carico della vescicola, sia in termini di proteine di membrana, sia in termini di proteine del lume della vescicola. |CLATRINA: STRUTTURA A- La clatrina ha una struttura detta a trischelio ↪ perché è fatta da tre catene pesanti e tre catene leggere → clatrina libera. B- i trischeli che si sovrappongono, interagiscono tra loro e formano questa struttura intorno alla vescicola che sembra una specie di gabbia. Questo è il trischelio di clatrina con le catene pesanti e le catene leggere: • in rosso la catena pesante; • in giallo la catena. Questa, invece, è la struttura di questo rivestimento di clatrina, dove potete vedere come si sovrappongono i vari trischeli. In questo caso sono evidenziati: uno in rosso, uno in marrone ed uno in verde. Chiaramente ce ne sono molti di più e questo legame, questa sovrapposizione, fa in modo che si formi questa struttura a gabbia intorno alla vescicola. Qua vediamo altre foto di triscleri e la struttura tridimensionale della clatrina che ingabbia la vescicola. In questa immagine al microscopio elettronico si vede, invece, la formazione della vescicola di clatrina. Possiamo distinguere anche la membrana plasmatica, l'esterno della cellula e c'è l'interno della cellula. Il rivestimento di clatrina è evidente, perché si vede questa struttura dal lato citosolico che seleziona le proteine di membrana, che sporgono dall'esterno e che andranno a legare i ligandi → piano piano l'immagine diventa sempre più profonda fin quando non abbiamo quasi una vescicola [vediamo ancora il collo della vescicola che non è stato chiuso, fino a quando questa vescicola poi non si stacca]. Al microscopio elettronico a scansione vediamo come una fotografia guardando la membrana dal lato del citosol. Ci sono vescicole che si stanno formando e vescicole che si sono già formate, con rivestimento di clatrina. |FORMAZIONE del RIVESTIMENTO e SELEZIONE del RECETTORE Qui possiamo osservare la membrana da cui parte la vescicola. Prima abbiamo fatto l'esempio delle endocitosi; tuttavia abbiamo visto che la clatrina funziona in vari tipi di trasporto: • abbiamo visto che le vescicole rivestite da clatrina partono anche dal trans-Gorgi Network ma anche da altri compartimenti e organelli. |COSA SUCCEDE Nella membrana plasmatica vi sono una serie di recettori che vanno a legare alcune delle molecole presenti [per esempio all'esterno della cellula]; 1. il recettore viene legato dalle adattine nella porzione citosolica; 2. poi le adattine vengono legate dalla clatrina ↪ questo fa in modo che la membrana si curvi e nello stesso tempo che il rivestimento sia responsabile anche della selezione delle proteine di membrana e delle proteine del lume che si legano a proteine di membrana. 65 ▹ Quando la vescicola è quasi del tutto formata e si deve staccare, questo avviene: • tramite costrizione e ripiegamento della membrana; • tramite processo di fissione [opposto al processo di fusione] ↪ nella fusione abbiamo una vescicola che si fonde ad un'altra membrana; nella fissione abbiamo la gemmazione di una vescicola. 3. una volta formata completamente la vescicola, grazie al suo rivestimento, e staccata dalla membrana donatrice, la vescicola perde il rivestimento e può andare a fondersi con il compartimento bersaglio. Cosa cosa ci dice questo processo? Se consideriamo questa membrana come la membrana plasmatica: - abbiamo la formazione delle vescicole endocitiche rivestite di clatrina; - abbiamo detto che la serie di proteine di membrana può essere riconosciuta dalle adattine, che a loro volta sono poi riconosciute dalla clatrina. È importante anche ricordare che queste proteine possono essere dei recettori per delle molecole che sono presenti, in questo caso [stiamo parlando di vescicole endocitiche] all'esterno della cellula. ▹ Quindi, tutto questo processo, serve a far si che: • le proteine adattatrici riconoscano i recettori; • i recettori riconoscano e leghino delle proteine ↪ sia questi recettori che le proteine saranno inglobate nelle vescicole. ▹ Se stiamo parlando di membrane plasmatiche e, quindi, di vesciole endocitiche, dobbiamo dire che queste sequenze amminoacidiche riconosciute dalle adattine, o meglio da questi complessi adattatori, sono dei segnali per l'endocitosi. Perché sono segnali per l'endocitosi? Se abbiamo 10 proteine su di una membrana e alcune vengono endocitate ed altre no. A seconda del tipo di proteina, quelle che vengono endocitate hanno una sequenza particolare che viene riconosciuta dalla reattina → quindi questo è un segnale per l'endocitosi. Quindi, tra i vari segnali studiati, aggiungiamo anche il segnale per l’endocitosi ↪ cioè la sequenza amminoacidica presente a livello del dominio citosolico di queste proteine di membrana e che gli permette di essere internalizzate nelle vescicole rivestite da clatrina; • le proteine che hanno questo segnale verranno riconosciute dalle adattine ed internalizzate; • le proteine che non hanno questo segnale non verranno riconosciute delle adattine e quindi non verranno internalizzate. |SEGNALI PER L'ENDOCITOSI Questi segnali sono molto semplici: I° SEGNALE - DUE LEUCINE quando alcune proteine di membrana che si trovano sulla membrana plasmatica, hanno nella sequenza citosolica due leucine, una dietro l’altra → questo amminoacido è ripetuto due volte • questo segnale viene riconosciuto dal complesso adattatore AP2 e porta queste proteine ad essere internalizzate • è fatto da II° SEGNALE - TIROSINA-XX-AMMINOACIDO questo segnale è leggermente più complesso ed è fatto da quattro amminoacidi: • il primo amminoacido è una tirosina; • il secondo ed il terzo sono amminoacidi qualsiasi → quindi XX; • il quarto è un amminoacido idrofobico. Questi due segnali vengono, quindi, riconosciuti dal complesso adattatore AP2 e queste proteine vengono internalizzate nelle vescicole rivestite di clatrina. Abbiamo visto che la clatrina è un rivestimento non solo per le vescicole endocitiche, ma anche per altri tipi di vescicole; • come proteina di rivestimento è, effettivamente, sempre la stessa; ciò che cambia sono le proteine adattatrici. I complessi adattatori possono essere, per esempio, AP1, AP2 o AP3 ↪ la clatrina è sempre la proteina di rivestimento, ma i complessi adattatori sono diversi. ▹ Questi complessi adattatori diversi selezioneranno: - sia proteine di membrana diverse, che quindi andranno a selezionare proteine; - che il lume dell'organello per esempio • Clatrina + AP1 può essere un certo tipo di trasporto • Clatrina + AP2 un altro tipo di trasporto; • Clatrina + AP3 un altro tipo di trasporto. ↪ quindi i complessi adattatori possono variare, anche se la proteina di rivestimento rimane la stessa. Si parla sempre di rivestimento di clatrina, ma i complessi adattatori sono diversi e quindi le proteine che vengono selezionate come carico che siano proteine di membrana o proteine del lume, vengono legate alle proteine di membrana e cambiano a seconda delle proteine adattatrici. 66 |ALTRI TIPI DI RIVESTIMENTO • COP1; • COP2. Il rivestimento è diverso e quindi la struttura di queste proteine di rivestimento è diversa ↪ quindi questa gabbia intorno alla vescicola è abbastanza diversa, ma il principio è sempre quello • abbiamo la proteina di rivestimento; • le proteine adattatrici che vanno a legare le proteine di membrana; • le proteine di membrana, a loro volta, legheranno altre proteine. Quindi il rivestimento di nuovo è responsabile del reclutamento nella vescicola di proteine di membrana, poi di proteine solubili e quindi della selezione del carico. Noi abbiamo considerato solo tre tipi di rivestimento, ma ce ne sono altri che non sono ancora stati identificato o trovati. Alcuni ricercatori pensano che tutte le vescicole nella loro formazione debbano avere un rivestimento, proprio per il ruolo del rivestimento nel curvare la membrana e selezionare il carico e quindi si pensa che le vescicole senza rivestimento siano: • o derivate da quelle con il rivestimento che poi hanno perso il rivestimento; • o che si vedano senza rivestimento semplicemente perché non abbiamo gli strumenti per vedere il rivestimento; • o che il rivestimento non sia stato ancora identificato. Quindi, si ritiene che l'avere il rivestimento sia un meccanismo generale che debba valere per ogni tipo di trasporto vescicolare. DISTACCO VESCICOLARE Il distacco della vescicola avviene ad opera di una proteina che si chiama dinamina, la quale si dispone sul collo della vescicola a spirale; • ci sono tante molecole di dinamina che formano una spirale; • quello che fanno con l'idrolisi del GTP è stringere questo colletto della membrana, in modo che poi si effettui la fissione → cioè il distacco della vescicola. Nell'immagine si vede la dinamina → la struttura che è come se tagliasse il collo della vescicola. |DINAMINA è una proteina G, che lega e idrolizza il GTP. |COSA SUCCEDE se prendiamo una molecola analoga al GTP, che quindi sarà legata dalla dinamina ma che non può idrolizzare, perché è un analogo non idrolizzabile. ▹ La dinamina non può idrolizzare, quindi non riesce a far staccare la vescicola. ▹ Se usiamo questo analogo non idrolizzabile del GTP vedremo delle vescicole con un collo lunghissimo, perché, appunto, la dinamina non riesce ad agire • le molecole di dinamina continuano a porsi sul collo della vescicola; • il collo della vescicola diventa lunghissimo, ma la vescicola non riesce a staccarsi. ▹ Una volta che la vescicola si è spaccata, tramite la dinamina, deve: • muoversi nella cellula; • raggiungere il compartimento bersaglio. ↪ attraccarsi, ormeggiarsi, fondersi e quindi scaricare il suo contenuto nel compartimento bersaglio. In tutti questi processi hanno un ruolo anche le |PROTEINE RAB sono delle proteine G quindi proteine che legano e idrolizzano il GTP. PROTEINE G Le proteine G, nei vari processi in cui si presentano, hanno funzioni diverse ma sono sempre dei regolatori e degli interruttori molecolari ↪ perché possono passare da essere legati al GTP, quindi attivi, ad essere legate al GDPE, quindi inattive → per questo vengono chiamate interruttori molecolari. Perché le proteine RAB hanno un ruolo importante? Le proteine RAB sono circa 70 e ognuna di queste regola una certa tappa del trasporto. Ad esempio PROTEINA RAB5 regola il trasporto dalla membrana agli endosomi precoci; PROTEINA RAB7 regola il trasporto tra gli endosmi tardivi ed i lisosomi 67 Negli endosomi tardivi troviamo le vescicole intraluminari; • con la fusione tra endosoma tardivo e lisosoma si forma l’endolisosoma e le idrolasi acide vanno a distruggere anche queste vescicole intraluminali; • degradano poi tutto il materiale che è arrivato e si ritorna praticamente al lisosoma. L’ endocitosi si può anche classificare in base alle molecole che entrano e alle modalità di entrata. |ENDOCITOSI DELLE LDL LDL sono le Low Density Lipoproteins e sono proteine che legano il colesterolo. Il colesterolo è una molecola molto importante: • costituisce le membrane; • è anche il precursore degli ormoni steroidei e di tutta un'altra serie di molecole. Le LDL sono complessate con il colesterolo; • esistete nella cellula il recettore per l'LDL, che è presente sulla membrana plasmatica e serve per internalizzare le LDL e quindi per internalizzare il colesterolo. |COSA SUCCEDE 1. il rivestimento, e l'LDL a sua volta, selezionano il recettore delle LDL nella vescicola nascente ↪ quindi nelle vescicole ci sarà LDL; 2. la vescicola perde il rivestimento e si va a fondere con gli endosomi precoci ↪ quindi si fonderà con gli endosomi precoci e il recettore; 3. a livello degli endosomi precoci il recettore si stacca dall’ LDL ↪ perché negli endosomi precoci vi è un pH acido; 4. il recettore verrà recuperato e tornerà alla membrana plasmatica per andare a rilegare altre LDL e portare altro colesterolo dentro; 5. nel mentre le LDL procederanno agli endosomi tardivi ed ai lisosomi e verranno degradate liberando il colesterolo, che sarà messo a disposizione della cellula. In questo caso stiamo parlando di endocitosi mediata da recettore delle LDL. Questo avviene per tutta una serie di recettori, che portano all'interno della cellula, molecole importanti per la cellula. Come si è scoperto questo meccanismo? I due ricercatori Brown e Goldstein stavano studiando una patologia: l'ipercolesterolemia familiare. A causa di questa patologia i pazienti avevano alte quantità di colesterolo nel sangue. [grafico B] -i pallini verdi sono gli individui normali -i pallini blu sono gli individui con questa patologia. 1. prima hanno preso le cellule di questi pazienti e le hanno incubate con delle LDL, marcate radioattivamente per perseguirle. 2. poi hanno preso le cellule dei pazienti e cellule di individui sani e le hanno incubate con LDL. ▹ Nelle cellule sane, man mano che passava il tempo si legavano sempre di più all’LDL fino a saturarsi, fino a che non si legava più niente. Cosa significava? Legavano a delle molecole specifiche che poi sono state individuate come i recettori, che erano presenti in un numero ben preciso sulla cellula ↪ all'inizio, più passa il tempo, più si legano alla cellula; da un certo punto in poi non si possono più legare perché tutti i recettori sono pieni. ▹ Nelle cellule dei pazienti nell’LDL non si legavano per niente. Successivamente questi ricercatori hanno scoperto che le cellule di questi pazienti, avevano il recettore delle LDL mutato nel dominio extracellulare, cioè in quello che legava LDL. ↪ quindi nell’LDL non trovavano il recettore a cui legarsi perché questo aveva il dominio di legame dell’ LDL cioè il dominio extracellulare mutato. C'erano però degli altri pazienti, che avevano sempre ipercolesterolemia familiare, che si comportavano, rispetto al legame con l’LDL, come individui normali. Quindi erano famiglie che avevano la stessa ipercolesterolemia familiare, che però quando andavano a fare questo saggio di legame non vedevano differenze. Allora che cosa hanno fatto? Hanno deciso di legare l’LDL. 1. Questo esperimento veniva fatta a 4°, temperatura a cui non c'è endocitosi. 2. Successivamente veniva fatto scaldare a 37° per vedere quante LDL e quindi colesterolo, entrava nella cellula. RISULTATI: ▹ nelle cellule normali entrava parecchia LDL, quindi colesterolo; ▹ nelle cellule dei pazienti, che legavano e non LDL, non entrava LDL. 70 I° CASO- è chiaro che se l’LDL non si lega al recettore, anche se il recettore entra, non porterà LDL dentro. II° CASO- hanno visto che questo recettore era mutato nel dominio citosolico. RICORDA! il recettore: porzione extracellulare, porzione trans membrana, porzione citosolica. ▹ nel primo gruppo di famiglie era mutata la porzione extracellulare, cioè quella che riconosce l’LDL ↪ quindi all’LDL non si possono legare, il colesterolo non può essere internalizzato e rimane all'esterno e si determina ipercolesterolemia. ▹ nel secondo gruppo di famiglia, le LDL che trasportano il colesterolo si legano al recettore, si legano anche normalmente. Quando vengono a internalizzate, quindi scaldate a 37°, avvenendo l' endocitosi, LDL non entrano; ↪ questo perché il recettore è mutato nel dominio citosolico, quello che ha il segnale di endocitosi e che è riconosciuto dalle adattine. Quindi è vero che l’LDL si lega al recettore, ma il recettore non viene riconosciuto dalle adattine e quindi non viene endocitato; quindi il colesterolo resta nel sangue e determina la patologia. CORPI MULTIVESCICOLARI Il corpo multivescicolare è una struttura, un organello, contenente tante vescicole. Queste vescicole sono presenti nei corpi multivescicolari e soprattutto negli endosomi tardivi. A livello dei lisosomi, sebbene in questa figura sembra che ci siano, in realtà vengono distrutte. A cosa servono questi corpi molti vescicolari? La loro utilità si è scoperta una volta analizzata l’endocitosi di altri recettori ↪ quindi non i ricettori dell’LDL, ma il recettore per la segnalazione. |COSA SUCCEDE In questo caso si parte già dall’endosoma precoce. 1. un recettore lega il ligando, viene inglobato nelle vescicole rivestite da latrina ed entra nella vescicola rivestita da clatrina; 2. la vescicola poi perde il rivestimento e va a fondersi con gli endosomi precoci. Quando abbiamo un recettore che funziona nella segnalazione, la parte citosolica del recettore è quella che segnala. ▹ Se consideriamo di portare questo recettore avanti nella via endocitica [quindi dagli endosomi precoci agli endosomi tardivi fino ai lisosomi], essendo i compartimenti topologicamente equivalenti, si avrà questo dominio nel citoplasma: • sia nell’endosoma precoce; • sia nell’endosoma tardivo;infine nel lisosoma. Questo dominio citosolico è quello che effettua la segnalazione ed oltretutto il recettore sarebbe degradato nella porzione intraluminare, mentre la porzione citosolica e quella trans membrana rimarrebbe non degradate ↪ questo perché le idrolasi acide degradano solo quello che sta all’interno del lisosoma. Il recettore quindi continuerebbe a segnalare. Tramite questo meccanismo di formazione delle vescicole, nell’endosoma si formano delle vescicole dove è presente il recettore, in modo che la porzione citosolica di questo recettore venga inglobata in esse. Questa porzione citosolica, che serve per la segnalazione, viene inglobata nelle vescicole e quindi non è più nel citosol. 1. Termina la segnalazione 2. Il recettore sarà completamente nel corpo multivescicolare, dunque nell’endosoma tardivo e potrà essere completamente degradato nell’endolisosoma. RICAPITOLANDO TRAFFICO VESCICOLARE 1. si forma una vescicola dal compartimento donatore che si va poi a fondere con il compartimento accettore [o compartimento bersaglio]; 2. si ha la gemmazione della vescicola; 3. infine avviena la fusione della vescicola. Ci sono diverse tappe per la formazione e fusione della vescicola e un ruolo importante lo svolgono i rivestimenti della vescicola ↪ questo perché il rivestimento ha un ruolo importante per incurvare la membrana e selezionare il carico. Esempi di 3 rivestimenti: CLATRINA, COPI e COPII. Questi rivestimenti sono fatti diversamente perché le proteine che li compongono sono diverse ma hanno la stessa funzione ↪ cioè quella di incurvare la membrana, facendo formare la vescicola, ma soprattutto selezionare il carico della vescicola. CARICO in termini di proteine di membrana della vescicola che a loro volta possono selezionare dei ligandi, cioè qualcosa che legano, vanno a selezionare anche molecole che saranno presenti nel lume della vescicola. 71 Quindi non solo il rivestimento serve a selezionare le proteine di membrana, ma indirettamente, seleziona anche proteine che saranno dentro il lume della vescicola perché riconosciute dai recettori. |CLATRINA: SELEZIONE DEL CARICO I rivestimenti sono fatti da: • proteine di rivestimento vere e proprie; • proteine adattatrici (chiamate complessi adattatori perché fatti da più proteine adattartici diverse). Secondo il modello della membrana a mosaico fluido, si hanno due strati fosfolipidici, all’interno dei quali si trovano delle proteine che possono essere integrali di membrana, immersi nella membrana. Siccome il modello è a mosaico fluido, i lipidi e le proteine si muovono. ▹ In una porzione di membrana della cellula, ci saranno tantissime proteine diverse che secondo il modello del mosaico fluido si spostano nel mosaico ▹ Nel momento in cui una proteina viene legata dal complesso adattatore, si ferma in una posizione. ▹ Successivamente si lega anche la clatrina. Il rivestimento serve a incurvare la membrana e ad indurre la gemmazione di una vescicola ma serve soprattutto a selezionare il carico ↪ questo perché le proteine trans membrana che vengono legate alle proteine adattartici si fermano in una zona della membrana perché legate a queste molecole che a loro volta sono legate dalla proteina di rivestimento che si chiama adattina. ▹ Quindi, mentre una vescicola si sta formando, una serie di proteine vanno avanti e indietro (secondo il modello a mosaico fluido) ma non si fermano perché non vengono legate dalle adattine. Questo porta a fare in modo che nella vescicola nascente ci sia una grossa concentrazione di proteine legate alle adattine. ▹ In una vescicola rivestita da clatrina si troveranno diverse proteine che vengono selezionate per essere nella vescicola. Per essere selezionate devono avere il SEGNALE DI ENDOCITOSI (nel caso di endocitosi). ↪ quindi ci vogliono dei segnali che sono nella porzione citosolica del recettore perché devono essere riconosciuti dalle proteine adattartici in modo da essere inglobati nella vescicola che si sta formando. ▹ La vescicola si forma e c’è una proteina che si chiama dinamina, che forma degli anelli intorno al collo della vescicola ed idrolizzando il GTP è in grado di far staccare la vescicola. ▹ Una volta che la vescicola si è staccata, il rivestimento non serve più, in quanto questo serviva per selezionare il carico e far formare la vescicola. ▹ Una volta che la vescicola si stacca essa viene chiamata VESCICOLA DI TRASPORTO NUDA ↪ perché non ha più il rivestimento e può proseguire a spostarsi sui binari del citoscheletro per raggiungere il compartimento accettore. |FORMAZIONE DEL RIVESTIMENTO COP II Ci sono sempre delle proteine G che entrano nel controllo di tutti i processi cellulari ↪ perché le proteine G sono degli interruttori molecolari e quindi sono importanti per la regolazione di processi cellulari. In questo caso in membrana si ha un GEF • fattore di scambio → proteina che stimola la proteina G a lasciare il GDP e prendere il GTP. Questa proteina, una volta fatto questo, si ritrova legata al GTP e quindi attiva in membrana: • sarà in grado di reclutare delle proteine adattartici che andranno a selezionare delle proteine di membrana; • queste, a loro volta, andranno a selezionare dei ligandi e quindi del cargo che sarà poi trasportato nel lume della vescicola. Le proteine adattartici saranno ligate dal rivestimento che, in questo caso, è un rivestimento di COPII. ▹ Questo rivestimento va a far incurvare la membrana mentre le proteine adattartici selezionano le proteine da trasportare. ▹ Quindi il rivestimento seleziona le proteine sia della membrana che del lume della vescicola nonostante si trovi nel citosol, quindi non a contatto con il lume. Il rivestimento è fatto da proteine di rivestimento vere e proprio (chiamate anche proteine del rivestimento esterno) e proteine adattartici (chiamate anche proteine del rivestimento interno); • il rivestimento si lega alle proteine di membrana che legano le proteine del lume che vengono selezionate dentro la vescicola. |FUSIONE DELLA VESCICOLA Il processo di riconoscimento del compartimento bersaglio e poi di fusione è regolato dalle proteine RAB ↪ quando sono attive e presenti sulla vescicola, reclutano su di essa una serie di effettori, di proteine che svolgono una serie di funzioni. I°- PROTEINA DI ATTRACCO è il primo effettore e serve a fermare la vescicola; poi si ormeggia perché la proteina di attracco si piega; • una volta che ha legato la vescicola, la avvicina al compartimento bersaglio. 72 Ciò che succede per i recettori di segnalazione è diverso. I recettori di segnalazione, quando si formano le vescicole intraluminali, vengono inglobati in esse: • la porzione extracellulare rimane nel lume dell’organello → perché il lume dell’organulo è equivalente topologicamente all’esterno della cellula • la porzione citosolica si ritrova dentro la vescicola luminale → perché la vescicola è topologicamente equivalente al citosol, quindi quando si forma la vescicola il dominio citosolico del recettore sarà dentro la vescicola. A questo punto, formando un corpo multivescicolare, si è messo per intero il recettore dentro il corpo multivescicolare ↪ quindi quando arriverà al lisosoma o all’endolisosoma le idrolisi acide andranno a degradare tutto il recettore, anche la porzione citosolica che non potrà più segnalare. Inoltre, già da quando la porzione citosolica si rimuove dal citosol, non potrà più segnalare. ▹ Quindi, anche quando si parla di endocitosi mediata da clatrina, a seconda del caso di endocitosi le molecole si comportano diversamente ↪ questo perché il recettore della transferrina viene recuperato indietro insieme alla transferrina e quindi non arriva mai ai compartimenti tardivi, ma solo agli endosomi precoci di smistamento e agli endosomi di recupero. ▹ Nel caso del recettore delle LDL e dell’internalizzazione delle LDL, il recettore viene recuperato mentre le LDL vengono degradate per liberare il colesterolo. ▹ Nel caso dei recettori di segnalazione, come i recettori per le GF, sia il recettore che il ligando, cioè le GF, vengono completamente degradati all’interno dell’endolisosoma e poi del lisosoma. |CURL è il compartimento dove il recettore ed il ligando si staccano; • precedentemente gli endosomi precoci venivano chiamati curl che stava per compartimento dove c’era il distacco di recettore e ligando Questa definizione di compartimento va bene dal punto di vista funzionale ma non può indicare un unico compartimento perché: • ci sono recettori che si staccano dai ligandi a livello degli endosomi precoci; • altri recettori che non si staccano dai ligandi; • altri recettori che si staccano a livello degli endosomi tardivi. Quindi definire, oggi, un compartimento curl lo si può fare solo per quel recettore, perché cambia a seconda del recettore. |SELEZIONE DELLE PROTEINE CHE DEVONO ESSERE INTERNALIZZATE NELLE VESCICOLE INTRALUMINALI Le proteine devono avere un segnale che è rappresentato da una MOLECOLA di UBIQUITINA. RICORDA! ▹ Degradazione proteasomica ubiquitina-dipendente. L’ubiquitina serviva a marcare proteine che devono essere degradate dal proteasoma. riferimento a ▹ POLIUBIQUITINAZIONE, ovvero di catene lunghe di tante molecole di ubiquitina. In questo caso si parla di MONOUBIQUITINAZIONE perché c’è un’unica molecola di ubiquitina che si attacca alla molecola del recettore; • in realtà le molecole sono due perché molti di questi recettori per la segnalazione, dimerizzano e quindi si ha un dimero; • ognuno dei monomeri è marcato con l’etichetta di ubiquitina, ma in realtà è sempre monoubiquitinazione perché c’è una sola ubiquitina per monomero. L’ubiquitina è il segnale, quindi: • le proteine che sono monoubiquitinate vengono internalizzate nelle vescicole intraluminali; • le proteine che non sono monoubiquitinate non vengono internalizzate nelle vescicole intraluminali e quindi rimangono nella membrana delimitante l’endosoma, il corpo multivescicolare o il lisosoma. Come funziona questo processo? Si ha una serie di complessi che si chiamano ESCRT (complessi endosomai richiesti per il trasporto); 1. vari complessi [ESCRT-0, ESCRT-1, ESCRT-2, ESCRT-3] riconoscono l’ubiquitina e la legano; 2. essi legano anche il fosfatidilinositolo-3-fosfato (lipide presente a livello degli endosomi PI(3)P); 3. successivamente si passa al complesso 1, 2, 3 e il recettore viene a far parte della vescicola nascente intraluminale che si ritroverà nell’endosoma. ▹ C’è un lipide che prende parte in questo processo. Ci sono una serie di lipidi importanti per il trasporto; le membrane, infatti, non sono tutte uguali sia in termini di proteine ma anche in termini di lipidi. Ci sono lipidi caratteristici di alcuni compartimenti. esempio • gli endosomi precoci di smistamento hanno il fosfoinositile (PI(3)P); • la membrana plasmatica ha un altro fosfoinositile (fosfatidilinositolo-4,5-fosfato). Quindi anche i lipidi sono importanti per questi tipi di trasporto. Ci sono lipidi che caratterizzano compartimenti particolari e, per esempio, anche il reclutamento del rivestimento dipende da alcuni tipi particolari di lipidi. 75 |ALTRO RUOLO DEGLI ENDOSOMI La cellula può immagazzinare dei trasportatori a livello degli endosomi quando non servono. ad esempio I trasportatori del glucosio sulla membrana sono pochi e quindi entra poco glucosio ↪ la maggior parte dei trasportatori del glucosio sono presenti a livello degli endosomi. Quando arriva l’insulina, essa si lega al recettore, il quale inizia la segnalazione e tutti i trasportatori vengono trasportati sulla membrana ed entra molto più glucosio nella cellula. ▹ La cellula, quindi, può regolare l’attività di una proteina regolandone la localizzazione intracellulare. ↪ infatti i trasportatori del glucosio, che sono messi negli endosomi, non possono svolgere la loro funzione in quanto non sono attivi. ▹ Nel momento in cui vanno sulla membrana plasmatica possono funzionare da trasportatore e far internalizzare glucosiodnella cellula ↪ quindi la cellula li tiene negli endosomi in modo da averli pronti per quando arriva l’insulina. TRANSCITOSI È un processo tramite cui la cellula viene attraversata; • essa è tipica delle cellule polarizzate cioè che hanno due domini di membrana diversi per composizione, struttura e funzione. La transcitosi serve a portare materiale da una parte all’altra della cellula, quindi dal lato basolaterale al lato apicale o viceversa. |COME FUNZIONA esempio delle immunoglobuline (gli anticorpi) e con la ghiandola mammaria. Come arrivano gli anticorpi nel latte? Gli anticorpi si trovano normalmente nel sangue. Nelle cellule della ghiandola mammaria si ha la porzione basolaterale e la porzione apicale (che guarda verso l’esterno). 1. gli anticorpi vengono riconosciuti da un recettore, perché nella porzione basolaterale della cellula mammaria si avrà il sangue; 2. vengono inglobati in vescicole (rivestite da clatrina) e arrivano agli endosomi precoci; 3. dopodiché vanno agli endosomi di recupero e vengono trasportati sulla membrana apicale e rilasciati nel latte. Anche per l’endocitosi nelle cellule polarizzate si ha che nella cellula si hanno endosomi precoci apicali e basolaterali ed endosomi di recupero apicali e basolaterali. Ci sono, quindi, due endocitosi, una dal lato apicale e l’altra dal lato basolaterale. Quando la cellula deve mandare materiale dal lato apicale o dal lato basolaterale agli endosomi tardivi o ai lisosomi, queste due vie: • si uniscono a livello dei compartimenti degradativi; • restano separate a livello degli endosomi precoci e degli endosomi di recupero ↪ questo perché: - qualcosa che entra dal lato apicale poi deve tornare indietro al lato apicale e quindi ci sono gli endosomi di recupero apicali; - qualcosa che entra dal lato basolaterale e poi deve tornare sulla membrana basolaterale utilizzerà gli endosomi di recupero basolaterali. Un’eccezione rappresentata dalla transcitosi è che utilizza gli endosomi precoci di un lato e gli endosomi di recupero dell’altro lato. ▹ Quindi, se un anticorpo riconosciuto dal recettore per FC • questo recettore tramite vescicole rivestite da clatrina, arriva agli endosomi precoci del lato basolaterale, • poi, però, trasporta questo recettore agli endosomi di recupero apicali ↪ quindi la vescicola trasporterà il recettore che porterà le immunoglobuline dal lato apicale → le immunoglobuline saranno presenti nel latte. ▹ Al contrario, nella cellula intestinale: • gli anticorpi vengono riconosciuti da recettori sulla membrana apicale della cellula intestinale; • il recettore per gli anticorpi della cellula epiteliale intestinale porterà gli anticorpi agli endosomi precoci apicali e poi agli endosomi di recupero basolaterali. Quindi gli anticorpi finiranno nei fluidi extracellulari e quindi nel sangue. Nella ghiandola mammaria: • la parete basolaterale sta a contatto con i fluidi extracellulari e con il sangue; • la porzione apicale è quella che va verso l’esterno dove c’è la secrezione del latte. Nella cellula intestinale, la transcitosi è nel senso opposto: va dall’apicale (cioè il lume intestinale) al basolaterale; • il basolaterale sta a contatto con i fluidi extracellulari e con il sangue; • il lato apicale va verso l’esterno degli epiteli. A parte l’endocitosi mediata da clatrina, ci sono altri tipi di pinocitosi ↪ questo perché si è visto che bloccando alcune vie di endocitosi, c’era comunque materiale che continuava ad entrare, ad arrivare agli endosomi. Questo significa che le vie endocitiche sono svariate. 76 |ENDOCITOSI MEDIATA DA CAVEOLINA |CAVEOLINA è un’altra proteina di rivestimento. Le vescicole rivestite da caveolina, al microscopio elettronico a scansione, appaiono come delle linee sopra la vescicola che si sta formando, un gomitolo. Le CAVEOLE hanno una struttura diversa sia nel rivestimento che nella forma rispetto alle vescicole rivestite da clatrina; • questo perché le caveole hanno una forma più a fiasca, sono meno tondeggianti; • spesso si allungano molto nel citoplasma e hanno una serie di protuberanze. Le caveole sono state inizialmente scoperte nelle cellule endoteliali [ricoprono i vasi sanguigni], quindi si pensava che fosse una caratteristica esclusiva delle cellule endoteliali [sono però presenti anche in altri tipi cellulari ma in quantità minore]. Inizialmente si pensava che fossero delle strutture statiche, ferme e non fossero responsabili di endocitosi ↪ questo perché, mentre la formazione delle vescicole rivestite da clatrina è molto rapida, nel caso delle caveole si hanno dei tempi più lunghi. Nonostante ciò, si è dimostrato che le caveole sono in grado di staccarsi e di far internalizzare alla cellula del materiale. |VIA INTERESSATA DALLE CAVEOLE Dalle caveole si formano delle vescicole rivestite da caveolina che poi vanno agli endosomi precoci, sebbene sembrino andare in maniera prevalente al caveosoma. Al contrario di quanto accade per le vescicole rivestite da clatrina, che perdono il rivestimento e poi si vanno a fondere, le strutture rivestite da cavallina perdono in parte il rivestimento ma quando vanno a fondersi con il caveosoma conservano parte del rivestimento che si ritrova nel caveosoma; • quando si arriva al caveosoma, il materiale può prendere diverse vie e quindi arrivare al reticolo endoplasmico, al complesso del Golgi ma anche agli endosomi precoci. Questo tipo di endocitosi porta direttamente al complesso del Golgi o al reticolo endoplasmico. Questo viene sfruttato da alcuni patogeni intracellulari ↪ i microrganismi che invadono le cellule entrano tramite questo sistema per poter raggiungere o il Golgi o il reticolo endoplasmico senza problemi. Questo perché entrare tramite endocitosi o fagocitosi significa finire nel lisosoma, un organello in grado di distruggere il microrganismo entrato; • invece, se il microrganismo entra tramite caveole e finisce nel caveosoma, può spostarsi nel reticolo endoplasmico o al livello del complesso del Golgi avendo meno problemi. Il virus SV40 entra tramite caveole, arriva al caveosoma e poi si ritrova al reticolo endoplasmico. Un’altra modalità di entrata è la MACROPINOCITOSI • in essa c’è un’estroflessione della membrana 1. la membrana prima si increspa formando delle strutture che sporgono da essa, fino a quando queste non si richiudono sulla membrana formando un MACROPINOSOMA. ▹ Si parla di macropinosoma e di macropinocitosi perché mentre per le vescicole formate dagli altri tipi di pinocitosi si ha l’invaginazione della membrana, ma soprattuto la formazione di vescicole molto piccole, in questo caso il macropinosoma è molto più grande. ▹ La macropinocitosi serve principalmente per la risposta immunitaria • con questo processo si internalizzano le molecole presenti nei fluidi extracellulari che vengono tagliate e poi presentate alle cellule del sistema immunitario ▹ Quindi se ci sono tossine o proteine batteriche o qualcosa che non appartiene alla cellula, di “non self” della cellula, questi vengono messi a disposizione delle cellule del sistema immunitario. La FAGOCITOSI è l’internalizzazione, in compartimenti delimitati da membrane, di materiale particolato → ovvero cellule o frammenti di cellule; • negli eucarioti inferiori è un processo sempre presente che serve per nutrirsi; • negli eucarioti superiori la fagocitosi è appannaggio di particolari cellule del sistema immunitario come i macrofagi e i neutrofili e quindi viene usata per eliminare microorganismi, potenziali pericoli, cellule vecchie o che non funzionano più. ↪ questo processo, negli eucarioti superiori, è effettuato dalle cellule fagociti (che sono i macrofagi o i neutrofili). ▹ Anche per la fagocitosi non c’è un’invaginazione della membrana: • la membrana non rientra verso l’interno per poi gemmare una vescicola o un compartimento, ma forma dei filipodi e lamellipodi che sporgono verso l’esterno e che vanno ad inglobare il materiale da fagocitare. Il fagosoma, rispetto ad una piccola vescicola rivestita da clatrina, può essere molto grande. ▹ Quindi nella fagocitosi si formano dei pseudopodi, filopodi, lamellipodi che si estendono man mano e vanno ad inglobare il materiale da internalizzare. ▹ La fagocitosi avviene quando il materiale da fagocitare viene riconosciuto da specifici recettori. 77 NEUTROFILO CHE INSEGUE I BATTERI L’actina è concentrata maggiormente nel fronte di avanzamento della cellula. 1. la cellula è più stretta nella parte distale perché si sta staccando da quel lato per muoversi sulla superficie e prosegue nella direzione del fronte; 2. i batteri si sono spostati e la cellula sposta l’actina e si gira per cercare di prendere i batteri → processi rapidi; 3. la cellula si riorganizza come forma e polarizza diversamente l’actina, spostandola nel fronte di avanzamento. ▹ Il citoscheletro determina anche l’organizzazione e la polarità cellulare. ▹ Si hanno delle cellule epiteliali; • esse nella porzione apicale hanno dei microvilli ↪ strutture fatte dalla membrana, possibili in quanto si ha il citoscheletro di actina che li sostiene e che serve alla loro formazione. Se si dovesse distruggere il citoscheletro di actina, in queste cellule, scompariranno i microvilli. • le cellule epiteliali sono tenute insieme da una serie di giunzioni ↪ perché in un epitelio le cellule sono una vicina all’altra e sono tenute insieme dalle giunzioni così che niente possa passare attraverso l’epitelio. • gli epiteli sono normalmente sistemati nelle zone dell’organismo che sono a contatto con l’esterno. RICAPITOLANDO Il citoscheletro è una parte importante della cellulare. Ci sono 3 componenti che formano il citoscheletro: • microtubuli; • microfilamenti; • filamenti intermedi. I microtubuli sono i più spessi in quanto hanno un diametro di circa 25 nanometri, i filamenti di actina o microfilamenti hanno un diametro di 8 nanometri ed i filamenti intermedi invece hanno un diametro di circa 10-14 nanometri (vengono chiamati filamenti intermedi proprio perché hanno un diametro intermedio). A cosa serve il citoscheletro per le cellule? In realtà ha tutta una serie di funzioni: • innanzitutto determina l’organizzazione della cellula e la forma della cellula Se togliessimo il citoscheletro alle cellule, queste sarebbero tutte tondeggianti, invece sappiamo che ci sono numerosi tipi cellulari nell’organismo ↪ basti considerare che nell’uomo ci sono più di 200 tipi di cellule diverse ed, a parte le cellulepresenti nel sangue, la maggior parte hanno forma tondeggiante. Poi ci sono tanti altri tipi cellulari che hanno invece una forma ben definita e questa forma è data proprio dal citoscheletro. • il citoscheletro è poi importante per resistere a forze che potrebbero facilmente rompere le cellule ↪ quindi esso rappresenta un sistema per resistere a queste forze; • esso è fondamentale anche per il movimento della cellula ↪ molte cellule sono in grado di effettuare un’attività migratoria ad esempio mettendole in una piastra sono in grado di spostarsi da una parte all'altra, proprio grazie al citoscheletro; • non solo determina la forma di microvilli, ma anche dei mellopodi, filopodi, pseudopodi. ad esempio se analizziamo il processo di fagocitosi è indispensabile il citoscheletro di actina: • se inattivassimo il citoscheletro di actina cioè se facessimo in modo che il citoscheletro di actina non si potesse riorganizzare, non si potrebbero formare gli pseudopodi perciò la fagocitosi non potrebbe avvenire. Ci sono, poi, alcuni batteri patogeni [microrganismi patogeni], che non si vogliono far fagocitare, per esempio dai macrofagi ed iniettato in essi delle proteine batteriche che vanno a bloccare la riorganizzazione del citoscheletro di actina; ↪ nonostante il batterio sia attaccato alla membrana della cellula, siccome ha iniettato delle molecole che vanno a bloccare la riorganizzazione del citoscheletro di actina, questo non può formare questi pseudopodi e quindi non può fagocitare il microrganismo. • un’altra sua funzione è il movimento delle vescicole ↪ le vescicole, per andare da un compartimento all’altro, si muovono proprio sul citoscheletro, in particolare sui microtubuli. ↪ anche gli organelli cellulari si muovono utilizzando il citoscheletro, per esempio i mitocondri. È stato dimostrato che il movimento dei mitocondri nell'assone [una porzione della cellula nervosa → cioè del neurone] dipende proprio dai microtubuli, quindi da queste strutture fatte da tubulina, ma anche dai microfilamenti quindi dai filamenti di actina. • anche il posizionamento dei diversi organelli nella cellula dipende dal citoscheletro ↪ abbiamo normalmente il nucleo in una certa posizione, il reticolo in un’altra posizione, il Golgi. 80 I MICROTUBULI I microtubuli sono delle strutture citoscheletriche fatte da tubulina; • sono delle strutture cilindriche cave, per questo motivo hanno un diametro esterno di 25 nanometri ed uno interno di 15 nanometri. I microtubuli sono fatti dalla |TUBULINA; - è un dimero fatto da due monomeri diversi: TUBULINA ; TUBULINA . [queste subunità vengono colorate diversamente, proprio per fare vedere che sono 2 monomeri diversi, alpha e beta tubulina]. Questi dimeri di tubulina si mettono poi insieme per formare delle lunghe catene chiamate protofilamenti. |PROTOFILAMENTO Il protofilamento è un unico filamento formato da queste subunità di tubulina che si alternano; • i protofilamenti si assemblano a gruppi di 13, per formare il microtubulo. ▹ Quindi abbiamo il dimero di tubulina, che è l’unità fondamentale, questi dimeri, si mettono poi insieme e formano i protofilamenti, che vanno a formare un microtubulo cavo. Perché abbiamo bisogno di 13 protofilamenti per formare questo microtubulo? La ragione sta nella stabilità o instabilità di queste strutture. ▹ Se guardiamo ad un protofilamento singolo, questo è termicamente instabile ↪ cioè questo protofilamento si può rompere; • se si rompe uno dei legami, esso viene praticamente tagliato a metà e quindi abbiamo la rottura del protofilamento; • se rimuoviamo una subunità alfa e beta da un’estremità, si rompe il legame ed il filamento si accorcia. Notiamo quindi che questo protofilamento singolo è termicamente instabile. ▹ Se invece andiamo a guardare il microtubulo, quindi la struttura fatta da protofilamenti multipli, si vede è che è termicamente molto più stabile. ↪ perché rompere questo microtubulo richiede la rottura di tanti legami, che è molto più difficile; • se si staccasse una molecola di tubulina formata dalla tubulina alfa e tubulina beta, il microtubulo non si accorcerebbe perché tutti gli altri protofilamenti che lo compongono resterebbero al loro posto. |FORMAZIONE DEI MICROTUBULI I microtubuli si formano tramite varie tappe: • la prima tappa è di nucleazione ↪ rappresenta l'inizio del processo di assemblaggio del microtubulo; • la seconda tappa è l’allungamento del microtubulo. Sia l'alpha che la beta tubulina legano GTP ↪ quindi anche la tubulina è una proteina g quindi una proteina che lega ed idrolizza il GTP. ▹ In questo in questo caso le dinamiche dei microtubuli {→ parliamo di dinamica perché il citoscheletro non è qualcosa di statico ma di estremamente dinamico, che cambia in base alle esigenze della cellula} sono influenzate dalla GTP, quindi dal legame e dall’idrolisi del GTP. ▹ La nucleazione e l'allungamento sono due fasi abbastanza diverse: • la nucleazione, il primo stadio di formazione dei microtubuli, richiede tubulina, magnesio e GTP; • l'allungamento, quindi la seconda fase, è il posizionamento di nuove molecole di tubulina per formare protofilamenti e microtubuli e procede molto più velocemente. |LA NUCLEAZIONE 1. l’alfa tubulina e la beta tubulina si mettono insieme e formano l'eterodimero; 2. il dimero si mette insieme agli altri per formare i protofilamenti. Le tubuline sono proteine G, quindi in grado di legare il GTP ed idrolizzarlo al GDP. I dimeri singoli lo possono fare, l’idrolisi è estremamente lenta ↪ appena questi dimeri vengono incorporati nel microtubulo, l'idrolisi avviene rapidamente. 81 I microtubuli hanno: • un'estremità che viene detta più (+ → positiva); • un'estremità che viene detta meno (- → negativa). ▹ Le due estremità non sono uguali, ma si distinguono facilmente perché, sebbene la crescita può avvenire ad entrambe le estremità, all’estremità + i microtubuli crescono più in fretta. ▹ Inoltre, tramite esperimenti, è stato scoperto che i microtubuli sono sottoposti ad instabilità dinamica ↪ guardando sperimentalmente quello che succede, i microtubuli si allungano dopo averli messi nelle giuste condizioni. In realtà succede anche di vederli accorciare. |INSTABILIT DINAMICA è questa proprietà del microtubulo di accorciarsi ed allungarsi; • dinamica proprio perché non sono fermi, cioè non vengono allungati per formare una certa struttura e poi stanno fermi in quella posizione, ma vengono continuamente accorciati e allungati. ▹ Quando c’è una crescita rapida arrivano i dimeri; • i dimeri si attaccano e poi c'è l'idrolisi; • l'aggiunta di questi dimeri al microtubulo fa in modo che il GTP venga idrolizzato e diventi GDP. Se il GTP non viene idrolizzato immediatamente, quest'estremità diventa un'estremità in cui abbiamo il GTP → parleremo di cappuccio di GTP. ▹ Può succedere che l’idrolisi del GTP proceda più rapidamente dell’aggiunta di subunità: • accade che queste subunità aggiunte vanno ad idrolizzare il GTP più rapidamente di quanto vengono aggiunte nuove subunità Quando questo succede, c’è un evento che viene chiamato catastrofe. |CATASTROFE • da una parte si è perso il cappuccio iniziale di GTP; • tutte le molecole di tubulina sono legate al GDP; • il microtubulo di fatto si va ad accorciare. Succede che queste subunità si vanno a staccare dal microtubulo. ▹ Quando abbiamo la catastrofe, troviamo una curvatura dei protofilamenti e la situazione apparirà molto più disordinata. |SALVATAGGIO è un altro processo che avviene quando si aggiungono altre subunità che hanno il GTP, ricreando il cappuccio di GTP; ↪ si ricrea una situazione in cui all’estremità c’è il GTP e quindi questo consente una rapida crescita. ▹ Quando abbiamo la fase di salvataggio, che si tratti di salvataggio dopo la catastrofe o prima della catastrofe, quindi di rapida crescita prima o dopo la catastrofe, il microtubulo appare rigido, non incurvato ma diritto. Questo è il modo con cui si procede e quindi si alternano queste catastrofi ai salvataggi. Ricapitolando! ▹ quando c’è il cappuccio di GTP continuano ad apporsi subunità e il microtubulo si allunga ed è diritto → salvataggio ▹ quando l’idrolisi è più veloce dell’apposizione di nuove subunità, l'idrolisi del GTP: • cambia la conformazione della subunità; • indebolisce il legame del polimero ↪ per cui abbiamo la curvatura, poi il distacco delle subunità, la fase di depolimerizzazione → catastrofe. ▹ La formazione dei microtubuli avviene in un’area denominata MTOC che significa centro organizzatore dei microtubuli. ▹ La formazione dei microtubuli viene da questo centro organizzatore dei microtubuli e nell’interfase quando le cellule non si stanno dividendo. Nell'interfase, il MTOC prende il nome di centrosoma: • è localizzato vicino al nucleo ↪ si parla di posizione perinucleare • è associato a due centrioli che sono circondati da materiale pericentriolare. centro organizzatore dei microtubuli centrioli materiale pericentriolare 82 Nei neuroni nella figura la cellula nervosa è rappresentata con un solo dendrite (solitamente sono di più) e un assone interrotto (per dare l’idea del fatto che l’assone è più lungo). Al contrario di ciò che succede nelle altre cellule, nel neurone abbiamo una situazione particolare: in verde abbiamo il microtubulo; in rosso la chinesina; in blu la dineina. Come si vede nell’assone: • la vescicola con la dineina va verso il centro organizzatore dei microtubuli; • la chinesina porta verso l’estremità positiva dei microtubuli e quindi porta ad allontanarsi dal centro della cellula. Nelle cellule nervose c’è una situazione particolare nei dendriti, perché i microtubuli hanno polarità opposta (non sono tutti orientati nello stesso modo): • alcuni hanno nei dendriti (+) vicino al corpo cellulare; • altri hanno (+) vicino all’estremità del dendrite. Possono essere dunque disposti con polarità opposta, sia in un verso che nell’altro; ↪ normalmente nelle altre cellule non succede poiché l’estremità positiva va sempre verso la periferia mentre quella negativa verso il centro. Nei dendriti c’è questa situazione particolare e questo significa che la dineina e la chinesina, che andranno rispettivamente verso (–) e (+), siccome i microtubuli vanno in direzioni diverse potranno andare sia verso il centro sia verso la periferia. DOMANDE 1. la dineina segue sempre l’estremità negativa? La dineina segue sempre il negativo, le chinesine verso il positivo. In realtà, all’esame potete dire che vanno sempre verso il (+) poiché la stragrande maggioranza va verso il (+), ma ci sono delle eccezioni. Seguendo la normalità, la dineina va verso il centro mentre le chinesine vanno verso la periferia, poiché i microtubuli hanno il (+) verso la periferia. Questo vale in quasi tutte le cellule; nei neuroni troviamo una situazione diversa nei dendriti perché si alternano i segni. Quindi, fermo restando che la dineina va in senso negativo e le chinesine in quello positivo, siccome i microtubuli sono orientati diversamente, possiamo avere che: • le chinesine possono andare anche verso il centro; • la dineina verso la periferia. 2. Map2 e proteina tau sono proteine motrici? No, sono proteine non motrici. Ricordiamo che sono importanti per legami fra microtubuli diversi per via della loro conformazione. ACTINA L’actina è costituita dai microfilamenti più sottili; • essi sono fatti da subunità di actina; • anche in questo caso abbiamo un’estremità positiva e una negativa. L’actina lega l’ATP e mentre nel filamento troviamo l’ADP (cioè l’ATP che è stato idrolizzato). |POLIMERIZZAZIONE dell'ACTINA In figura abbiamo la rappresentazione della polimerizzazione osservata in provetta. Si possono distinguere: • fase di nucleazione → sempre quella più lenta 1. le subunità dell’actina che si mettono insieme e poi cominciamo ad avere un filamento • fase di allungamento. Anche in questo caso l’actina può essere aggiunta sia da un lato, sia dall’altro. Nel caso dell’actina si può arrivare anche a uno stato stazionario ↪ cioè ci sono subunità di actina che entrano e che escono ma alla fine abbiamo sempre la stessa lunghezza ↓ c’è un mantenimento della lunghezza costante, ma di fatto non si resta fermi e il filamento rimane uguale, ma perde molecole e acquista molecole di actina restando nella stessa dimensione. In questo caso si parla di stato stazionario o di fase di equilibrio, che non è comunque una fase ferma. Questa situazione che abbiamo descritto viene anche denominata “treadmilling” (tapis roulant). Si parla di TREADMILLING perché: • da una parte si aggiungono unità di actina; • dall’altra si rimuovono, rimanendo in una situazione costante. Anche in questo caso, l’aggiunta può avvenire all’estremità positiva o negativa; ↪ l’aggiunta all’estremità negativa è lenta mentre a quella positiva è veloce. 85 Con la tubulina, l’actina globulare [subunità libere, mentre invece l’actina filamentosa corrisponde al filamento] si lega all’ATP; quando invece va a formare il filamento, man mano idrolizza l’ATP e dunque va a legarsi piano piano all’ADP. Anche nel caso dell’actina abbiamo una serie di proteine accessorie. |PROTEINE ACCESSORIE PER L'ACTINA Come per i microtubuli, anche per l’actina vi sono tante proteine accessorie che si legano a essa, che hanno le più disparate funzioni ad esempio • formina e ARP2/3 servono per la nucleazione dell’assemblaggio, quindi per l’inizio della reazione che costituisce il citoscheletro di actina; • la profilina si lega alle subunità libere e accellera l’allungamento; • l'actropomiosina stabilizza il filamento di actina; • la timosina si lega alle subunità libere e impedisce l’assemblaggio. In figura vediamo cosa succede con la timosina: • vediamo i monomeri di actina che vengono di norma aggiunti a estremità + e – per allungare il filamento. ▹ Quando la timosina si lega all’actina, questo monomero non si può più legare, quindi non c’è più crescita all’estremità +. ▹ Nel caso, invece, della profilina si favorisce l’aggiunta al filamento ↪ cioè quando la profilina si lega all’actina, questa immediatamente va a legarsi all’estremità +. Vediamo poi il complesso ARP2/3 esso è importante per la nucleazione dell’actina; • inizialmente il complesso è inattivo, poi si ha un fattore di attivazione che provvede ad attivarlo perché legandosi ne cambia la conformazione; • a questo punto il complesso attivo va a legare i monomeri di actina, quindi induce la formazione del filamento ↪ così facendo consente la nucleazione, cioè l’inizio della posizione di actina che continuerà ad essere aggiunta formando il filamento. Il complesso è inattivo se si trova nel citoplasma. Nell’immagine il complesso ARP2/3 viene indicato più semplicemente come un ferro di cavallo unico e non si distinguono le subunità, ma a seconda di dove inizia la nucleazione, si determina una rete con i filamenti di actina. Per formare questa rete c’è bisogno ogni volta di ARP2/3 che inizi la creazione di un nuovo filamento. |ALLUNGAMENTO DELL'ACTINA mediato dalle FORMINE Ricordiamo che la formina è un’altra delle proteine accessorie e il suo utilizzo consiste nel disporsi all’estremità positiva e spostarsi ogni volta che viene aggiunta una nuova molecola di actina globulare; 1. all’inizio è in una determinata posizione, dopodichè è come se si alzasse facendo spazio ad un'altra molecola di actina; 2. a questo punto si alza dall’altro lato consentendo ad un’altra molecola di actina di legarsi. Il processo continua favorendo l’allungamento del filamento e l’entrata di nuove molecole di actina. |INCAPPUCCIAMENTO DEL FILAMENTO Nei filamenti di actina la cellula può controllare in che punto si deve fermare l'allungamento, tramite dei cappucci, a loro volta costituiti da proteine; • alcuni filamenti sono sprovvisti di cappuccio e quindi continuano a crescere sia all’estremità positiva sia negativa (con velocità diverse); • altri filamenti hanno il cappuccio sull’estremità positiva, dove non può più entrare l’actina, favorendo la crescita solo all’estremità negativa. L’esempio serve per capire la dinamicità e la varietà del processo di allungamento dei filamenti che può essere regolato dalla cellula in maniera molto precisa; la cellula può regolare fino a quando devono crescere i filamenti, da quale estremità crescere e così via. 86 |DISPOSIZIONE dell'ACTINA in una CELLULA A seconda di come l’actina si dispone abbiamo delle strutture diverse: • l'actina può formare delle fibre da stress (chiamate anche fasce contrattili) che possono essere contratte e possono creare tensione; • può formare anche delle reti (soprattutto alla periferia della cellula) dove i filamenti si incrociano fra di loro; • si possono costituire delle reti dendritiche che sono più regolari rispetto alle prime reti (in figura queste reti sono alla base della formazione dei lamellipodi); • infine possono formare dei fasci paralleli molto stretti costituendo dei filipodi ↪ mentre i filipodi sono molto filiformi, i lamellipodi formano delle lamelle e sono molto più estesi e alla base hanno una struttura di actina diversa. Altre proteine sono: la fimbrina, l’alphaactinina, la filamina e la spectrina. • hanno tutte i domini che legano l’actina (in rosso); • servono a creare dei legami crociati nell’actina, cioè a legare insieme diversi filamenti di actina. • hanno tutte due domini di legame all’actina ↪ in questo modo possono legarsi a due filamenti tenendoli insieme. Perché tante proteine svolgono questo ruolo? Queste proteine hanno una struttura molto diversa e dunque la rete di filamenti che si forma è diversa. ▹ La fimbrina è piuttosto piccola e due siti di legame sono molto vicini l’uno l’altro, quindi i due filamenti di actina a cui si legherà saranno vicini. ▹ L’alpha-actinina essendo un dimero ha i due domini opposti, quindi si è visto che i filamenti vengono spaziati di circa 30 nm. ▹ La filamina, avendo quella struttura, può creare quasi un angolo retto (i due domini sono quasi ad angolo retto) → al momento del legame i due filamenti di actina seguiranno quella struttura. ▹ La spectrina è un tetramero ed è molto più lunga e i filamenti sono spaziati di circa 200 nm (come nel caso dell’alpha-actinina ma più in grande). A cosa serve tutto questo? Si possono creare strutture di actina che possono essere completamente diverse e possono essere adatte a funzioni diverse. Due ulteriori esempi: • se facciamo due filamenti di actina e fimbrina si avranno i filamenti molto vicini li uni agli altri; • se formiamo due fasce di filamenti con l’alpha- actinina, avremo dei fasci più distanziati. I° CASO - i fasci sono più compatti; • non potrà entrare la miosina2 (una proteina motrice dei filamenti di actina) per il poco spazio. II° CASO - i fasci sono più distanziati; • la miosina potrà entrare nel fascio, costituendo un fascio contrattile (contrattile proprio grazie all’azione della miosina). Considerando l’enorme numero di proteine diverse, ognuna di esse regola o l’allungamento dei filamenti o anche la struttura di questi fasci. |LA FILAMINA La filamina forma dei collegamenti angolati di circa 90° grazie alla sua struttura particolare e al legame dell’actina al dominio all’estremità; • la presenza di questa proteina crea una rete di filamenti con questa organizzazione. In figura vediamo la foto di un cervello di una persona normale (dx) e una foto di un cervello con una mutazione nella filamina (sx). Questo paziente ha una patologia e, guardando e comparando le due immagini, si può notare che la zona chiamata “rugosa” presenta una concentrazione di neuroni che non sono riusciti a migrare nella corteccia durante lo sviluppo. Il collegamento della biologia cellulare con il mondo dell’anatomia è importante, perché tutte le patologie umane hanno una base cellulare e molecolare. Se un organo non funziona vuol dire che le sue cellule non funzionano e di conseguenza anche le sue molecole. 87 ▹ A destra una cellula intatta, con il nucleo, gli emidesmosomi e la rete di filamenti di cheratina; ↪ siccome questa cheratina è difettosa, queste cellule tendono facilmente a rompersi proprio fra il nucleo e gli emidesmosomi che sono nella porzione della cellula basale che si attacca alla lamina basale. ▹ Rompendosi si formano tutte queste vesciche sulla pelle. Ci fa capire dunque che l’alterazione di queste proteine porta alla costituzione di patologie. |NEUROFILAMENTI Sono dei filamenti intermedi presenti nelle cellule del sistema nervoso. Ci sono due reti di filamenti diversi: • la prima fotografata dall’assone di un neurone; • la seconda dalle cellule gliali (cellule importanti per la sopravvivenza dei neuroni); • la terza è la sezione trasversale di un assone → i tondini più grandi sono i microtubuli tagliati, mentre i punti più piccoli sono i filamenti intermedi. Sono sempre filamenti intermedi ma molto diversi: • dei filamenti hanno tanti legami crociati (legami fra un filamento e l’altro); • nei filamenti delle cellule liali, i filamenti sembrano più lisci visto la mancanza o la pochezza dei legami crociati. Anche i filamenti intermedi presentano delle proteine accessorie. In questo caso si vede il ruolo della plectina (verde) che lega i filamenti intermedi (celeste) ai microtubuli (rosso). Risultano evidenti le connessioni fatte da questa proteina accessoria tra i filamenti e i microtubuli; ciò vuol dire che ci sono diverse connessioni fra elementi del citoscheletro. Non vanno dunque considerati diversi questi elementi, anzi la regolazione dei vari tipi di citoscheletro è spesso coordinata. RICAPITOLANDO I filamenti intermedi hanno questo nome proprio perché hanno una dimensione intermedia rispetto ai filamenti di actina e ai microtubuli; • abbiamo detto che al contrario del citoscheletro di actina, di miosina e di tubulina, che si chiamano così proprio perché la proteina principale è da una parte l’actina e dall’altra parte la miosina, nel caso dei filamenti intermedi la proteina principale varia; • abbiamo parlato delle lamine (per quanto riguarda la lamina nucleare), la cheratina, la periferina. Quindi è vero che per il citoscheletro di actina e tubulina ci sono decine e decine di proteine accessorie che servono alla regolazione di questi citoscheletri; • tuttavia la proteina principale è una, da una parte l’actina e dall’altra parte la tubulina. ▹ Riguardo ai filamenti intermedi abbiamo filamenti intermedi di tanti tipi in base alla proteina principale che li compone. Una classe importante di filamenti intermedi sono i neurofilamenti, cioè quei filamenti presenti all’interno del sistema nervoso e quindi nei neuroni e nelle cellule gliali. Abbiamo visto che ci possono essere tanti tipi diversi di neurofilamenti. Nelle immagini: ▹ nella prima abbiamo dei neurofilamenti che hanno tanti legami incrociati, formano una rete e danno molta più resistenza alla tensione e questo è importante nell’ assone. ▹ L’ assone è questo prolungamento della cellula nervosa; è veramente molto lungo, anche decine di cm e praticamente, per i neuroni periferici addirittura può arrivare ad essere lungo un metro. All’ interno dell’assone c’è bisogno di un citoscheletro che sia molto resistente alla tensione. ▹ Esiste un legame tra i diversi elementi del citoscheletro. I diversi tipi di citoscheletro hanno diverse funzioni ma non agiscono completamente indipendentemente perché ci sono delle connessioni fra loro molto forti. |CONNESSIONE TRA NUCLEOSCHELETRO E CITOSCHELETRO Un altro esempio di connessioni tra diversi tipi di citoscheletro è la connessione tra nucleo-scheletro e il citoscheletro. |CITOSCHELETRO è lo scheletro della cellula anche se attualmente è considerato come quello presente nel citoplasma; |NUCLEOSCHELETRO si intende quello presente nel nucleo, ma di fatto tutto fa parte della cellula. 90 L’ esistenza del nucleo dipende dalla lamina nucleare. |LAMINA NUCLEARE rete fatta da una serie di proteine chiamate lamine; • questa lamina nucleare si trova sotto alla membrana nucleare interna. Durante la mitosi le lamine, le proteine dei filamenti intermedi, vengono fosforilate ↪ ciò fa si che i tetrameri si stacchino gli uni dagli altri, portando al disassemblamento della lamina nucleare. Durante tale processo anche la cisterna nucleare si frammenta e non si trova più il nucleo. Questa è la mitosi aperta e avviene nella maggior parte degli eucarioti, anche se in alcuni avviene una mitosi chiusa, in cui si conserva il nucleo. Il citoscheletro, di actina e tubulina, che troviamo a livello del citosol, è connesso con il nucleoscheletro, quindi con la lamina nucleare ↪ questo perché la lamina nucleare è ancorata alla membrana tramite le proteine trans membrana della membrana nucleare interna. ▹ Queste proteine si legano anche a proteine della membrana nucleare esterna le quali, a loro volta, si legano all’actina, formando una connessione tra citoscheletro di actina e la lamina, oppure si legano a proteine motrici. ▹ Le proteine motrici (proteine motore) servono a muoversi lungo i microtubuli. Possiamo vedere come le proteine della membrana esterna si legano a questi motori dei microtubuli, creando una connessione tra il nucleo-scheletro ed i microtubuli. ▹ Alcune proteine legano la plectina, una proteina associata ai filamenti intermedi. |MIGRAZIONE CELLULARE ▹ Ci sono delle cellule che hanno il flagello che, ruotando, spinge il batterio in avanti ↪ questo movimento permette che la cellula possa nuotare nel fluido. ▹ Ci sono altre cellule eucariotiche che hanno delle ciglia per nuotare in ambiente acquoso. Molte cellule, come quelle degli organismi eucariotici superiori, si muovono strisciando su una superficie. ▹ Negli animali le cellule si muovono tramite strisciamento (tranne gli spermatozoi che nuotano). Come funziona questo strisciamento? Dipende tutto dalla riorganizzazione del citoscheletro e, in particolare, dalla riorganizzazione del citoscheletro di actina. L’actina ha una localizzazione corticale, quindi verso la periferia della cellula → corteccia di actina. La migrazione cellulare dipende dalla corteccia di actina e si divide in tre fasi: I°- PROTUSIONE Un lamellipodio si forma e va in avanti, sporgendosi verso una direzione ben precisa, causato dalla polimerizzazione dell’actina che porta questo lamellipodo in avanti e quindi si parla di protusione. II°- ATTACCO Questo lamellipodio, che si è allungato sulla superficie, va ad attaccarsi di nuovo alla superficie, in queste zone che vengono chiamate contatti focali ↪ sono zone particolari in cui, grazie al citoscheletro di actina, si formano punti di adesione alle superfici L’actina non polimerizzata (globulare) va in una direzione per supportare la protrusione. III°- TRAZIONE La parte posteriore della cellula viene ritratta, o contratta, ed in questo modo la cellula, tramite il susseguirsi di queste tre fasi, si sposta man mano sulla superficie. Tutto questo movimento è dovuto, principalmente, alla depolimerizzazione e polimerizzazione dell’actina: • questo lamellipodio viene formato e si allunga grazie alla polimerizzazione dell’actina in questo luogo e alla creazione di nuovi contatti focali; • dall’altra parte si ha una contrazione, quindi depolimerizzazione e disassemblaggio dei vecchi contatti focali. Il citoscheletro di actina viene continuamente polimerizzato e depolimerizzato, e nella migrazione questo cambiamento serve a muoversi. 91 |REGOLAZIONE del CITOSCHELETRO di ACTINA Ci sono delle proteine della famiglia Rho che regolano la formazione del citoscheletro di actina. Queste proteine fanno parte della stessa famiglia ↪ famiglia perché hanno delle caratteristiche analoghe, come le sequenze proteiche in comune. La famiglia Rho è composta da: • Rho → regola la formazione delle fibre da stress (ci sono varie proteine); • Rac → regola la formazione dei lamellipodi (ci sono varie proteine di rac); • CDC42 → regola la formazione dei filopodi. Queste proteine Rho fanno parte di una famiglia di proteine G → legano e idrolizzano il GTP e sono anche dette interruttori molecolari; • quando sono attive regolano i citoscheletro di actina, regolano la polimerizzazione; • quando sono legate a GDP sono inattive e non sono in grado di regolare la polimerizzazione. ▹ Le proteine Rho sono il bersaglio di alcuni effettori batterici perché ci sono dei batteri patogeni che, per esempio, non vogliono farsi fagocitare e quindi iniettano nella cellula degli effettori che vanno a bloccare le proteine Rho, impedendo la formazione delle protrusioni che poi vanno ad inglobare il batterio per fagocitosi. ▹ Altri patogeni, che vogliono entrare nelle cellule meno pericolose come le cellule epiteliali, iniettano delle proteine nella cellula che vanno a regolare le proteine Rho in modo da farsi fagocitare. Questo ci fa notare come i patogeni sfruttino la cellula ed è proprio per questo che è importante studiare come funziona la cellula → si possono così trovare dei farmaci per combattere i patogeni, i quali riescono a resistere alle difese cellulari, regolando quelle proteine che regolano, appunto, la cellula, nel modo più comodo per loro. immagini di cellule marcate per vedere l’actina, quindi vediamo il citoscheletro di actina A- CELLULA QUIESCENTE è una cellula che non è stata sottoposta a nessun trattamento; • l’actina è presente in tutta la cellula ma in maniera predominante nella porzione corticale, quindi in periferia. B-C-D- PROTEINA CDC42, RHO, RAC ATTIVE Ci sono cellule in cui è stata messa la proteina CDC42 attiva, la proteina Rho attiva, Rac attiva; • questo viene fatto nella cellula introducendo un plasmide, un pezzo di DNA, che viene espresso e poi trascritto in RNA e, in seguito, in proteine. Queste proteine sono proteine mutate, dette costitutivamente attive → non hanno alcuna possibilità di disattivarsi perché sono legate al GTP. La forma cambia a seconda che venga espresso: 1. CDC42 ATTIVO → promuove la formazione di filopodi, strutture che partono dalla membrana e che sono molto sottili; 2. RAC ATTIVO → promuove la formazione di lamellipodi, strutture che partono dalla membrana e che sono molto ampie; 3. RHO ATTIVO → regola la formazione di fibre da stress, che attraversano tutta la cellula. Esprimendo nelle cellule queste proteine attive si esaspera la funzione delle proteine rispetto alle altre presenti nella cellula e quindi andiamo a vedere il ruolo delle singole proteine. Le proteine della famiglia Rho innescano una serie di processi complessi che: • vanno ad attivare delle chinasi, o GTP; • vanno a reclutare Arp2/3 e così via. Queste proteine innescano questi eventi che poi vanno ad essere responsabili: I°- CASO di RAC della formazione di lamellipodi; II°- CASO di RHO della formazione di fibre stress, in alcuni casi diminuendo la presenza delle altre componenti ↪ ad esempio Rac promuove la formazione di lamellipodi ma diminuisce l’attività della miosina, quindi riduce la produzione di fibre da stress. |POLARIZZAZIONE e CHEMIOTASSI dei NEUTROFILI |CHEMIOTASSI è il movimento verso una molecola chimica, nutriente o che attrae la cellula. ↪ le cellule si muovono verso un qualcosa che le attira, e che può essere: • una citochina; • un nutriente; • una qualsiasi molecola che le attrae in quella direzione. 92 CONTROLLO DEL CICLO CELLULARE I più importanti punti di controllo o checkpoint sono: I - FASE G1 è la fase di crescita cellulare; • in questa fase gap il DNA non è stato ancora replicato. Alla fine della fase G1 c'è un primo punto di controllo: • va a verificare se le condizioni della cellula sono favorevoli, quindi che la cellula sia nelle condizioni ideali per andare incontro alla divisione. ad esempio ▹ se la cellula si trova in condizioni di stress ↓ - con pH non è favorevole, - non ci sono nutrienti nel terreno di coltura o nel mezzo extracellulare → l'ambiente non è favorevole quindi la cellula si ferma, cioè non va avanti con la fase S ▹ se invece va tutto bene, allora la cellula procede alla fase S in cui si duplica il materiale genetico e si va fino in G2. II - FASE G2 prima di entrare in mitosi, c’è un ulteriore punto di controllo • la cellula va a controllare che l'ambiente sia favorevole; • ma soprattutto controlla che tutto il DNA sia stato replicato. ▹ Questo è fondamentale perché se il DNA non è stato tutto replicato andando verso la divisione e quindi la distribuzione dei cromosomi, arriveremo ad avere delle cellule a cui mancherà parte del patrimonio genetico → proprio perché i cromosomi non sono stati duplicati ↪ avremo quindi cellule difettose o che andranno direttamente incontro a morte. III - passaggio da MITOSI a CITOCHINESI c'è un ulteriore punto di controllo • controlla che tutti i cromosomi siano attaccati al fuso. ▹ I cromosomi infatti devono essere attaccati al fuso per poter essere trasportati verso i due centri organizzatori di microtubuli in modo da costituire, poi, il patrimonio genetico delle due cellule figlie che si andranno a creare. Quindi questi sono i punti di controllo più importanti. Il ciclo cellulare è regolato dalle proteine cicline e da chinasi, quindi proteine che fosforilano altre proteine; • sono dipendenti da ciclina e si chiamano CDK (cyclindependent kinase) → chinasi dipendente da ciclina. |CICLINE diciamo che di cicline ce ne sono varie nella cellula e sono state chiamate così per due motivi: 1. perché agiscono durante il ciclo cellulare; 2. perché la loro espressione è ciclica. Cosa significa? Se andiamo a vedere l'espressione della tubulina, la troviamo sempre presente nella cellula. Guardando alle cicline, l'espressione sale e scende. Le cicline sono raggruppate in tre gruppi diversi: I°- CICLINE G1/S l'espressione: • sale e poi scende quando le cellule sono in fase S; • poi rimane bassa e quando si torna in G1 risalirà e poi scenderà di nuovo in fase S. Quindi queste sono cicline espresse per la maggior parte nella fase G1, mentre nelle altre fasi o non sono espresse o sono espresse in quantità bassissime. II°- CICLINE S hanno un'espressione ciclica perché: • cominciano ad essere espresse alla fine della fase G1 e sono maggiormente espresse nella fase S; • poi continuano ad essere espresse nella fase G2 nella mitosi fino alla metafase. Praticamente risalgono per la fase S e scendono per la metafase. III°- CICLINE M • cominciano a salire come espressione nella fase G2 e poi anche queste scendono intorno alla metafase. Quindi sono tre tipi di cicline diverse, ma la loro espressione va su e giù continuamente a seconda della fase del ciclo cellulare. |CHINASI DIPENDENTE DA CICLINA: come funziona? La chinasi inattiva si lega alla ciclina e diventa attiva ↪ per questo la chinasi è dipendente da ciclina, per attivarsi ha bisogno che si leghi ad essa. 95 Per esempio, per questa chinasi è stato dimostrato questo meccanismo ↪ cioè ci sono due siti per questa chinasi di fosforilazione; • la presenza di un fosfato in questa posizione attiva la chinasi; • la presenza di un fosfato in quest'altra posizione disattiva la chinasi. Quindi da una parte c'è il legame con la ciclina che è importante per l'attivazione e dall’altra parte c'è la fosforilazione. Ci sono dei casi in cui la fosforilazione disattiva: • in questo caso vediamo che la stessa proteina, a seconda del sito di fosforilazione, può essere attivata o disattivata. In generale, queste chinasi dipendenti da ciclina una volta attive, vanno a fosforilare altre molecole, quindi iniziano la trasduzione del segnale. Questo è un altro meccanismo di attivazione- inattivazione dove c'è il complesso ciclina-chinasi ed insieme sono attive. Ci può essere un'altra proteina che si lega a entrambe e rende poi la chinasi inattiva. Questo è un secondo esempio. In realtà ci sono anche altri esempi, però il punto importante è che queste chinasi che agiscono nel ciclo cellulare sono dipendenti dall'interazione con la ciclina, quindi devono legarsi alla ciclina per essere attive e poi ci sono tutta un'altra serie di meccanismi che possono regolarne l'attivazione o la disattivazione. I punti di controllo che avevamo individuato sono anche legati alla produzione di cicline. Cosa significa? se la cellula si accorge che c'è un danno al DNA e quindi non vuole andare avanti nella mitosi o nel ciclo cellulare, va a bloccare le cicline e le chinasi dipendenti da cicline, in modo che ci sia un blocco. per esempio se c'è un danno al DNA, c'è un blocco a livello di G1, ma succede anche se il danno viene rilevato dopo, prima di andare praticamente in mitosi. Iimmagine classica di un cromosoma mitotico in microscopia elettronica a scansione, quindi tridimensionale; |IMMAGINE CLASSICA in quanto normalmente nella cellula siamo abituati a pensare ai cromosomi così, che in realtà si vedono così solo durante la mitosi. Normalmente il DNA non è così condensato, ma è sparso nel nucleo per cui non si vedono i cromosomi, allora come si condesa il DNA in questo modo? Esiste un complesso proteico, la condensina che è importante per la ristrutturazione, il compattamento del DNA cromosomico; • è una specie di anello che va a compattare il DNA cromosomico in modo da occupare meno spazio e formare questi cromosomi mitotici che saranno utili a dividere il materiale genetico tra le cellule. Qui possiamo vedere che non c'è più il il nucleo e lo schema di una cellula in metafase. Nella metafase abbiamo formato il fuso mitotico in cui ci sono i centri organizzatori dei microtubuli, che rappresentano anche il polo del fuso. |MICROTUBULI ASTRALI intorno al polo del fuso (in verde scuro). |MICROTUBULI INTERPOLARI vanno a collegare i due poli (in rosso) Il primo polo del fuso è la struttura verde circolare a sinistra. Il secondo polo del fuso è la struttura circolare verde a destra. In realtà, il collegamento avviene tramite altre proteine (in nero) tra il microtubulo che viene da un polo e il microtubulo che viene dall'altro ↪ per questo vengono chiamati interpolari. 96 |MICROTUBULI CINETOCORE che connettono il polo del fuso con i cinetocori dei cromatidi fratelli (in azzurro). Questo cromosoma (in marrone) è formato da due cromatidi fratelli praticamente uguali e che hanno queste zone rosse che vengono chiamati cinetocori. ↪ c'è un microtubulo (in azzurro) che parte da un polo e finisce in corrispondenza del cromosoma ed un altro microtubulo che parte dall'altro polo e finisce nel cromosoma. Questa struttura dà la possibilità alla cellula di dividere questo cromosoma replicato e quindi di dividere i cromatidi fratelli uno ad un polo ed uno all'altro polo, distribuendo equamente il DNA e il patrimonio genetico tra le due cellule figlie. Questo processo viene aiutato dalle proteine motrici. Qua ci sono una serie di proteine motrici [nomi non importanti]. Bisogna ricordare che per questo processo sono importanti le chinesine, ma anche la dineina; • servono sia nella nella formazione che nelle funzioni del fuso mitotico e cioè nel distribuire gli organelli ai due poli che poi rappresenteranno il centro delle delle due cellule. Cosa succede durante la formazione del fuso? 1. c’è un primo evento che viene di nucleazione. ↪ chiamato di nucleazione perché si promuove la formazione dei microtubuli nelle vicinanze dei cromosomi. Abbiamo parlato di nucleazione nella formazione dei microtubuli, nella formazione dei microfilamenti. 2. successivamente si formano dei legami crociati tra i diversi microtubuli e agiscono varie cinesine, ↪ arrivano a strutturare un fuso mitotico dove i microtubuli che vengono da un polo e dall'altro polo, si legano al cinetocore e portano il cromosoma al centro di questo fuso mitotico. si riferisce a ''formazione del fuso mitotico'' → Questo è il cromosoma replicato. |CROMOSOMA REPLICATO è fatto da due cromatidi fratelli, come vengono chiamati, perché sono uguali. Possiamo vedere il cinetocore ed i microtubuli del cinetocore che si attaccano ad esso e posizionano il cromosoma al centro di questo fuso mitotico. Qua, per curiosità, un’immagine al microscopio elettronico dove vedete il cinetocore, quindi questa zona del cromosoma alla quale si attaccano tutti questi microtubuli che vanno sia ad un polo che all'altro del fuso mitotico. |PROFASE • nella profase i cromosomi si cominciano a condensare; • nella profase tardiva li cominciamo a vedere; • nella prometafase precoce cominciamo a vedere qualche cromosoma attaccato ai microtubuli, • andando più avanti, quando si arriva o nella prometafase media o avanzata, cominciamo a vedere cromosomi che sono legati ai due fasci di microtubuli, uno che proviene da un polo e l'altro dall'altro polo. • nella metafase c'è l'orientamento corretto, cioè abbiamo il cromosoma legato da microtubuli che vengono da un polo e dall'altro polo, che si dispone al centro del fuso. |FORMAZIONE DEL FUSO MITOTICO Abbiamo studiato che possiamo avere: - il cromosoma col suo cinetocore che interagisce solo con un microtubulo o con microtubuli che vengono da un solo polo, - i due poli che mandano dei microtubuli che vanno entrambi a contattare il cromosoma tramite il cinetocore ma sono entrambi dallo stesso lato. Tutte queste “posizioni”, questi attacchi dei microtubuli ai cinetocori non sono corretti o non sono completi, perché manca qualcosa; ad esempio nel caso C non è corretto perché dai due poli partono microtubuli che vanno allo stesso cinetocore e quindi queste conformazioni sono tutte instabili. 97