Genetica batterica e trasferimenti genetici orizzontali, Appunti di Microbiologia

Scarica Genetica batterica e trasferimenti genetici orizzontali e più Appunti in PDF di Microbiologia solo su Docsity! GENETICA BATTERICA CROMOSOMA BATTERICO Gli acidi nucleici sono macro molecole formate da subunità monomeriche chiamate nucleotidi: un nucleotide è composto da uno zucchero a cinque atomi di carbonio (ribosio o deossiribosio), una base azotata e uno o più gruppi fosfato. Le basi azotate si suddividono in purine (adenina e guanina) e pirimidine (citosina timina e uracile). I nucleotidi si legano covalentemente mediante un legame fosfodiestere tra residui fosfato tra il carbonio 3’ di uno zucchero e il carbonio 5’ dello zucchero adiacente. Nel DNA l’informazione genetica è determinata dalla sequenza delle basi azotate della catena polinucleotidica. Nelle cellule il DNA e a doppio filamento per appaiamento, mediante legami a idrogeno, delle basi complementari (A=T e GΞC). I due filamenti orientati in senso antiparallelo, uno in direzione 5’-3’ e l’altro opposto, sono avvolti uno intorno all’altro per formare una doppia elica. La stabilità della molecola di DNA è determinata sia dalla struttura lineare della catena poli nucleotidica sia dallo stretto appaiamento tra basi complementari. I batteri hanno generalmente un unico cromosoma circolare è formato da una singola molecola di DNA a doppia elica che, pur essendo legato a proteine, si può considerare nudo. Questa doppia elica è organizzata in domini super avvolti in cui proteine specifiche si legano al DNA rendendolo più stabile. All’interno di una cellula batterica il DNA può essere presente anche in forma rilassata cioè non supera avvolta. Entrambi i casi sono necessari: il super avvolgimento è utile per l’impacchettamento del DNA all’interno della cellula, mentre la forma rilassata è necessaria per la sua replicazione. Gli enzimi coinvolti nella transizione tra questi due stati appartengono al gruppo delle topoisomerasi: la DNA girasi (topoisomerasi II) partecipa al super avvolgimento del DNA, mentre la topoisomerasi I contribuisce alla sua struttura struttura circolare rilassata. Informazione genetica si esprime attraverso tre tappe fondamentali: - replicazione: processo di duplicazione del DNA - trascrizione: sintesi di mRNA su uno stampo a DNA - traduzione: processo di sintesi delle proteine che utilizza come stampo e informazioni genetica contenuta nella molecola di mRNA. La sequenza degli aminoacidi di ogni proteina è determinata dalla specifica sequenza di base dell’mRNA : sono necessarie tre basi, codoni, per codificare un singolo amminoacido. Il codice genetico è tradotto in proteine da un complesso di sintesi a cui partecipano ribosomi, RNA transfer e numerosi enzimi. Modello operone Un operone è formato da una regione di controllo (promotore e operatore) e da un gruppo di geni strutturali, e la sua espressione è regolata dal prodotto del gene regolatore. Il primo operone studiato è stato l’operone lac. Gli enzimi coinvolti nel metabolismo del lattosio sono: la β-galattoside permeasi (trasporta lattosio dentro cellula batterica), la β-galattosidasi di 22 78 (scinde il lattosio in glucosio e galattosio) e la β-galattoside transacetilasi (metabolizza altri disaccaridi oltre lattosio). Questi tre enzimi sono codificati dai geni lacZ, Y e A chiamati geni strutturali. Quando nel terreno c’è lattosio, i geni strutturali lac sono tutti trascritti e tradotti rapidamente e contemporaneamente. A monte dei geni strutturale si trova la regione di controllo formata dal promotore (regione di DNA dove RNA polimerasi inizia a trascrivere) e dall’operatore (regione DNA dove si lega proteina repressore). Vicino all’operone lac si trova un gene regolatore chiamato lacI, che codifica per una proteina repressore. Quando non c’è lattosio, la proteina repressore legandosi saldamente al sito operatore non permette alla RNA polimerasi di trascrivere i geni strutturali adiacenti, per cui non si forma mRNA né sono sintetizzati gli enzimi. Quando si aggiunge la lattosio al substrato, parte di questo entra nella cellula ed è convertito in allolattosio (induttore). Questo si lega alla proteina repressore e altre alla conformazione in modo tale che essa non può più legarsi al sito operatore. La presenza del lattosio induce quindi quindi la produzione degli enzimi e quindi l’operone Lac è perciò un operone inducibile. RICOMBINAZIONE E MUTAZIONI La ricombinazione è il processo attraverso cui il genoma di un batterio scambia suoi geni con quelli di un altro genoma, dando origine a un genoma diverso dai due precedenti, detto ricombinante. Nei batteri la ricombinazione può avvenire attraverso diverse modalità. Nella ricombinazione generale si ha lo scambio fra un paio di sequenze genetiche largamente omologhe ma non identiche. Il meccanismo è mediato dall’enzima prodotto del gene recA coinvolto nei meccanismi di riparazione del DNA. Si ha rottura del DNA e incorporazione del singolo filamento di DNA con la di 23 78 - negativa: è indiretta perchè li seleziono in quanto necessitano un fattore di crescita (mutanti che hanno perso la capacità di sintetizzare un composto organico come gli AA) rispetto al ceppo parentale. (Es his- e his+). Riparazione del DNA Sono diversi i sistemi che riparano DNA: - sistema di fotoriattivazione - sistema della replicazione pre-replicativa - sistema della riparazione post-replicativa ricombinazionale di tipo costitutivo - sistema inducibile di riparazione post- replicativa (SOS repair) - uno o più sistemi introdotti nella cellula da diversi plasmidi I primi tre riparano il DNA con grande fedeltà e la loro azione non da luogo a mutazioni, gli ultimi due intervengono rapidamente ma tendono a introdurre mutazioni TRASFERIMENTI GENETICI ORIZZONTALI Il trasferimento di DNA è solitamente associato alla divisione cellulare. Questa trasmissione di materiale genetico è detta verticale perchè procede da una generazione all’altra. I batteri possono, però, scambiare e trasferire informazione gentica senza andare incontro a divisioni cellulari, in un processo detto di trasferimento orizzontale, che può avvenire secondo tre differenti modi: trasformazione, coniugazione e trasduzione. Un’altra fonte principale di trasferimento genetico orizzontale all’interno di una popolazione batterica è l’acquisizione di elementi di DNA mobili come elementi genetici repliconi (plasmidi) o non repliconi (sequenze di inserzione e trasposoni) che consentono di ottenere nuove informazioni genetiche. Indipendentemente dal metodo di trasferimento, le cellule che donano il DNA sono dette donatrici e le altre riceventi. Trasformazione Il trasferimento di DNA può avvenire solamente in un particolare momento del loro stadio vitale, detto competente o di competenza. In questo momento la cellula è capace di legare il DNA e di farlo entrare al proprio interno. Deve seguire quindi un evento di ricombinazione, per consentire l’incorporazione del DNA esogeno nel proprio genoma e quindi assicurarne la replicazione. Se il DNA esogeno fosse un plasmide, la cell batterica deve consentirne la duplicazione. Durante un singolo evento di trasformazione solo una piccola parte di DNA può essere trasferita a causa della sua lunghezza (si frammenta). La comparsa della fase di competenza può essere indotta da particolari condizioni di crescita o di stress; questa inducibilita è stata utilizzata per clonare del DNA eterologo e ottenere dei batteri geneticamente manipolati. La trasformazione si è rilevata la via artificiale più semplice da usare per muovere in laboratorio igiene da un batterio ad un altro. la procedura di base include l’estrazione del DNA da una popolazione di cellule donatrici, la sua purificazione e quindi l’introduzione mediante trasformazione in cellule della popolazione batterica ricevente. Coniugazione È il procedimento con il quale le cellule batteriche trasferiscono DNA alle cellule con le quali sono entrate in contatto fisico. Avviene se la cellula donatrice contiene plasmidi coniugativi non incompatibili con quelli già presenti nella cellula ricevente. Nei batteri Gram negativi i plasmidi coniugativi sono responsabili della sintesi di speciali strutture tubulari, chiamate Pili sessuali, che si estroflettono dalla cellula donatrice e sono dotati di recettori adesivi sulle loro estremità, in modo da legarsi fermamente ai ligandi delle pareti cellulari delle cellule riceventi. La presenza di episomi consente lo scambio coniugativo di parte del cromosoma. di 26 78 L’episoma F o di fertilità di Escherichia coli È un plasmide presente in alcuni ceppi denominati F+, capace di auto trasmettersi a bassa frequenza ad altri ceppi della stessa specie, denominati F-. Il fattore F funziona da episoma, può quindi integrarsi nel cromosoma della cellula ospite, che viene denominata Hfr perché l’integrazione porta ad aumentare la frequenza con cui la cellula che contiene il fattore F come episoma può donarlo in processi di coniugazione e quindi di ricombinazione. I ceppi Hfr che si differenziano per il sito di inserzione del plasmide F nel cromosoma, trasferiscono i geni in ordine sequenziale diverso. I batteri Gram positivi non hanno normalmente Pili sessuali e il contatto avviene direttamente fra le cellule. Elementi genetici repliconi: PLASMIDI Le molecole di DNA che contengono nella loro sequenza in tutto o in parte le informazioni necessarie per la loro auto duplicazione vengono definite repliconi. Il vero replicone batterico è il cromosoma, unica molecola totalmente autonoma nei processi di duplicazione. Accanto esistono elementi genetici accessori, non essenziali per la vita batterica, ma importanti per assicurare una maggiore flessibilità genetica a cellule non dotate del meccanismo di ricombinazione assicurato dalla riproduzione sessuale. di 27 78 I plasmidi sono repliconi extracromosomici presenti principalmente nei batteri ma anche in lieviti e funghi. Sono delle molecole circolari di DNA doppia elica e covalentemente chiuse ma di dimensioni più piccole del cromosoma. Sono ereditate dalla cellula insieme a cromosoma e attraverso gli usuali sistemi di scambio genetico tra i batteri possono diffondersi non solo tra batteri della stessa specie ma anche tra procarioti di specie diverse. Vengono definiti come repliconi non essenziali per la vita del micro organismo che li contiene, non contengono geni indispensabili per le funzioni vitali dell’ospite. Una cellula batterica può contenere diversi plasmidi oppure essere totalmente priva. Durante le procedure di laboratorio necessarie per l’isolamento dei plasmidi dalla cellula batterica, la conformazione circolare a doppio filamento può venire danneggiata, l’introduzione di un taglio nel doppio legame in uno dei filamenti porta alla perdita del super avvolgimento, pur conservando la struttura circolare. La rottura del secondo legame porta all’apertura del circolo e quindi alla linearizzazione del plasmide (forma L). Tutte e due le forme si creano per danneggiamento del DNA durante le fasi di isolamento dei plasmidi dalla cellula batterica. PCR, replicazione Ci sono 3 fasi dell'PCR: 1. Denaturazione del DNA è la separazione dei due filamenti che avviene a 94-96 gradi. 2. T si abbassa e si ha appaiamento di specifici primers, ossia piccole sequenze di nucleotidi che sono complementari a specifiche regioni dei due filamenti, riuscendo così a legarsi/appaiarsi a queste regioni (appaiamento). Questo avviene abbassando la T (50-65°). 3. A sto point può intervenire la TAQ, ossia una polimerasi, che si può legarsi al DNA soltanto se ci sono il primer perché si può legare solo a punto in cui il DNA è a doppio filamento. Questa DNA polimerasi permette l'allungamento del filamento perché aggiunge i nucleotidi complementari al filamento stampo del DNA e permette di ottenere due doppi filamenti di DNA. Aumento T a 72°QUINDI: il primer serve perché la tac ha bisogno di un innesco. NB: la tac viene da un microrganismo chiamato 'termus acquaticus' che ha permesso la PCR. L'inventore del processo ha pensato che ci fosse bisogno di un enzima che lavora ad alta T. L'idea x far si che questo processo avvenisse era prendere un organismo che di 28 78 Gli elementi genetici mobili (geni saltellanti) sono suddivisi in due gruppi: le sequenze di inserzione e in trasposoni. Le IS alle estremità hanno sequenze particolari di DNA, dette sequenze ripetute e invertite per la loro particolare sequenza nucleotidica. Al centro della struttura vi sono i geni utili per la mobilizzazione di questi elementi (trasposasi). I trasposoni sono in sostanza delle IS di dimensioni maggiori contenenti informazioni genetiche di altro tipo. Ogni trasposone contiene due copie della stessa IS. di 31 78 Funzioni Gli elementi genetici mobili hanno lo scopo di aumentare la variabilità genetica. Possono quindi asportare geni da un organismo e trasportarli in un altro. Non codificano per funzioni indispensabili per la cellula, ma possono essere ezzensiali a garantire un vantaggio in particolari ambienti. Sono associati a resistenza antibiotici, ma anche alla produzione di sostanze che inibiscono la crescita di altri batteri (batteriocine), alla utilizzazione di alcuni zuccheri e alla fago- resistenza. Meccanismo di trasposizione Questo tipo di elementi genetici non replicati hanno brevi sequenze nucleotidiche ripetute ed invertite all’estremità del loro DNA. Queste sequenze sono coinvolte nel processo di trasposizione. Quando un elemento trasponibile si inserisce in un altro punto del DNA (DNA bersaglio) si verifica la duplicazione di una breve sequenza presente su quest’ultimo, ma non sul trasposone, nel punto in cui avviene l’integrazione. La duplicazione della sequenza bersaglio è dovuta all’attività dell’enzima trasposasi, che causa la rottura di un solo filamento del DNA bersaglio. Il trasposone si attacca poi all’estremità a singola elica generato dall’azione della trasposasi e la chiusura delle porzioni a singolo filamento determina la duplicazione di piccole zone di DNA a monte a valle del punto di inserzione del trasposone nel DNA ospite. Il meccanismo di trasposizione richiede sequenze ripetute l’estremità degli elementi trasponibili e l’enzima trasposasi che li riconosce. La trasposizione può essere - conservativa, alla fine del processo di trasposizione rimane una sola copia del trasposone ma in posizione diversa - replicativa, si ha una duplicazione e una nuova copia si inserisce in una posizione diversa, mentre una copia dell’elemento trasponibile rimane nel sito originale. Mutagenicità La mobilità di questi elementi genetici comporta delle variazioni nella composizione genetica e nell’espressione fenotipica dell’ospite batterico. L’escissione di un trasposone può portare a una delezione, precisamente di quelli portati dal trasposone stesso. L’integrazione di un trasposone su di un nuovo replicone può originare l’acquisizione di uno o più geni. L’inserimento di una IS o di un Tn i un replicone può originare un’inserzione inattivante, cioè l’inattivazione per l’interruzione del gene in cui l’elemento mobile si va a inserire. di 32 78 ii) Variazione di fase nell’antigene H di Salmonella (rotazione dell’orientamento) HI gene IS H2 gene le-__te—_°>°>+t__ —- Î I HI H2 flagello flagello Pseudomonas brassicacearum NFM421 usa variazione di fase per un fenotipo ipermobile (iperproduttivo di flagellina) per colonizzare punte radici Arabidopsis thaliana (Danhorn e Fuqua, Annu. Rev. Microbiol. 2007). La bassa probabilità di eventi genetici rari come la variazione di fase è 35 controbilanciata dal n° di m.i. ospitati nel biofilm. 33 di 78