Array Comparative Genomic Hybridization, Slide di Genetica

Scarica Array Comparative Genomic Hybridization e più Slide in PDF di Genetica solo su Docsity! Ca) flo]e]o]}2Z=YZ/0)p}= noie o] RE / p / I, ANALISI DEL GENOMA (1) SEQUENZIAMENTO DNA (1bp) FISH (da 40Kb) CARIOTIPO (da 3-5Mb) ARRAY- CGH (da 1.8Kb) 100bp 101 102 103 104 105 106 107 108 109 RISOLUZIONE DIMENSIONE Permette di identificare anomalie del corredo genetico quali riarrangiamenti inter– ed intracromosomici sbilanciati, regioni di amplificazione e delezioni Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) Ibridazione competitiva del DNA in esame e del DNA di controllo normale su un microarray (vetrino) di sonde genomiche (di cui è nota sequenza e mappatura). Tecnica whole-genome. aCGH – tecnologia Agilent  Sul vetrino sono spottate sonde oligonucleotidiche (60-mer) corrispondenti a loci specifici del cromosoma Risoluzione: da 1 Mb a circa 1 Kb La risoluzione genomica dipende dalla quantitá di sonde utilizzate (che determina la spaziatura media) (probe di DNA a singolo filamento pre-sintetizzati sono fissati su vetrini mediante apparecchiature automatizzate Tecnologia Ink-Jet Printing) Formato migliore per la nostra esperienza: 180K+SNPs ISCA (risoluzione media 20Kb) Sonde CGH mappano nelle regioni critiche e sui geni OMIM associati a patologia, rilevazione di alterazioni ‘exon by exon’ Abbina circa 59000 sonde SNP utili per osservare tratti di omozigosi (UPD e consanguineità). Standardizzazione e ripetibilità. A u m e n to d e lla riso lu zio n e log2ratio + aCGH -protocollo in breve (1) Sonde oligonucleotidi che vetrino Targe t DNA Cy5 Ref DNA Cy3 Agilent CytoGenomi c aCGH (2) Interpretazione dei dati – log2ratio sonde Aberrazioni significative Delezione in eterozigosi (-1) Normale Una copia in più (+1) Delezione in omozigosi (-2) Amplificazione (+2) log20/2 log21/2 log22/2 log23/2log24/2 Variazioni di numero di copie significative se almeno 3 sonde consecutive danno valore di log2ratio significativo. DLRS Tar g Spot Finding of the Four Corners of the Array Histogram of Signals Plot (Red) lr—__—__—m—m—mT————{îi Histogram of Signals Plot (Green) \ Evaluation Metrics for CytoCGH_Da_GCMT_JuHE Exoellent {8}; Good (7) Metric Mame Value IsGoodiGrd 0 Signalintenetty r_Sipnaintenziy LogRatiolmesiance DAG tO DAG (ISGin-DI. 20.25 0r>016 * Evaluate Cromosoma 12 Esempi… grosse alterazioni marcatoret trisomiat i i Cromosoma 9 Visibili al cariotipo convenzionale Esempi… piccole alterazioni Non visibili al cariotipo convenzionale CO PY NU MB ER VA RIA TIO N - CN V NOVITÁ aCGH: rilevazione di CNVs •CNVs possono essere dei polimorfismi (in più dell’1% della popolazione; Redon R. et al. 2006: 1447 CNVs, 12% del genoma, su 270 indagati normali) e non avere effetto fenotipico. •Possono influenzare il dosaggio genico, permettere di individuare loci di suscettibilità associati a patologie e influenzare meccanismi epigenetici. •Possono essere de novo o ereditate •VOUS (Variants of Uncertain clinical Significance) •Benigne o patogenetiche TUTTI SIAM O POR TATO RI DI CNV Se la CNV non è descritta: Cerco di confermare il dato con altre tecniche (FISH, RT-PCR, MLPA) Se la CNV è una amplificazione cerco di verificarne la localizzazione (duplicazione in tandem, marker sovrannumerario, inserzione, traslocazione)li i i , i , i i , l i Verifico pattern di segregazione Tenendo conto che: una CNV non è sempre benigna anche se ereditata -difetti di penetranza ed espressività - fattori epigenetici -effetti diversi di CNV del cr. X tra maschi e femmine una CNV insorta de novo non necessariamente è patogenetica PENETRANZA INCOMPLETA E/O ESPRESSIVITA’ VARIABILE •Copresenza di altre varianti •Differenza epigenetica •Imprinting •Ambiente •Effetti sporadici Penetrance estimates with case and control frequencies for recurrent CNVs Frequency of Frequency, P value de novo Penetrance Region (gene Copy Coordinates postnatal aCGH Frequency, (Fisher exact occurrence in estimate, % within region) number (hg18) cases controls one-tailed test) cases (95% CI) Proximal Duplication chrl: 85/48,637(0.17%) 10/22,246 (0,04%) =<0.0001 0/13 (0%) 17.3 (10.8-27.4) lq2i.1 (RBMSA) 144.0-144.5 Mb Distal Deletion chel: # 6 (020%) 622,246 (0.03%) <<0.0001 7/39 (17.9%) — 36.9(23.0-55.0) lq21.1 (GYAS) 145.0-146.35 Mb Distal Duplication chel: 8/33,226 (0,20%) 6/22,246:(0.03%) <=0.0001 5/30 (167%) 29.1 (16.9-46.8) 1q21.1 {G/A45) )-146.35 Mb ____ lr 15911.2 (N/PA/) | Deletion chrl5: 203/25,113 (0,81%) 84/22,246 (0,38%) <<0.0001 0/27 (0%) 10.4 (8.45-12.7) 20,3-20.8 Mb inv Pa 0080 = _ 16p13.11 Deletion chrl6: 50/33,226 (0,15%) 12/22,246 (0.05%) =0.0005 5123 (21,7%) 131(7.91-21.3) (MYHLA) 14.9-16.4 Mb 16p1l2.1 Deletion chele: 62/33,226 (019%) 16/22,246 (0,07%) 1/28 (3.6%) 12:3 (7.91-18.8) (CDR2) 21.85-22.4 Mb Distal 16p11.2 Deletion chrlé: 46/33,226 (0,14%) 1/22,246 (0.005%) #0 #21 (33,3%) = 624(26.8-94.4) (SH2BN 28.65-29.0 Mb Distal 16p11:2 Duplication chrl6: 35/33,226 (0,11%) 10/22,246 (0.04%) 18 {12.5% 11,2:(6.26-19.8) (SA2BI) 28.65-29.0 Mb LL 146/33,226 (0.4 Add!!! 3347 (70.295)A 468 G1.5-64:2) Esempio Re SIE Ì 7/30 ( % 272 (17.4-40.7) Proximal 16p11.2] Deletion ehrl6: (TBX6) 29.5-30.15 Mb Proximal 16p11.2f Duplication chrlb: 93133, 226 (| (TBXA) 29.5-30.15 Mb © freq.15q ns casi _—_____— . " 17912 (HNFIB) | Deletion che 335% 00 ereditarieta' 3/9 (55.6%) = 344(13.7-70.0) 31.833, ‘To 19quosog] €107 DINd US 17912 (N75) | Duplication chel? 37/33,226 (0.11%) .5/22,246 (0.02%) <0.0001 2I 2 21.1 (10.6-39.5) 31.8-33:3 Mb 22g1 121 (78XA)f Duplication chr22: 136/48,637 (028%) 12/22,246 (0.05%) <<0.0001 2 i 21.9 (14.7-31.8) 7.2-19.9Mb aCGH, microarray-based comparative genomic hybridization; CI, confidence interval; CNV, copy-number variation ‘much less than. Applicazioni aCGH  Ricerca ad alta risoluzione di aneuploidie segmentali  Mappatura fine delle regioni critiche nelle sindromi da microdelezione o microduplicazione  Studi di popolazione di CNV  Ricerca per l’identificazione di regioni in cui sono presenti di oncogeni e oncosoppressori  Possibilità di identificare loci malattia nelle sindromi congenite a difetto sconosciuto Nella PATOLOGIA POST-NATALE (1) Definizione di nuove sindromi da micro-delezione e micro- duplicazione, generalmente associate a regioni del genoma che presentano SEGMENTAL DUPLICATION (meccanismo NAHR e NHEJ) ♂ ♂ ♂ ♂ ♀ MICRO-DELEZIONI MICRO-DUPLICAZIONI Dimensioni da 200Kb a 10Mb 1q21.1 15q11.2 7q11.23 22q11.2 22q11.21- 11.22 22q11.23 CROM.7 del/dup7q11.23 del 22q11.21- q11.22 distaledel 22q11.2/dup reciproca dup 22q11.2 3 CROM.22 Sempre in fieri Costante aggiornamento con la lettteratura. Interfaccia continua fra genetista di laboratorio e genetista medico. DATI INCORAGGIANTI: proporre test array- CGH in prima battuta in pz MR/MCA n.d.d.? Nella PATOLOGIA POST-NATALE (2) Approccio ‘DISMORFOLOGICO AL CONTRARIO’ in contrasto con l’approccio fenotipico (prima analisi genetica poi correlazione pz) (Slavotinek A.M. 2008). Tuttavia paragonando alle altre tecniche di citogenetica…qualche limite c’è! FISH SNP array CGH array Bandeggio Q/G Aiuto con sonde SNP; reference 47,XXY E così inversioni e inserzioni bilanciate Solo con sequenza contenente geni. A volte a mosaico (freq. e pop.cell.) Ma occorre FISH per determinarne la posizione SMCs UPD - - - + -Scelta del DNA reference -Costo e validazione Grazie per l’attenzione!