Biologia cellulare dettagliata, Sbobinature di Biologia Cellulare

Scarica Biologia cellulare dettagliata e più Sbobinature in PDF di Biologia Cellulare solo su Docsity! Il telomero è quindi la parte terminale del nostro cromosoma quindi l'inizio e la fine. I telomeri vanno incontro ad un processo di accorciamento, ma accorciando i telomeri potremmo perdere parte dell'informazione che è presente nei geni, quindi presentano delle regioni che non hanno alcuna funzione se non quella di proteggere i geni da eventuale perdita di informazione genetica, queste sequenze che sono presenti proprio nella parte terminale del cromosoma vengono detti satelliti. Poi vi sono anche delle regioni, all'interno della molecola di DNA, che possono svolgere una funzione importante quando la loro sequenza viene modificata perché portano all'attivazione di geni che normalmente sono tenuti spenti all'interno della cellula e questi sono i geni che chiamiamo oncogeni. Essi sono coinvolti nello sviluppo di tumori e normalmente sono tenuti a bada proprio da queste regioni che ritroviamo all'interno del nostro genoma. Ogni variazione di queste regioni (che vengono ripetute più volte) possono portare all'attivazione degli oncogeni. Oppure possiamo perdere la funzionalità degli oncosoppressori ma l'evento è sempre lo stesso, perché l'oncosoppressore normalmente terrebbe a bada il gene che funziona da oncogene. Quando perdiamo l'oncosoppressore gli oncogeni possono perdere il sopravento. Tra queste sequenze che sono presenti più volte nel nostro genoma ve ne sono alcune che ci permettono di distinguere il DNA di soggetti che appartengono alla stessa specie e queste sequenze in particolare sono sequenza che definiamo sequenze ALU. Esse sono delle sequenze che sono costituite da circa 300 paia di basi, vengono ripetute circa 500.000 volte all'interno del nostro genoma (pari al 10% circa di tutto il DNA umano). E queste sequenze ALU vengono sfruttate in medicina florense, cioè sono quelle che ci permettono di attribuire l'appartenenza di DNA ad un determinato soggetto. Si può fare ciò innanzitutto sfruttando degli enzimi di restrizione, che sono degli enzimi che vanno a riconoscere particolari sequenze che sono presenti sul DNA, gli enzimi di restrizione sono normalmente presenti nei batteri, questi enzimi di restrizione tagliano il DNA in particolari punti, in corrispondenza di particolari sequenze, in modo tale da ottenere due frammenti, quindi frammenta la molecola in maniera tale da ottenerne più porzioni. Tra gli enzimi di restrizione che vengono sfruttati, abbiamo l'enzima ALU che riconosce le sequenze ALU. La posizione di queste sequenze è diversa da individuo a individuo, quindi avendo due dai Hpal tiaii campioni di DNA i punti che vengono tagliati Ha MA i sono leggermente diversi perché la sequenza È STA » ALU si trova in una posizione diversa rispetto alla precedente. Quindi i numeri di frammenti che otteniamo sono sempre lo stesso, perché sono sempre 3, ma di diverso avremo la lunghezza, quindi quello che varia seconda di dove questi siti ALU vengono posizionati nel genoma sono i frammenti che si ottengono quando utilizziamo l'enzima ALU 1 per andarli a tagliare. In questa immagine abbiamo una EcoRI Pl Smal procedura, che viene utilizzata in laboratorio, che ci permette di misurare la lunghezza di questi frammenti, al di là della metodica è importante anche notare che ogni frammento di colore nero, indica un frammento di DNA, questi frammenti di DNA vengono separati tra di loro in base alla loro dimensione, in alto si avrà il frammento più grande ed in basso si avrà il frammento più corto. Nella figura troviamo il DNA della vittima, che è stato estratto, processato e tagliato in frammenti tramite l'enzima ALU 1, ed i frammenti che vengono ottenuti vengono separati tra di loro rispetto al peso molecolare, andando quindi dal più grande (in alto) al più piccolo (in basso). Ma sulla scena dell'omicidio viene ritrovato un altro campione biologico, anche da esso viene estratto il DNA e frammentato mediante l'enzima di restrizione ALU 1 e poi questi frammenti di DNA vengono separati in base al loro peso molecolare, e possiamo notare che questa divisione in base ai pesi molecolari è diverso rispetto a quello della vittima, quindi sappiamo che questo DNA non appartiene alla vittima ma all'assassino. Di seguito vengono riportati tre campioni dei tre rispettivi sospettati, che sono stati ottenuti dall'estrazione di DNA che venne a sua volta processato e tagliato in frammenti per poi essere ordinato in base al peso molecolare. Possiamo notare che i tre campioni sono tra di loro diversi, ma quello del campione 1 ha un quadro di frammenti che è identico a quello del campione che era stato ritrovato sulla scena del crimine. Questo ci dice che il sospettato 1 è il responsabile dell'omicidio perché il suo DNA è il DNA che è stato ritrovato sulla scena del crimine. Questo per far capire che ogni individuo appartenente alla stessa specie ha un DNA che può essere identificato in maniera univoca e specifica ad un soggetto proprio sfruttando queste sequenze imperfette, queste sequenze che vengono ripetute più volte nel nostro DNA e che servono a distinguere un soggetto dall'altro. Questo perché i geni, che sono 8 vittima campione N - sospettati wu sequenze di proteine, sono tutti identici per una stessa specie, cioè le sequenze di DNA che ci servono per fare le proteine, come per esempio ATP sintetasi, quel gene avrà la stessa sequenza in tutti gli appartenenti alla stessa specie. Ciò che distingue il DNA da un | soggetto all'altro sono proprio queste sequenze non codificanti e sono quelle che vengono sfruttate proprio per attribuire un DNA | ad un determinato soggetto. CITOSOL Importina e ottenuti gli RNA di trasferimento, messaggeri, ribosomiali ma anche le componenti dei ribosomi, queste molecole devono uscire dal nucleo e lo fanno proprio attraverso i pori nucleari. Per poter riconoscere in maniera specifica le molecole da trasportare, le proteine che vengono sintetizzate nel citoplasma e devono essere trasportate all'interno del nucleo, devono contenere delle particolari sequenze che vengono dette sequenze di localizzazione nucleari. Nel citoplasma sono presenti delle proteine che hanno la capacità di riconoscere queste particolari sequenze. Quindi se una proteina serve all'interno del nucleo, essa deve presentare questa sequenza che viene detta sequenza o segnale di glocalizzazione nucleare, ed anche in questo caso la denominazione è in inglese con l'acronimo NLS cioè nucleol localizzazion segnal. Quando la proteina presenta questa particolare sequenza, quindi sono dei particolari amminoacidi disposti con un ordine ben preciso, la proteina con questo segnale di NLS viene riconosciuta da una proteina che chiamiamo importina. Si forma questo complesso tra importina e proteina e questo complesso viene riconosciuto proprio dal foro che è presente sulla QUE I membrana plasmatica. Questo nelnuoleo;l processo complesso proteina e importina passa pool attraverso il poro dopodiché quello che deve avvenire e la sua dissociazione, in modo tale che se la = proteina che stiamo trasportando è ( una proteina istonica, questa proteina verrà poi utilizzata per il @ Il complesso proteico si lega a NPC D. _ ripiegamento della molecola di DNA. NLS Quindi così come esistono questi (F) La proteina che contiene il segnale segnali per trasportare le proteine da 7 i — NLS si lega all'importina e si sposta citoplasma al nucleo, vi saranno anche roteina richiesta verso un poro nucleare SRO delle sequenze che vengono riconosciute per trasportare le molecole che dal nucleo devono essere portate nel citoplasma, e questi segnali vengono detti segnali di esportazione nucleare e le proteine che aiutano l'uscita vengono dette esportine. Quindi le importine per portare le molecole all'interno del nucleo e le esportine per trasportare le nostre molecole fuori dal nucleo. Il nucleolo Le cellule possono presentare anche più di un nucleolo e il nucleolo rappresenta la zona in cui vengono depositati gli RNA ribosomiali, l'RNA ribosomiale è un tipo di RNA che ritroviamo sul ribosoma e che svolge un compito molto importante durante il processo di sintesi proteica. Gli RNA vengono sintetizzati all'interno del nucleo e poi dal nucleo vengono trasportati nel citoplasma proprio per essere incorporati nei ribosomi. La regione del nucleo in cui questi RNA ribosomiali vengono depositati è il nucleolo. Quindi la cellula può presentare anche più di un nucleolo ed è la regione in cui ritroviamo gli RNA ribosomiali. Duplicazione del DNA (oppure replicazione) La prima cosa da dire sul processo di replicazione è che questo è un processo semiconservativo ed il significato di questa parola lo si può capire dall'immagine, la molecola in blu rappresenta la molecola che deve essere replicata. La molecola di partenza deve essere aperta, e per aperta significa che FAF004> 0040 >>00>490>0] FHF004> 0040 >> 003400» bisogna rompere i legami ad idrogeno che tengono unite le basi azotate, e una volta aperta la molecola di DNA ciascun filamento servirà da stampo per la sintesi di un nuovo filamento. Si definisce un processo semiconservativo perché noi partiamo da una molecola e ne otteniamo due e ciascuna delle nuove molecole ottenute sarà fatta per metà dal DNA di partenza e per metà dal DNA nuovo che è stato appena sintetizzato, per essere più precisi la molecola di PE PEER DNA di partenza, la chiamiamo DNA be OMERO parentale, quindi in questo caso la 0 molecola azzurra è il nostro DNA = parentale ed esso dopo esser stato denaturato, perché non stiamo Mala. facendo altro che rompere i legami = tra le basi azotate, servirà da 2::[Diana] Po ? stampo per la sintesi di un nuovo 7 i ° ag-o-p= DNA e questo lo chiamiamo DNA di Estromità 3 BECA nuova sintesi. Il DNA parentale guida la sintesi del nuovo filamento & i esi aa], È Ì sfruttando le regole 4 @ SETT dell'appaiamento delle basi, cioè se * % KS ” per esempio nel DNA parentale 2 ° troviamo una 6, il filamento di nuova sintesi dovrà contenere una C, se invece il DNA parentale contiene Ls una T, sul DNA di nuova sintesi si [Ermina] TS avrà una A. Quindi non si fa altro H > che leggere la sequenza dei - nucleotidi presenti sul DNA asi lab parentale e aggiungere le basi ria complementari sul filamento di 5 nuova sintesi. L'enzima che catalizza l il processo di sintesi del DNA si [aserina } 4 chiama DNA polimerasi, esso non fa x né -0-t=0 altro che creare un polimero fatto di nucleotidi e quindi DNA polimerasi. Esso catalizza la formazione del legame fosfodiesterico, cioè il legame che tiene insieme i nucleotidi, in particolare tra il gruppo OH in posizione 3' dello zucchero e il gruppo fosfato presente sul carbonio 5' dello zucchero del nucleotide successivo. La DNA polimerasi, in pratica, prende un nuovo nucleotide e non lo prende a caso, ma legge il messaggio sul filamento parentale, nel caso sul filamento parentale legge per esempio che c'è un adenina, la DNA polimerasi andrà a legare una timina, proprio perché deve ripristinare l'appaiamento A-T; prende un nuovo nucleotide nel quale utilizza il gruppo fosfato che è presente sul carbonio 5' e realizza il legame fosfodiesterico tra il gruppo fosfato in posizione 5 del nucleotide libero e l'OH presente in posizione 3' della catena che si sta sintetizzando, così si va a formare il legame tra due nucleotidi. Quindi quando noi procediamo nell'allungamento non facciamo altro che procedere in direzione 3'+5' ad indicare il fatto che l'ultimo nucleotide della catena utilizza il gruppo OH al 3', il nuovo nucleotide che deve essere inserito utilizza il gruppo fosfato nella Estremità 5 Estremità 3 Estromità 5 posizione 5", quindi la sintesi del DNA precede in direzione 3'+5'. Il filamento parentale è anche detto filamento stampo e viene letto dalla DNA polimerasi che non farà altro che aggiungere il nucleotide complementare. Quindi se abbiamo un'adenina di fronte dovremmo mettere una timina, quindi la DNA polimerasi lega questa timina libera e di questa timina libera utilizza il gruppo fosfato presente al 5' e fa avvenire il legame con il gruppo OH presente in posizione 3' del nucleotide presente nella catena in allungamento, nel filamento in crescita. Quindi l'ultimo nucleotide del filamento in crescita verrà impiegato con il gruppo OH in posizione 3' per formare il legame fosfodiestere con il gruppo fosfato presente in posizione 5' del nucleotide libero, questa reazione consentirà alla formazione di un nuovo legame fosfodiestere. Quindi questo modo di procedere della DNA polimerasi fa definire la sua azione con DNA polimerasi 5'+3'. Quindi ogni volta che unisce un nuovo nucleotide mantiene libero l'OH in posizione 3’, quindi direzione 5'+3' indicando che la posizione 3' rimane sempre disponibile per un nuovo legame. La nostra molecola di DNA è una molecola molto lunga e per poter accelerare il processo di replicazione, la sintesi del nuovo DNA parte da più punti contemporaneamente, quindi i punti in cui il DNA viene aperto ed i legami idrogeno tra le basi azotate vengono aperti vengono detti origini di replicazioni, quindi il punto in cui inizia la sintesi della molecola di DNA viene definito origine di replicazione e di essa su ogni molecola di DNA ne possiamo ritrovare più di una, proprio perché in questo modo il processo di replicazione avviene più velocemente. Le caratteristiche di questi punti sono delle sequenze molto ricche di appaiamenti adenina timina e proprio queste due basi azotate perché sono tenute insieme da due legami ad idrogeno e quindi si preferisce adenina e timina piuttosto che guanina e citosina che sono legate tra di loro da tre legami ad idrogeno, perché per rompere i legami ad idrogeno c'è bisogno di energia e quindi per rompere i legami tra adenina e timina servirà meno energia di quanto ne servirebbe per la coppia di basi guanina e citosina, quindi le origini di replicazione sono caratterizzate dall'avere un elevato numero di appaia menti adenina timina perché in questo modo Filamenti parentali Origini di replicazione - . » ; di tré diversi ropliconi la cellula risparmia energia. Quando il Filamenti figli | \ - gi i a processo di duplicazione va avanti si (a) = = Forcelle Y di replicazione Bolle di replicazione (b) | due repliconi di sinistra si sono uniti insieme (d) 5 e iz, | Fusione dei rep! (e) funziona in direzione opposta al posto del gruppo OH ci dovremmo trovare legato all'ultimo nucleotide tre gruppi fosfato (abbiamo tre gruppi fosfato perché i nucleotidi che utilizziamo per formare il legame fosfodiestere sono nucleotidi trifosfato), arriva il nuovo nucleotide e i tre gruppi fosfato sono sempre presenti, a questo punto se è stata inserita una base errata una volta rimossa, nel nostro caso l'adenina avrà libero il gruppo OH, se invece di andare in direzione 5'+3 stiamo procedendo in direzione 3'+5', anziché il gruppo OH abbiamo un gruppo fosfato, ogni volta che formiamo il legame fosfodiestere abbiamo un gruppo fosfato, quindi andiamo a rompere il legame fosfodiestere nel momento in cui allontaniamo il nucleotide sbagliato. Quello che ci rimane alla fine sarà solo un gruppo fosfato perché il legame fosfodiestere conteneva solo un gruppo fosfato che fa da raccordo tra i due nucleotidi, quindi l'ultimo nucleotide che ci rimane avrà solo un gruppo fosfato. Quando i gruppi fosfato vengono rimossi viene liberata energia, qualsiasi reazione enzimatica nella cellula richiede un consumo di energia, ed in questo caso ogni volta che viene inserito un nucleotide, l'allontanamento del pirofosfato (i due fosfati insieme prendono il nome di pirofosfato) libera energia. Quando arriviamo ad ottenere un unico gruppo fosfato, dopo l'allontanamento del pirofosfato, perdiamo la fonte di energia che ci consente di mandare avanti la reazione. Quindi se le cellule avessero avuto un enzima capace di sintetizzare in direzione 3'+5', l'ultimo nucleotide aggiunto alla catena avrebbe all'estremità 5' un nucleotide trifosfato, in seguito all'aggiunta del nucleotide successivo il pirofosfato viene rimosso, per correggere un eventuale errore se l'ultimo nucleotide fosse rimosso non si potrebbe legarne un altro perché non si avrebbe più l'energia che viene fornita dall'allontanamento del pirofosfato. Questo è il motivo per cui non abbiamo un enzima in grado di procedere in direzione 3'+5', perché questa direzione non permetterebbe di ripristinare il processo di sintesi dopo aver effettuato un processo di correzione. Ripetendo: Nell'immagine su stiamo mettendo a confronto gli eventi di una DNA polimerasi che funziona in direzione 5'+3 che è la direzione che effettivamente ritroviamo nelle nostre cellule e che è quella riportata in figura, stiamo sintetizzando la nuova molecola che è quella azzurra ed ogni volta che inseriamo un nucleotide nuovo, quest'ultimo nucleotide avrà sempre disponibile il gruppo OH nella posizione 3', quando il nuovo nucleotide viene aggiunto rimuoviamo questi due gruppi che stanno legati tra di loro e che chiamiamo pirofosfato, la rimozione di questi due gruppi libera energia, che è l'energia necessaria proprio per far formare il legame fosfodiestere. Quindi la DNA polimerasi riesce a funzionare perché c'è l'energia che viene liberata dall'allontanamento del pirofosfato. Quando effettuiamo questo meccanismo di correzione, l'ultimo nucleotide avrà nuovamente ripristinato il gruppo OH al 3' perché l'ultimo nucleotide, quando sintetizziamo la nostra molecola di DNA, ha libero il gruppo OH, se questa base è una base errata l'allontaniamo ma il gruppo OH ritorna ad esserci per cui la sintesi può ricominciare a partire proprio dal nucleotide corretto, se invece avessimo la situazione capovolta al posto di avere un OH avremo un gruppo fosfato ed in particolare l'ultimo nucleotide avrebbe tre gruppi fosfato perché li utilizziamo come nucleotidi trifosfato nel processo di sintesi, solo che se facciamo l'errore e quindi dovremmo rimuovere la base, l'ultimo nucleotide avrà libero soltanto un unico gruppo fosfato per cui non potremmo più ricavare l'energia necessaria per mandare avanti la reazione di sintesi. Quindi abbiamo una DNA polimerasi che procede in direzione 5'+3' perché altrimenti non potremmo operare questo processo di correzione, processo che viene detto processo di correzione delle bozze. Quindi la capacità di correggere gli errori viene detta correzione delle bozze e procede in direzione inversa, opposta a quella con cui sintetizza. Quindi la DNA polimerasi sintetizza in direzione 5'+3' e corregge gli errori in direzione opposta quindi 3-+5', questa attività enzimatica viene detta esonucleasica, esonucleasica perché rimuove i nucleotidi nella direzione opposta con cui sintetizza, quindi sintetizza in direzione 5'+3' e rimuove il nucleotide in direzione 3'>5', quindi la DNA polimerasi ha capacità di sintesi in direzione 5'+3' e capacita di correzione in direzione 3'+ 5' perché è come se tornasse sui suoi passi per controllare che gli appaiamenti siano corretti e se gli appaiamenti non sono corretti rimuoverà il nucleotide sfruttando questa attività enzimatica che viene detta esonucleasica. Quindi nel momento in cui si forma un appaiamento che deforma la struttura della doppia elica, quindi non consente di mantenere quella struttura in cui i due filamenti sono distanziati esattamente di 2nm, la DNA polimerasi rimuove un nucleotide e ne introduce quello corretto, quindi procede in direzione opposta a quella con cui avanza e quindi la chiamiamo direzione opposta 3'—5B'. Una caratteristica della DNA polimerasi è quella di poter aggiungere nucleotidi ad una catena preesistente, ciò che significa che se noi prendiamo il filamento di DNA (in figura quello più scuro), la DNA polimerasi che si attacca ad un'estremità in realtà non può iniziare a sintetizzare a meno che non trovi già un piccolo frammento che questo enzima riesce ad allungare, quindi non ha la capacità di sintetizzare dall'inizio, non può introdurre il primo nucleotide ma ha bisogno di un piccolo frammento che poi verrà allungato, quindi prima che la DNA polimerasi possa cominciare a lavorare è Regione a singolo richiesto l'intervento di un altro enzima che si Primasi filamento del DNA . . . . a . su parentale chiama primasi. La primasi è un enzima che è in grado di sintetizzare un primer, primer è la parola inglese che indica un corto frammento o corta sequenza che anziché esser una sequenza fatta da deossinucleotidi è una sequenza fatta da nucleotidi, vale a dire non Pini m sono i nucleotidi che ritroviamo nella catena di ] DNA che hanno come zucchero il deossiribosio, E ma sono i nucleotidi che normalmente troviamo Innesco di RNA n 5 nel RNA e che quindi hanno come zucchero il DNA inonda più ribosio, nell'immagine la parte colorata in rosa, neosintetizzato che sta ad indicare che la natura di questa DNA piccola sequenza è diversa da quella del DNA. | polimerasi | Innesco di RNA, innesco che sta ad indicare il st primer cioè il piccolo frammento ed è un innesco perché poi una volta che la primasi Ù sintetizza questa sequenza, la DNA polimerasi RNA che deve ancora — Ultimo DNA comincerà ad allungare questo innesco, quindi SEA ITRAeZZatO STRNZZRO se non c'è questa sequenza di RNA la DNA | polimerasi non può funzionare. Quindi prima dell'attività della DNA polimerasi è richiesto l'intervento della primasi ed essa ha il compito di sintetizzare un piccolo innesco di RNA. Il meccanismo di replicazione è un meccanismo che avviene a partire da più punti, questo perché in questo modo riusciamo ad accelerare il processo di replicazione. La sintesi del secondo filamento procede in direzione 5'+3, la w @ Filamento figlio completo @ sequenza di DNA precedente è stata anch'essa replicata ma a partire da un altro innesco e il filamento di nuova sintesi avanza, quindi arrivati al punto 3, la DNA polimerasi che ha sintetizzato il frammento precedente troverà sulla propria strada il frammento di RNA, ovviamente noi vogliamo che il nuovo filamento di sintesi sia fatto soltanto da DNA, quindi non vogliamo che abbia delle sequenze fatte di RNA e poi la sequenza fatta di DNA. Quindi questo primer, che però ci è servito senno la DNA polimerasi non poteva lavorare, dovrà essere rimosso, ed è rimosso proprio dalla DNA polimerasi che arriva dal frammento precedente sempre in direzione 5'+3' e quando riconosce che questa sequenza è una sequenza fatta di RNA andrà a rimuovere questi nucleotidi e rimuovendo questi nucleotidi l'attività enzimatica verrà definita anche in questo caso esonucleasica 5'-> 3' perché è la direzione con cui la DNA polimerasi sintetizza. Quindi la DNA polimerasi possiede tre attività enzimatiche: attività polimerasica 5'->3, che è la direzione con cui sintetizza, e questo enzima ha la capacità di sintetizzare il polimero fatto di nucleotidi, attività esonucleasica 3'->5' che gli permette di correggere eventuali appaiamenti errati vale a dire fare la correzione delle bozze, attività esonucleasica 5'->3' che ha il compito di rimuovere il primer. Quindi tre diverse attività enzimatiche per svolgere tre diverse funzioni: l'allungamento, le correzioni delle bozze e la rimozione del primer. Quindi fino ad adesso abbiamo incontrato tre enzimi: uno è quello che ci permette la sintesi, quindi la DNA polimerasi; uno è l'enzima che ci permette di sintetizzare il primer e quindi la primasi; l'altro enzima che abbiamo incontrato è la DNA ligasi che ci permette unire tra di loro i diversi repliconi, ma anche i diversi frammenti di Okazaki che venivano sintetizzati sul filamento ritardante. Ma ancor prima che tutti questi tre enzimi possano intervenire, lavorano in sequenza altri due enzimi: uno è l'elicasi, perché per poter consentire alla DNA polimerasi di inserirsi tra le maglie della doppia elica, la doppia elica deve essere aperta, quindi per renderla maggiormente accessibile abbiamo bisogno dell'intervento dell' elicasi ed ha il compito di agire sull'elica rompendo i legami a idrogeno che tengono Uniti i nucleotidi, quando questo accade le maglie del DNA si infittiscono (si crea un superavvolgimento) e devono essere nuovamente allargate, quindi per togliere il superavvolgimento interviene un altro enzima che si chiama topoisomerasi, essa non fa altro che effettuare un taglio sui due filamenti del DNA e srotolare l'elica per poi risaldarla. Quindi le topoisomerasi sono enzimi che sono in 5° grado di eliminare il superavvolgimento che si viene a creare quando la doppia elica Topoisomerasi (punto di perno) Elicasi viene aperta. Nell'immagine I possiamo notare x queste sferette che sono delle proteine che aiutano ° Proteina che si lega ai filamenti singoli (SSBP) sui telomeri per allungarli. Questo enzima contiene nel suo interno un frammento di RNA (quello in rosa), questa è il motivo per cui la telomerasi la chiamiamo ribozima cioè un enzima che contiene al suo interno una piccola sequenza di RNA. La telomerasi non fa altro che utilizzare questo stampo (la sequenza rosa) come stampo per allungare il telomero, sfruttando la complementarità della basi, quindi alla sequenza AACCCCAAC e quindi una sequenza fatta solo da A e C, la sequenza complementare è fatta tutta da C e G, quindi tutti i telomeri del DNA presenti nelle nostre cellule presentano queste sequenze che sono complementari alla sequenza contenuta nella telomerasi. Quindi noi allunghiamo i telomeri con delle sequenze che non hanno nessuna informazione ma hanno una funzione importante che è quella di proteggere il DNA dall'accorciamento che si verifica ad ogni ciclo di replicazione. Quindi i telomeri si accorciano, questo evento non si può evitare ma possiamo evitare di perdere informazioni geniche e questo lo possiamo fare grazie alle telomerasi che allungano i telomeri aggiungendo queste sequenze che sono complementari all'ENA che è presente nella telomerasi. Finita la sintesi di DNA nell'immagine abbiamo il filamento parentale di colore nero e quello di nuova sintesi in colore blu, ma nella cellulare i colori non vengono utilizzati, per cui quando finisce la sintesi di DNA noi abbiamo un filamento nuovo e un filamento preesistente ed essi vengono riconosciuti non dai colori ma grazie a gruppi metili che sono presenti solo sul filamento parentale. Quindi il filamento parentale presenta delle sequenze che sono metilate e la metilazione avviene in corrispondenza di particolari regioni del DNA, quindi il filamento parentale è metilato e le metilazioni sono importanti perché ci fa capire quel è il filamento parentale e qual è il filamento di nuova sintesi. Questi due filamenti è importante distinguerli perché nonostante la DNA polimerasi è in grado di correggere eventuali appaiamenti errati sfruttando l'attività esonucleasica, però alcuni errori possono sfuggire al meccanismo di correzione delle bozza, quindi quando in un secondo momento questa molecola di DNA viene sottoposta ad un controllo di qualità, quindi viene nuovamente scansionata per accettarsi che non ci siano errori, nel momento in cui viene riconosciuto un appaiamento errato, viene rimosso il nucleotide presente sul filamento di nuova sintesi perché quello sul filamento parentale è sicuro corretto, per questo è di fondamentale importanza distinguerli e per distinguerli si sfruttano le metilazioni. Quindi se abbiamo un appaiamento errata sappiamo che quella da rimuovere è quella che si trova sul filamento non metilato e quella che è presente sul filamento metilato deve fungere da stampo per inserire una base corretta, quindi questi quadri di metilazioni vengono ereditati durante il processo di replicazione e ci permettono di distinguere il filamento parentale da quello di nuova sintesi. Corretti eventuali appaiamenti abbiamo ottenuto due molecole, il quadro di metilazione all'inizio ce l'abbiamo solo sul filamento nero, vale a dire quello parentale, perché ci permette di distinguere il filamento parentale da quello di nuova sintesi. Dopo la correzione degli errori su queste due molecole che sono state sintetizzate dovrà avvenire la metilazione, perché entrambi devono diventare filamenti parentali una volta che saranno destinati ad una nuova cellula e questa cellula dovrà andare incontro al processo di divisione. Quindi la metilazione, la regione che è metilata sul filamento nero, dovrà poi essere metilata anche sul filamento azzurro, quindi questi quadri di metilazione sono ereditari, sono presenti sulle nostre molecole di DNA e vengono passate da una cellula madre ad una cellula figlia, proprio perché nella replicazione di DNA ciò che è metilato sul filamento parentale dovrà essere metilato sul filamento di nuova sintesi. Perché l'uracile non è presente nella molecola di DNA? Se confrontiamo la struttura dell'uracile con la struttura della timina, la differenza tra le due è solo un gruppo metile, il gruppo metilico può essere perso da eventuali reazione e non faremmo altro che trasformare la timina in uracile, quindi quando abbiamo questa timina metilata, se perdiamo la metilazione la convertiamo in uracile, quando ci troviamo di fronte ad un appaiamento errato chi deve essere rimosso, l'uracile o la timina metilata che viene convertita verso il gruppo metilico in uracile. Per cui quando l'uracile viene prodotto in seguito a questa reazione di deaminazione della citosina, non saremmo in grado di riconoscere se un appaiamento errato richiede la rimozione dell'uracile o la rimozione della guanina, perché in un appaiamento quando questa citosina viene convertita in uracile, dobbiamo rimuovere la guanina o l'uracile? Per evitare questo problema l'uracile non è presente nella molecola di DNA e al posto dell'uracile ci troviamo la timina. Ripetendo: la citosina può subire reazione di deaminazione, cioè rimozione del gruppo amminico, quando questo avviene la citosina viene convertita in uracile, quindi la citosina mediante reazione di deaminazione viene convertita in uracile, quindi se noi ci troviamo nel DNA e abbiamo una citosina, la citosina sarà appaiata con la guanina. La citosina subisce reazione di deaminazione e viene convertita in uracile, quindi a questo punto invece di avere la citosina, ci troviamo di fronte un uracile, questa reazione di deaminazione avvengono in qualsiasi momento, vale a dire che queste reazioni non avvengono necessariamente dopo il processo di duplicazione, ma possono succedere anche dopo che i due filamenti sono stati metilati. Quindi entrambi i filamenti sono metilati, non possiamo distinguere qual è il filamento di nuova sintesi e qual è filamento neosintetizzato, ci troviamo di fronte un appaiamento errato, in cui invece di avere C-G abbiamo un appaiamento U-G, quindi ci domandiamo qual è la bosa che dobbiamo rimuovere, per risolvere questo problema mettiamo la timina al posto dell'uracile, questo perché non riusciamo a distinguere un eventuale appaiamento errato per cui non avendo questo processo, nel momento in cui la citosina viene deamminata e ci troviamo l'uracile, sappiamo già che la base che deve essere rimossa è l'uracile e quindi questa viene rimossa e al suo posto viene inserita nuovamente la citosina. L'uracile, quindi, non è presente per non trovarci nella situazione in cui non sappiamo chi rimuovere, perché se l'uracile fosse presente nella molecola di DNA avendo a disposizione questo tipo di appaiamento la cellula si chiederebbe chi rimuovo? Per evitare di non saper rispondere a questa domanda, la molecola di DNA non presenta uracile ma presenta la timina, quindi in questo caso trovando questo tipo di condizione sappiamo che l'uracile non deve essere presente e quindi andiamo a rimuovere l'uracile dall'appaiamento errato e al suo posto mettiamo nuovamente la timina. La deaminazione della citosina può avvenire perché è una sorta di danno al DINA, i processi di deaminazione possono avvenire perché è un danno che viene recato al nostro DNA e quando avviene la deaminazione la citosina viene convertita in uracile, il danno al DNA viene riparato e la riparazione prevede l'eliminazione dell'uracile e la reintroduzione della citosina. Processo di trascrizione. Con questo termine viene indicato il processo che consente di DNA (ATC G) sintetizzare RNA, usare la parola trascrizione trascrizione significa riferirci al meccanismo di sintesi dell'RNA, per poter sintetizzare RNA SINSNSINASANI abbiamo bisogno di una molecola di DNA che RNA messaggero (A U C G) faccia da stampo, a partire dalla sequenza di | . nucleotidi che sono presenti sulla molecola di | traduzione DNA sintetizziamo una molecola di RNA. Gli RNA che abbiamo a disposizione nella cellula sono 3: RNA ribosomiale, RNA Messaggero e Proteina (20 amminoacidi) RNA di trasferimento. La sequenza dei nucleotidi presenti sull' RNA messaggero, dei diversi RNA messaggero che vengono sintetizzati, mi darà la sintesi delle proteine, o meglio gli amminoacidi che verranno inseriti nelle proteine che devono essere sintetizzate. Il processo della sequenza di RNA che viene trasformata in amminoacidi viene detta ca all'interno di una cella traduzione. Quindi abbiamo due processi: il processo di trascrizione e traduzione. La sintesi dell'RNA messaggero, ma anche degli altri due tipi di RNA che abbiamo a disposizione, da una molecola di DNA viene definito trascrizione, mentre la sintesi di proteine nel citoplasma basata sull'informazione codificata in un mRNA viene definito processo di traduzione. Si parte, quindi, dalla sequenza di DNA che viene letta per poter sintetizzare mRNA, tRNA e rRNA (che sono le tre categorie principali che vedremo). Tutti e tre questi tipi di RNA vengono utilizzati durante il processo di sintesi proteica, processo che abbiamo appena definito traduzione, in particolar modo per quanto riguarda MRNA esso guida l'ordine con cui gli amminoacidi devono essere inseriti all'interno della catena polipeptidica e stabilisce con quale successione gli aminoacidi devono comparire nella nostra proteina, il +RNA è il responsabile del trasporto degli amminoacidi e l'rRNA sono componenti essenziali dei ribosomi e i ribosomi sono la sede in cui avviene il processo di sintesi proteica cioè il processo di traduzione, quindi tutti e tre questi tipi il RNA vengono utilizzati durante il processo di traduzione, quindi questo passaggio da DNA a RNA lo chiamiamo trascrizione e i tre tipi di RNA li utilizzeremo poi nel processo di traduzione cioè nel processo di sintesi proteica. Le regioni del DNA che vengono trascritte le definiamo geni, quindi avremo dei geni che codificano per gli mRNA, geni che codificano per il tRNA e geni che codificano per rRNA, ma nel caso del mRNA esso viene poi utilizzato per la sintesi proteica quindi se noi togliamo di mezzo questo passaggio possiamo chiamare gene quella sequenza di DNA che codifica per una proteina e nel passaggio intermedio c'è I'mRNA, quindi che cos'è un gene? Un gene è la sequenza di DNA che serve per la sintesi di un polipeptide, quindi per la sintesi di una proteina o che serve per la sintesi di vari tipi di RNA. Quindi gene è quella sequenza di DNA che viene utilizzata per la sintesi di RNA di diverso tipo o quella sequenza di DNA che viene utilizzata per la sintesi di una proteina e in questo passaggio è obbligatorio il passaggio attraverso I'mRNA. Perché parliamo di processo di trascrizione e traduzione? Innanzitutto qua in alto (nella figura precedente) noi abbiamo una molecola di DNA che è praticamente scritta in un linguaggio di quattro lettere che sono le quattro basi azotate quindi quattro nucleotidi, quando la sequenza delle basi, quindi la sequenza dei nucleotidi, viene letta per sintetizzare la molecola di RNA, la molecola di RNA che andremo a formare è anch'essa fatta di nucleotidi quindi il linguaggio che utilizziamo nel passaggio da DNA a RNA è lo stesso, è il linguaggio dei nucleotidi, l'unica cosa che facciamo noi è ricopiare questo messaggio e quindi questo è il motivo per cui parliamo di trascrizione quindi stiamo semplicemente ricopiando ciò che è scritto nel DNA in una molecola di RNA. Il passaggio successivo avendo a disposizione un mRNA prevede che ciò che è scritto in nucleotidi venga poi trasformato in una proteina e la Nucleo, ‘RNA messaggero (sintesi proteica) Proteina A (a) ll flusso dell'informazione genetica fra le generazioni di cellule interviene in questo processo è l'enzima che si chiama RNApolimerasi, l'RNApolimerasi funziona in maniera del tutto identica alla DNA polimerasi, cioè va a formare legami fosfodiesterici fra nucleotidi utilizzando nucleotidi trifosfato. E così come la DNA polimerasi anche l'RNA polimerasi procede in direzione 5'-> 3'. Una delle differenze fondamentali tra la molecola di RNA e la molecola di DNA è che l'RNA è un singolo filamento. Quindi, mentre la molecola di DNA, quando dobbiamo attuare il processo di duplicazione, deve essere ricopiata su entrambi i filamenti, nel caso della trascrizione, visto che l'RNA ha un unico filamento, utilizzeremo un solo filamento di DNA. E dei due quale utilizzeremo? Visto che le RNA polimerasi procede in direzione 5'->3' il filamento di DNA che dobbiamo utilizzare è un filamento che ha anche in questo caso orientamento antiparallelo, quindi dei due filamenti di DNA utilizzeremo esclusivamente il filamento 3'->5', perché questo filamento consentirà le RNA polimerasi di procedere in direzione 5'->3'. Questo perché anche I'RNA polimerasi non deve far altro che leggere la sequenza di nucleotidi presente sul filamento di DNA e inserire dei nucleotidi complementari. Il filamento di DNA che utilizziamo proprio durante il processo di trascrizione lo chiamiamo filamento stampo, stampo perché appunto fa da stampo per l'inserimento dei Nucleotidi complementari. Ma l'altro filamento, quello che non viene utilizzato durante il processo di trascrizione lo definiamo filamento codificante. Viene dato questo nome perché se andiamo a leggere la sua sequenza, essa risulterà identica alla sequenza dell'RNA e in basso nella figura precedente viene riportato questo esempio, se immaginiamo di avere una sequenza di DNA fatta da una successione sul filamento 5'->3' Adenina, Adenina, Citosina, Guanina, Citosina, Citosina, guanina, timina, adenina, timina, timina. Questo filamento che corrisponde al filamento codificante ha una sequenza identica a quella che ritroviamo sul filamento di RNA. Con un'unica differenza: che la timina presente sul DNA è stata sostituita con l'Uracile. Proprio per questa omologia, quindi la sequenza dell'ENA con orientamento 5'->3 è identica alla sequenza del filamento di DNA con andamento 5'->3’, ci porta a definire questo filamento di DNA, filamento codificante, perché se noi andiamo a leggere semplicemente la sequenza delle basi su questo filamento e che questo gene codifica per una proteina, sappiamo già quale sarà la successione degli aminoacidi che compariranno nella nostra proteina. Questo perché abbiamo detto che se I'RNA in questione è un RNA messaggero esso guida gli aminoacidi che devono essere inseriti nella proteina, quindi visto che la sequenza dell'RNA è uguale alla sequenza del DNA con orientamento 5'->3', andare a leggere la sequenza delle basi su questo filamento ci dirà la sequenza degli amminoacidi presenti poi alla fine nella proteina. Questo è il motivo per cui questo filamento viene detto codificante. Quindi fase di legame, riconoscimento da parte dell'RNA polimerasi del nostro promotore. Fase di inizio, cioè inizio della sintesi e quindi inizia a sintetizzare muovendosi in direzione 5'->3' utilizzando come filamento da utilizzare nella lettura, il filamento di DNA che ha orientamento 3°->5', perché questo filamento consente all'ENA polimerasi di muoversi in direzione 5'->3', questo filamento viene definito filamento stampo. La fase successiva è data dalla fase di allungamento, quindi non fa altro che leggere la sequenza dei nucleotidi e inserire i nucleotidi complementari, quindi sta allungando la molecola di RNA fino ad arrivare all'ultima fase che è rappresentata dalla fase di terminazione. Che cosa succede in questa fase? L'RNA polimerasi dovrà dissociarsi dalla molecola di DNA e una volta che si è dissociato, anche la molecola di RNA che è stata appena sintetizzata verrà rilasciata, quindi ci +roviamo nuovamente la molecola di DNA di partenza con il suo promotore, nuovamente i due filamenti appaiati con i legami ad idrogeno e ci ritroviamo poi la molecola di RNA che è stata appena trascritta. Durante questa fase di allungamento, quello che si verifica, quindi, quello che si vede e un ibrido Costituito per circa 8-9 nucleotidi da RNA, la molecola che stiamo sintetizzando e da DNA la molecola che sta funzionando da stampo. Man mano che la doppia elica si apre e viene utilizzata per il processo di trascrizione, subito dietro, quindi, la regione che è stata già trascritta, viene nuovamente riappaia al filamento codificante quindi questo processo di apertura è attuato per un breve periodo che dura giusto per il tempo di consentire alle RNA polimerasi di trascrivere, ma subito i legami idrogeno che tengono appaiati i due filamenti di DNA vengono riformati. Durante il processo di duplicazione questo lavoro di apertura della doppia elica era svolto dalle ligasi in questo caso, invece, il lavoro è fatto esclusivamente, quindi è svolto esclusivamente dall' RNA polimerasi. In più, durante il processo di duplicazione del DNA avevamo bisogno di una primasi che cominciava sintetizzare un piccolo innesco, il primer, che consentiva poi alla DNA polimerasi di allungare questa sequenza. Qui l'RNA polimerasi può iniziare a lavorare da zero, quindi non ha bisogno di un piccolo innesco. Quindi la sintesi di RNA viene mediata esclusivamente dal RNA polimerasi, che è in grado sia di aprire la doppia elica e sia di iniziare la sintesi da zero. Man mano che l'RNA polimerasi si muove lungo la molecola di DNA. La apre, trascrive e subito dopo aver trascritto la regione, che non serve più perché già stata ricopiata, viene nuovamente legata con il filamento codificante. Il processo va avanti e durante questo processo di allungamento, esattamente come abbiamo fatto durante la sintesi del DNA, formiamo il legame fosfodiestere utilizzando nucleotidi trifosfato, il gruppo pirofosfato viene allontanato e questo fornisce l'energia per mandare avanti la reazione di sintesi e la catena si allunga. Si allunga fino a quando non viene attuata l'ultima fase, che è la terminazione. Per quanto riguarda le cellule batteriche, quindi i procarioti, la terminazione può avvenire con due diversi meccanismi. Una terminazione viene detta rho dipendente, mentre l'altra viene definita rho indipendente. Rho è una piccola proteina, questa proteina rappresentata in figura come una sorta di sferetta, mentre la struttura a forma di fiore rappresenta I'RNApolimerasi. All'inizio la DNA polimerasi apre la doppia elica, comincia a trascrivere questo filamento di RNA, quindi questa sorta di tubo di colore arancione-rosso e la doppia elica viene via via sempre più aperta, la RNA polimerasi sintetizza e ad un certo punto, subito dopo l' avvio del processo di trascrizione, all'estremità 5' della molecola di RNA, si lega una proteina, questa proteina la chiamiamo rho, questa proteina non fa altro che risalire lungo il filamento di RNA e per la RNA polimerasi trascrive il DNA rho sì lega all'estremità 5' della catena di RNA 49%, é » n tho sì sposta lungo ANA prodotto dalla polimerasi con una reazione ATP.-dipendente 4 rho ADI ATP A la polimerasi si arresta ‘ad un terminatore che rho Ò (e ha appena raggiunto lo io on (ee terminatore terminatore e i n >> conna>>>a * occo sesncecs Fo © 5 tho-indipendente tho-indipendente terminazione e rilascio della polimerasi e dell'ANA -oM spe diversi tipi di rRNA, li indichiamo mettendo la lettera “r” prima di "RNA" che sta ad indicare RNA ribosomiale, in più gli RNA ribosomiali li differenziamo in base alla loro misura, alla loro dimensione e di rRNA ne abbiamo a disposizione 4 tipi: 285, 185 , 5,85 e in più un altro tipo che è I'RNA ribosomiale 55 che però non viene sintetizzato dalla RNA polimerasi di tipo 1. Quelli che otteniamo sono i precursori degli rRNA (28,18 e 5.8) perché queste molecole subito dopo la trascrizione quindi appena la DNA polimerasi ha finito di lavorare questi precursori devono essere sottoposti a maturazione, quindi lo chiamiamo precursori o preRNA per indicare a indicare il prodotto ottenuto dall'azione enzimatica dell'RNA polimerasi ma non ancora pronto per assolvere alla propria funzione. E poiché abbiamo detto che gli rRNA li troviamo nel nucleolo, la RNA polimerasi avrà localizzazione nucleolale. Quindi quando precedentemente abbiamo parlato del nucleo come regione in cui viene conservata la molecola di DINA nel compartimento cellulare in cui viene conservato il DNA, abbiamo detto che nel nucleo si distingue una zona più scura che chiamiamo nucleolo e il nucleolo è la sede degli rRNA, ecco perché l'RNA polimerasi ha una localizzazione nucleolale. L'ENA polimerasi di tipo 2 serve per sintetizzare gli mRNA, la M sta a indicare L' RNA Messaggero, anche in questo caso è un precursore e quindi lo chiamiamo premRNA. Infine, abbiamo I'RNApolimerasi di tipo 3 che è deputata alla sintesi dell'ultimo tipo di RNA che è I'RNA di trasporto ma è anche un precursore quindi si definisce quindi pre-tRNA e oltre al pre-tRNA sintetizza anche l'ultimo tipo di rRNA 55. UOlMI CRE CCR ORESTE RI RNA polimerasi Localizzazione Prodotti principali Sensibilità alla @-amanitina l Nucleolo Precursore per rRNA 28S, rRNA 18S e rRNA 5,8S Resistente LL) Nucleoplasma Pre-mRNA e la maggior parte degli snRNA + Molto sensibile IM Nucleoplasma Pre-tRNA, rRNA 5S e altri piccoli RNA Parzialmente sensibile* Mitocondriale Mitocondrio RNA dei mitocondri Resistente Cloroplastica Cloroplasto RNA dei cloroplasti Resistente *Nei mammiferi Il mitocondrio abbiamo detto che è l'unico organello cellulare che contiene DNA e la sintesi del DNA mitocondriale avviene proprio nel suo interno, quindi non è di derivazione nucleare che poi viene traportato nel mitocondrio, la sua duplicazione avviene direttamente nel mitocondrio quindi abbiamo anche RNA polimerasi mitocondriale la cui localizzazione è esclusivamente nel mitocondrio, così come nelle cellule vegetali anche i cloroplasti contengono DNA e la localizzazione del RNA polimerasi la localizzazione sarà all'interno del cloroplasto. Quindi tre diverse RNA polimerasi per i diversi tipi di RNA che utilizziamo all'interno della cellula. Se abbiamo tre diversi tipi di RNA polimerasi e la trascrizione deve avvenire grazie al riconoscimento che questo enzima fa del promotore, avendone a disposizione tre i tre promotori saranno diversi tra di loro, quindi l'RNA polimerasi 1 riesce a trascrivere esclusivamente questo tipo di molecole perché il promotore riconosciuto dalla polimerasi 1 ha un sito di inizio ben preciso che non può essere riconosciuto dalle altre due polimerasi, stessa cosa la abbiamo per la polimerasi 2 che è quella che svolge la sintesi del MRNA il che significa che la polimerasi 2 deve riconoscere delle caratteristiche peculiari presenti sui geni che codificano per gli RNA messaggero e queste caratteristiche non devono essere presenti sui geni che vengono riconosciuti dalla polimerasi 1 e dalla polimerasi 3. Quindi questa specificità di trascrizione è consentita proprio dall'avere dei promotori con delle caratteristiche bene precise e queste caratteristiche consentono il riconoscimento da parte di una sola RNA polimerasi. Ovviamente i promotori più complessi sono quelli riconosciuti dal RNA polimerasi 2 perché la polimerasi 2 viene utilizzata per sintetizzare i tre mRNA che servono per la sintesi delle proteine, quindi per la traduzione, ma ovviamente le proteine che sono presenti nella cellula innanzitutto non sono sempre le stesse perché dipende da quello che la cellula ha bisogno in quel particolare momento, quindi significa che se non ha bisogno sempre delle stesse proteine e per fare la proteina abbiamo bisogno dell'ÌNA messaggero perché I'mRNA deve essere letto e tradotto per fare la proteina, significa che questi geni che codificano per gli mRNA devono essere regolati in maniera diversa proprio per rispondere alle esigenze del particolare momento che la cellula sta attraversando, per esempio le cellule epatiche in un particolare momento quando introduciamo cibo gli zuccheri che sono presenti nel nostro cibo vengono scissi principalmente in glucosio e questo glucosio viene depositato dalle cellule epatiche e per depositare glucosio abbiamo bisogno di enzimi che sono in grado di legare tra di loro i diversi monomeri del glucosio che ci consentono di formare glicogeno, però questo enzima che sintetizza glicogeno non è sempre presente, perché non serve in qualsiasi momento, per esempio quando siamo a digiuno il glicogeno non dobbiamo sintetizzarlo ma Promotore eucariotico tipico utilizzato dalla RNA polimerasi Il °9raderlo. quindi la cellula risponde Regione TATA localizzata a | cambiando la -25 nucleotidi rispetto al quantità di sito di inizio | enzima che ST sintetizza o ——" enzima che o a e metabolizza il glicogeno e per fare questo c'è == bisogno di cambiare la quantità di mRNA, questo L’elemento di riconoscimento L'elemento promotore a significa che per dei TFIIB valle posto a +30 fare l'mRNA n "i n nen dell'enzima che | quattro elementi sono organizzati in 2 tipi di promotore core: . . metabolizza il * TATA ed Inr (+/- BRE) * BRE e DPE Sequenze addizionali aumentano l’efficienza: CAAT box GC box glicogeno, il suo promotore verrà riconosciuto dall'RNA polimerasi però in maniera diversa dal promotore che invece sintetizza per l'enzima che deve degradare il glicogeno. E questa diversità consente quindi di sintetizzare l'mRNA rispondendo alle particolari esigenze che la cellula ha in ogni momento. Quindi gli mRNA hanno dei promotori estremamente variabili, quindi l'RNA polimerasi lavora su dei promotori che hanno delle caratteristiche standard (elencate in figura) ma che in aggiunta alle caratteristiche sempre presenti hanno un'elevata variabilità che consente quindi di sintetizzare il gene, quindi trascrivere il gene, in maniera diversa a seconda dell'esigenza della cellula. L'INA polimerasi 2 riconosce dei promotori che sono estremamente variabili ma in figura vengono riportati gli elementi più comuni. Primo tra i quali la particolare sequenza detta TATA box, gli mRNA al 98% contengono nel loro promotore questa sequenza che viene TATA box, la chiamiamo in questo modo perché se guardiamo la sequenza di nucleotidi non facciamo altro che alternare timine e adenine quindi se le leggiamo come se fosse una parola, quello che viene fuori è proprio la parola TATA; quindi TATA box indica una sequenza costituita da adenine e timine che si viene a posizionare orientativamente 25 nucleotidi prima del sito +1. Questa sequenza è molto importante perché essa viene riconosciuta dai fattori trascrizionali. Precedentemente quando abbiamo elencato le diversità che troviamo durante la trascrizione nelle cellule eucariote, una di queste peculiarità sta nel fatto che il processo di trascrizione è facilitato da alcune proteine che chiamiamo fattori di trascrizione. Uno dei fattori di trascrizione serve proprio a riconoscere e legare la sequenza TATA. Il promotore della polimerasi III, a differenza di quello che vediamo sia polimerasi I e sia per la polimerasi IT, questo promotore si trova dopo il sito +1, quindi non si trova nella regione che numeriamo con numeri negativi ma si trova nella regione che noi numeriamo con numeri positivi. Quando il processo di trascrizione deve essere avviato, devono intervenire queste proteine che chiamiamo fattori di trascrizione e i fattori di trascrizione li indichiamo con le lettere TF, ovviamente sempre con nominazione inglese TF sta per trascrition factor, solo che questi TF li chiamiamo fattori generali o basali, successivamente si vedrà la differenza, quindi tutto ciò che indichiamo con le lettere TF rappresenta un fattore di trascrizione generale o basale. In più queste lettere Promotore eucariotico tipico utilizzato dalla RNA polimerasi Ill TF le facciamo seguire da un numero romano che cambia a seconda della polimerasi Pra ll gene dl RNA Sto d'inizio che prendiamo in 4 Boa BoxB considerazione, = = Sire indi i ; DNA quindi abbiamo il TF I, se parliamo della polimerasi I, TF III se abbiamo una polimerasi III e il TF II se DNA Trascrizione parliamo di RNA (©) Due tipi di promotore per la ANA polimerasi Il polimerasi II. (Sintesi dei tRNA e del 5S rRNA) Abbiamo molteplici fattori di Promoter a valle del sito d’inizio della trascrizione trascrizione, ma ogni volta che la trascrizione deve essere avviata questi fattori TF intervengono tutti in un ordine ben preciso, quindi ognuno ha una sua funzione ed interviene nel processo di trascrizione seguendo un diciamo che gli RNA ribosomiale sono quelli più abbondanti all'interno delle cellula, quindi la percentuale maggiore che troviamo all'interno delle nostre cellule è rappresentato dall'eRNA e questo è facilmente comprensibile perché I'rRNA entra a far parte dei ribosomi e i ribosomi servono per il processo di trascrizione, per la sintesi delle proteine, e li troviamo sul reticolo endoplasmatico, sulla membrana nucleare e liberi nel citoplasma. Quindi avendo a disposizione questo elevato numero di ribosomi significa che rRNA ne dobbiamo avere tanto all'interno della cellula. Gli rRNA li distinguiamo e vengono divisi in base al coefficiente di sedimentazione, che è una sorta di modo per valutare quanto tempo impiega l'rRNA a posizionarsi sul fondo della provetta, quindi se abbiamo una soluzione che contiene tutti gli rRNA, quello più pesante andrà giù, poi ne abbiamo altro che avrà un peso intermedio e quindi si posizionerà in una posizione intermedia, mentre quello ancora più leggero si troverà vicino alla superficie della nostra provetta. Questa capacità di disporsi in diverse posizioni, la andiamo a indicare con l'unità di misura che chiamiamo coefficiente sedimentoso e che viene indicato con la lettera S. nelle cellule eucariote l'rRNA lo troviamo nelle dimensioni 5.85, 185 e 55. mentre quando guardiamo l'rRNA che troviamo nelle cellule procariote, e quindi nei batteri, i pesi molecolari e quindi le dimensioni sono leggermente più piccoli e abbiamo un rRNA 235, 55 e 165. CLASSI DI RNA DEI RIBOSOMI CITOPLASMATICI rRNA Fonte Subunità ribosomale Coefficiente di sedimentazione Nucleotidi Gellule procariatiche Maggiore (508) 238 2900 5S 120 Minore (30S) 168 1540 Cellule eucariotiche Maggiore (605) 25-288 < 4700 5,88 160 58 120 Minore (405) 188 1900 Questo tipo di RNA è quindi il più abbondante nelle nostre cellule e per mantenere questa abbondanza, nel nostro genoma sono presenti più copie dei geni che codificano gli rRNA, mentre normalmente per ogni gene abbiamo un'unica copia del nostro genoma, per gli rRNA i geni che li codificano sono presenti in molteplici copie nel nostro genoma. E se osserviamo il gene sulla molecola di RNA troviamo la sequenza che codifica per il 185, la sequenza che codifica per il 5,85 e poi una sequenza che codifica per il 285. questi geni sono separati tra di loro dalle regione che vengono indicate in figura in azzurrino e che si chiamano spaziatore trascritto, trascritto perché nel momento in cui viene avviato il processo di trascrizione dell'eRNA, questo compare sul trascritto primario, quindi la sequenza più scura che rappresenta il gene è separata dagli altri due geni, da queste sequenza chiare che prendono il | geni per gli rRNA eucariotici e la maturazione del trascritto rimario P Spaziatore non trascritto Unità di trascrizione ica Gruppo metile: "I ste ni i (a) Unità di trascrizione x CH; organizzate intandem ,‘ Spaziatore xi trascritto di trascrizione 0 Trascrizione da parte della RNA polimerasi | 0 Pesi 665 [O N RO HN Ng N (0) Psi n ll Maturazione S dell'RNA (taglio) ]egradazione degli o Ch spaziatori trascritti HN N ) (d) Molecole di rRNA Gue peo 55 Se HaN N N 188 5,85 288 J RNA RNA rRNA nome di spaziatore trascritto. Lo spaziatore trascritto che è appunto una sequenza che separa i geni, lo definiamo trascritto perché quando l'RNA polimerasi inizia a trascrivere ricopia questa sequenza anche sulla molecola di pre-RNA, quindi su quello che abbiamo chiamato trascritto primario, quindi spaziatore trascritto perché compare sulla molecola di trascritto primario. Quando deve avvenire la maturazione quello che avviene è proprio il taglio, l'allontanamento dei spaziatori trascritti, in maniera da avere esclusivamente l'rRNA 185, 5.85 e 235, mentre queste sequenze chiare sono state tutte allontanate e degradate. Ma come fanno le nostre cellule a garantire elevate quantità di rRNA all'interno della cellula? Può garantire perché nel nostro genoma queste unità di trascrizione sono ripetute più volte, quindi di questa successione 185, 5.85 e 285 ne troviamo più copie nel nostro genoma, queste unità di trascrizione sono separata a loro volta da delle regioni che chiamiamo spaziatore non trascritto, spaziatore perché serve a separare un'unità di trascrizione da un'altra e non trascritto perché non lo troviamo nella molecola di pre-rRNA e quindi nel nostro trascritto primario. È importante dire che il 185, 5.85 e il 285 fanno parte tutti di una stessa sequenza che viene trascritta contemporaneamente e questo blocco dove sono presenti i tre rRNA lo chiamiamo unità di trascrizione, tutto ciò avviene nel trascritto primario. Visto che la polimerasi I è quella che sintetizza questi tre tipi di RNA, mentre la polimerasi III è quella che catalizza la sintesi del rRNA di tipo 55, come facciamo a ottenere queste molecole a partire da polimerasi diverse, polimerasi diverse vanno a riconoscere promotori con delle caratteristiche diverse, quindi il 55 verrà trascritto dalla polimerasi III e va a riconoscere promotore diverso rispetto a quello che varrà riconosciuto dalla polimerasi I, quindi i promotori diversi riconosciuti da enzimi diversi per ottenere poi tipi di RNA diversi. La polimerasi ITI in particolare, oltre ad affidare la sintesi dell'RNA di tipo 55 è principalmente è deputato alla trascrizione degli tRNA, i tRNA sono deputati al trasporto degli amminoacidi ed anche alla sintesi proteica e questi amminoacidi vengono legati in alto, all'estremità 3, quando viene terminata la sintesi di questi RNA, quindi trascritto primario degli tRNA ha una lunghezza maggiore rispetto alla lunghezza del +tRNA tradizionale, cioè il tRNA che viene effettivamente utilizzato per trasportare gli amminoacidi, quindi quando questo trascritto primario deve essere maturato per ottenere la forma matura del tRNA quello che si deve verificare all'estremità 3' è una sostituzione di nucleotidi questo perché tutti gli RNA devono presentare all'estremità 3' la sequenza CCA, questa sequenza serve per legare l'amminoacido ed è la sequenza che viene proprio riconosciuta da particolari enzimi, che sono proprio quelli che legano gli amminoacidi al tRNA, questi particolari enzimi riconoscono proprio questa sequenza, gli enzimi di sintesi proteica (si vedrà successivamente) sono chiamato amminocil- tRNA sintetasi, cioè gli enzimi che sintetizzano il legame dell'amminoacido a tRNA e questo enzima fa proprio riconoscere questa sequenza CCA per capire che quella è la regione che si devono legare i legami dell'amminoacido, poi per capire quale amminoacido andare a legare utilizza un'altra regione del tRNA che è la regione che chiamiamo anticodone, questo anticodone è proprio deputato durante il processo di sintesi proteica a un riconoscimento dell'amminoacido che deve essere inserito ma durante il legame dell'amminoacido con i tRNA è la regione che viene scansionata per decidere l'amminoacido da inserire, quindi l'amminoacido da legare al 3' viene scelto andare a guardare la regione definita anticodone. Quindi l'anticodone viene letta per legare uno specifico amminoacido in alto all'estremità 3' e questa regione deve essere riconosciuta per effettuare il legame nella posizione corretta e per essere riconosciuta l'estremità 3° deve presentare la sequenza CCA. Il processo di maturazione di questo tRNA richiede: la rimozione della sequenza leader all'estremità 5', la sostituzione di due nucleotidi al 3' con la sequenza CCA (che serve da sito di attacco per gli amminoacidi in tutte le molecole di tRNA mature), la modificazione chimica di alcune basi e l'eliminazione di un introne. abbiamo detto che nel DNA sono trascritti i geni, quindi l'esone è la sequenza codificante del gene, mentre l'introne è la sequenza non codificante del gene. Questo processo che ci consente di allontanare gli introni, lo definiamo splicing che è il processo che ci consente di eliminare gli introni dal trascritto primario di mRNA e che prevede l'eliminazione delle regioni non codificanti che definiamo introni. Per poter effettuare il processo di splicing verrà richiesto l'aiuto, quindi l'intervento di specifiche proteine. Queste proteine complessivamente andranno a formare quello che viene chiamato spliceosoma, esso è un complesso multiproteico che ci consente di eliminare gli introni. Come fanno queste proteine che costituiscono lo spliceosoma a capire dove effettuare il taglio? Vengono praticamente riconosciute delle specifiche sequenze, la regola generale dice che tutti gli introni iniziano con la sequenza GU e terminano con la sequenza AG, quindi le proteine sono deputate al riconoscimento di queste specifiche sequenze. Quando vengono soddisfatte delle particolari caratteristiche, la sequenza —AG che troviamo più vicina all'estremità 3 la sequenza AG Esone 1 inrone LL Esone 2 dà = C — RS deve essere wu Roo preceduta da un adenina e questa adenina viene definita punto di ramificazione perché quando AG si trova alla giusta distanza Spliceosoma Degradazione da una adenina, rr queste Vea Gi Splicing: 5" GU 3’AG proteine, 5'AU 3'AC questa di color arancione, queste di colore azzurro, poi intervengono queste altre di colore viola, si assemblano tra di loro e vanno a formare questa la struttura che viene definita lariat, quindi riconosciute nelle specifiche sequenze posizionate con delle regole ben precise, tutte queste proteine che costituiscono lo spliceosoma si assemblano tra di loro, viene formata la struttura che viene chiamata lariat, dopodiché vengono fatti i tagli in corrispondenza della GU e i tagli in corrispondenza AG. Dopodiché, questa struttura lariat viene degradata e allontanata, mentre i due esoni vengono saldati sulla molecola di mRNA. Quindi lo spliceosoma è un complesso multiproteico che interviene durante il processo di splicing, lo spliceosoma deve operare in corrispondenza di specifiche sequenze e le sequenze standard che vengono riconosciute sono la sequenza GU in prossimità del 5' e la sequenza AG in prossimità del 3°. Queste sequenze vengono riconosciute da queste proteine che hanno il compito di formare una struttura a pacchi che definiamo lariat e che viene allontanata e degradata, mentre i due esoni vengono saldati tra di loro, ma l'mRNA può essere costituito da un numero molto maggiore di due, a seconda del gene che prendiamo in considerazione possiamo avere un numero estremamente variabile di esoni e ogni volta che l'mRNA deve essere maturato gli introni che separano gli esoni devono essere allontanati. Inoltre, così come esistono geni costituiti da più esoni esistono anche geni che sono costituiti da un unico esone, quindi in questo caso l'mRNA non devono subire il processo di splicing, però sicuramente saranno sottoposti all'aggiunta del cappuccio al 5' e l'aggiunta della coda poliA al 3°. L'ipotesi vuole che i diversi esoni che sono presenti sulla molecola di RNA vadano a costituire i diversi domini delle proteine, cioè I'mRNA che noi sintetizziamo a partire dal gene è costituito dall'unione dei diversi esoni, questo mRNA lo utilizziamo per sintetizzare proteine e si pensa che ogni esone vada a costituire un dominio preciso della proteina, quindi l'esone 1 coincide con il dominio 1, l'esone 2 con il dominio 2, ecc. I domini sono porzioni delle proteine che possono avere funzioni ben precise. Vedremo ad esempio quando parleremo di proteine che si trovano nella membrana e in particolar modo proteine, che diventano integrati, quindi vengono inserite nel doppio strato fosfolipidico, i domini possono essere proprio la forcella della proteina destinata a essere inserita nel doppio strato fosfolipidico o porzioni della proteina che possono essere fosforilate, quindi un dominio che assolve ad una funzione ben precisa e si pensa che i diversi domini derivino dai diversi esoni, inoltre gli mRNA quando sono presenti come RNA non ancora maturi possono subire delle modificazioni che portano ad ottener a partire dalla stessa molecola di mRNA, quindi dalla stessa molecola’ di preRNA, possiamo ottenere due RNA diversi. : ZARA] e Pre-mRNA Editing dell'RNA CURE RNA non sottoposto a editng RNA sottoposto a editing CAR RA E CERA SARO Traduzione Traduzione * Deamminazione della citosina In figura possiamo vedere un pre-mRNA in cui a un certo punto troviamo la sequenza CAA e poi la sequenza UAA , questa sequenza in particolare quando la troviamo su una molecola di mRNa nel processo di sintesi proteica, questa particolare sequenza presente sull'mRNa segnala la fine della sintesi proteica, quello che possiamo avere è che I'RNA non ancora matura e quindi il trascritto primario può subire definito editing, che ci permette di sostituire un nucleotide con un altro, dalla citosina possiamo passare all'Uracile e questo passaggio si ha mediante deaminazione della citosina convertendo cosi la citosina in uracile, ma quando questo RNA non sottoposto ad editing viene utilizzato nella traduzione, ci permette di ottenere una proteina di una determinata lunghezza, quando invece lo sottoponiamo ad editing la sintesi proteica termina prima e la proteina che otteniamo è più forte rispetto a quella di sinistra, questo è quello che si verifica per esempio durante l'ottenimento delle proteine che ritroviamo nelle lipoproteine a basse densità (LDL), le Apo-B sono componenti delle LDL. Di Apo-B ne possiamo avere una versione più grande che chiamiamo Apo-B100 e una porzione Apo-B più corta che si chiama Apo-B48. Quindi partendo dallo stesso RNA per ottenere due proteine diverse si ha il processo editing che consiste nel modificare un nucleotide. IL CODICE GENETICO Per leggere la sequenza di nucleotidi che ritroviamo nella molecola di DNA , che vengono poi ricopiati nella molecola di mRNA per inserire i 20 amminoacidi che ritroviamo nelle nostre proteine e se noi utilizzassimo un nucleotide e volessimo inserire un amminoacido nelle nostre proteine, potremmo inserirne soltanto 4 diversi tipi, cioè se fosse un nucleotide uguale ad un amminoacido potremmo avere soltanto 4 tipi di amminoacidi, se invece utilizzassimo una lettura di due nucleotidi alla volta, le possibilità di combinazione sarebbero 4 nucleotidi elevati alle seconda perché la lettura viene fatta due alla volta e quindi in questo caso avremo 16 possibili combinazioni che sono ancora meno dei venti amminoacidi che effettivamente ritroviamo nelle nostre proteine. Leggendo tre nucleotidi alla volta le possibili combinazioni sono 64 ottenute facendo 4 (nucleotidi) al cubo che ci da 64 e 64>20. Quindi non possiamo leggere una base alla volta perché avremo soltanto 4 amminoacidi e non ci basta, 2 alla volta non li possiamo leggere perché otteniamo 16 combinazioni e ancora queste non li possiamo leggere perché non sono sufficienti a soddisfare la necessità di 20 amminoacidi. Se leggiamo i nucleotidi 3 alla volta le possibili combinazioni che otteniamo sono 64 e con 64 abbiamo superato i 20 amminoacidi ma numeri intermedi non ce ne stanno quindi il nostro codice genetico è un codice a triplette, quindi le basi che noi troviamo nell'RNA e che vengono ricopiate nell'mRNA vengono lette a tre a tre, questo ci consente di dire che più triplette verranno utilizzate per indicare l'inserimento dello stesso amminoacido, cioè questo porta a definire il codice genetico come codice degenerato, degenerato significa che più triplette (a) Codice non sovrapposto AUGGGCUTE mRNA: AUGCGECUO ‘ Y Y , ‘ + Proteina selvatica: (M@ì Gy Ser Proteina mutata: Met AG Leu (©) Codice sovrapposto mRNA: A_U_G eg ee mRNA N-WEae-wryg = green Proteina 1 $ Y t vatica: Met -Trp)-(Giy)-(Giy)- (Ala) Leù)- Ser Mel - Cys - Ala - Arg -Giy-la)-Leò - Ger procarioti i ribosomi vengono assemblati l'analogo del 185 è rappresentato dal 165 e questo lo ritroviamo nella subunità minore, l'analogo del 285 è rappresentato dal 23 S, il 55 è presente in tutti e due i tipi cellulari, quello che manca è l'rRNA più corto rappresentato dal 5.85. quindi la struttura fondamentalmente simile, subunità maggiore e minore, ciascuna contenente uno specifico rRNA, queste due subunità maggiore e minore si associano solo quando il processo di sintesi proteica deve avvenire, quindi solo quando gli mRNA sono presenti. Nelle cellule procariote quando subunità maggiore e minore si associano tra di loro si vengono a formare delle cavità che prendono il nome di sito A, sito E e sito P, le lettere non sono a caso perché in ognuna di queste cavità deve essere disposto un tRNA, nel sito A viene inserito un +RNA che trasporta l'amminoacido, mentre nel sito P_il tRNA mantiene legato il polipeptide in I siti di legame del allungamento Î ioti 1 SitoP (peptidil (i ribosoma procariotico: serv» Polipepride è un polimero Sito A (amminoacile) “Subunità 50S Sito E (uscita). di , amminoacido) Sito A: tRNA trasporta l’a.a. Sto4/egame (SO quindi il Sito P: tRNA mantiene legato il polipeptide in polipeptide in allungamento i allungamento Sito E: (exit) serve per far uscire il Dr a proteina tRNA scarico (privo di a.a.) Sito P can formando, polipeptidica in allungamento questa proteina rimane legata Sito di legame ad un tRNA e dell'mRNA ina questo tRNA (b) mRNA i viene posizionato nel sito P, mentre il sito E è il sito per far uscire dal ribosoma il tRNA scarico, cioè quello che ha ceduto l'amminoacido, amminoacido che è stato inserito catena proteica che si sta formando, e quindi una volta che è scarico, cioè privo di amminoacido, deve essere allontanato. In basso alla figura possiamo vedere che quando l'mRNA viene legato al ribosoma, la proteina, che è il filamento di colore viola, rimane sempre posizionato nel sito P, perché nel sito P rimane un tRNA che mantiene il polipeptide in allungamento. Per la sintesi proteica ciò che noi abbiamo bisogno è innanzitutto di riconoscere sulla molecola di mRNA le triplette: la prima che dobbiamo riconoscere la tripletta si stacco cioè la tripletta AUG e per poter avviare la sintesi proteica, la tripletta deve essere posizionata esattamente nel sito P dove il tRNA inizialmente trasporta il primo amminoacido che è codificato dalla tripletta AUG e questa tripletta codifica per l'amminoacido che si chiama metionina, la seconda cavità rappresentata dal sito A deve essere riconosciuta da un secondo amminoacido. In figura possiamo vedere rappresentato I'mRNA e l'amminoacido che è trasportato da esso, per essere riconosciuto ha anch'esso una sorta di pettine (con i denti che rappresentano le basi azotate Le fasi del processo di traduzione sia nel caso ES É tRNA che trasporta il primo amminoacido// i MA99I01e A s.bunità sn 1, ribosomali @ INzio UAC —< Anticodon Minore E 5 3 Codon di inizio n 2) \ AÙG PESA vAG Codon di inizio Codon di stop Riciclaggio dei componenti della traduzione Fattore di rilascio Polipeptide completo & e è @ TERMINAZIONE Codon di stop dell'mRNA che sia nel caso dell'amminoacido). Se tRNA e MRNA si sono legati il legame si forma tra basi complementari, infatti così come la tripletta la chiamiamo codone, la regione del +RNA che è deputata al riconoscimento del codone la chiamiamo anticodone; e codone ed anticodone interagiscono tra di loro grazie alla formazione di legami a idrogeno tra basi complementari. In base all'anticodone riusciamo ad inserire l'amminoacido che viene codificato dal AUG. Quindi significa che i tRNA con il suo anticodone è in grado di legare la sequenza AUG e quindi deve trasportare l'amminoacido metilina, quindi l'anticodone viene utilizzato per inserire l'amminoacido corretto sulla molecola di tRNA, se il nostro codone è rappresentato dalla tripletta AUG, l'anticodone complementare dovrà avere la tripletta UAC; quindi, codone e anticodone si legano tra di loro tramite le basi complementari. Ma la AUG corrisponde all'amminoacido metilina, quindi significa che il nostro tRNA deve trasportare la metilina; e questo prima tRNA che trasporta la metilina viene posizionato nel sito che viene chiamato sito P; dopodiché la tripletta successiva va a cadere perfettamente nel sito A, si inserisce i tRNA che trasporta il secondo amminoacido e a questo punto si deve poter formare il legame tra gli amminoacidi, vale a dire il legame peptidico. Quindi una volta che abbiamo +RNA che trasporta l'amminoacido 1 (la metilina) e +RNA che trasporta l'amminoacido 2, questi due amminoacidi devono legarsi mediante il legame peptidico, quando questo avviene (quando si forma il legame peptidico) quello che succede è una sorta di scorrimento, quindi il nostro ribosoma scorre lungo l'mRNA e scorre di una tripletta, e in questo modo il tRNA che si trovava nel sito P ora si troverà nel sito E e quello che si trovava nel sito A ora si ritroverà nel sito P e il sito A sarà nuovamente libero. Con questo processo, che viene ripetuto più volte finché ritroviamo un codone di stop, viene formato il legame peptidico tra i diversi amminoacidi che sono codificati dal mRNA. Dal sito E viene allontanato un +RNA scarico (vale a dire privo di amminoacido, che l'ha ceduto) la proteina che si sta formando la troviamo sempre inserita al +RNA nel sito P, infatti la P sta per polipeptide, perché in esso da questo sito vediamo formarsi la nostra proteina, quindi ogni volta che formiamo il legame fra i due amminoacidi dal sito P la proteina passa all'amminoacido che si trova nel sito A, la proteina viene sempre trasferita all'ultimo amminoacido che viene inserito, questo perché successivamente facendo scorrere il ribosoma di tre nucleotidi, ciò che si trovava nel sito P lo ritroveremo nel sito E, ciò che si ritrovava nel sito A lo ritroveremo nel sito P e il sito A sarà nuovamente libero per poter inserire un nuovo +RNA. Ogni volta che inseriamo un nuovo amminoacido, la catena polipeptidica che si forma viene spostata dal sito P al sito A, quindi la nostra catena in allungamento viene sempre spostata all'ultimo amminoacido che è stato inserito, ma dopo che si è verificato ciò il ribosoma scorre di un'altra tripletta, per cui ciò che ora si trovava nel sito A scorrendo di una tripletta si troverà nel sito P e in questo modo il sito A sarà nuovamente libero e potrà essere inserito un nuovo tRNA che trasporta il nuovo amminoacido e facendo ciò il tRNA che si trovava nel sito P e che ha ceduto la catena proteica adesso non trasporta più niente e quindi ce lo ritroveremo nel sito E, il sito E è quindi il sito dove viene posizionato il +RNA scarico, cioè privo di amminoacidi, quindi questo processo viene ripetuto più volte fin quando nel sito A non viene posizionata una delle tre triplette di stop, queste triplette non sono riconosciute da nessun *RNA e quindi al posto del tRNA viene inserita una proteina che si chiama fattore di rilascio, il fattore di rilascio contiene una molecola d'acqua che permette di idrolizzare il legame che tiene unito il tRNA con la proteina, dopo l'idrolisi del polipeptide esso è pronto e quindi può essere ripiegato e poi indirizzato al compartimento cellulare la cui sua funzione è richiesta, mentre tutti gli altri componenti: I'mRNA, il ribosoma, così come il tRNA possono essere nuovamente utilizzati per far avvenire la sintesi di una nuova proteina. Quindi il MECCANISMO DI BASE DELLA TRADUZIONE DELLE PROTEINE: durante l'inizio, i componenti dell'apparato traduzionale formano un complesso insieme a una molecola di MRNA. Il TRNA che trasporta il primo amminoacido e si Lega al sito P si Lega al CODONE d'inizio a AUG. Durante l'allungamento, gli amminoacidi sono convogliati dai corrispondenti +RNA all'mRNA e vengono aggiunti uno a uno alla catena polipeptidica in crescita, formando così legami peptidici tra i diversi amminoacidi che vengono trasportati dal tRNA al sito A del ribosoma. E poi una fase definita di terminazione in cui nel sito A invece di posizionare un +RNA viene posizionato un fattore di rilascio e questo succede perché sulla molecola di mRNA i tre codoni di stop non sono in grado di essere riconosciuti da +RNA per cui quando questi codoni vengono posizionati nel sito A, anziché legare un +RNA legano una particolare proteina che viene detta fattore di rilascio, questa proteina consente di effettuare un idrolisi della catena proteica e che quindi viene rilasciata e indirizzata verso il suo destino. si trova nella subunità minore del ribosoma, quando questa sequenza forma questi legami a idrogeno il codone AUG si posiziona perfettamente nel sito P del ribosoma e quindi siamo certi di avviare la sintesi proteica a partire dal codone giusto. Questa sequenza però non è presente nel mRNA delle cellule eucariote. Negli eucarioti il corretto inizio della traduzione deve avvenire con meccanismo diverso. E in esso vengono in aiuto la presenza della 7- metilguanosina che è una delle modificazioni che viene fatta alla molecola di pre-RNA e quindi era la base che veniva aggiunta all'estremità 5' dell'mRNA, mentre all'estremità 3 veniva aggiunta la coda di poliA; sia il poliA e sia la 7-metilguanosina hanno un ruolo chiaro nel processo di traduzione. Un altro aspetto importante e che ci permette di definire il meccanismo con il quale viene avviata la sintesi proteica è il fatto che il primo RNA, quindi il tRNA che I tipi di tRNA per la metionina presenti in tutte le cellule trasporta la metionina, che viene definito { Ationin ] => Inizio TRA i £ iniziatore, Batteri 4 CHO viene modificato Tutte . I le cellule in quanto la + ===> {ove }-{RRAEST] => Allungamento metionina che viene H | Gruppo formile i NH o Struttura della N- CHy8_CHy OH 0-60" formilmetionina (fMET) H trasportata viene addizionata di un gruppo formile, quindi questa metionina viene chiamata formilmetionina e questo gruppo formile viene aggiunto all'estremità N terminale perché il gruppo amminico viene formilato e quindi non è libero, non può formare legame peptidico, ed ecco perché la sintesi proteica andrà dall'estremità N terminale verso l'estremità C terminale, quindi il primo amminoacido impegna il gruppo carbossilico perché il gruppo amminico è impegnato quindi non può essere utilizzato per la formazione del legame peptidico. Inoltre, durante tutto il processo di traduzione in aiuto del ribosoma vengono utilizzate una serie di proteine che prendono il nome di fattori di traduzione. Fattori traduzionali Procarioti Eucarioti Inizio. |F-1,1F-2, 1F-3 elF-1, elF-1A, elF-2, elF-2B, elF-3, elF-4A, elF-4B, elF-4E, elF-4G, elF-5 Allungamento | EF-Tu, EF-Ts, EF-G || eEF-10, eEF-1By, eEF-2 Terminazione |RF-1, RF-2, RF-3 || eRF-1, eRF-3 Essi vengono indicati con IF dove i sta per inizio ed F sta per fattore, sono quelle proteine che intervengono nella prima fase, cioè nel momento in cui bisogna assemblare la subunità minore del ribosoma, il mRNA, il tRNAi e poi richiamare la subunità maggiore. Quindi per poter avviare il processo di traduzione intervengono queste proteine che chiamiamo fattori di inizio. Durante invece il processo di allungamento vengono utilizzate delle proteine che vengono dette fattori di allungamento che vengono indicati con la lettera EF perché la E sta per “elonghescion" e la F per "factor". Nella fase finale invece vengono utilizzati i fattori di rilascio indicati come RF, la R sta per “rilising. E se mettiamo a confronto quelli che intervengono nei due tipi di cellule possiamo notare che ne abbiamo un numero maggiore nelle cellule eucariote. Processo di traduzione nelle cellule eucariote La differenza che vediamo elencando i diversi fattori è la "e" che precede ogni fattore, la "e" sta per eucarioti. Anche nelle cellule eucariote il processo di traduzione consiste in una fase di inizio, una fase di allungamento e una fase di terminazione, in ciascuna di queste fasi intervengono i diversi fattori. La fase più importante è quella di inizio perché è la fase in cui deve avvenire il riconoscimento della sequenza AUG, cioè il primo codone, con cui iniziare la sintesi proteica. E tutte queste proteine, tutti questi fattori, vengono assemblati con una sequenza ben precisa e ciascuno di questi fattori svolge un ruolo ben definito durante il processo di traduzione. Per prima cosa quello che deve avvenire è la formazione del complesso che viene detto 435, 435 che è la dimensione, il peso molecolare che si ottiene facendo la somma tra la subunità 405, che è la subunità minore del ribosoma, più le diverse proteine, i fattori di inizio degli eucarioti. Quando si è avuto questo complesso tra subunità 405 e fattori di inizio, solo in quel momento viene legato I'mRNA che deve essere sottoposto a scansione e la scansione ci permetterà di riconoscere la tripletta AUG, vale a dire la tripletta con cui iniziare la sintesi proteica. Una volta che questa sequenza è stata riconosciuta ed è stata posizionata nel sito P, solo in quel momento verrà assemblata la subunità maggiore del ribosoma che è la subunità 605. Tra tutti i diversi fattori che intervengono durante questa fase iniziale quelli che hanno un ruolo fondamentale sono: il fattore 2, il fattore 1, il fattore e ed il fattore S, perché sono quelli che hanno un ruolo chiave durante tutto il processo. Il fattore 2 è quello responsabile del legame con il tRNA iniziatore. Il fattore E è quello deputato al riconoscimento del cappuccio in 5', quindi della 7-metilguanosina, il complesso 4F è formato da 3 proteine ed è costituito da 4E, 4A e dal 4G ed insieme al fattore 1 è quello che passano a scansione l'mRNA per garantire il riconoscimento del codone d'inizio, quindi hanno un ruolo importante perché grazie a questi fattori il +RNA viene posizionato in maniera corretta. Nell'immagine abbiamo la successione degli eventi che si susseguono quando la sintesi proteica deve essere avviata. Per prima cosa bisogna formare un legame fra eIF2 e il +RNA iniziatore, Fase di inizio negli eucarioti elB3 elF2 1 e ETÒ) 2 elF2 ternary complex formation _ ; na GT) ha 3 435 complex Ins tRNA/ | formation lla PABP: polyA binding protein À VAATAAYAA quindi quello che trasporta la metionina, dopodiché questo fattore eIF2 viene legato con la subunità minore del ribosoma che è la subunità 405 insieme al complesso terziario, che è formato dalla proteina eIF4E, eIF4G ed eIF4A, successivamente si forma il legame tra il fattore di inizio 4E e la 7-metilguanosina, in più la proteina più grande (la erF4G) è deputata all'interazione con un'altra sequenza che è la sequenza di poliA, la sequenza di poliA viene a sua volta riconosciuta da una proteina che si chiama poliA binding protein (PABP), cioè la proteina che lega la sequenza di poliA, quindi quando la PABP ha legato il poliA, questa proteina a sua volta va ad interagire con il fattore di inizio 4G, quello che abbiamo ottenuto in questo momento è un mRNA attivato, esso viene reclutato sulla subunità minore del ribosoma arrivando così alla formazione del complesso che viene chiamato 435 più il legame dell'mRNA e in questo momento il fattore eIF2, che era quello che aveva legato la metionina, porta il +RNA che viene posizionato nel sito P, perché il sito E ed il sito A vengono occupati da altri fattori di inizio. Il tRNA che trasporta la metionina non ha un legame forte perché non ha trovato la sintetizzate in diversi compartimenti cellulare: o nel reticolo endoplasmatico o liberi nel Subunità ribosomale $ citoplasma per ci essere poi indirizzate ai DT Polonia diversi stone mag inzio te cin nani SOT compartimenti cellulari. Polipeptide completo nei cllosol O viene importato in un organello Attraverso i pori nucleari, (il cloroplasto S9 è presente nella foto ma Perossisoma ” non studiamo la cellula vegetale nel nostro corso) Vescicola di secrezione Membrana plasrnatica Lisosoma Mitocondrio Ciotoplasto Proteine recettoriali Innanzitutto, parlando di proteine stiamo parlando di una classe ben precisa di macromolecole, cioè macromolecole fatte da aminoacidi. Le proteine recettoriali possiamo semplicemente definirle recettori ed essi sono delle proteine deputate a ricevere un segnale e ad innescare poi nella cellula una specifica risposta. Avendo un organismo pluricellulare, come l'uomo, e immaginando tutti i diversi compartimenti del corpo, tutti i compartimenti vengono a contatto con il sangue e il sangue trasporta una moltitudine di molecole e tutte queste molecole che vengono trasportate dal sangue vanno a contatto con le cellule e queste molecole sono grado di produrre un effetto sulla cellula solo in un caso, ci deve essere una condizione necessaria, cioè la presenza di una proteina che è in grado di legare questa molecola. Quindi sono presenti una moltitudine di molecole ma solo le molecole che sono in grado di interagire con una proteina, che chiamiamo recettore, potranno innescare una specifica risposta nella nostra cellula. Quindi le cellule ricevono messaggi dall'esterno che sono portati da molecole di diversa natura, possono essere dei gas, dei carboidrati, acidi grassi e anche delle proteine stesse, quindi molecole di diversa natura che vengono definite primi messaggeri, perché sono esse che portano il messaggio alla cellula. La cellula poi dovrà rispondere a questi messaggi attivando una specifica risposta. Il primo messaggero può portare alla risposta entrando all'interno della cellula e in questo caso deve oltrepassare la membrana e per fare ciò i primi messaggeri devono essere delle molecole con le stesse caratteristiche che abbiamo definito quando abbiamo parlato di trasporto attraverso la membrana, quindi solo molecole piccole e prive di cariche saranno in grado di attraversare il doppio strato fosfolipidico ed entrare di conseguenza nella cellula per innescare poi la risposta. Oppure questi primi messaggeri nel caso hanno dimensioni più ingombranti, sono carichi, sono molecole polari, non possono attraversare il doppio strato fosfolipidico e in questo caso il recettore si deve trovare sulla membrana plasmatica e il nostro primo messaggero andrà a interagire con il recettore che prende il nome di recettore di membrana. Quindi i primi messaggeri sono molecole di diversa natura che sono in grado di innescare una risposta all'interno della nostra cellula, i primi messaggeri possono essere molecole che innescano la risposta interagendo con un recettore presente all'interno della cellula ed in questo caso il primo messaggero deve attraversare lo strato fosfolipidico per arrivare all'interno della cellula oppure possono essere delle molecole che proprio perché hanno delle dimensioni maggiori o perché sono con caratteristiche chimiche poco affini al doppio strato fosfolipidico, questi primi messaggeri rimangono al di fuori della cellula e quindi andranno a interagire con dei recettori che sono presenti sulla membrana e che quindi chiamiamo recettori di membrana. In entrambi casi, però, questi primi messaggeri per essere definiti tali dovranno interagire con un recettore. Il recettore è una proteina. Il primo messaggero, che possiamo anche definire ligando, dovrà interagire con un meccanismo estremamente specifico, significa che se prendiamo in considerazione i recettori che abbiamo sulla membrana plasmatica, quindi sulla cellula, la cellula viene a contatto con una moltitudine di segnali, ovviamente non sarà in grado di rispondere a tutti, ma risponderà solo a quei primi messaggeri che trovano sulla membrana plasmatica il proprio recettore, questo significa che ci deve essere un interazione altamente specifica tra ligando e recettore, e solo quando si instaura questa interazione altamente specifica siamo in grado di avere poi la risposta da parte della nostra cellula. Quindi è presente una moltitudine di segnali extracellulari, devono interpretarli ed elaborare la risposta e questa elaborazione della risposta dipende dalla struttura del recettore perché ovviamente a seconda di come questo recettore è strutturato sarà in grado di interagire con il ligando e una volta che questa interazione è avvenuta si innesca una cascata di eventi che complessivamente chiamiamo trasduzione del segnale. La trasduzione del segnale comprende tutti gli eventi che si verificano all'interno della cellula dopo che il ligando ha interagito con il proprio recettore. Possiamo avere molteplici meccanismi di trasduzione del segnale perché dipende dal tipo di recettore che prendiamo in considerazione e dal tipo di legando che prendiamo in considerazione, un ligando che promuove un determinato metabolismo cellulare, un ligando che promuove la divisione cellulare, un ligando che promuove la morte cellulare; quindi, a seconda del tipo di ligando e del tipo di interazione con lo specifico recettore la trasduzione del segnale può essere altamente variabile. In ogni caso quello che dobbiamo capire è che la trasduzione del segnale prevede una sorta di passaparola in cui questo primo messaggero subito dopo l'interazione con il recettore non fa altro che passare con un passaparola questo primo messaggio a quello che è poi l'effettore finale, cioè noi vogliamo una precisa risposta da parte della nostra cellula, ad esempio vogliamo che la cellula si divida, quindi l'effetto finale alla fine dovrà essere la divisione cellulare, però dal momento in cui il ligando interagisce con il recettore al momento in cui effettivamente si va a dividere si passa attraverso delle fasi, quindi tutti questi passaggi intermedi che si verificano tra interazione ligando-recettore e poi l'effettiva divisione cellulare, tutti quei passaggi rappresentano la trasduzione del segnale e durante questi passaggi si instaura un passaparola tra le proteine in cui il messaggio portato dal primo messaggero viene passato da una proteina all'altra. Quando il ligando deve interagire con un recettore, immaginiamo che all'interno di un recettore esiste come nel caso degli enzimi un sito in cui si deve inserire il ligando, quindi l'interazione tra ligando e recettore è un po' simile all'interazione che abbiamo visto nel caso degli enzimi, gli enzimi hanno un sito attivo che ha una conformazione ben precisa ed in questo sito attivo possiamo inserire solo quel determinato substrato perché i due hanno una conformazione complementare, anche nel caso dei recettori esiste un'elevata specificità tra ligando e recettore, cioè il nostro recettore ha una forma ben precisa e questo recettore potrà andare a interagire con il ligando, quindi la specificità è la capacità che il recettore ha di discriminare fra la moltitudine di molecole con cui esso viene a contatto quella che poi è effettivamente in grado di portare la risposta. Quindi una delle caratteristiche fondamentali che definisce l'interazione tra ligando e recettore è la specificità, cioè tra tanti ligandi il recettore è in grado di sceglierne solo uno perché con esso è in grado di formare una interazione altamente specifica. Quindi esiste un sito che è il sito di legame del primo messaggero che ce lo possiamo immaginare proprio con una conformazione complementare al nostro ligando ed ecco perché il nostro recettore riesce a scegliere esattamente di legare quel ligando e non altri perché esiste una specificità di interazione, quindi grazie alla specificità riesce a distinguere tra la moltitudine di molecole con cui il recettore viene a contatto. L'altra caratteristica che definisce l'interazione ligando e recettore è l'affinità, l'affinità ci dice che evidentemente uno stesso recettore per quanto possa essere altamente specifico riesce ad interagire eventualmente con più molecole, però se questo recettore mettiamo il caso può interagire con la molecola A, la molecola B e la molecola C, sceglie la molecola la cui concentrazione è molto alta, quindi quando la sua concentrazione è molto alta lega il nostro recettore e porta poi alla risposta, però vi sono anche molecole che nonostante abbiano una concentrazione estremamente bassa sono in grado di portare alla risposta perché hanno un'elevata affinità, quindi possiamo dire che l'affinità è inversamente proporzionale alla concentrazione, basta che ce n'è poca di quella molecola con un'affinità estremamente alta che riesce a prendere il posto della molecola che è più abbondante. Affinità alta significa portare alla risposta anche quando la sua concentrazione è bassa. Quindi possiamo scegliere di legare quel ligando perché nonostante abbia bassa concentrazione ha un'elevata affinità per il recettore e quindi il recettore sceglie quella molecola anche se la sua concentrazione è più bassa, perché sono estremamente affini, evidentemente i legami che si formano tra recettori e ligando sono dei legami più stabili rispetto ai legami che si formano tra il recettore e il ligando che ha un'affinità più bassa. Quindi l'affinità è quella sorta di interazione che si instaura tra ligando e recettore e una molecola risulta essere estremamente affine quando porta ad una risposta nonostante la sua concentrazione è bassa. I diversi tipi di recettori Nonostante i meccanismi di trasduzione del segnale sono infiniti, li possiamo raggruppare in quattro grosse categorie e li raggruppiamo in base al tipo di recettore. Innanzitutto, la prima distinzione che facciamo è tra recettori di superficie e recettori intracellulari, li distinguiamo in queste categorie perché il ligando può attraversare la membrana oppure rimane fuori dalla cellula perché non attraversa la membrana, quindi se il ligando rimane fuori significa che il recettore deve trovarsi sulla membrana plasmatica e quindi in quel caso parleremo di funzione inibitroia, quindi dipende dal momento in cui ci troviamo nella cellula, a stabilire se la proteina deve essere attivata o inibita. Nell'immagine le due strisce grigie rappresentano la membrana plasmatica e su di essa possiamo trovare un canale che normalmente è chiuso e le sferette azzurre che sono i nostri ioni si trovano al di fuori della membrana ed essendo che il canale normalmente è chiuso lo ione non riesce passare questo canale, arrivano dei particolari segnali ed in questo caso abbiamo il nostro ligando che è rappresentato dalla sferetta di colore rosso e solo quando il ligando va a legare il recettore esso si apre e gli ioni riescono a passare attraverso il legame. La seconda categoria è rappresentata dai recettori accoppiati a proteine G. in questo caso il recettore è la struttura in verde e normalmente questo recettore quando il ligando non è presente si trova in prossimità di una proteina che chiamiamo proteina G e nell'immagine possiamo notare che la proteina G è staccata dal recettore ed ecco perché non si avvia la trasduzione del segnale. Per avviare la trasduzione del segnale ci sarà bisogno del nostro ligando che interagisce con il recettore e dopo l'interazione la proteina G si associa con il nostro recettore e da questo momento in poi si attiva la trasduzione del segnale che abbiamo detto che è proprio come un passaparola, quindi significa che la proteina G dovrà passare il messaggio a un bersaglio che è l'enzima che si trova sulla membrana e da qua in poi tutta una serie di eventi fino ad arrivare all'evento finale. Recettori accoppiati alla tirosina chinasi che sono recettori che normalmente sono costituiti da due unità separate, queste due unità sono separate fin tanto che manca il ligando, quando arriva il ligando i due recettori (in questo caso sono due dimeri che poi formano un'unità attiva) sono in grado di interagire con un enzima rappresentato dalla tirosina chinasi, solo che questa tirosina chinasi inizialmente si trova in una forma inattiva, quindi non funziona, perché manca il ligando, c'è bisogno di (0) signal molecule , , activated tyrosine kinase signal molecule in form of a dimer inactive catalytic active catalytic domain domain quest'ultimo che lega il recettore per poter attivare poi questo enzima. E poi l'ultima categoria rappresentati da recettori che posseggono essi stessi un'attività enzimatica e in queste strutture con le punte di colore rosso che indicano il fatto che questa parte del nostro recettore dopo che il ligando è arrivo ed ha legato il recettore, questa porzione del recettore diventa attiva e a attiva significa che è in grado di innescare una risposta a catena, quindi mentre in C il recettore non possiede attività enzimatica, l'attività enzimatica la possiede questa chinasi che si associa con il recettore, in D l'attività enzimatica è posseduta dal | recettori associati alle proteine G (proteina che lega un nucleotide Guanina) FLUIDO Sito di legame GPCR EXTRACELLULARE NH del messaggero n | Membraf plasmatica CITOSOL Dominio che interagisce con le proteine G 700C recettore stesso e quindi è questo recettore che è in grado di trasferire l'informazione alle molecole successive. La prima classe di recettori sono i recettori associati alle proteine G, essi condividono tutti la stessa struttura, sono cioè delle proteine che attraversano la membrana cellulare e la attraversano 7 volte, questo è il motivo per cui le definiamo proteine “epta passo" quindi attraversano la membrana plasmatica 7 volte, quindi sono delle proteine e quando le proteine attraversano la membrana, le abbiamo definite proteine integrali, quindi i dissociano dalle subunità catalitiche e quest'ultime possono catalizzare una specifica reazione, vale a dire la reazione di fosforilazione. in questa immagine possiamo osservare subunità COME è fatta la PKA: le due subunità cataliiche Megolatorie Reg che contengono la porzione centrale che è il sito di legame per cAMP e poi le due subunità cataliche. Quando le cAMP, rappresentate come Subunità regolatoria odaisia pentagono perché stiamo parlando di un © D nucleotide quindi uno zucchero, quando Nolessia questo nucleotide va a legare le subunità di cAMP regolatorie si ha la dissociazione delle due regolatorie dalle subunità cataliche e queste subunità catalitiche si spostano dal citoplasma all'interno del nucleo. Il loro target è una proteina quindi se sono delle chinasi e le chinasi fosforilano serina e treonina e se li deve fosforilare significa che ha come bersaglio una proteina, perché serina e treonina sono degli amminoacidi e gli amminoacidi li troviamo nelle proteine. Quindi la PKA dovrà fosforilare una proteina che si trova all'interno del nucleo e questa proteina è quella indicata con il nome ci CREB. CREB è una proteina che si comporta da fattore di trascrizione. I fattori di trascrizione sono delle proteine che aiutavano l'RNA polimerasi ad avviare il processo di trascrizione. CREB è un fattore di trascrizione però non appartiene alla categoria dei fattori di trascrizioni basali, è un fattore di trascrizione regolato, viene definito così perché non funziona sempre, affinché esso possa funzionare c'è bisogno di un particolare segnale, quindi c'è bisogno del primo messaggero che arriva al recettore che attiva la via di trasduzione del segnale fino ad arrivare poi alla sua attivazione grazie alla PKA. L'evento ultimo della trasduzione del segnale è quello di regolare la trascrizione genica. Dopo tutte queste reazioni stiamo consentendo ad uno specifico gene di essere trascritto ma se facciamo l'mRNA andremo a produrre proteine, quindi questo segnale che è arrivato alla cellula, alla fine cambia l'assetto proteico della nostra cellula, perché le proteine fanno tutto il lavoro all'interno della cellula, quindi se vogliamo che la cellula risponda a questo segnale, per rispondere ha bisogno di cambiare le proteine che sono presenti all'interno della cellula, se vogliamo che metabolizzi più glucosio per formare energia ovviamente avremo bisogno di un aumento di tutti gli enzimi che fanno parte della glicolisi e per fare gli enzimi avremo bisogno del mRNA, quindi qualunque segnali arrivi sulla superficie della cellula, alla fine porta come risposta un cambiamento dell'assetto proteico che può essere cambiato perché stiamo variando la quantità di mRNA che ci consente di fare quella determinata proteina. Quindi CREB è un fattore di trascrizione e una proteina che va a legare il promotore, quindi la PKA in questo caso ha il compito di fosforilare CREB che è un fattore di trascrizione e solo quando è fosforilato diventa attivo e quindi può aumentare la trascrizione dei geni target. CREB non si trova su tutti i promotori perché i fattori di trascrizione devono riconoscere delle specifiche sequenze e solo se è presente quella sequenza CREB sarà in grado di legare. Legame tra recettore e ligando Associazione tra recettore e proteina G Attivazione della proteina G (scambio GDP-GTP) Dissociazione tra subunità alfa-GTP e beta-gamma subunità alfa-GTP attiva l’adenilato ciclasi (ATP----cAMP) cAMP (secondo messaggero) Attiva la PKA Subunità catalitiche della PKA fosforilano CREB pCREB attiva la trascrizione di geni target OIOSURONA Nonostante il nostro genoma sia identico in tutte le nostre cellule, le nostre cellule riescono a svolgere funzioni diverse. La funzione svolta da un neurone è diversa dalla funzione svolta da una cellula muscolare ed è diversa la funzione svolta da un epatocita, da una cellula del fegato. Quindi come riusciamo ad ottenere delle funzioni così diverse da cellule che hanno lo stesso DNA? La funzione diversa è dovuta al fatto che i geni possono essere regolati, quindi le nostre cellule riescono a far funzionare alcuni geni in alcuni cellule e quegli stessi geni possono non funzionare in altre cellule. Il geni sono una sequenza di DNA che poi deve essere utilizzata per sintetizzare l'RNA. Quindi i geni devono essere trascritti. E in tutte le cellule del nostro corpo per avere questo fenomeno, questo evento di trascrizione, ci servono i fattori trascrizionali. Grazie alla PKA che è in grado di attivare il CREB possiamo regolare la trascrizione di alcuni geni ben specifici. Quali geni? solo quelli che contengono nel loro promotore una sequenza che deve essere in grado di fare cosa? Quando abbiamo parlato di, ad esempio la sequenza TATA nel promotore, questa sequenza la chiamavamo in questo modo perché era una successione di timina adenina timina adenina e questa sequenza era in grado di legare la proteina che si chiamava Tata Banding Protein TBP. E la TBP entrava a far parte del fattore trascrizionale basale che abbiamo chiamato TF2D. Quindi significa che questi fattori trascrizionali devono poter interagire con delle sequenze ben precise sul promotore, quindi CREB, fattore trascrizionale, non si va a legare su tutti i promotori di tutti i geni, ma solo su alcune categorie. Ecco perché possiamo differenziare una cellula dall'altra, perché se la nostra cellula epatica, quindi il nostro epatocita, risponde ad un recettore accoppiato a proteina G che poi porta l'attivazione di CREB, esso si andrà a legare sui geni target e porterà alla trascrizione di specifici geni. Se quello stesso recettore manca sul nostro neurone, succede che non potendo attivare quel recettore, non riusciamo ad attivare CREB e quindi non riusciamo ad attivare il gene target, il gene bersaglio, quindi differenziamo le nostre cellule, perché esse non sono in grado di rispondere agli stessi stimoli, perché su di esse mancano alcuni recettori, quindi tutti i segnali mediati dai recettori ci permettono proprio di cambiare il contenuto di RNA nelle nostre cellule perché alla fine di tutto il meccanismo, di tutta la segnalazione, quella che abbiamo chiamato trasduzione del segnale, quindi alla fine in tutti questi eventi, Abbiamo un fattore trascrizionale, che viene regolato e Media la trascrizione, quindi tutti questi eventi che mettiamo in sequenza e che sono diversi, secondo il tipo di recettore, portano alla fine a una stessa risposta: la regolazione della trascrizione. Quindi, indipendentemente dal recettore che prendiamo in considerazione l'evento ultimo è sempre lo stesso: cambiare la trascrizione nelle nostre cellule ma cambiare la trascrizione che cosa significa? Poiché I'mRNA ci serve per fare proteine, a risposta finale è un cambiamento dell'assetto proteico nelle nostre cellule e alla fine tutto il lavoro nelle cellule lo fanno le proteine, che siano enzimi o che siano proteine che svolgono altre funzioni, proteine strutturali, proteine che fungono da trasportatori, tutto il lavoro nelle nostre cellule svolto dalle proteine. Quindi, se vogliamo cambiare la funzione svolta da ogni singola cellula nel loro interno, dobbiamo cambiare il tipo di proteine che sono presenti. Ma per fare una proteina che ci serve I'mRNA e quindi per cambiare l'assetto proteico delle nostre cellule dobbiamo intervenire proprio con questi fattori trascrizionali, fattori trascrizionali che chiamiamo regolati. Perché regolati? Perché sono quelli che rispondono alla necessità del momento, quindi in relazione alla necessità della cellula riusciamo a regolare la trascrizione di specifici geni e per farlo abbiamo bisogno proprio di queste proteine che chiamiamo fattori trascrizionali. Fatta questa premessa, come va funzionare CREB in tutto questo processo? CREB, la sigla sta per CRE binding protein, cioè la proteina che lega la sequenza CRE. CRE che significa elemento di risposta alla AMP ciclico, perché il CREB viene attivato proprio in risposta all'attivazione della proteina G che attiva l'adenilato ciclasi e che produce poi AMP ciclico. Quindi per arrivare all'attivazione di CREB abbiamo avuto bisogno di un aumento nella nostra cellula della AMP ciclico. Ed ecco perché alla fine CREB funziona in relazione alla quantità di AMP ciclico che abbiamo nelle nostre cellule e CREB riconosce questa sequenza che è una sequenza con precise un preciso ordine di basi. E solo se quella sequenza è presente nel promotore, CREB sarà in grado di legarsi. Se quella sequenza non c'è, CREB non lega e quindi non riesce ad aumentare la trascrizione del gene. Quindi CREB è la proteina che viene attivata in risposta al ANP ciclico e che Lega una precisa sequenza sui promotori di alcuni geni. Queste sequenze le chiamiamo sequenze CRE. Dove E sta per elemento, R sta per risposta e ci sta per cAMP, quindi l'elemento di risposta al cAMP. La sequenza CRE è: TGACGTCA e solo se è presente questa sequenza il CREB è in grado di legarsi. endoplasmatico liscio troviamo dei canali che chiamiamo canali del calcio, cioè consentono il passaggio del calcio, normalmente questi canali li troviamo chiusi, in questo modo il calcio viene mantenuto all'interno del REL. Quando la via di segnalazione mediata da dalla PLC viene attivata e i livelli di IP3 nella cellula aumentano, questi canali del calcio legano il recettore e quindi legano per IP3, dopo che hanno fatto questo legame, i canali del calcio si aprono e il calcio fuori esce dal reticolo. Tutte queste reazioni questi eventi avvengono nella cellula in termini di millisecondi, cioè sono risposte estremamente rapide. E una volta che la concentrazione di calcio è aumentata, può essere riportata nuovamente a concentrazioni basse, che significa che il calcio dovrà essere nuovamente trasportato all'interno del reticolo endoplasmatico e il canale si deve chiudere per mantenere il calcio all'interno del REI, quindi nell'ordine ovviamente di millisecondi, una volta che IP3 è stato formato lega questi canali, li apre e fa aumentare il calcio. Il calcio ha una via di segnalazione, quindi continua la trasduzione del segnale, e la continua perché ancora non l'abbiamo visto nessuna regolazione della trascrizione, quindi ancora non siamo arrivati all' attivazione di alcun fattore trascrizionale. Il calcio, quindi, dovrà continuare a segnalare. Quindi il ruolo del IP3 è quello di fare uscire, quindi rilasciare il calcio dai depositi intracellulari ed essi sono rappresentati del reticolo endoplasmatico liscio. La fosfolipasi C va a metabolizzare IP2 sulla membrana e porta alla produzione di IP3. L'IP3 va a legare i canali del calcio che sono presenti sul reticolo e il calcio fuori esce da RE. Effettuato questo meccanismo, quindi, fatta aumentare la concentrazione di calcio all'interno della cellula, il calcio continuerà a trasmettere il messaggio e il suo bersaglio, il suo target è una proteina che si chiama calmodulina. La calmodulina è una proteina che presenta quattro siti di legame per il calcio. Questo in realtà è Struttura e funzione del complesso calcio- il secondo Messaggero, perché è calmodulina quello la cui concentrazione aumenta molto velocemente nella cellula. Il calcio è effettivamente un secondo Messaggero. E il bersaglio del calcio è la proteina che si chiama Calmodulina. La calmodulina presenta quattro siti ( sruisa Ce-camouina Funzione del complesso Ce"-camoguin di legame per il calcio e sono queste sferette che si vedono in figura in basso e che cosa succede alla calmodulina dopo che ha legato il calcio? Avviene il cambio della sua conformazione, la sua struttura tridimensionale, la sua struttura terziaria. E dopo che ha cambiato conformazione, è in grado di legare una proteina bersaglio, quindi stiamo continuando a passare il nostro messaggio, quindi stiamo continuando il nostro passaparola. Il calcio ha passato il messaggio alla Calmodulina che quest'ultima dovrà passare il messaggio ad un'altra proteina. E la proteina che viene attivata viene passata alla CAM Chinasi cioè la chinasi calmodulina dipendente. Questi sono tutti gli eventi che si verificano in sequenza nella Bersaglio della calmodulina trascrizione del segnale. Una volta che la calmodulina ha legato il calcio, il messaggio viene passato a questa proteina che si Cam Kinase........ Fosforila bersaglio (CREB) 1. Legame recettore/ligando Chiama CAM 2. Attivazione della proteina Gaq Chinasi, —Chinasi 3. Attivazione della PLC Calmodulina 4. Produzione di IP3 e DAG dipendente. Quindi 5. IP3legail canale del calico sul REL è una chinasi che 6. Aumento del Ca++ nel citoplasma normalmente nella 7. Legame Ca++ calmodulina cellula troviamo in 8. Legame delle calmodulina alla Cam chinasi una forma inattiva, 9. Cam Chinasi fosforila CREB quando non è legata 10. CREB regola la trascrizione di geni target alla calmodulina. La sua attivazione richiede il legame con la calmodulina. E che cosa farà questa CAM chinasi? Essendo una chinasi adesso dovrà andare ad attivare mediante fosforilazione, una proteina a bersaglio e anche in questo caso la CAM chinasi tra i suoi bersagli va a fosforilare la proteina CREB. Tra i possibili meccanismi che si verificano nella cellula dopo l'attivazione della fosfolipasi C, ancora una volta abbiamo l'attivazione della proteina CREB. CREB fosforilata lega le sequenze CRE e media la trascrizione dei geni bersaglio, quindi nuovamente, anche in questo caso abbiamo finito la nostra segnalazione con un cambiamento della trascrizione. Cambiare però la quantità di RNA Messaggero significa cambiare alla fine la quantità di proteine di una specifica proteina nella nostra cellula. In relazione alla produzione di PKA o di Calcio, le risposte che si possono avere nella cellula sono molteplici, sono diverse, tra i meccanismi standard, tra i meccanismi canonici, ricordiamo proprio l'attivazione della proteina CREB. In questo elenco però abbiamo visto quello che succede in risposta al IP3, ci rimane l'altra molecola segnale che è rappresentata dal DAG. Cosa fa il DAG nella cellula? Il DAG si comporta da ligando e quindi da attivatore di un'altra chinasi. Questa chinasi la chiamiamo proteina chinasi C e le indichiamo con la sigla IKC. Il DAG è la porzione che viene prodotta ma che viene trattenuta, rimane legata alla membrana plasmatica, quando poco fa abbiamo visto il PIP2 che era un fosfolipide di membrana, quindi è inserito integrato nella membrana plasmatica. Quando la fosfolipasi C lo degrada, produce IP3 che è la porzione che viene liberata nel CITOPLASMA ed ecco perché riesce a raggiungere il reticolo endoplasmatico. Il DAG, invece, rimane integrato, rimane inserito all'interno della membrana plasmatica e sulla membrana plasmatica va a interagire con una la PKC, con la proteina chinasi C. Di PKC all'interno della cellula ne esistono diversi tipi e ognuno di questi tipi potrà mediare l'attivazione di specifici fattori trascrizionali. Di PKC ne esistono diverse categorie, Questi cappucci ne esistono diverse categorie e ognuna di queste PKC potrà mediare specifiche vie di traduzione del segnale però, in tutti i casi che vi è un passaggio all'interno del nucleo e quindi questi saranno fattori trascrizionali che andranno a mediare la trascrizione di specifici geni. Le PKC sono delle chinasi che vanno poi a continuare la trasduzione del segnale e sono quelle presenti nel citoplasma, mentre i fattori trascrizionali sono questi che vediamo all'interno del nucleo. La PKC, diversi tipi, vanno ad attivare diverse vie di trasduzione del segnale che porteranno l'attivazione di diversi fattori trascrizionali. Vi è una particolare proteina che andremo a conoscere quando parleremo dei recettori con attività tirosinachinasica. Questa proteina si chiama SRC (viene letta proteina sarc). Sarc attiva la PKC lambda, abbiamo una chinasi, che poi converge sullo stesso segnale che viene attivato direttamente dalla PKC tetra. Quindi i segnali si incastrano all'interno della cellula, si parte da uno, ma si può finire sullo stesso segnale attivato da un altro esoforma di PKC. Se vogliamo raggruppare in un certo senso i recettori a proteina G in categorie, le categorie che abbiamo sono quelle che abbiamo visto mediare l'attivazione della PKA e che chiamiamo Ga, quelli che mediano l'attivazione della fosfolipasi C che chiamiamo Gq e l'altra categoria è la Gai dove i sta per inibitore. Questa L’attivazione e l’inibizione dell’adenilato immagine ci fa capire cosa succede: ciclasi sono mediate rispettivamente da Gsa quando il ligando lega il recettore a e Gia proteina G i segnali a valle sono segnali inibitori, quando il suo recettore ha legato il suo ligando Aerea ino | Calza fi n esso blocca l'attività del secondo, / ld o quindi inibitoria perché blocca dei nem f deo de specifici segnali e in questo caso puri P33 Lee” Î abbiamo il blocco di un secondo Citosol x — n recettore, quindi impedisce ° DSS peromone l'attivazione del recettore a lato. Quindi oltre ai venti stimolatori che G stimolatoria inibitoria portano ad un'attivazione di eventi all'interno della nostra cellula, si può avere anche il blocco di segnali in risposta ai recettori accoppiati a proteina G, come possiamo vedere in questa immagine dove il legame fra ligando e recettore blocca un secondo recettore e quindi impedisce che questo recettore vada ad attivare una via di trasduzione del segnale. Recettori intracellulari o nucleari I recettori sono proteine che sono presenti o sulla superficie cellulare o all'interno della cellula e che ricevono dei segnali per portare poi ad una risposta bene precisa. Una categoria di questi recettori è la categoria di recettori cellulare, intracellulari o nucleari. Questi recettori a differenza di quelli che abbiamo visto precedentemente si trovano all'interno della cellula, quindi il ligando per poter interagire con questi recettori deve attraversare la membrana plasmatica. Quindi molecole di piccole dimensioni che attraversano la membrana plasmatica e trovano il loro recettore all'interno della cellula. Innanzitutto li indichiamo con la lettera NR dove NR è l'acronimo per nuclear reseptor, recettore nucleare, è una classe di proteine che si comportano da fattori trascrizionali, di fattori trascrizionali ne abbiamo visto Recettore per ormone stimolatorio solo da lui e non dagli altri membri, così come il recettore per gli estrogeni deve riconoscere una sequenza che è in grado di riconoscere solo lui e non gli altri. Quindi anche il DBD è una sequenza estremamente variabile perché questo ci permette di far interagire il recettore nucleare con una sequenza ben precisa che solo lui è in grado di riconoscere. Come funzionano questi recettori? Il meccanismo canonico prevede che il a b e Steroidhormone . i LI con ligando, che = È nell'immagine ( e vediamo En o. _ 09 gp Land definito come Steroid receptor ee ormone 19/050 pese steroideo, Nucleus passi attraverso la membrana. All'interno del Recettori steroidei citoplasma il Recettori orfani adottati Recettori orfani Un considerevole sottogruppo della recettore per AR (recettore per gli androgeni) a “ Peroxisome-proliferator superfamiglia dei recettori nucleari questo ormone Pit jiecotiore per gli sstrogeni) activated receptors ‘sembra legarsi principalmente al DNA steroideo si GR {recettore per I (PPAR8) e liver X come monomeri. glucocorticoidi) È receptors (LXRs), legano il Nella maggior parte dei casi, questi trova a ME girini 3 DNA in maniera recettori sono designati come "orfani".1 formare un fi a costitutiva in associazione recettori orfani potrebbero mediare la PR (recettore per | progestinici) ‘ad RXRs come partner trascrizione regolamentata attraverso comp lesso con obbligao. cambiamenti nella loro espressione o una proteina modifica post-traduzione (ad esempio HSP che sta fosforilazione) per Hit Shock Protein, la proteina dello shock termico. Normalmente, all'interno della cellula, questo recettore nucleare per gli ormoni steroidei è bloccato e a bloccarlo è la proteina che chiamiamo HSP. Quindi diciamo che si trova in uno stato di riposo grazie all'interazione con la proteina HSP. La proteina HSP non fa altro che nascondere la regione che è deputata all'interazione con il ligando e quindi lo tiene fermo, immobilizzato in uno stato inattivo. Quando arriva il ligando quello che succede è l'allontanamento della proteina HSP e il legame del ligando. Quindi l'ormone steroideo spiazza la proteina HSP e si lega con il recettore specifico, solo dopo questa interazione ligando recettore, il recettore passa nel nucleo e nel nucleo va a riconoscere una particolare regione che viene detta regione di risposta, risposta perché una volta legato il recettore quello che andremo a fare è una regolazione della trascrizione, cioè la quantità di mRNA che viene prodotta può essere aumentata o può essere ridotta. Questo meccanismo viene detto meccanismo standard e con questo meccanismo funzionano i recettori per gli androgeni, gli estrogeni, i glucocorticoidi (cortisolo), i mineralcorticoidi e per i progestinici. Quindi tutti gli ormoni steroidei, che li definiamo così perché derivano dal colesterolo, funzionano con questo meccanismo. Di questi 48 recettori inizialmente non si conosceva per tutti il ligando, quindi non conoscendone il ligando questi recettori vennero definiti recettori orfani, orfani perché non si sapeva chi era in grado di legarli e attivarli, la ricerca è andata avanti e per molti di questi recettori orfani è stato definito il ligando naturale, cioè quali sono le molecole che il nostro corpo produce e che sono responsabili dell'attivazione di questi recettori, motivo per il quale questi recettori sono stati chiamati ex- orfani. Questi recettori ex-orfani, un esempio di questi recettori, sono i recettori che vengono detti PPAR e i recettori che vengono detti LXR. Le LXR adesso si sa che è in grado di legare dei derivati del colesterolo che si chiamano osseosteroni e una volta che questi LXR li legano portano poi ad una serie di risposte. I PPAR è uno dei recettori che viene preso come target ad esempio da un farmaco che viene utilizzato per il trattamento del diabete perché una volta che questo recettore viene attivato porta ad un aumento dei segnali dell'insulina, quando parliamo di diabete di tipo 2, quello che si manifesta normalmente con l'avanzamento dell'età e viene detto diabete senile, uno degli eventi che si verifica in questo tipo di diabete è una ridotta risposta delle nostre cellule, soprattutto a livello epatico, all'insulina, quindi le nostre cellule non rispondono più bene ai segnali inviati dall'insulina e normalmente quello che l'insulina fa è segnalare a livello epatico, di catturare il glucosio che è in circolo sangue e di depositarlo sotto forma di glicogeno, quindi questa è l'azione che normalmente l'insulina svolge, riduce i livelli di glucosio nel sangue perché li fa depositare e li fa depositare soprattutto nel fegato sottoforma di glicogeno. Nel caso di diabete di tipo 2 questi segnali funzionano meno. Il rosiglicoazone che è una molecola in grado di attivare il PPAR funziona aumentando i segnali dell'insulina, quindi anche laddove l'insulina funziona meno grazie a questa molecola che funziona su questo recettore nucleare i segnali aumentano. Vi sono però alcuni di questi recettori che sono rimasti ancora orfani, per i quali ancora non si conosce il ligando e quindi la ricerca va avanti per definire a cosa servono, perché definirne il legando significa definire quand'è che essi vengono attivati e quand'è che svolgono la propria azione. Dall'immagine possiamo vedere che l'ormone steroideo entra all'interno della cellula, il recettore normalmente si trova legato alle proteine HSP e in questo momento il recettore è inattivo, dopodiché all'arrivo dell'ormone steroideo la proteina HSP viene dissociata e quindi in questo momento il recettore è in grado di legare l'ormone steroideo. Solo dopo questo legame, quindi questo complesso ormone-recettore, passa dal citoplasma all'interno del nucleo e arrivato nel nucleo va a legare delle particolari regioni presenti sui promotori dei geni target, geni target significa che non tutti i promotori sono in grado di rispondere ai recettori steroidei, solo alcuni perché devono avere esattamente quella sequenza di DNA, quelle basi poste con quell'ordine e solo in quel caso il recettore nucleare è in grado di legare il promotore, quindi è una regolazione mirata e selettiva perché bisogna avere una sequenza ben specifica per poter legare il recettore. A che cosa servono le diverse regioni che vediamo all'interno del recettore? Abbiamo detto che tutti i recettori condividono una struttura comune, ora vediamo a cosa servono queste diverse regioni. La prima regione è la ragione AF1, essa ha un ruolo importante perché serve come sede di fosforilazione, quindi questa è la regione che può essere fosforilata, a cui si possono addizionare i gruppi fosfato e la fosforilazione porta a un cambiamento dell'attività del recettore e può essere attivato mediante fosforilazione anche senza ligando, ed è la regione che è deputata all'interazione con fattori cellulo-specifici. Qua entra in gioco il concetto di avere cellule nel nostro corpo che svolgono funzioni diverse che hanno, se si guardano al microscopio, aspetti diversi ma non solo l'aspetto perché svolgono proprio funzioni diverse e questo dipende proprio da un diverso assetto proteico che queste cellule hanno e l'assetto proteico deriva proprio dalla capacità di poter regolare la trascrizione, perché per fare la proteina c'è bisogno dell'RNA e possiamo fare RNA diversi, quindi andare a sintetizzare mRNA di alcuni messaggeri e non di altri grazie a proteine che chiamiamo cellulo-specifiche, cioè che le abbiamo in un tipo di cellula e in altre no. Queste proteine cellulo-specifiche parlando dei recettori nucleari, parlando della trascrizione, perché il recettore nucleare si comporta da fattore trascrizionale, quindi questi fattori cellulo- specifici altro non sono che delle proteine in grado di interagire in maniera selettiva con il recettore nucleare. Riassumendo: tutti i fattori trascrizionali dopo che hanno legato il DNA devono interagire con delle altre proteine per formare dei complessi multiproteici che poi sono quelli deputati all'interazione con I'RNA polimerasi che è l'enzima che media il processo di trascrizione, quindi per consentire l'attivazione dell'ENA polimerasi, perché è lei che deve andare a trascrivere, c'è bisogno che il recettore nucleare vada a reclutare tutta una serie di altre proteine e queste proteine che vengono reclutate le chiamiamo cofattori. Questi cofattori non saranno preseti in tutte le cellule e questo è il motivo per cui il recettore nucleare riesce a funzionare solo in un tipo cellulare e non in un altro, ad esempio estrogenico può funzionare all'interno dell'ovaio solo se sono presenti dei cofattori che sono in grado di legare il recettore estrogenico, quindi solo se si forma questo complesso multiproteico il meccanismo di trascrizione può essere efficiente, se non si forma questo complesso multiproteico la trascrizione non avviene. Questi cofattori sono cellulo-specifici e vanno a interagire con il dominio AF1 del recettore nucleare. Il dominio DBD è il dominio deputato all'interazione con il DNA, questa regione della proteina va a conformarsi, disporsi, in maniera da avere dello estroflessioni, quest'ultime contengono dei residui di cisteina (che è un amminoacido), essa è in grado di coordinare lo ione zinco (Zn°*). Lo zinco permette di stabilizzare queste estroflessioni e di esse se ne vengono a formare 2 e permettono alla proteina di incastrarsi sul filamento di DNA, proprio come se fossero delle dita ed è per questo che prendono il nome di zinc finger (dita di zinco), grazie a queste estroflessioni che coordinano lo ione zinco e grazie a queste estroflessioni la proteina, quindi il recettore nucleare, si incastra sul filamento di DNA, cioè sul promotore dei geni target. Questa è una struttura comune a tutti i recettori È nucleari ma anche a delle proteine che Legami al DNA non appartengono alla classe di recettori nucleari ma che funzionano A. Steroid hormone receptors —B.NR2B heterodimers ugualmente come fattori trascrizionali, quindi è una categoria di fattoria trascrizionali che chiamiamo proprio zinc finger. Quindi AF1 serve per la ivetad repeat. Diect rape an n) Lia Vi . . RS a fosforilazione e per l'interazione con i i veri repeat. n ‘ 1 ‘ NR3A1,2: AGGTCAN:TGACCT NRIA,18,1C,1H,2F,4A: AGGTCAng «AGGTCA cofattori e DBD serve per l'interazione NR3C1,2,3,4: AGAACAn,TGTTCT NR1H4:; AGGTCAng.TGACCT con il DNA. Molti dei recettori nucleari funzionano sottoforma di dimeri, cioè C. Homodimeric receptors D. Monomeric orphan receptors quando si legano al DNA non se ne lega uno solo, ma se ne legano due; questo avviene perché sui promotori sono presenti vicini uno all'altro non una Direct repeat e) n) Evert ropoo: im sequenza che viene riconosciuta dal NRIA,28,2C: AGGTCANg /AGGTCA NRIA, 144,44, 5A: (A/T/CNA/CIAAGGTCA recettore ma, avendo a disposizione NRIA TGTCCTn, AGGTCA . . Mar: STCICAMIAGOTCA due sequenze, ci saranno due recettori NR4A TGATATn,ATGCCA nucleari che sono in grado di legarsi. PPARYy targets manca il ligando, invece, il posto di Cee latina questi coattivatori Uncoupling prot 1, mochondrii-— Up? è preso tutto di da una serie di proteine che si dpi . - ho. Godo chiamano corepressori, quindi i Oche csse, sbuni VII Cond . . . DNA Cytochvome c oxidase,subunit Vila 1 CoxZat coattivatori attivano la Pyruvate cardoryiase Pex Pyrate carboni fa izi i AGGTCA n AGGTCA ft pope 3 AUDIp o trascrizione, mentre Î Direct repeat (DR1) Ir vga UD) 100 corepressori bloccano la 8. Heterodimerization of a SRL Ta trascrizione. I coattivatori si i Camino paimtoytranirase , musce Ctib . PPAR with RXR. Camin pameoyranirase 1, musce Cpo associano al recettore nucleare solo se è presente il ligando, se il Ligand-independent Agonist-dependent Antagonist-dependent ligando non è presente il posto dei repression activation repression È È x È coattivatori è preso dai — corepressori. Nel caso ue — cassino ° ° ° % dell'immagine abbiamo un AANIAnA. ANY Finn NANI nno dai De (nel caso di formazione di dimero), ten Pmacdogi Scene eterodimero perché fatto da due recettori nucleari diversi. Quando è presente il corepressore, e quindi manca il ligando, il processo di trascrizione è bloccato, quando è presente il ligando il processo di trascrizione è aumentato, perché il posto dei corepressori è preso dai coattivatori e quindi il processo di trascrizione è attivo. E poi possiamo avere situazioni in cui piuttosto che mettere il ligando naturale, possiamo intervenire farmacologicamente, vi sono delle molecole che possono legare il recettore nucleare e bloccare la trascrizione perché impediamo il legame naturale. Quindi l'approccio farmacologico prevede che se noi vogliamo prevenire l'azione che quel recettore nucleare svolge, dobbiamo competere con il ligando , quindi il posto del ligando lo prende il nostro farmaco che va a legare il recettore nucleare. Solo che il legame del farmaco deve impedire al recettore nucleare di acquisire la conformazione necessaria a legare i coattivatori, quindi il farmaco mantiene il recettore nucleare in una conformazione tale da impedire il legame con i coattivatori. PPARy (questa y è gamma) è proprio il target di uno dei farmaci utilizzati per il trattamento del diabete di tipo 2, questo farmaco si chiama rosiglitazone, esso si comporta in questo caso non come antagonista ma come agonista del PPARy e quando essi si legano nella cellula avviene un cambiamento della trascrizione dei geni bersaglio. Questo farmaco va ad aumentare la trascrizione di tutti i geni elencati in figura, alcuni dei quali sono coinvolti nel metabolismo degli acidi grassi. (Questo farmaco è usato anche nelle droghe di doping per diminuire la massa grassa). Il rosiglicoazone aumenta la quantità di enzimi nella cellula che consentono di utilizzare gli acidi grassi, motivo per cui porta ad una riduzione della massa grassa e ad un aumento di quella magra,perché alla fine quello che otteniamo è un aumento della quota di ATP che le nostre cellule sono in grado di sintetizzare. Come funzionano i coattivatori e corepressori? Quando abbiamo parlato di struttura di DNA, abbiamo detto che esso nelle nostre cellule viene ripiegato, quindi non lo ritroviamo come singolo filamento ma lo troviamo associato a delle proteine e quando lo troviamo associato a queste proteine invece di DNA parliamo di cromatina. la nostra cromatina è il DNA che viene avvolto intorno agli istoni, gli istoni formano il nucleosoma. Quando questi istoni sono tutti vicini, ben compatti, anche il DNA risulta essere molto compatto. Quando dobbiamo operare il processo di trascrizione l'RNA polimerasi deve essere in grado di inserirsi tra le maglie del DNA, quindi nel momento in cui il DNA è compatto l'FRNA polimerasi non riesce a lavorare perché gli istoni gli bloccano il passaggio. Così intervengono i cofattori che hanno il compito di aggiungere dei gruppi chimici a carico degli istoni e quando questi gruppi chimici vengono aggiunti gli istoni si allontanano gli uni dagli altri e quindi il DNA risulta essere meno compatto, i gruppi chimici che vengono aggiunti sono dei gruppi acetili, quindi l'acetilazione degli istoni ad opera di enzimi che si chiamano acetil- transferasi, enzima che trasferisce gruppi acetili. Acetil-trasferasi è una delle azioni enzimatiche possedute dai coattivatori. Quindi i coattivatori aumentano il processo di trascrizione perché rendono la nostra cromatina più lasta, meno impacchettata, così che l'RNA polimerasi riesce a inserirsi tra le maglie del DNA e attivare il processo di trascrizione. Quindi il recettore nucleare dopo aver legato il DNA, quando si associa con coattivatori porta ad un aumento della trascrizione, e adesso abbiamo capito che l'aumento della trascrizione dipende dall'attività enzimatica posseduta proprio dai coattivatori, quest'ultimi sono delle acetil-transferasi, hanno il compito di aggiungere gruppi acetilici a carico degli istoni e quando gli istoni vengono acetilati, il DNA risulta essere meno compatto e quindi trascrizionalmente attivo. Ma così come esiste questo meccanismo di acetilazione deve esistere anche un meccanismo di deacetilazione, cioè questo DNA trascritto non deve essere trascritto all'infinito e quindi il segnale viene meno, viene meno perché abbiamo degradato il ligando, viene meno perché abbiamo prodotto delle proteine che con un feedback negativo vanno a bloccare uno dei fattori trascrizionali, quindi a un certo questo segnale si deve spegnere e lo spegniamo rimuovendo i gruppi acetilici per portare il DNA nuovamente in uno stato compatto e questo lavoro lo svolgono le deacetilasi, a possedere attvità deacetilasica sono i corepressori, essi inibiscono la trascrizione perché rimuovono i gruppi acetilici, mantenendo il DNA in una forma compatta. Quindi coattivatori e corepressori mediano azioni opposte. Alcuni recettori oltre a funzionare con questo meccanismo, quindi oltre a comportarsi direttamente come fattori trascrizionali, possono comportarsi da recettori di superfice, cioè alcuni recettori nucleari piuttosto che trovarli liberi nella cellula, li troviamo direttamente associati alla membrana plasmatica e dopo che legano il ligando portano proprio a un meccanismo di trasduzione del segnale specifico, che coinvolge proteine ben precise, questo meccanismo, proprio perché non prevede che il recettore nucleare vada interagire con il DNA, lo chiamiamo meccanismo non genomico. Il meccanismo genomico prevede invece che il recettore nucleare vada a interagire con il DNA, che rappresenta il genoma delle nostre cellule. Possiamo attivare i nostri recettori, in assenza di ligando, mediante fosforilazione del nostro recettore nucleare, attraverso le chinasi. La chinasi viene attivata da un fattore di crescita GF, il GF attiva una trasduzione del segnale che coinvolge la chinasi e questa chinasi media la fosforilazione del recettore e poi il recettore va a interagire con il DNA ed attivare la trascrizione anche se il suo ligando non è presente.