Biologia Generale, utile per passare esame di biologia e prepararsi ai test di ingresso, Appunti di Biologia Cellulare

Scarica Biologia Generale, utile per passare esame di biologia e prepararsi ai test di ingresso e più Appunti in PDF di Biologia Cellulare solo su Docsity! CORSO BIOLOGIA GENERALE E CELLULARE 2020/2021 Massimo Crimi: Professore biologia cellulare e generale. Primo semestre: formato da 6 crediti formativi Secondo semestre: Laboratori pratici Orario inizio lezione lunedì: 8:40-9.00 Mercoledì: 12.00-13.40 LIBRI DI TESTO: • Il mondo della cellula. Becker W.M. → PRENDERE QUESTO E SEGUIRE LE LEZIONI. USARE UN TESTO. Sul moodle ci saranno anche degli articoli scientifici, materiale interattivo. PRIMA PARTE → TEST SCRITTO DI METÀ CORSO (a fine Gennaio): Deve servire soprattutto a noi per capire come state studiando e che comprensione avete della materia. N.B. CONTRIBUISCE ALLA VALUTAZIONE Seconda parte: Test scritto di fine corso (a Maggio/Giugno) Prova orale: (a partire dalla sessione estiva), con VERBALIZZAZIONE DEL VOTO FINALE. Parte di laboratorio con relazione che ogni persona deve presentare. Relazione di laboratorio in cui descriviamo cosa abbiamo fatto in laboratorio, che risultati abbiamo ottenuto. CONSIGLI IN GENERALE: • Studiare durante tutto il corso dell’anno, gradualmente, ogni giorno; • Se ho dubbi, posso frequentare lo sportello MENTRE; BIOLOGIA GENERALE E CELLULARE Le forme di vita sono diversificate, abbondanti e diffuse su tutta la Terra, e spaziano dai batteri microscopici alle piante La vita è complessa in tutti i suoi aspetti, a partire da come è organizzata. Sono tantissimi. Possiamo partire dal livello cellulare e passare alle molecole, ai sistemi cellulari, molecolari, ai tessuti, agli organi, al sistema di organi, all’organismo, alle popolazioni, alle comunità, all’ecosistema fino ad arrivare all’intera biosfera. Per studiare tutti gli esseri viventi devo capire per prima cosa tutte le interazioni che gli esseri viventi hanno in tutti i differenti livelli. Un organismo vive perché continua a ricevere informazioni da tutto l’ambiente che lo circonda. Bisogna abituare a chi fa la scienza ad utilizzare il metodo scientifico. Il metodo scientifico parte da delle osservazioni e da delle osservazioni si fanno delle ipotesi. Da un fenomeno che interessa un organismo, bisogna osservare e ipotizzare come avviene questo. La cosa più importante non è solo fare l’ipotesi, ma anche testarla, con esperimenti pratici o mentali, che verificano questa ipotesi. Fare un’ipotesi devo anche costruire degli esperimenti o pensare delle prove da fare che possono o verificare o smentire la mia ipotesi. Devo trovare una serie di prove che mi permettano di sapere se funziona così o funziona in un altro modo. Quando faccio un’ipotesi devo formulare esperimenti che mi permettono di verificare, ma anche CONFUTARE una mia ipotesi. Sempre pensare a prove che siano dirette ad avere un esito positivo o negativo. Con entrambi gli esiti posso continuare con la mia indagine scientifica. Se è confutato posso passare ad un’altra ipotesi, che cerca di colmare le lacune che l’altra ipotesi aveva. Se è verificato può darsi che la mia ipotesi è in linea con il fenomeno, ma può darsi che la mia ipotesi abbia una parte debole in un altro campo. LE IPOTESI NON SONO MAI CERTE. Quando faccio un’indagine e l’esperienza è positiva, so che per ora la mia ipotesi è vera in quel campo, ma può essere sempre confutata con il tempo. Tante scoperte sono state ostacolate dalle ipotesi precedenti. Tutta la comunità scientifica aveva la certezza che la legge precedente spiegava quel fenomeno. Quello che noi cerchiamo di fare è considerare i dati in modo OGGETTIVO, mai filtrare i dati in maniera soggettiva. Devo cercare dei dati in modo oggettivo e non mettere da parte delle ipotesi plausibili solo perché credo che l’ipotesi precedente sia una certezza o sia ancora valida. Quando si parla di teoria, parliamo di una cosa che tratta di più ipotesi che spiegano il funzionamento di un gruppo di fenomeni più ampio. Devo sempre pensare ad un esperimento che abbia un campione di controllo. Quando per esempio prendo, nel gruppo sperimentale, un’ameba e rimuovo il suo nucleo chirurgicamente con una microansa, l’ameba muore. Nel gruppo di controllo invece inserisco la microansa, bucando la membrana, ma non rimuovo il nucleo. Così posso affermare che anche se inserisco una microansa in un’ameba, ma non rimuovo il nucleo, quella non muore. L’esperimento era volto a dimostrare che se rimuovo un nucleo ad un’ameba, essa muore. Questo dimostra l’importanza del nucleo in una cellula eucariotica. Posso osservare gli organelli tramite microscopio ottico. Posso osservare le macromolecole tramite microscopio elettronico. LE PROPRIETÀ FONDAMENTALI DELLE CELLULE Sono molto organizzate e molto complesse. • Tutte le forme di vita hanno dei programmi, che sono le informazioni genetiche contenute al loro interno e hanno i macchinari utili per utilizzare queste informazioni. (I virus non hanno macchinari che sono capaci di gestire l’informazione); • Sono capaci di riprodursi; La riproduzione è diversa, ci sono diversi metodi di riproduzione della cellula. • Possono acquisire energia e utilizzarla, trasformando l’energia, con una forte perdita nel processo; • Svolgono una grandissima quantità di reazioni chimiche ( metabolismo cellulare: CATABOLISMO (reazioni di degradazione), ANABOLISMO (reazioni di sintesi)); • Sono capaci di rispondere a stimoli, hanno auto-regolazione (es. embrione riccio di mare, separazione delle 2 o 4 cellule); Se separo le cellule di un embrione di riccio di mare, danno ognuna un individuo, invece se rimangono attaccate producono un solo individuo. Le cellule separate riprogrammano il loro codice genetico per produrre due organismi distinti. • EVOLVONO: Tutte le cellule sono in grado di rispondere attraverso un processo che è evolutivo che non è migliorativo, è casuale, che poi, attraverso LE INTERAZIONI, determinerà quali individui sopravvivono e quali no. La base della vita è la capacità di ricevere delle segnalazioni e saperle utilizzare, rispondendo a certi stimoli. Il processo evolutivo va in tutte le direzioni, poi la selezione determinerà quali sopravvivranno e quali no. IMPORTANTE: SEMPRE GUARDARE LA RISOLUZIONE DELL’IMMAGINE (misura della scala). LA CHIMICA È SIMILE IN TUTTE LE CELLULE; Le reazioni chimiche di basi sono comuni a tutti gli organismi viventi. L’origine di tutti gli esseri viventi è COMUNE. Non ci sono state evoluzioni diverse. Tutte le cellule hanno una chimica simile, che è difficile pensare che sono partite da punti diversi, per poi arrivare alla stessa chimica di base. Le cellule sono super-attive nel movimento. Al microscopio si possono vedere i movimenti all’interno della cellula. Le cellule animali, per esempio i batteri, si muovono velocemente, nell’ambiente (non tutte). Ci sono cellule mobili che molto rapidamente si spostano, che cambiano forma. Sul nostro pianeta esistono più di 100 milioni di specie viventi (stima). La forma più semplice di classificare gli esseri viventi è verificare la presenza del nucleo all’interno delle cellule. Le cellule possono essere eucariotiche (con nucleo) e procariotiche (senza nucleo). I procarioti hanno all’interno del proprio citoplasma strutture semplici, mentre gli eucarioti hanno strutture molto complesse (organelli). Nella composizione dell’rRNA c’è stata una variazione tra i batteri, archebatteri ed eucarioti. Inizialmente c’è stata una prima biforcazione tra i domini dei batteri e dei archebatteri ed è dagli archebatteri che si sono generati gli eucarioti. Gli archebatteri sono un gruppo di batteri strani, che sono i predecessori delle cellule con nucleo. Il 99,7% della biomassa sulla terra è costituita da piante. Lo 0,3% della biomassa è composto da animali e batteri. Gli organismi viventi sono comparsi molto tardi rispetto all’origine della Terra. Se noi agiamo sulle condizioni della biomassa, sicuramente la biosfera cambierà in modo drastico ed irreparabile. Le piante mantengono la biosfera! PROCARIOTI Eubatteri e archeobatteri: non hanno il nucleo Sono sempre organismi unicellulari, sono molto semplici, ma questo non vuol dire che hanno strutture molto evolute. Tutte le cellule hanno una membrana che le richiude. I batteri, hanno, oltre che alla membrana, la parete cellulare. Struttura molto resistente, che è una caratteristica dei procarioti. All’interno della cellula c’è il citoplasma e all’interno del citoplasma ci sono le strutture e una molecola di DNA, chiamata nucleoide (DNA nudo). Nei procarioti il DNA interagisce con alcune proteine, ma non è mai legato ad esse, per questo è NUDO. Sono presenti anche dei ribosomi, responsabili della sintesi proteica e i mesosomi (strutture generate dalla membrana). Alcuni batteri possono avere strutture di movimento, come flagelli, legati alla membrana, con un motore molecolare, azionato grazie ad un input energetico, il più delle volte ATP, ma potrebbe essere prodotto anche da altre fonti. Il flagello permette al batterio di spostarsi nell’ambiente. La parete viene usata spesso per classificare gli organismi batterici, Gram positivi o Gram negativi. Le pareti degli organismi batterici possono reagire in modo diverso alle colorazioni Gram. La parete è formata da due componenti: peptidi e zuccheri che formano delle strutture polimeriche estremamente resistenti, anche alla degradazione chimica. Bisogna sempre considerare che devo rompere dei polimeri molto resistenti formati da peptidoglicani. Le strutture accessorie sono: • Corpi d’inclusione: strutture di isolamento di proteine prodotte in eccesso o mal prodotte; • Spore: Prodotte quando il batterio si ritrova in condizioni avverse. Sono strutture super resistenti che possono permanere nell’ambiente per milioni di anni (stati quiescenti di vita), che possono rigenerare le strutture vitali quando ci sono delle condizioni accettabili; • Flagelli; • Vacuoli gassosi: possono farli i batteri che vivono in ambienti liquidi e li utilizzano per muoversi nel fluido. I vacuoli gassosi possono per esempio permettere al batterio di regolare il suo galleggiamento; • Pili; • Capsula e strati mucosi. Strutture o di tipo recettivo o di tipo diverso (mucose scopo difensivo). La ruotazione del flagello è data dal passaggio di protoni attraverso il gradiente GLI ARCHEBATTERI Sono i nostri progenitori come cellule eucariotiche. Sono una classe di batteri molto particolare. Li troviamo in situazioni ambientali, delle nicchie ecologiche, che ricordano molto le condizioni originarie della Terra ai primordi. Esistono degli archebatteri: • Metanogeni: archebatteri che vivono in condizioni anaerobie (senza ossigeno). Usano l’energia per ridurre l’anidride carbonica a metano e come energia utilizzano l’idrogeno molecolare (H2), per ridurre la CO2 a metano (CH4). Li ritroviamo nel tratto intestinale degli animali. Vivono in situazioni totalmente anaerobie. Sono importanti, perché sono presenti nelle termiti, che utilizzano la cellulosa. Vivono inoltre nelle paludi, dove altri microorganismi hanno consumato l’ossigeno e dove è rimasto del materiale organico. Un’altra classe di archebatteri sono gli Alofili, che vivono in ambienti salini, dove l’acqua è quasi assente. Sopportano valori di pH estremi (pH=11,5). Sono studiati per la produzione di particolari enzimi. Altra classe di archebatteri: Termoacidofili. pH estremamente acidi e con temperature molto elevati. Vivono negli ambienti termali (gayser, gas marini). La rapidità in cui sono in grado di evolvere è di gran lunga superiore a quella degli eucarioti. VIRUS (MATERIALE A PARTE SUL MOODLE) (Lezione in videoconferenza, esperto durante il lockdown). I virus non possono essere considerati delle forme di vite, sono dei parassiti, hanno bisogno di una cellula per riprodursi, ma sono vitali, perché producono progenie, evolvono. La parola viene da sostanza tossica. I virus sono incredibilmente diversi come dimensioni. I batteriofagi sono virus che prendono di mira solo batteri. I virus sono stati scoperti in seguito alla scoperta di germi, con la scoperta del microscopio. I virus sono stati scoperti dopo, il primo che è stato scoperto è quello del mosaico di tabacco, attacca le foglie di tabacco. È stato scoperto grazie ad un esperimento ingegnoso: sono state prese delle foglie infette e si diceva di purificare i batteri che causano questa malattia. Per purificare i batteri che causavano questa malattia, c’era la possibilità di avere filtri che aveva una certa porosità. Se io ho una foglia infetta, la macero e lavo via nel filtro il prodotto, nel filtro si dovrebbero vedere i patogeni che causano questa infezione. Il prodotto presente nel filtro poi è stato messo su una foglia, per vedere se si ammalava. Non si ammalava. Quindi si è preso il materiale filtrato e lo si è messo sulla foglia e questa si è ammalata. L’esperimento è stato fatto bene, perché non ho gettato lo scarto e l’ho tenuto nel caso che le mie ipotesi siano errate. BISOGNA TENERE DA PARTE TUTTO QUELLO CHE STIAMO FACENDO. I virus non sono in grado di andare dove vogliono, essendo organismi parassiti, hanno una fortissima specializzazione che gli permettono di riconoscere le cellule ospite. I virus inoltre evolvono rapidamente. LE CELLULE EUCARIOTICHE Senza un sistema di interfaccia esterno, che nel caso della cellula eucariotica, non c’è comunicazione. La membrana inoltre SEPARA l’interno della cellula dall’esterno. Ricevere informazioni, trasporto, capacità di movimento ed espansione. Le cellule che hanno una parete cellulare, non possono utilizzare la membrana cellulare come forma di movimento. Le cellule eucariotiche hanno anche al proprio interno un sistema di membrane. Il vantaggio di un sistema di membrane interno può anche velocizzare le reazioni chimiche, mantenendo una quota di concentrazione di reagenti adeguata. Un ciclo futile di reazione consiste nel decomporre un composto, per poi riprodurre la stessa sostanza. Nei compartimenti ci sono delle specializzazioni che permettono di creare degli ambienti differenziati e che producono solo certe sostanze. La membrana della cellula è diversa dalla membrana dei mitocondri, che è diversa dalla membrana del reticolo endoplasmatico, che è diversa dalla membrana del Golgi. Per l’evoluzione è stato importante questo processo, poiché ha permesso di differenziare le funzioni della cellula. Il nucleo è formato da due membrane avvolte, in continuità con le altre membrane, è legato al reticolo, ma determina un ambiente unico. Il nucleo è anche una struttura di resistenza, è difficile spezzare la membrana nucleare. Comunicazione con il resto della cellula attraverso pori. Il nucleo è un punto di comunicazione fondamentale per il controllo della qualità. Se quasi tutta l’informazione è contenuta nel nucleo, uno dei punti cruciali è il controllo della qualità. Esiste un nucleo, esistono i pori nucleari che mi danno la possibilità di controllare le sostanze sintetizzate. Il nucleo ha come diametro 5 micrometri, ma se pongo tutti i cromosomi in un filo unico, linearmente faccio 2 metri e sono mantenuti e organizzati in una sfera di 5 micrometri. RETICOLO ENDOPLASMATICO LISCIO E RUGOSO Non è soltanto la sintesi delle proteine, ma abbiamo entrambi i processi di sintesi (lipidi nel liscio, proteine nel rugoso). Il traffico delle vescicole nasce dal reticolo, endoplasmatico e rugoso. CELLULE EUCARIOTICHE Hanno la possibilità di formare organismi pluricellulari, cosa che i procarioti non erano in grado di formare. La vita può raggiungere complessità anche con gli organismi unicellulari, ma la possibilità di formare organismi pluricellulari ha aperto nuove via ad un nuovo livello di complessità. Alcuni eucarioti sono parassiti (es. Plasmodium malariae). In generale, le cellule sono di piccole dimensioni, perché mano a mano che la cellula diventa sempre più grande, si perde il rapporto superficie-volume. Dentro ad una cellula pensiamo ad un soluto, come si muove all’interno di una cellula? Con il movimento browniano. Se l’ambiente è molto grande, i tempi per raggiungere determinate condizioni, diventano sempre più lenti. Un elemento che può aumentare il movimento browniano è la temperatura. DEVONO ESSERE MANTENUTE DELLE CONCENTRAZIONI UNIFORMI. Riassumendo, una cellulla deve mantenere dimensioni ridotte, per: • Mantenere le giuste concentrazioni; • A causa dei limiti nella velocità di diffusione delle molecole; • Per mantenere un adeguato rapporto superficie/volume): la membrana che ha un basso rapporto superficie/volume, avrà una superficie più ridotta per dare i nutrimenti ai sistemi che lo richiedono. Le cellule, per aumentare la superficie, ma mantenere il volume costante, si riuniscono in un organismo pluricellulare, ma questo è il risultato di un complesso sistema evolutivo. Le cellule, negli organismi pluricellulari, non lavorano più solamente per sé stesse, ma divengono capaci di comunicare con altre, vivere con altre e sono capaci di suicidarsi se l’organismo lo richiede. Se cellule piccole si riuniscono, il rapporto superficie/volume aumenta, consentendo di assorbire più sostanze nutritive. Le cellule eucariotiche hanno dei programmi di differenziamento cellulare. A partire da cellule totipotenti, negli organismi pluricellulari si arriva a creare delle cellule specializzate, in cui alcuni geni non vengono trascritti, mentre altri sì. Il pattern che cambia è l’espressione genica della cellula. Il programma genetico viene modificato secondo uno schema preciso epigenetico. LE CELLULE STAMINALI SONO CELLULE TOTIPOTENTI. A partire dallo zigote, negli organismi pluricellulari animali, le cellule partono con l’essere totipotenti, per poi specializzarsi. Così accade anche nelle piante. Le piante continuano a mantenere delle cellule staminali nei meristemi, posti sugli apici della radice e dei germogli. I Nella vita troviamo solo la SERIE L. Con il passare degli anni le analisi sono più precise e i meteoriti sono stati studiati nel dettaglio e sui meteoriti sono state trovate altre molecole complesse di tipo organico. Questo può avere un ruolo nella generazione della vita sul nostro pianeta? Le origini sulla genesi chimica della vita nasce nell’Ottocento, quando ci si accorge che i composti chimici organici (con scheletri C – C o legame C – N) si potevano formare anche a partire da composti inorganici. Un chimico tedesco però dimostrò che si poteva sintetizzare l’urea (un composto organico) a partire da composti inorganici (cianati e cloruro d’ammonio o ammoniaca). Questo fa pensare che prima della vita, ci fosse stata un’evoluzione chimica. Questa evoluzione avrebbe dato il substrato che ha gettato le basi per la vita. Nel 1922 Oparin fece delle ipotesi sull’evoluzione chimica e studiò bene il caso. Notò che l’atmosfera primordiale NON CONTENEVA OSSIGENO allo stato elementale (O2), ma c’erano molti elementi utili alla vita, come azoto, carbonio, idrogeno, ossigeno (presenti in molecole come diossido di carbonio e acqua), sia dispersi nell’atmosfera, che disciolti nelle acque. Era disponibile molta energia in forme diverser (eruzioni, fulmini, radiazioni ultraviolette); Dai gas atmosferici si formavano composti organici, che si raccoglievano in mari e laghi (brodo primordiale). Era come un brodo si arricchisse sempre con qualcosa di nuovo. Una volta che si generavano, i composti chimici si potevano concentrare in alcuni luoghi come pozze e stagni. Com’era l’atmosfera all’origine della Terra? Ci sono studi geologici che hanno date molte informazioni e in parte si sa come fosse l’atmosfera agli inizi della Terra. L’atmosfera primordiale, conteneva molta CO2, N2, ma anche ammoniaca (NH3) ed anche SO2 e HCl (composti riducenti). Conteneva anche H2 e He ed alcuni gas nobili. Si ipotizza che molti gas siano sfuggiti nello spazio. Si ipotizza inoltre che fosse accaduto un impatto catastrofico con un altro pianeta, che portò alla formazione della Luna e alzò le concentrazioni di vapore acqueo. Dopo l’impatto con il pianeta: Aumento di CO2, N2 e H2O. CH4, NH3 e H2S che rendevano l’atmosfera riducente sono state in questa fase dilavate e fotolizzate. La CO2 è poi calata rendendo più leggera l’atmosfera. Infine è comparso O2, l’OSSIGENO MOLECOLARE. La vita è nata in COMPLETA ASSENZA DI OSSIGENO MOLECOLARE. Nel 1950 Stanley Miller (allora graduate student) ideò l’esperimento per verificare l’ipotesi di Oparin che richiedeva: 1. Assenza di ossigeno; 2. C, H, O e N in quantità. Miller costruì l’apparato per farlo e ci mise gli ingredienti giusti. Gli ingredienti erano quelli elencati da Oparin. Tutti gli studi, tra cui i vulcanologi, dicono che l’atmosfera ipotizzata da Oparin era quella primordiale. Miller inoltre aggiunse energia, in due modi diversi: • Calore (eruzioni); • Elettricità (scariche elettriche), perché quando c’è un’eruzione vulcanica ci sono moltissime scariche elettriche, perché le nubi vulcaniche sono simili all’atmosfera primordiale della Terra. Miller costruì uno strumento perfetto per condurre l’esperimento. Mise acqua, su una fonte di calore (rappresentava l’oceano), in modo che evaporasse, ci sono dei tubi che portano il vapore acqueo nell’atmosfera, dove erano presenti gli elementi dell’atmosfera primordiale (atmosfera riducente), un condensatore che raffreddava l’aria e i composti che si erano creati, che si depositavano nel brodo. Mise nell’atmosfera anche scariche elettriche. Mise nel suo alambicco anche delle vie da cui poteva prelevare campioni, senza contaminare l’ambiente. Dopo una serie di cicli, Miller recuperò amminoacidi, ma recuperò anche delle molecole che rappresentavano tutte le classi di molecole presenti nella vita. Questo ha spalancato il pensiero a riguardo dell’origine della vita. Miller tenne le prove dei suoi campioni e dopo 50 anni i campioni di Miller sono stati ripresi ed analizzati, con gli strumenti attuali, molto più precisi di quelli al tempo di Miller. Ci sono un sacco di altri composti, che Miller non aveva visto. Nel 2008 le analisi dei suoi campioni hanno portato alla scoperta di nuove molecole organiche interessantissime. Questo è stato l’esperimento che ha aperto la strada all’evoluzione chimica. I vulcani sottomarini creavano delle condizioni ottimali per delle reazioni chimiche, che evaporavano con le bolle di vapore, andavano a finire nell’atmosfera riducente, in cui venivano riempite di energia, tramite scariche elettriche, si generavano legami chimici e questi legami chimici nuovi, ripiovevano nell’oceano e nei laghi attraverso la pioggia, per poi rigenerare nuovo vapore e il ciclo continua. I LIMITI: dal “brodo primordiale” non è possibile ottenere catene di acidi grassi lunghe; le reazioni di condensazione sono sfavorite in acqua; MA: • Ci sono condizioni in cui le stesse reazioni avvengono in natura tutt’oggi. Nei fanghi e nelle argille sono presenti dei catalizzatori che favoriscono la formazione di molecole complesse. Le argille e il fango sono delle superfici a cui le molecole si legano; • Gli acidi grassi e i lipidi possono aver formato uno strato sulla pirite (roccia eruttiva); • Certe condizioni naturali quindi possono avere fatto da ambiente ideale per condensare polimeri (tramite reazioni di condensazione) implicati nel metabolismo e di molecole in grado di autoriprodursi. PROVE: queste molecole sono abbondabnti presso le bocche vulcaniche nella profondità degli oceani, (archeobatteri che utilizzano come nutrimento la pirite FeS2). I gruppi ferro e zolfo sono contenuti negli enzimi e formano i catalizzatori all’interno degli enzimi. Ci sono delle evidenze quindi che questo (evoluzione chimica) ha a che fare molto con l’origine della vita. Uno studio del 2014 mostra come le pietre pomici possano aver creato degli ambienti che hanno favorito la formazione di polimeri e molecole organiche complesse, se non anche le prime forme primordiali di cellule. I composti come i composti formati da polimerizzazione del carbonio (come gli acidi grassi), sono idrofobici, ma quando vengono in contatto con, per esempio, le pietre pomici, formano uno strato idrofobico sulla superficie di questi oggetti. Le pietre pomici possono aver creato condizioni ideali tipico di un ambiente che permette la formazione di reazioni specifiche. Nel profondo dell’oceano, nei pressi di sfiati idrotermali, c’è molta vita e questi ambienti possono essere gli ambienti originali, dove si è generata la vita. Prima della genetica, c’è stato il metabolismo, diverse reazioni chimiche accoppiate per formare delle vie. La limitazione di questa teoria è la stabilita delle molecole chimiche alle temperature alte presenti negli sbocchi vulcanici oceanici. QUALE ALTRE CARATTERISTICHE DEVE AVERE UNA PROTO-CELLULA? Deve avere la possibilità di avere dei metabolismi, reazioni chimiche organizzate, non casuali e che abbiano la possibilità di riprodursi e sono cose che possono essere nate in una forma prebiotica, prima della vita. Le camere idrofobiche all’interno della pomice e, quando ci sono i lipidi, delle gocce (liposomi). Questi ambienti possono aver offerto la possibilità di formare un ambiente chiuso. Gli enzimi presenti all’interno di queste strutture, possono formare dei cicli, delle reazioni in una via precisa, che trasformano certi composti, in altri tipi di composti. Si sono formati dei polimeri, ma come si sono formati i polimeri necessari alla produzione di altri polimeri? Si ipotizza che esistevano delle molecole che fungevano sia da catalizzatori, sia da “memoria” di quello che è stato fatto. Non è stato il DNA, ma forse potrebbe essere stato l’RNA. L’RNA è una molecola molto meno stabile del DNA, ma a differenza del DNA, si ripiega da sola nello spazio, esattamente come fanno le proteine. L’RNA è in grado spontaneamente di piegarsi in un certo modo e di prendere una certa Molte cellule oggi vanno a parassitare altre cellule e o la cellula si libera del parassita o il parassita si libera della cellula. Invece, in questi eventi, dopo migliaia di eventi che hanno portato alla competizione, un altro evento ha portato all’assimilazione di un organismo, che appena entrato in una cellula, può aver dato ad essa un vantaggio enorme, per esempio nel caso dei mitocondri, la capacità di liberarsi dell’ossigeno. Per questo motivo sono stati tollerati e sono rimasti all’interno delle cellule ed è nato uno scambio tra i due chiamato SIMBIOSI, dove entrambi gli organismi beneficiavano dei prodotti di entrambi. Ora non si parla più di organismo parlando di mitocondri e cloroplasti, poiché sono stati assimilati nella cellula eucariotica. QUESTE IPOTESI FANNO PARTE DELLA TEORIA ENDOSIMBIOTICA. La prima prova a supporto di questa teoria è che guardando i mitocondri e i cloroplasti possiamo notare che hanno un DNA proprio e che questo DNA è un DNA circolare, un unico cromosoma circolare, tipico dei procarioti, dei batteri. Hanno una quantità di DNA molto inferiore a quella che consentirebbe loro di vivere in modo indipendente. Se andiamo a vedere nelle cellule che conosciamo noi, gli unici organelli che hanno una membrana doppia sono i cloroplasti e i mitocondri. Ma si sono formati prima i compartimenti citoplasmatici o è avvenuta prima l’endosimbiosi? Sono state fatte moltissime ipotesi e studi su quando è avvenuto questo processo e alla fine, quello che si pensa è che non ci sia stata né una endosimbiosi prima che ci fossero gli organelli, né che ci fosse stata un’endosimbiosi dopo che si siano formati gli organelli. Ci si trovava in un momento in cui non si era ancora sviluppato il nucleo, ma era iniziato il processo di formazione degli organelli. Circa 600 milioni di anni fa, nel giro di 10-20 milioni di anni, un arco di tempo brevissimo, scoppia una delle più grandi crescita di nuove specie (ESPLOSIONE CAMBRIANA). Su questo si è discusso moltissimo, ci mancano dei fossili. Alla fine la cosa più accreditata e supportata da evidenze è che in quel periodo è successo che ci fu un bombardamento di meteoriti sulla Terra notevole. È successo che praticamente questi meteoriti sulla Terra, per qualche milione di anni hanno stravolto il clima, un cambio della temperatura drastico. Dopo questo lungo periodo di cambio climatico, il clima ha di nuovo cominciato a cambiare ed ha occupato tutte le nicchie possibili e immaginabili. Questo ha dato l’esplosione di tutte le forme di vita primordiali e questi organismi si sono potuti evolvere liberamente. Le crisi climatiche hanno dato in poche milioni di anni, delle possibilità di biodiversità. DEFINIZIONE DI EVOLUZIONE Processo di cambiamento nel tempo delle frequenze geniche. Il termine evoluto non è sinonimo di migliorato! Questo toglie ogni valutazione del processo! Non si può dare un parere al processo evolutivo, che non è un processo migliorativo, buono, è solo un processo di cambiamenti di FREQUENZE GENICHE, che danno cambiamenti casuali. NON si deve avere una visione puramente antropocentrica dell’evoluzione. Dobbiamo immaginarci un processo nel quale c’è una esplosione di vie diverse. Facciamo fatica con il vedere l’evoluzione come è veramente, poiché mancano MOLTISSIME INFORMAZIONI. Ciò che vediamo adesso è il risultato di 4 miliardi di anni di evoluzione, con tutto quello che è più antico perso o non pervenuto. La vita sulla Terra è legata a moltissimi fattori e molti di questi non li conosciamo. Non esiste l’organismo da dove discendiamo, stiamo facendo un errore clamoroso col comparare noi con la scimmia attuale, che ha subito un processo evolutivo totalmente diverso, dal nostro antenato comune, che non è più presente. NON possiamo rappresentare l’evoluzione come un processo graduale. A volte ci sono dei salti che non sono assolutamente rappresentabili! L’evoluzione e le speciazioni hanno permesso alla vita di colonizzare praticamente ogni ambiente disponibile sul pianeta. NON DOBBIAMO PIÙ VEDERE IL MONDO COME UN SISTEMA ANTROPOCENTRICO! Se guardiamo temperatura e pH troviamo forme di vita per tutto il range dell’acqua liquida, ma anche fuori da questo range. Ed è quasi in tutto l’arco di pH. Le forme di vita hanno esplorato anche tutti i possibili ambienti, addirittura estremi! Qual è il futuro del nostro pianeta e delle sue forme di vita, sempre considerando la scala temporale dell’evoluzione della vita, ovvero miliardi di anni? Il sole diventerà più luminoso nel corso dei prossimi 5 miliardi di anni… l’atmosfera terrestre diventerà sempre più simile a quella di Venere e l’acqua non esisterà più sulla superficie terrestre e quindi anche la vita così come noi la conosciamo. LA CHIMICA DELLA CELLULA Gli unici elementi che troviamo in quantità significative negli esseri viventi sono idrogeno, sodio, potassio, calcio, ferro, ossigeno, carbonio, fosforo, zolfo, cloro, azoto. Quelli che sono presenti in grandissime quantità sono carbonio, ossigeno, idrogeno e azoto. Non c’è una corrispondenza di disponibilità e uso. Una delle basi della vita è la formazione di composti organici e se guardiamo i legami importanti sono tutti quelli che forma il carbonio e se guardiamo l’energia di questi legami in kcal/mol, questi superano i 100 kcal/mol. Vediamo anche come la luce sia capace di interagire con la materia organica. Se li mettiamo in scala con l’energia della luce, i legami del carbonio cadono nell’energia dello spettro dei raggi ultravioletti. Se io colpisco molecole che hanno doppi legami con radiazioni ultraviolette, queste sono capaci di rompere il legame covalente e quindi possono danneggiare gli esseri viventi. In laboratorio si usano lampade a raggi UV per igienizzare e disinfettare i piani di lavoro da eventuali tracce biologiche. I legami non covalenti invece sono legami molto più deboli di quelli a carbonio, ma sono importantissimi per l’interazione, lo scambio di informazioni. Tutto quello che avviene nelle cellule avviene per le forme di legame di tipo debole. Le proteine e i loro substrati interagiscono secondo legami deboli. Tutto quello che succede nella cellula è determinato da legami ionici, ad idrogeno, dalle interazioni di Van der Waals. Molti siti attivi di enzimi sono fatti a serratura e se mancano le interazioni adeguate, la funzione dell’enzima non può essere utilizzata. Le molecole funzionali hanno la possibilità di ripiegarsi nello spazio, azione che è consentita da legami deboli. Le interazioni di Van der Waals sono molto delicate, poiché si stabiliscono ad una determinata distanza tra i centri degli atomi. L’altra cosa che domina la vita, che ha permesso la vita come la conosciamo è la presenza dell’acqua, considerato il solvente per la vita ed è stato utilizzato dagli esseri viventi come mezzo dove si svolgono la maggior parte delle reaizoni chimiche. Per via della sua capacità di essere una molecola polare ha molte proprietà. È capace di stare allo stato liquido tra gli zero e i 100 gradi centigradi. Proprietà dell’acqua: • Coesione: capacità dell’acqua di formare legami ad idrogeno. La capacità di coesione delle molecole d’acqua, permette molte funzioni che servono alla vita, come la risalita dell’acqua dalle radici alle foglie, poiché l’acqua è capace di stabilire legami ad idrogeno. • L’elevato punto di ebollizione, è dovuto al fatto che nel processo di evaporazione, c’è una rottura di legami ad idrogeno, che è una reazione endotermica. Mentre quando si formano si ha una reazione esotermica. Ipotizziamo di andare sotto zero, l’acqua nelle membrane si espande e si formano cristalli di ghiaccio. Quando si formano i cristalli di ghiaccio, rilasciano temperatura. Nel cristallo di ghiaccio le molecole d’acqua si stabilizzano formando legami stabili ad idrogeno e dove si formano fermentazione. Si poteva avere un processo chimico uguale anche senza cellule vive, prendendo cellule di lievito, rompendole con sabbia di quarzo e terra diatomaciosa, mettendole sotto una pressa, si riporta attraverso un piccolo tubino che è a 500 atm e la riporto subito ad 1 atm e facendo questo le cellule di lievito esplodono e sono sicuro di aver rotto tutte le cellule. FENCE PRESS (strumento che permette di rompere le cellule a livello meccanico, creando uno shock di pressione). Si è preso questo composto ed è stato messo in un ambiente in cui poteva avvenire la fermentazione (presenza di glucosio o zucchero di canna) e in luoghi in cui di solito non avveniva la fermentazione (lattosio, mannosio). Si è notato che avveniva la fermentazione dove erano presenti elementi che normalmente creavano reazioni di fermentazione (glucosio e zucchero di canna). Partendo dagli zuccheri, vediamo cosa serve per formare gli zuccheri: CO2 e acqua (H2O). Gli zuccheri sono formati da carbonio, idrogeno ed ossigeno e, legandosi insieme, formano polisaccaridi. Se agli zuccheri aggiungiamo altro ossigeno, tramite ossidazioni, possiamo formare molecole più ossigenate, come glicerolo, acidi grassi e steroidi, dai quali si possono formare i lipidi. I composti come il glicerolo, gli acidi grassi e gli steroidi, se sottoposti ad aminazione, si possono formare amminoacidi, che poi si legano per formare rispettivamente proteine. Ma si possono formare anche nucleotidi, che tramite fosforilazione, si trasformano in nucleosidi trifosfati, che poi vanno a formare gli ACIDI NUCLEICI. Un passaggio cruciale è il passare da precursori, che sono piccole molecole organiche, a molecole organiche. Questo avviene grazie alla formazione di polimeri, che si formano grazie a reazioni che vedono l’aggiunta di un monomero ad un polimero che si sta formando o ad un altro monomero. Per idrolisi i monomeri possono essere separati dai polimeri. Questo è un processo importantissimo che porta alla formazione di macromolecole. È possibile provare, nella vita di adesso, a sostituire un elemento con un altro? Il fosforo è un elemento che assomiglia molto all’arsenico. Nel 2011 un gruppo ha trovato dei batteri, una specie di batterio che è stato isolato dal Mono Lake in California, che avevano la capacità di vivere in un ambiente con alta concentrazione di arsenico nell’acqua. Hanno provato a far crescere questi batteri in un ambiente con assenza di fosforo e i batteri sono stati capaci di riprodursi in presenza di arsenico, poiché hanno preso l’arsenico al posto del fosforo. Avevano evidenze che il batterio era capace di sostituire il fosforo con l’arsenico per contribuire alla sua crescita. Con esperimenti successivi avevano scoperto che nel terreno che davano c’erano presenza di fosforo, che c’erano SOLO CONTAMINAZIONI di arsenico nelle molecole. QUINDI NON SI PUÒ SOSTITUIRE NEANCHE IL FOSFORO. I COSTITUENTI ORGANICI DELLA CELLULA: 1. Zuccheri; 2. Lipidi; 3. Proteine; 4. Nucleotidi. GLI ZUCCHERI • Ruolo degli zuccheri nelle cellule: • Strutturale • Riserva di energia (Amido e glicogeno), intermedi metabolici • Elementi Strutturali. I Polisaccaridi sono elementi strutturali della parete dei batteri e delle piante. Anche l’ATP, il trasportatore universale di energia, contiene nella sua struttura uno zucchero (ribosio). Gli zuccheri Ribosio e Desossiribosio fanno parte della struttura portante del DNA e RNA. Come sono fatti gli zuccheri? Sono le molecole più semplici, composte da idrogeno, ossigeno e carbonio. I carboidrati si trovano anche legati ad altre macromolecole (es. proteine e lipidi) e ne modificano le proprietà. I MONOSACCARIDI possono essere descritti come: (CH2O)n con n=3, 4, 5, 6, 7 Esosi → n=6 Pentosi → n=5 I monosaccaridi possono unirsi per formare strutture più complesse. I monosaccaridi possono presentarsi in forme diverse: • Aldozuccheri, con gruppo funzionale aldeidico; • Chetozuccheri: con gruppo funzionale chetonico. Il fruttosio, è uno zucchero a 6 atomi di carbonio che ha un gruppo funzionale chetonico, quindi è un chetozucchero. Questi zuccheri hanno un’altra caratteristica, ovvero sono molecole chirali. Le molecole contenenti carbonio, possono formare stereoisomeri. Potremo avere L-glucosio e D-glucosio. L’L-gliceraldeide e la D-gliceraldeide. Le molecole con geometria diversa hanno proprietà chimiche diverse. Lo stereoisomero L- Glucosio non è utilizzato dagli esseri viventi, poiché l’enzima esochinasi (utilizzato nella glicolisi) si è evoluto per agire unicamente sul D-glucosio. Per distinguere il glucosio in forma L alla forma D si osserva un atomo di carbonio. Il carboidrato è D se ha il penultimo carbonio (numero 5) con il gruppo alcolico a destra. Se invece ha il gruppo alcolico a sinistra si ha la forma L del glucosio. Noi guardiamo il carbonio 5, poiché quando la molecola è nello spazio, la forma D ciclizza in diverse forme. A seconda di dove andranno a finire i due atomi del gruppo alcolico avremo due forme di glucosio: alpha-glucopiranosio (gruppo alcolico in basso) e beta-glucopiranosio (gruppo alcolico in alto). All’equilibrio i pentosi e gli esosi ciclizzano per formare ANELLI PIRANOSICI E FURANOSICI. Ciclizzando poi le strutture degli zuccheri sono in grado di polarizzare e formare strutture importanti per l’energia. Per vedere se una struttura è ridotta o ossidata, basta vedere quanti atomi di idrogeno sono legati alla molecola: poco idrogeno e molto ossigeno sono ridotti, se invece hanno molto ossigeno e poco idrogeno, sono ossidati. Prima di formare delle catene, gli zuccheri ciclizzati formano dei disaccaridi. A seguito di condenzsazione, i monosaccaridi possono diventare DISACCARIDI. Quando una molecola di glucosio-alpha si lega ad una molecola di glucosio- beta si forma MALTOSIO. Il saccarosio, non è altro che un disaccaride formato da alpha-glucosio legato ad una molecola di fruttosio. Il saccarosio è il principale prodotto della fotosintesi nelle piante. I monosaccaridi, oltre che a formare disaccaridi, possono formare anche polisaccaridi, che possono essere formati da monomeri tutti uguali (omopolisaccaridi) o formati da diversi monomeri (eterpolisaccaridi). I polisaccaridi si possono presentare in forma non ramificata o forma ramificata. Per formare polisaccaridi a partire da monomeri, in una cellula due molecole di glucosio non possono interagire direttamente, hanno bisogno di essere attivati. Lo zucchero semplice di solito interagisce con una molecola, perdendo parte dell’energia, formando un composto “attivato” a livello energetico più alto. La molecola che porta la molecola ad essere attivata si chiama “trasportatore”. Per la molecola attivata è possibile fare un’interazione con un altro monomero. La molecola formata è ancora attiva e se compare un altro monomero attivato, si ha una nuova aggiunta di un altro monomero e così via. La reazione ciclica permette di allungare la catena, formando lunghi polimeri. LE UNITÀ MONOMERICHE DEVONO ESSERE ATTIVATE E AVERE UNA MOLECOLA CHE FUNGE DA TRASPORTATORE. DUE GRUPPI DI POLISACCARIDI: LIPIDI Ruolo lipidi: strutturale, riserva energetica, molecole segnale. Molecole derivate dai lipidi importanti come molecole segnale. Strutturale: membrane Riserve energetiche. Segnali: ormoni steroidei. Il fatto della creazione di membrane, determina la creazione di un ambiente diverso, ma la membrana è un ambiente, idrofobico. I lipidi determinano la creazione di un ambiente diverso, che è la membrana, dove avvengono processi unici a quel luogo. Due parole in generale della chimica, cominciando dal fatto che sono strutture idrofobiche, poiché apolari, non hanno gruppi che hanno una carica. La distribuzione delle cariche non è asimmetrica. Cosa fa una struttura idrofobica quando è in acqua? Costringe le molecole d’acqua ad essere organizzate attrono ad una struttura. Queste strutture sono strutture che hanno una bassa entropia ed un’alta energia. Quando due particelle idrofobiche interagiscono favorevolmente tra di loro, si crea una situazione più favorevole anche nei confronti del solvente, meno particelle d’acqua saranno associate all’inglobimento della struttura idrofobica, il che fa aumentare l’entropia dell’ambiente. Questa aggregazione delle particelle idrofobiche genera una situazione più favorevole per quanto riguarda l’equilibrio. Come sono fatte le particelle idrofobiche? Le strutture più semplici dei lipidi sono gli acidi grassi. In realtà gli acidi grassi hanno una testa dotata di carica, polare. Sono delle molecole anfipatiche. Hanno solo la testa polare, il resto della molecola è idrofobico. Un acido grasso può essere saturo (senza doppi legami) o insaturo (con doppi legami). Che cosa fanno queste molecole quando le metto in acqua. Tenderanno ad andare ad un livello energetico più stabile, più basso, interagendo con le parte idrofobiche. Con la testa possono interagire con l’acqua. La testa idrofilica consente agli acidi grassi di fomare delle micelle: le parti idrofobiche interagiscono fra di loro, mentre le teste interagiscono con l’acqua. É la stessa cosa di quando usiamo i saponi. I saponi sono composti da molecole anfipatiche. Gli acidi grassi non fanno solo micelle, ma possono anche fare degli strati, possono stratificarsi e quando si stratificano possono generare delle interazioni laterali con le parti idrofobiche e interazioni polari con le teste. Acidi grassi e insaturi che interagiscono, se ci sono insaturazioni in cis (gruppi dello stesso tipo sullo stesso livello) l’acido grasso si piega, se le insaturazioni sono in trans (elementi dello stesso gruppo sono disposti in posizioni opposte), in realtà l’acido grasso può proseguire nella stessa direzione. Gli acidi grassi, sotto forma di triacilgliceroli (TRIGLICERIDI), servono da riserva concentrata nelle cellule. Gli acidi grassi non vengono accumulati come tali, ma vengono legati ad uno scheletro carbonioso, il GLICEROLO. Vengono fatte tre esterificazioni a livello dei tre gruppi OH del glicerolo (sul carbonio 1, 2 e 3). Gli acidi grassi che si legano, possono essere diversi. Questo serve a produrre una molecola chiamata trigliceride, che viene utilizzata dall’organismo come riserva energetica. Se noi andiamo a vedere sia nei vegetali, che negli animali, troviamo delle cellule specializzate per accumulare trigliceridi, sotto forma di gocce che occupano, spesso, interamente la cellula. Qual è il vantaggio di avere trigliceridi rispetto ad avere come riserva energetica gli zuccheri? Il rapporto energia-massa. L’energia sta in queste molecole, nel carbonio ridotto e negli acidi grassi la maggior parte degli atomi di carbonio sono ridotti. A parità di massa nei lipidi, rispetto agli zuccheri, ho 6 volte a livello di energia disponibile. Se io trasformo tutti i grassi in zuccheri, noi peseremo 140 kg, a parità di energia disponibile. Il nostro peso sarebbe il doppio, perché in realtà i trigliceridi sono anidri, l’acqua è esclusa dalla struttura! L’aumento di energia dipende dal fatto che le molecole degli zuccheri sono idratate, invece i trigliceridi sono anidri, sono legati tra di loro con legami idrofobici, con un vantaggio a livello di volume e massa. LIPIDI STRUTTURALI: Fosfolipidi sono i principali costituenti delle membrane cellulari. La base di TUTTE LE MEMBRANE sono i fosfolipidi. I fosfolipidi sono una forma diversa dai trigliceridi. Invece che il glicerolo, si prende il gruppo funzionale fosfato. I fosfolipidi sono formati da GLICEROLO-FOSFATO, a cui sono legati due acidi grassi. Quindi il fosfolipide avrà due code idrofobiche e testa polare. Sicuramente il gruppo fosfato gli darà carica. I fosfolipidi hanno la caratteristica di essere differenti dagli acidi grassi, poiché basta che metta dei fosfolipidi in acqua, agito un po’, si creeranno dei doppi strati di fosfolipidi, che tenderanno a chiudersi tra loro per evitare al massimo le interazioni con l’acqua, formando i liposomi. I liposomi stanno benissimo in acqua, poiché le teste polari sono rivolte verso l’acqua e le code idrofobiche interagiscono solo con altre code idrofobiche. Abbiamo scoperto come sono fatti i costituenti principali di tutte le membrane. La parte che cambia nei fosfolipidi è la testa, e se cambia la testa cambiano anche le proprietà dei fosfolipidi. Andando a modificare solo la testa polare, posso cambiare le proprietà della membrana. La membrana rappresenta il centro comunicazioni di una cellula. Gli sfingolipidi sono diversi poiché hanno solo 1 acido grasso e poi hanno la sfingomielina al posto di un acido grasso → sono importanti nelle cellule nervose. Un fosfolipide può avere entrambi gli acidi grassi saturi o un acido grasso saturo e uno insaturo. Nel formare le membrane le strutture fosfolipidiche inglobano anche strutture proteiche che devono interagire con le membrane. Come fanno le proteine a stare dentro la membrana? Per rimanere all’interno delle membrane, le proteine devono avere sufficienti interazioni da potersi stabilizzare nella membrana. La zona di proteina a contatto con la zona idrofobica della membrana, deve stabilire interazioni idrofobiche con essa e nelle zone a contatto con l’acqua ci deve essere una parte della proteina polare, in grado da instaurare interazioni idrofiliche. I lipidi di riserva sono neutri (trigliceridi), mentre i lipidi di membrana sono polari. La membrana cellullare è anche costituita da glicolipidi. I glicolipidi non sono altro che lipidi ai quali è attaccato una parte derivata da zuccheri. Zuccheri legati allo scheletro del lipide, avranno una zona idrofobica e nella zona idrofilica ci saranno degli zuccheri. IL COLESTEROLO O FITOSTEROLI: Il colesterolo è presente nelle membrani cellulari delle cellule eucariotiche ma non procariotiche. È estremamente importante poiché nella cellula eucariotica ha un importante ruolo per la membrana, poiché aumenta estremamente la stabilità delle membrane. C’è una parte polare e una parte apolare. Che cosa succede alla membrana quando metto colesterolo? La parte interna è più voluminosa delle code idrofobiche, quindi la presenza del colesterolo rende la parte interna della cellula più disorganizzata. Se fosse soltanto fosfolipidi la membrana sarebbe un impaccamento estremamente stabile. Il colesterolo rende la membrana più fluidi. La testa del colesterolo invece aiuta le teste dei fosfolipidi a stare legate, rendendo i legami più stabile. Le membrane ricevono un vantaggio enorme, poiché a basse temperature si solidificano e perdono la possibilità di funzionare, diventando fragili e quindi la cellula è in pericolo. Il fatto di avere una disorganizzazione, fa sì che ci voglia una temperatura più bassa, affinché la membrana si solidifichi. Invece se le temperature aumentano, il colesterolo fa anche l’effetto di interagire con la parte esterna della membrana, rendendo le teste più compatte. Quando la temperatura è alta, la membrana può Il passo delle eliche è 0.54 nm – 5,6 armstrong → ci vogliomo 3,5 amminoacidi per formare un’elica. Tra gli amminoacidi si formano legami idrogeno. Nei foglietti beta invece gli amminoacidi sono posizionati a zig-zag e se trovano un foglietto beta vicino si formano dei legami idrogeno tra gli amminoacidi affiancati. Questi foglietti possono essere o antiparalleli o paralleli. Queste sono le due strutture principali, che troviamo in tutti gli esseri viventi. Certe volte nei foglietti beta si possono anche formare dei cambi di direzione, dati da delle sezioni instabili, in cui la proteina è libera e si determina un cambio di direzione (turn). Come facciamo a capire la forma che prende una proteina? Posso fare analisi strutturali a raggi x, o posso prevedere la struttura di una proteina, osservendo la tendenza degli amminoacidi di formare una determinata struttura e andando ad analizzare questo, riesco a capire quali sono le regioni alpha-elica, quali sono le sezioni foglietto-beta. Possiamo visualizzare la struttura di una proteina vedendo lo scheletro, le strutture secondarie o le zone accessibili a solventi, dove è possibile anche vedere la distribuzione delle cariche e delle zone idrofobiche. Certe proteine possono funzioneare appena finito il processo di ripiegamento nella struttura terziaria, altre necessitano l’intervento di altre proteine per poter funzionare correttamente, andando a formare delle strutture quaternarie. Come si fa a vedere una proteina ripiegata nello spazio nel suo stato funzionale? Le proteine sono strutture molto piccole e la struttura, il modo più funzionale per ottenere le strutture è la cristallografia a raggi x. Delle radiazioni X vengono mandati contro un cristallo di una certa proteina, che deve essere estremamente regolare e puro. Alcuni raggi x colpiscono l’oggetto, altri colpiranno il cristallo e la radiazione verrà deviato dal cristallo, ma in maniera estremamente regolare. Il primo passo è avere un pattern di diffrazione molto regolare. La prima proteina ad essere stata osservata, fu la mioglobina. Ogni atomo è numerato nella rappresentazione tridimensionale. Una cosa è ottenere lo scheletro, senza le catene laterali. Quando vado ad aggiungere le catene laterali, ottengo una struttura molto più complessa. Queste sono proteine che per cristallizzarle in laboratorio, devo averle estratte da una cellula, purificate meticolosamente. Devo metterle in soluzione e togliere gradualmente il solvente (acqua), finché non si cristallizzano. Per ogni proteina bisogna trovare le condizioni giuste per farla cristallizzare. Ci sono altri modi per vedere le proteine. Un altro modo è l’NMR, la risonanza magnetica nucleare. La risonanza magnetica permette di vedere un pattern di atomi della proteina, che risonano in un certo modo essendo esposti ad un campo magnetico intensissimo. Il vantaggio è che non devo avere cristalli di proteine. Il problema è che è più difficile scoprire quale atomo ha dato una certa macchia. Devo quindi prendere le mie proteine e mettere dei marcatori, composti da metalli pesanti, che hanno un segnale molto intenso. Devo mettere isotopi pesanti e a quel punto posso avere delle macchie più intense che mi identificano quella specie, quell’elemento. Questo mi rende più facile la mappatura degli atomi. Più difficile è invece ottenere la struttura tridimensionale delle proteine all’interno delle membrane, poiché le proteine di membrana hanno delle parti idrofiliche, ma anche delle parti idrofobiche. Nel processo di creazione delle proteine di membrana, esse vengono già inserite nella membrana. Negli anni ‘80, si è riusciti a cristallizzare le proteine di membrana, con dei detergenti specifici. Si sono creati anche nuovi detergenti di sintesi. Mettendo in acqua diversi detergenti si riusciva a rompere le membrane e a mantenere però le proteine integre e funzionanti. Da queste strutture solubilizzate, attraverso la concentrazione di queste sospensioni di proteine, prendendo le proteine e mettendole in soluzioni particolari, era possibile ottenere un cristallo. Hartmut Michel fu quello che riuscì a cristalizzare una proteina che costituiva il centro fotosintetico dei batteri. Questo complesso contiene anche molti pigmenti ed è capace di strappare elettroni ad un donatore e fare composti ridotti, utilizzando come energia quella dei fotoni. Il fatto che questo complesso di proteine cristallizzò, comportò lo studio della forma tridimensionale. Tuttavia, il processo di cristalizzazione per altre proteine non funzionava, bisognava cambiare il protocollo ogni volta che si vuole studiare una nuova proteina. Nella struttura quaternaria si hanno diversi polipeptidi che interagiscono tra di loro per formare una proteina funzionante. Un esempio di proteina con struttura quaternaria è l’emoglobina, che è un tetramero. Le strutture tridimensionali che si formano dipendono dalle interazioni che si formano tra gli atomi, per formare una struttura più stabile. Quando la proteina si ripiega nello spazio trova il suo valore più basso di energia libera, l’energia libera diventa più negativa e quindi diventa più stabile. Questo è un sistema che posso “rompere”, poiché sono tutte interazioni deboli. Se porto una proteina ad alte temperature (100°C) o la espongo a certe sostanze chimiche (es. urea), la proteina si denatura, perdendo la sua struttura tridimensionale. Ci sono delle proteine che riportate alle loro condizioni fisiologiche, possono ritornare nella loro struttura tridimensionale e riacquistare la loro funzione. Altre proteine però, una volta denaturate perdono permanentemente la loro funzione, poiché si ripiegano in modo errato. Nel 1962, F. M. Ritossa, un biologo italiano, studiando lo sviluppo del moscerino della frutta Drosophila, riferì la sua curiosa scoperta: • quando la temperatura a cui le larve del moscerino si sviluppavano aumentava dai normali 25°C a 32°C, si attivavano nuovi siti nei cromosomi giganti delle cellule larvali. I risultati suggerirono che l’aumento di temperatura induceva l’espressione di nuovi geni. Ritossa pensò che erano delle regioni che si attivavano in base alla temperatura, che chiamò heat shock. Questi geni rispondono solo quando aumenta la temperatura dell’ambiente. Proteine da risposta allo shock termico (hsp). In seguito, identificati e chiamati Chaperoni. I Chaperoni non sono altro che proteine che assistono le altre proteine a ripiegarsi. All’interno dei chaperoni ci sono delle camere, che hanno la funzione di assistere al ripiegamento di una certa proteina. I chaperoni sono collocati nel citoplasma. Quando la proteina non è ripiegata bene, espone dei residui che non stanno bene nell’ambiente acquoso, trovano queste proteine che hanno un residuo idrofobico esposto, entrano in queste proteine (chaperoni) e nella prima camera ci sono degli enzimi idrolitici che portano un’altra proteina a chiudere l’entrata. Dentro la camera, la proteina può esplorare nuove interazioni deboli e poi grazie all’ATP si apre il punto di uscita e la proteina riformata può uscire e, se non è ancora ripiegata bene, può rientrare nel chaperone e ricominciare il processo. Esperimento di Stress: Prendo del materiale batterico, vegetale e animale e le espongo ad alte temperature (39°C). Senza pretrattamento, le cellule soffrono e cominciano a morire. Secondo passaggio: metto per un attimo le cellule a 39°C per un determinato periodo, per poi rimetterle a temperatura ambiente. Dopo che ho fatto il pretrattamento, le lascio riposare e dopo un certo periodo di tempo le rimetto a 39°C. Si scopre che le cellule che ho pretrattato, sopravvivono in maniera maggiore rispetto alle cellule che non sono state esposte a pretrattamento. Cosa è successo? Sono coinvolti i chaperoni. Quando porto le cellule a 39°C, le proteine perdono più facilmente la loro conformazione e perdono quindi le loro funzioni. Una delle tecniche per ingannare i virus è quella di alzare la temperatura, rendendo più vulnerabili i virus. La temperatura è per quello che è una difesa. Se io pretratto le cellule con una temperatura alta, per poi rimetterli a temperatura ambiente, c’è un adattamento, lo stress ha attivato dei sistemi di difesa. Si attivano i geni dei chaperoni. Analizzando con elettroforesi l’espressioni di geni di una cellula a 25°C e a 39°C, noto che a 39°C ci sono certi geni che aumentano in quantità, questo Stiamo parlando di come cresce un SINGOLO FILAMENTO DI DNA. Anche gli acidi nucleici hanno una struttura ben definita: • Struttura primaria: sequenza di nucleotidi; • Struttura secondaria: anche i nucleotidi possono ripiegarsi e formare delle strutture precise. • Struttura terziaria: possono formare strutture tridimensionali complesse. Crick e Watson furono coloro che scoprirono la struttura del DNA, negli anni ‘50. Si era visto che in tutte le molecole di DNA c’era la stessa percentuale di AT e CG, rapporto 1:! tra le basi puriniche e le basi piramidiniche. Rosalind Franklin stava per pubblicare l’articolo su una rivista, ma morì prima che il processo andasse a buon fine, allora Crick e Watson riceverono le immagini dell’analisi a raggi X effettuatra da Franklin e notarono che c’era un rapporto tra basi puriniche e basi piramidiniche. Ipotizzarono quindi che esistevano molecole di DNA a due eliche antiparallele. Una elica 3’-5’ e l’altra 5’-3’. Crick e Watson pubblicarono il lavoro prima che Rosalind Franklin morì, ma pubblicò che la loro scoperta era grazie alle sue analisi. A Rosalind Franklin, morta per tumore nel ‘58, non venne dato il premio noble, assegnato nel 1962 a Crick e Watson. I due filamenti sono complementari, tendono a stabilizzarsi, quando si dispongono in forma antiparallela, perché questo permette alle basi azotate si trovino planarmente di fronte e in questa posizione, sono capaci di formare legami idrogeno. L’adenina e la timina si legano formando due legami idrogeno, mentre la citosina e la guanina si legano tramite tre legami idrogeno. L’uracile si può legare con lo stesso numero di legami idrogeno all’adenina. Quando dispongo 5’-3’ due filamenti, si forma un’elica. Tutti i nucleotidi, vengono sintetizzati sempre nella direzione 5’-3’. Se guardiamo la struttura secondaria, vediamo che ci sono delle scanalature. C’è uno spazio diverso in certe regioni e questo è importantissimo, poiché il DNA per essere funzionale deve interagire con moltissime molecole e questa struttura permette alle proteine di leggere, interagire con certe regioni del DNA. Queste zone sono zone di contatto in cui le proteine possono leggere la sequenza di quella particolare regione di DNA. L’RNA invece è identico al DNA, ma ha la differenza di avere nucleotidi con uno zucchero con un gruppo H, invece che un gruppo OH. Il DNA viene creato su copia del DNA. Molte basi, dopo che è stato prodotto l’RNA, ci sono delle basi particolari, che sono modificate in seguito alla sua sintesi. Non ha solo quattro basi (A, C, G e U), ma esistono basi molto diverse. Questo conferisce a questa molecola un ruolo importantissimo. Gli RNA principalmente nelle cellule hanno la funzione di messaggeri, trasportando informazioni che poi serviranno a sintetizzare le proteine. Ma esistono anche RNA che non trasportano informazioni: • rRNA (RNA ribosomiale); • Transfer RNA (tRNA); Alcuni RNA hanno anche delle molecole che servono per regolare l’espressione dei genomi. Gli RNA possono ripiegarsi, formando delle anse e delle regioni in cui sono presenti legami idrogeno e possono prendere delle strutture simile a quelle delle proteine, che conferisce a particolari tipi di RNA anche funzioni catalitiche. La cosa che ha lasciato molto perplessi all’inizio è che abbiamo 4 nucleotidi per 20 amminoacidi. Da un linguaggio di 4 lettere si passa ad un linguaggio di 20 lettere. Ocioa, alla fine degli anni ‘50, riuscì a decifrare il codice genetico. Devo fare 20 amminoacidi e usare 4 lettere, se combino le 4 lettere insieme, se uso 2 lettere alla volta, posso fare 16 combinazioni diverse, che sono troppo poche. Se invece faccio 3 basi: 4^3=64 combinazioni diverse. Sono più del necessario! Possono però esistere sinonimi, vale a dire che combinazioni diverse possono avere lo stesso significato. Questi gruppi di 3 basi sono chiamati CODONI. Alla fine di ogni sequenza per codificare la proteine ci sono sempre 3 codoni (UAA, UAG o UGA). Lezione 28-10-2020 Il codice genetico è letto 3 nucleotidi alla volta. Si passa da un linguaggio DNA ad un linguaggio RNA e dal linguaggio RNA si passa al linguaggio ad amminoacidi. Punti fondamentali del codice genetico: 64 differenti codoniz fatti da triplette, non c’è punteggiatura eterna e questi 64 codoni sono stati decifrati con la creazione di polipeptidi artificiali ed un sistema in vitro di cellule con citoplasma purificato e vedevo che proteina mi costruiva con il codone artificiale che avevo dato. È stato possibile facendo sintesi proteiche in vitro quali erano I significati dei differenti codoni. Ci è voluta però la tecnologia di poter fare nucleotidi artificiali in modo da ottenere combinazioni diverse. Il codice generato è altamente degenerato poiché ha molti sinonimi, è ridondante. Se vediamo la tabella non è per niente casuale. Se guardiamo le variazioni, quando ho le prime due basi che sono uguali, può darsi che anche l’amminoacido sia uguale. In tutte le cellule la biosintesi di una proteina funionale è il risultato di una via metabolica complessa e dinamica. Quello che porta l’informazione dal DNA alla proteina è un sistema precisissimo. Inserisce dei checkpoint, dei punti di controllo di qualità ad ogni passaggio. Avendo punti di controllo posso eliminare i componenti difettosi, evitando alla fine di avere un prodotto difettoso. Anche i meccanismi che legano le informazioni tra di loro sono metabolismi che si sono evoluti per mantenere un altissimo livello di precisione e qualità. BIOENERGETICA La bioenergetica è una materia nata negli anni ‘80 che studia il flusso di energia attraverso gli esseri viventi. Abbiamo un input di energia nel sistema, per esempio negli organismi autotrofi fotosintetici ricevono energia dall’esterno sotto forma di fotoni e riescono a trasformarla in energia chimica, molecole. Questi composti prodotti vengono utilizzati da altri organismi per produrre energia e, grazie all’azione di organismi decompositori, le forme di energia avanzate possono essere di nuovo trasformate in molecole semplici. I composti energetici sono a bassa entropia, ma ad alta energia libera. Dopo la decomposizione si ha invece alta entropia e bassa energia libera. Dobbiamo capire i termini di entropia ed energia libera. Per sapere questo dobbiamo mettere in conto che noi siamo organismi in relazione con l’ambiente. Noi siamo dei sistemi aperti, scambiamo energia liberamente con l’ambiente, questo è cruciale, poiché dobbiamo fare un bilancio preciso ed equilibrato. Noi sì ci organizziamo e siamo strutture organizzate, ma nel contempo dobbiamo farlo a scapito di un altro, lo facciamo quindi rilasciando calore ed entropia nell’ambiente. Cosa cambia in un essere vivente (organismo unicellulare) un millisecondo prima che muore e un secondo dopo? Si può notare dal raffreddamento della sua superficie, dalla cessazione del movimento. Parliamo di energia libera e Lezione 02-11-2020 LE MEMBRANE BIOLOGICHE Topologicamente, come ambiente di sintesi delle proteine, possiamo considerare gli ambienti all’interno delle membrane biologiche, come ambienti esterni alla cellula. Come è fatta la membrana? I primi esperimenti che sono stati effettuati sono per esempio trattare le cellule con coloranti idrosolubili e liposolubili. Si è scoperto che i coloranti liposolubili coloravano le cellule, mentre i coloranti idrosolubili non coloravano la cellula e quindi rimanevano all’esterno di essa. A quel punto si cominciò a lavorare sui lipidi, poiché si ipotizzò che la membrana delle cellule fosse composta da lipidi. Langmuir, in epoche vicine, isolò i lipidi e ne studiò il comportamento in fase acquosa. Gortel e Grendel, presero dei globuli rossi, estrassero i lipidi dagli eritrociti e calcolarono quanti lipidi c’erano in un eritrocita. Misuravando quanto occupavano i singoli lipidi, se si considerava che la superficie fosse composta da un solo strato di lipidi, la grandezza della superficie era maggiore rispetto alla superficie dell’eritrocita. Ipotizzarono quindi che ci fosse un doppio strato di lipidi. Quindi costruirono il primo modello, che risolvevano anche il problema della presenza della cellula in un ambiente acquoso esterno, con un ambiente acquoso interno, grazie alle teste polari. Danielli e Davson, nel 1935, fecero delle analisi con degli elettrodi e scoprivano che nelle membrane era presente un movimento di cariche, gli ioni devono passare e ipotizzarono che ci fossero delle cavità, formate da delle proteine, che formavano dei pori sulla membrana. Riuscivano a spiegare bene i comportamenti della membrana nei confronti degli ioni, ipotizzano l’esistenza delle proteine di membrana. Nel 1958, Robertson, sulla base delle osservazini al microscopio elettronico introdusse il concetto di membrana unitaria. Due modelli: • a sandwich • a mosaico Il modello con le proteine sulla superficie della membrana furono confutati con delle fosfolipasi, enzimi che digerivano i lipidi. I lipidi non erano protetti da proteine, poiché senno le fosfolipasi non avrebbero avuto effetto. Modello Singer & Nicolson: modello della membrana a mosaico fluido. I lipidi più semplici sono gli acidi grassi; questo tipo di strutture, sono, dal punto di vista sterico, sono delle molecole coniche, l’ingombro sterico essendo conico, fa sì che queste molecole in acqua si dispongano sotto forma di piccole goccioline chiamate micelle, al cui interno hanno la parte idrofobica, mentre le teste polari interagiscono con l’acqua. Se prendo le strutture dei fosfolipidi e le analizzo dal punto di vista sterico, noto che hanno la testa più voluminosa degli acidi grassi, ma al contrario degli acidi grassi, hanno due filamenti, quindi hanno un’ingombro sterico conico, che non gli permettere di formare delle micelle, ma gli permette di formare doppi strati che poi andranno a formare dei liposomi. Si possono creare anche dei doppi strati artificiali, ponendo delle microfessure tra due contenitori in cui è presente dell’acqua. In questo caso i fosfolipidi vanno a formare spontaneamente dei doppi strati. I doppi strati fosfolipidici sono dunque delle strutture auto-assemblanti. Definizione di membrana cellulare: La membrana cellulare è composta da un doppio strato fosfolipidico, in cui sono presenti delle proteine, glicolipidi, glicoproteine e colesterolo. Il ruolo della membrana cellulare: Permettere alla cellula di comunicare con l’esterno, di filtrare le sostanze che accedono all’ambiente interno della cellula e di muoversi. DEFINIZIONI PROF: La membrana cellulare è costituita da un sottile film (doppio strato) di molecole lipidiche tenute assieme da interazioni non covalenti e da molecole proteiche immerse o interagenti con esso. La membrana plasmatica racchiude la cellula, permette il trasporto di sostanze, è stabile, è flessibile, crea dei comportamenti con caratteristiche e composizioni chimiche diverse. Tre movimenti possibili: la rotazione di un fosfolipide, la diffusione laterale di un fosfolipide, la diffusione trasversale (“flip-flop”). Come si fa a misurare come si muove una molecola in una membrana? Le membrane sono ferme o sono fluide? Si prende una cellula e per riuscire a vedere i fosfolipidi si può utilizzare una sonda fosforescente (fluoroforo), che si lega alle teste polari dei fosfolipidi. Se io guardo poi la cellula al microscopio a fluorescenza, vedo la superficie della cellula che mi emette luce di fluorescenza e vedrò la superficie della cellula completamente fluorescente, poi cosa faccio per vedere se i fosfolipidi si muovono o no? Posso togliere la marcatura a qualcuno. Questo posso farlo chimicamente tramite fotolisi, una reazione causata dall’esposizione ad una forte fonte luminosa, per esempio un LASER. I lipidi sono rimasti, ma ho danneggiato il gruppo fluorescente con fotolisi. Osservo con un microscopio la zona sbiancata e vedo che nella zona sbiancata lentamente riappare la fluorescenza e col tempo la zona sbiancata diventa di nuovo fluorescente. Cosa è successo? I fosfolipidi hanno cambiato posizione. Questo mi fa capire che i fosfolipidi diffondono nello strato della membrana. Questo esperimento è chiamato FRAP e questa tecnica è chiamata FOTOBLEACHING, tecnica utilizzata anche per calcolare la velocità dei fosfolipidi, che è di due micrometri per secondo. Per misurare la velocità di diffusione e il coefficiente di diffusione, basta costruire un grafico, con il tempo nell’asse delle ascisse e l’intensità di fluorescenza nell’asse delle ordinate. Il coefficiente di diffusione cambia molto con la temperatura. Gli organismi che vivono nelle acque artiche e gli organismi che vivono nelle aree più calde, hanno una conformazione diversa della membrana. La velocità con cui si muovono cambia molto a seconda della temperatura. DIFFUSIONE TRASVERSALE Perché questo movimento è più lento? Perché c’è una testa polare che deve superare una barriera energetica forte, un’area idrofobica, che difficilmente viene superata, ma si è visto che questo movimento avviene e anche con molta efficenza. Qual è la soluzione? Esistono delle macchine proteiche, le FLIPPASI, che sono delle ATPasi (idrolizzano ATP), che trasportano un fosfolipide da un lato all’altro della membrana. LA FLUIDITÀ DELLA MEMBRANA La fluidità della membrana è data sicuramente dalla temperatura e dai doppi legami C=C. Se abbiamo temperature basse, la membrana tende ad irrigidirsi e ad assumere uno stato di gel solido; Se è alta tende a disgregarsi e rompersi. Le membrane non sono tutte uguali, se guardiamo la membrana dei mitocondri, la membrana lisosomiale, la membrana nucleare, l’ER ruvido, l’ER liscio, la membrana del Golgi, hanno tutte una conformazione diversa. La Cardiolipina per esempio è presente SOLTANTO in alcune membrane. Se in una miscela di solventi, i solventi meno polari sulle lastri per diffusione capillare, si muoveranno più velocemente dei composti che sono polari. Le membrane sono semi-permeabili (permeabilità selettiva). Questo perché la membrana di suo, senza proteine, come doppio strato fosfolipidico, ha delle caratteristiche fisico-chimiche, per esempio un colorante idrofobico passa attraverso la membrana. Se faccio uno strato di fosfolipidi sintetico, che cosa passa e che cosa non passa? Le piccole molecole non polari (O2, CO2, benzene), possono muoversi tranquillamente attraverso un doppio strato di fosfolipidi artificiali. Se prendo delle molecole piccole polari, senza carica netta, queste molecole sono piccole e polari, però riescono ad attraversare la membrana. Le molecole piccole idrofobiche attraversano però la membrana molto più rapidamente delle piccole molecole polari. Poi abbiamo le molecole polari di dimensioni maggiori, che hanno una barriera energetica molto più alta e quindi vengono deviate dalla membrana. Ugualmente gli ioni sono respinti dalla membrana. Anche se gli ioni sono estremamenti piccoli, questi vengono ugualmente respinti dalla membrana, poiché hanno una carica netta. ESPERIMENTO DI COLLANDER E BARLUND: Penetrazioni dei composti organici in cellule vegetali. Grafico con coefficiente di ripartizione olio/acqua sull’asse delle ascisse e con permeabilità relativa sull’asse delle ordinate. Ciascuna molecola diffonde attraverso il doppio strato fosfolipidico lungo il prorpio GRADIENTE DI CONCENTRAZIONE. Se c’è un gradiente alto di concentrazione tra i due ambienti e la membrana è permeabile a quella sostanza, la sostanza permeerà molto velocemente. DIFFUSIONE SEMPLICE ATTRAVERSO UNA MEMBRANA PERMEABILE AI SOLUTI. Queste sono le regole per la diffusione semplice di soluti attraverso la membrana, dipendono dalla concentrazione e dalla carica nei due ambienti. Diffusione facilitata: diffusione aiutata da una proteina, o da un sistema proteico. Nelle membrane biologiche abbiamo dei sistemi che sono dei canali, che permettono agli ioni di passare attraverso la membrana, chiamati canali ionici. Poi abbiamo la possibilità che ci siano dei trasporti, con rilevazione della sostanza e quando parliamo di trasporti, esistono dei tipi di trasporto che vanno contro il gradiente di concentrazione. TRASPORTO PASSIVO: se il flusso avviene solo con la spinta del gradiente di concentrazione (più concentrazione all’esterno → IN, più concentrazione all’interno → OUT). Come può avvenire il trasporto passivo? Il trasporto passivo è attraverso proteine che fanno da canali, poli acquosi in cui viene riconosciuto un soluto e fatto passare o può avvenire attraverso vettori. TRASPORTO ATTIVO: può avvenire CONTRO il gradiente di concentrazione e quindi significa che devo FORNIRE ENERGIA (spesso sotto forma di ATP). L’energia può essere data in molti modi diversi, ma prima guardiamo la carica. La membrana è neutra e all’esterno ho molte cariche positive, mentre all’interno ho poche cariche positive, lo ione si sposterà dall’esterno verso l’interno. Se ho una membrana caricata positivamente all’esterno e negativamente all’interno, lo ione positivo all’esterno avrà una forte spinta per entrare all’interno della cellula, avrà molta energia per tornare nell’ambiente interno. C’è un forte gradiente chimico e un forte gradiente elettrico sulla membrana. Se ho invece una membrana carica negativamente all’esterno e positivamente all’interno, il gradiente elettrico è piccolo, mentre il gradiente chimico è grande, ma si equilibrano tra di loro. Non mi posso quindi limitare a vedere la identità chimica, devo guardare anche la carica della membrana in cui si muove, ovvero il gradiente elettrico. Per questo per analizzare certi tipi di molecole (ioni) devo analizzare il gradiente ELETTROCHIMICO, che è influenzato anche dalla carica sulla membrana. TUTTE le cellule hanno una carica sulla membrana. Da dove proviene l’energia per il trasporto attivo? Che energia si può utilizzare per portare una molecola contro-gradiente? O si usa una differente specie chimica, che è molto favorita ad essere liberata all’interno, poiché non è presente all’interno. Questa specie chimica favorita nega la specie chimica sfavorita e utilizza l’energia per portare anche la molecola sfavorita all’interno (trasporto accoppiato). Si può utilizzare anche dell’ATP, idrolizzandolo, che genera un cambio conformazionale nella proteina, che permette alla molecola sfavorita di passare. (POMPA ALIMENTATA AD ATP) Un altra fonte di energia potrebbe essere la luce, ci sono delle proteine che consentono il trasporto a molecole sfavorita utilizzando fotoni, che modificano la conformazione della proteina. (POMPA FOTOALIMENTATA) L’ATP può essere utilizzato in due modi: • Primario: l’ATP guida il trasporto; • Secondario: usato tantissimo dai batteri, per prendere i nutrienti dal terreno. Usano l’ATP per portar fuori una molecola contro-gradiente, creano un gradiente della molecola fuori, dopodichè questa specie chimica viene reintrodotta all’interno della cellula, questa volta non più contro-gradiente, accoppiata alla molecola interessata. (TRASPORTO ATTIVO SECONDARIO) Globalmente la semipermeabilità della membrana cellulare è definita dalla presenza del DOPPIO STRATO DI FOSFOLIPIDI e da una SERIE DI PROTEINE che fungono da TRASPORTATORI. Un trasporto ionico può essere effettuato anche da ionofori (trasportatori mobili), in favore del gradiente elettrochimico. Es.: Nelle cellule epiteliali del lume intestinale, dove sono presenti villi, in cui il tessuto epiteliale è fatot in modo che la membrana dal lato esposto verso il lume ci sono dei trasportatori diversi rispetto al lato della membrana rivolto verso il sangue, per esempio. Dal lato esterno per esempio possiamo trovare un simporto, un trasporto che permette il passaggio di due molecole. Il sodio entra molto spontaneamente, poiché la concentrazione esterna di Na+ è molto elevata. Ma il trasporto del sodio può avvenire solo se esso è legato al glucosio. Poi dal lato della membrana rivolto verso il sangue, c’è un trasportatore dedicato solo al glucosio che esce e finisce nel sangue. Per quanto riguarda il sodio invece, esiste una proteina che permette il passaggio del sodio nel sangue con lo scambio di potassio. In questo modo è possibile mantenere il gradiente di sodio e quindi di assorbire più sodio e glucosio. Tutta l’energia la dà la proteina è la pompa sodio-potassio, che idrolizza ATP e quindi è l’ATP a fornire tutta l’energia. Sappiamo anche come funziona il simporto Na+-Glucosio a livello molecolare. Solo quando anche il glucosio è legato alla proteina, essa cambia la sua conformazione e permette il passaggio anche del sodio. Il trasportatore di glucosio (GLUT1), invece, il ciclo è più semplice, poiché il trasportatore lega il glucosio, cambia la conformazione appena si lega il glucosio e permette il passaggio del glucosio. Questa proteina segue il gradiente di concentrazione, è solo la concentrazione diversa dai due lati che spinge la molecola di glucosio da un lato o dall’altro. LA POMPA Na+-K+ (pompa sodio-potassio): IMPORTANTISSIMA PER GLI ESSERI VIVENTI, soprattutto nelle cellule ANIMALI. C’è sempre una differenza di potenziale sulla membrana e questa carica è mantenuta proprio dalla pompa sodio-potassio. Questi due ioni vengono mantenuti lontani dall’equilibrio dalla pompa, che utilizza ATP, pompando fuori 3 ioni sodio e pompa all’interno due ioni potassio. Ogni ciclo che fa questo trasportatore, genera una carica positiva verso l’esterno e quindi una carica negativa all’interno. Dentro quindi avrò un gradiente negativo e all’esteno un gradiente positivo. L’ATP viene utilizzato per modificare la conformazione della proteina che porta il sodio fuori e il potassio dentro. Come si muova l’acqua all’interno delle cellule? L’acqua può passare una membrana con una cinetica molto lenta. Questo è un controsenso, poiché la cellula ha bisogno di molta acqua. L’acqua è spostata sfruttando i soluti, dove ci sono più soluti, l’acqua viene attirata dal potenziale, chiamato potenziale idrico. Quindi l’acqua viene trasportata per OSMOSI. Se metto una cellula in una soluzione ipertonica, vedo che l’acqua esce dalla cellula. I SOLUTI GUIDANO IL MOVIMENTO DELL’ACQUA ALL’INTERNO E ALL’ESTERNO DELLA CELLULA. In una soluzione ISOTONICA, lo scambio di acqua sarà uguale in entrambi le direzioni. Posso vedere in un grafico che ci sono dei picchi di corrente elettrica, di intensità bassissima (picoAmpere = 10-12 Ampere), che segnalano l’apertura del canale. Si può fare con il metodo Patch-Clamp, ma ci sono anche altri metodi, come l’inside out, in cui aspiro un po’ con la membrana, in modo che un pezzetto della membrana rimanga legato alla pipetta. Poi posso mettere il pezzetto di membrana in una mia soluzione, simulando certe condizioni del citoplasma. Poi c’è il metodo outside-in, in cui stacco la pipetta, dopo che ho causato la rottura della membrana e dopo che ho fatto questo, mentre stacco la pipetta, la membrana si ribalta. In questo modo è come se la mia pipetta sia il citoplasma. Invece nel metodo inside-out, la pipetta simulerebbe l’esterno della membrana. Per queste tecniche utilizzo un microscopio invertito, che mi consente di guardare dal basso del campione e questo mi permette di lavorare sul campione, che si troverà su una piastra e questa stessa tecnica è quella che con il microscopio invertito mi permette di fare fecondazioni in vitro, denucleazioni, ecc.. Quali sono i modi per aprire o chiudere un canale? Parecchi, poiché i canali possono essere sottoposti a molteplici segnali! Il controllo apertura/chiusura può essere voltaico, con una variazione del potenziale della membrana, ma potrebbe essere anche a controllo di ligando, cioè ci deve essere una molecola che si deve legare all’esterno (extracellulare) o all’interno (intracellulare) che permette al canale di aprirsi. Ma il sistema di controllo può essere anche a stimolo meccanico o anche a stimolo luminoso. A cosa serve aprire i canali? Serve a trasdurre segnali. Arriva un segnale, causa l’apertura del canale, lo ione passa dentro, che causa la depolarizzazione della membrana. Altri canali, come quelli a controllo di voltaggio, possono rimanere chiusi quando la membrana ha potenziale normale. Ci possono essere dei segnali A CASCATA, in cui un segnale apre un canale, che diminuisce il potenziale di membrana e questo fa aprire un altro canale. Un canale a ligando può attivare un’altra proteina G, che attiva un’enzima che produce un altro segnale, detto “secondo messaggero”. Questo è un altro esempio di SEGNALE A CASCATA. Tutto questo accade a causa dello squilibrio delle concentrazioni di ioni. La trasmissione di un SEGNALE MECCANICO, avviene grazie ai canali ionici a controllo voltaico. Come avviene l’apertura e la chiusura di un canale? ESEMPIO: Canale ionico per il Na+ a controllo voltaico Ha eliche che formano 4 domini, inoltre è presente un loop esterno, che può disattivare la proteina. Resta da capire come la proteina riesce a sentire il voltaggio e come fa ad aprirsi e chiudersi con variazioni di potenziale elettrico microscopiche. Il meccaniscmo è stato risolto. Quando il potenziale è positivo all’esterno della membrana e negative all’interno della membrana, ci sono delle eliche cariche positivamente. Quando dentro c’è molta carica negativa all’interno della membrana, vengono attratte verso l’interno, deformando la proteina, chiudendo il canale tramite delle altre eliche. Quando si riduce il potenziale, le eliche ritornano in posizione normale, permettendo al canale di aprirsi. Sono questioni di pochi armstrong che permettono alla proteina di aprirsi o chiudersi. UN CASO PARTICOLARE: Il calcio Ca2+ Lo ione Ca2+ è un importante MESSAGGERO INTRACELLULARE che trasmette segnali di attivazione a numerose componenti intra-citoplasmatiche. Il calcio svolge una funzione fondamentale di messaggero in tute le cellule. Qualche esempio speciale: • Modula la contrazione delle cellule muscolari; • Modula la trasmissione dello stimilo chimico a livello sinaptico nei neuroni. Il calcio viene usato dunque come messaggero, attraverso la sua concentrazione e come fa ad agire da messaggero? O si lega a delle MOLECOLE EFFETTORI, che quando legano calcio si attivano o si lega ad un intermedio chiamato CALMODULINA, una piccola proteina che riconosce il calcio, lo lega, cambia la sua forma e si va a legare a delle proteine bersaglio. La CALMODULINA ha 4 siti in cui lega il calcio. Si lega alle proteine bersaglio, solo quando c’è calcio e le proteine bersaglio vengono ACCESE, cioè vengono attivate e possono svolgere la loro funzione. Tutto questo avviene nel citoplasma, quando si rileva calcio nel citoplasma la calmodulina entra in funzione. In tutti gli organismi il calcio è mantenuto come ione messaggero, come ione intracellulare. Il calcio viene sequestato all’interno della cellula in compartimenti separati, per esempio nel reticolo endoplasmatico. Nel citoplasma solo a risposta di certi segnali, si aprono i canali e dato che c’è un gradiente altissimo, immediatamente ho un picco di concentrazione di calcio ed è un segnale molto efficiente, poiché si possono colpire le proteine target, come la calmodulina, che va a colpire una proteina bersaglio che poi si attiva. Dopo che ha terminato lo stimolo, il calcio, per ristabilire il gradiente, viene pompato fuori dalla cellula, con una proteina di trasporto attivo, un’ATPasi, una pompa di calcio. Prende il calcio, usa l’ATP e spinge il calcio nella direzione contraria a quello in cui andrebbe normalmente, ovvero nell’ambiente in cui è più concentrato. È in grado di legare due ioni calcio e quando ha legato i due ioni calcio idrolizza l’ATP e il gruppo fosfato che è stato liberato si lega alla proteina, che diventa una proteina fosfata. La proteina poi si apre, consentendo agli ioni di passare e di essere espulsi dalla cellula. Tutte le volte che un nostro muscolo si contrae, le nostre cellule muscolari, appena ricevano lo stimolo di concentrazione, si attivano subito l’ATPasi, che pompano fuori il calcio, permettendo di continuare a contrarre i muscoli. Il malfunzionamento di un canale, causato da mutazioni su geni, può generare patologie genetiche ereditarie o non eriditarie. IL MOVIMENTO DELLE PROTEINE Anche le proteine diffondono nella membrana cellulare, oltre che ai fosfolipidi. Come si fa l’esperimento? Per vedere le proteine che si muovono come devo fare? Devo avere un modo per vedere le proteine e per vedere le proteine, si possono utilizzare degli anticorpi, proteine speciali capaci di riconoscere proteine bersaglio specifiche. Ci sono due tipi di cellule, marcate con anticorpi trattati con fluorofori diversi. Posso utilizzare dei virus, che quando infettano le cellule, inducono le membrane a fondersi. Se le membrane si fondono insieme si formano degli ibridi cellulari di cellule fuse insieme. Quando si uniscono ottengo una cellula ibrida, che a me interessa, poiché le membrane sono diventate uniche e se io osservo dopo 40 min, noto che su tutta la superficie vedo sia la fluorescenza verde sia la fluorescenza rossa, mentre all’inizio la fluorescenza era confinata alla cellula di origine. Questo ci fa vedere come le proteine possano muoversi nel doppio strato fosfolipidico. Però LE PROTEINE NON SONO SEMPRE LIBERE DI MUOVERSI NELLA MEMBRANA: A seguito di interazioni con altri complessi proteici le proteine vengono confinate all’interno di DOMINI CELLULARI. Riprendendo l’esempio delle cellule dei villi intestinali, da una parte c’è un simporto sodio-glucosio, mentre dall’altra ci sono trasportatori di glucosio che funzionano secondo il gradiente. Le proteine simporto e trasporto di solo glucosio, sono confinate in determinate parti della cellula, creando delle zone in cui la membrana non è continua, ci sono solo dei determinati tipi di proteine. Un altro modo di confinamento proteico avviene tramite proteine interne alla cellula, chiamate CITOSCHELETRO, che si legano alle proteine intramembrana mantenendole in una regione specifica. Altre proteine possono essere mantenute in una regione specifica attraverso il contatto con un’altra cellula. O possono esserci dei complessi proteici esterni alla cellula che mantengono le proteine in una determinata regione. strutture proteiche sono mutate, la lamina nucleare diventa più debole e non può più formare una struttura circolare, poiché la polimerizzazione della lamina è resa più instabile. Questa mutazione genera una sindrome HGPS (Hutchinson-Gilford progenia syndrome): la vita media delle cellule diventa molto inferiore e la capacità nel tempo di essere funzionali si riduce e il tempo cambia nell’organismo, che ha un processo di invecchiamento rapido. I PORI NUCLEARI L’involucro nucleare permette un grande traffico tra nucleo e membrana! Tutto questo traffico è regolato dai PORI NUCLEARI, strutture IMPORTANTISSIME per la loro funzionalità. Come sono composti i pori nucleari? Sono composti da più di 50 proteine diverse (nucleoporine), che attraversano entrambi le strutture di membrana dell’involucro nucleare. I PORI NUCLEARI SONO BIDIREZIONALI. Ci sono delle strutture nel canale centrale che fungono da filtro molecolare. Sono strutture molto complesse e sono in grado, pur lavorando in modo attivo, di fare molte reazioni cinetiche in tempi rapidissimi, con una frequenza di 1000 traslocazioni al minuto! Per essere osservati, si sono selezionate delle sostanze, dei residui ribosomiali, con degli isotopi radioattivi. Si nota che queste molecole passano in precisi punti dell’involucro nucleare. Per un nucleo cellulare, possiamo ritrovare 4000 pori nucleari e hanno caratteristiche di comunicazione e filtraggio molto complesse: possono passare piccole molecole e proteine fino ai 50 KDa (chilodalton), con un diametro non superiore ai 9 nm, possono diffondere QUASI LIBERAMENTE attraverso i pori. Proteine, anche grandi, vengono indirizzate al nucleo grazie alla presenza nella loro struttura di segnali, chiamati NLS (“Nuclear Localization Signal”), che sono sequenze amminoacidiche che vengono riconosciute e portate all’interno del poro nucleare, che poi le può spostare. Tali complessi possono essere anche molto voluminose (100-200 KDa). Si può entrare, ma anche uscire dal nucleo, tutti gli RNA prodotti nel nucleo sono trasportati dai pori. Gli RNA vengono riconosciuti e prima di passare attraverso i pori, si verifica la loro integrità, se sono MATURATI correttamente. Quindi si compie anche un punto di controllo dell’RNA, che mi permette di verificare che cosa andrà nel citoplasma e verrà utilizzato. Le modifiche sull’RNA che vengono prodotte per far uscire l’RNA dal nucleo, vengono fatte all’interno del nucleo e vengono poi riconosciute da proteine specifiche, che sono in grado di legare il polo nucleare all’RNA e permetto ad esso di uscire. Per una singola disfunzione nel poro nucleare si può generare una neurodegenerazione, come per esempio la SLA: Sclerosi Laterale Amiotrofica. Nella SLA, la tossicità a livello cellulare si manifesta a livello del funzionamento dei pori nucleari. CONTENUTO NUCLEARE Cosa definiamo quando diciamo cromatina? Intendiamo due cose: DNA legato stabilmente a delle proteine e questa cromatina, nelle cellule eucariotiche, si organizza sotto forma di cromosomi. Poi abbiamo anche una regione particolare nel nucleo molte delle volte visibile, chiamato NUCLEOLO, struttura sempre formata da DNA e proteine, dove si sintetizza le COMPONENTI RIBOSOMIALI, dove dunque vengono sintetizzati i ribosomi in forma NON FUNZIONALE. Dentro al nucleo ci sono anche tutti gli RNA, poi alcuni usciranno, mentre altri resteranno dentro il nucleo. C’è una serie di piccoli RNA che hanno importanti funzoni modulatorie e regolatorie. Inoltre sono presenti all’interno del nucleo TUTTE LE PROTEINE REGOLATRICI, che sono state sintetizzate nel citoplasma, ma poi entrano all’interno del nucleo (es. FATTORI DI TRASCRIZIONE). Il nucleolo e la cromatina sono strutture VISIBILI. Il nucleolo è una struttura circolare, e poi ci sono delle regioni più dense e regioni meno dense, chiamate rispettivamente ETEROCROMATINA ed EUCROMATINA. Posso distinguere le regioni più dense o meno dense della cromatina utilizzando la luce. Il nucleolo è quasi sempre visibile, poiché ha una densità maggiore. NUCLEOLO Ci può essere anche più di un nucleolo (da 1 a 4 nucleoli!!!) all’interno della cellula e sono le regioni in cui viene prodotto l’RNA ribosomiale. Sono dunque la fabbrica dei ribosomi. Possono essere di dimensioni diverse, per esempio in cellule che possiedono molti ribosomi. Il nucleolo è responsabile della sintesi delle due subunità ribosomiali. Come è fatto un ribosoma quando viene assemblato nel nucleolo, è fatto da RNA ribosomiali e dal citoplasma, vengono importate nel nucleo tutte le proteine che devono essere assemblate insieme per formare il ribosoma. Queste proteine nel nucleolo si assemblano con gli rna per formare delle strutture, chiamate SUBUNITÀ MAGGIORE E SUBUNITÀ MINORE. Queste due strutture nel ribosoma non si uniscono, non hanno interazione. Queste strutture vengono assemblate e poi portate fuori dal nucleo attraverso i pori nucleari, che devono prendere queste strutture di grandi dimensioni e eiettarle nel citoplasma. Diversi cromosomi contribuiscono alla formazione del nucleolo, rendendo disponibile la loro cromatina. La cosa incredibile è che i RIBOSOMI SONO DELLE STRUTTURE AUTOASSEMBLANTI! RISPOSTE ALLE DOMANDE: Le proteine di trasporto sono delle proteine che possono interagire con le strutture del poro nucleare, ma possono interagire con altre strutture. Sono libere quindi di passare avanti e indietro attraverso i pori nucleari. ORGANIZZAZIONE DEL DNA NEL NUCLEO Il DNA è una struttura a doppia elica, ma se portiamo il DNA in ambienti che sono superiori a 80°C, si aumenta l’energia, i legami ad idrogeno si rompono e i filamenti di DNA si staccano, formando singoli filamenti. Questa denaturazione del DNA è reversibile, se abbasso la temperatura, i filamenti di DNA sono in grado di ri-accoppiarsi e riformare la struttura a doppia elica. I batteri hanno meno quantità di DNA nel loro genoma. Nei procarioti il DNA è nudo ed è un filamento circolare. Nei procarioti abbiamo un unico “cromosoma”, chiamato NUCLEOIDE, che è composto da DNA nudo, senza proteine stabilmente legate e circolare. Quando andiamo a vedere gli eucarioti, vediamo che il DNA è STABILMENTE LEGATO A PROTEINE ed è un filamento LINEARE, il cromosoma ha un inizio ed una fine. Queste proteine sono importantissime, poiché sono proteine in grado di tenere organizzate queste enormi quantità di DNA in filamenti che sono organizzati ed utilizzabili. Come può cambiare lo stato di avvolgimento di una struttura così lunga e complessa? LE TOPOISOMERASI: permettono di mantenere tutta questa situazione sempre organizzata, poiché questi enzimi fanno sì che non si formano nodi o super avvolgimenti nella cromatina. Ci sono due tipi di topoisomerasi: • Topoisomerasi di tipo I: eliminano i nodi tagliando una parte di un filamento di DNA e facendo passare la parte rotta attraverso il nodo; • Topoisomerasi di tipo II: eliminano il nodo rompendo entrambi i filemnti di DNA e passando la parte non rotta attraverso il nodo. • Ci sono circa 25000 geni ma troviamo 250000 proteine diverse!; A cosa serve il DNA quando è metilato? Perché delle cellule inattive hanno del DNA, è importantissimo deattivare il DNA, poiché io devo utilizzare solo le parti di cui ho bisogno. Il DNA è lo stesso nell’organismo, ma le cellule svolgono funzioni diverse. La metilazione del DNA permette di regolare lo SVILUPPO, l’IMPRINTING GENOMICO (eredità genomica, che permette alle cellule specializzate, di creare altre cellule differenziate), l’INATTIVAZIONE DEL CROMOSOMA X (CORPI DI BARR), LA MEMORIA A LUNGO TERMINE NEL CERVELLO UMANO, la CARCINOGENESI. Le cellule staminali o le cellule meristematiche nel caso dei vegetali, sono cellule che hanno ancora la possibilità di inattivare certe regioni per cominciare il processo di differenziamento, che sia irreversibile o no. Per far capire che anche l’ambiente ha effetto sull’espressione genica in individui, facendo cambiare l’alimentazione ad una popolazione femminile di topi, se le nutrivo con sostanze ricche di metile, alcuni organismi (75%) della prole non manifestava più la patologia che aveva la madre. Certe condizioni quindi possono modificare il pattern di processi che può essere trasmesso poi alla prole. Cominciano a comparire dei casi in cui le memorie sono legate all’epigenetica, le memorie tra le generazioni (QUESTO è MOLTO CONTROVERSO!!!!), è un eccezione non la norma. Ci può essere un’eredità che la memoria dei genitori può essere trasmessa alla prole, dato che va contro a tutte le regole dei genetisti (MOLTO CONTROVERSO!!!). La norma è un’altra!!! C’è stata un’evidenza che i processi epigenetici hanno una portata differente, ma non può stravolgere il panorama dei processi di differenziamento. Ci sono dei programmi estremamente definiti che permette lo sviluppo di organismi complessi. RISPOSTE DOMANDE INIZIO LEZIONE: LIPOSOMI: doppi strati di lipidi che formano delle vescicole, che hanno un ambiente acquoso all’interno, separato dall’esterno da un doppio strato lipidico. I COMPARTIMENTI INTRACELLULARI Alcuni argomenti trattati in questa unità riguardano SOLO LE CELLULE ANIMALI. È un grande vantaggio avere i compartimenti per chi li studia, perché può rompere la cellula per studiare i diversi compartimenti. Per fare questo devo utilizzare diverse tecniche, tra cui la prima è rompere le cellule o il tessuto di cui le cellule fanno parte. TECNICHE DI ROTTURA: dipende da che cosa ho in mano: • ROTTURE MECCANICHE: prendo un frullatore e lo utilizziamo per immergere la testa con una lama di acciaio, come un minipiner, lo inseriamo nella nostra soluzione tamponata a pezzetti, se è duro, lo tagliamo, lo poniamo nella nostra soluzione, azioniamo il frullatore, che andrà a rompere il tessuto e quindi le cellule. Attenzione però più aziono il frullatore più si danneggiano anche le strutture cellulari; • OMOGENIZZAZIONE LIQUIDA: Pestelli di diversi materiali, con tessuto con campioni in soluzione tampone. Si fa muovere con un motore il pestello e contemporaneamente, muovo la provetta su e giù. In questo modo il liquido è costretto a passare tra la provetta di vetro e il pestello, rimanendo schiacciato sulle pareti del potter, rompendosi. Questo tipo di lisi cellulare posso fare con tessuti molli, per esempio con cellule di fegato; • FRENCH PRESS: sempre un tipo di omogenizzazione liquida. La french press è una pressa con un cilindro a pressione e si utilizza in soluzione liquida, per esempio con dei batteri, le cui pareti sono difficili da rompere. Quindi utilizzo una tecnica che consiste nel cambiare pressione, facendo scoppiare i batteri. Dopo che ho portato la pressione tramite un pistone ad un livello molto alto, nel mio cilindro ho una valvola, che permette di far fuori uscire il liquido, che passando a condizioni di pressione altissima a pressione atmosferica, fa esplodere il contenuto del liquido, nel nostro caso facendo esplodere le cellule; • SONICAZIONE: La sonicazione usa come tecnica di rottura, le microonde, uso una punta che spara ultrasuoni, che causano una forte vibrazione che rompono le membrane. Ottima tecnica per rompere cellule senza parete. Problema di questa tecnica, inserisco una punta metallica che è legata ad un meccanismo che spara ultrasuoni. Il difetto di questa tecnica è che questo scalda la soluzione, quindi per esempio immergo la soluzione immersa nel ghiaccio; • MORTAIO E PESTELLO, con CONGELAMENTO E SCONGELAMENTO: prendo il mio tessuto, le congelo in azoto liquido e, una volta congelate, sono estremamente fragili e mi basta metterle nel mortaio, facendole diventare una polvere, in cui le cellule sono state frammentate completamente. Una volta rotto il tessuto, che cosa devo fare? I contenuti della cellula son andati in sospensione. Posso separare gli organelli tramite centrifuga. CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE: Centrifugazione con forze non troppo grandi, con cui le particelle più pesanti rimangono sul fondo, mentre quelle più leggere si trovano in strati più alti. Posso fermare il processo di centrifugazione, cambiando le forze ogni volta. Il concetto è che più aumento il tempo e la forza e più anche le componenti leggere finiranno sul fondo. Questo tipo di centrifugazione si chiama DIFFERENZIALE. Invece si possono fare delle CENTRIFUGAZIONI SU GRADIENTE. Metto una soluzione le sostanze interessate nell’analisi, usando la diversa densità degli elementi. A seconda delle densità del mezzo le sostanze con stessa densità formeranno delle bande e così via. Le particelle più leggere si trovano più in alto, mentre quelle più pesanti si depositano più in basso. Si utilizza quindi il coefficiente di sedimentazione. Per sapere quanta forza applico nella centrifuga, chiamata CAMPO CENTIFUGO RELATIVO (RCF), si utilizzano i g, che sono multipli della costante di gravitazione terrestre. Una forza molto bassa sono 1000g. Una forza alta sono 400000g. Vediamo cosa succede. Prendiamo il mio composto di cellule rotte, le metto nella centrifuga, applico forze diverse e vado a raccogliere i depositi, chiamati “pellet”. Prendo la mia soluzione omogenea e la faccio andare per 10 minuti a 1000g, poi prendo gli elementi che si sono depositati in basso. Quello che trovo in questo pellet sono i nuclei e le cellule non rotte. Se prendo il sovranatante, ovvero la soluzione sopra il pellet, lo rimetto in centrifuga e lo rimetto in centrifuga a 1000g per 10 min, facendo questo però non succede nulla e sarebbe solo un modo per verificare che non ci siano altri residui pesanti. Se cambio la forza e metto 20000g per 20 min, comincio a trovare dei pellet che contengono particelle più leggere, come mitocondri, lisosomi, ma anche perossisomi. Prendo di nuovo il sovranatante e lo faccio di nuovo centrifugare a 80000g per 1 ora, ottengo un pellet con particelle come reticolo endoplasmatico, golgi, tutte quelle componenti fatte di membrane, che una volta che rompo delle cellule, tendono a riformarsi in soluzione acquose, per minimizzare l’energia libera e quindi succede che questo tipo di rottura ha causato la rottura del golgi e del reticolo endoplasmatico, ma che si sono ricostituite e noi in laboratorio le chiamiamo microsomi, vescicole che erano prima i reticoli. Prendo il sovranatante e lo metto in un’ULTRACENTRIFUGA, con una forza di 200000g, forze capaci nel deformare il metallo dei rotori, per 2 ore. Ottengo dei pellet che contengono particelle come i ribosomi, i virus e grandi macromolecole. Con queste forze riesco a far precipitare anche sostanze che sono nel citoplasma in soluzione. Tutta questa semplice tecnica di ripetere, mi permette di andare a prendere le cose che mi interessano. GLICOSILAZIONE, che è un tipo di MODIFICAZIONE POST-TRADUZIONALE. Tante proteine glicosilate si trovano sulla membrana cellulare rivolte verso l’esterno. La glicosilazione delle proteine consiste nell’attacare un monosaccaride ad un gruppo NH2, per questo è chiamato N-GLICOSILAZIONE, dell’asparagina. La proteina si glicosila. Nel Golgi c’è un’altra possibilità di glicosilazione, chiamata O-GLICOSILAZIONE, in cui il monosaccaride si attacca ad un gruppo -OH. Ci può essere poi l’aggiunta di altri zuccheri. Nel reticolo endoplasmatico rugoso, le proteine quindi possono essere modificate e una delle modifiche del reticolo endoplasmatico rugoso è l’N- GLICOSILAZIONE. Il donatore dello zucchero è un fosfolipide, che ha due gruppi fosfato a cui poi è legato lo zucchero. Quando il legame con lo zucchero si rompe, si ha l’energia necessaria alla reazione di glicosilazione. Solo se ci sono certe sequenze si riconosce la proteina e lo zucchero viene legato, in paricolare l’oligosaccaride viene legato ad un residuo di ASPARAGINA. L’energia è contenuta già nel DONATORE. Che fine fanno poi le proteine una volta che sono nella membrana? Si generano delle vescicole, che si staccano dal reticolo endoplasmatico rugoso che poi hanno come destinazione obbligata al Golgi, dove poi verranno smistaste, eventualmente modificate e mandate alle loro destinazioni. RETICOLO ENDOPLASMATICO LISCIO Ha altri enzimi ed ha un’altra organizzazione rispetto al rugoso. In questo luogo si sintetizzano i LIPIDI. Le membrane vengono fatte dal reticolo endoplasmatico LISCIO. Un’altra funzione del reticolo endoplasmatico liscio è la DETOSSIFICAZIONE. Il reticolo endoplasmatico liscio inoltre è l’organello principe per il DEPOSITO DEGLI IONI CALCIO. Il reticolo sarcoplasmatico delle CELLULE MUSCOLARI è un reticolo endoplasmatico liscio modificato per facilitare la contrazione dei muscoli. Dove troviamo molto endoplasmatico liscio? Nelle cellule che hanno un alto metabolismo di lipidi, nelle cellule del fegato per esempio negli animali e nelle cellule che devono provvedere ai lipidi per i semi nelle piante. Come vengono sintetizzati nuovi lipidi, poiché gli enzimi per condurre la sintesi dei lipidi si trovano nel citoplasma, dove si trovano anche i precursori dei lipidi. I lipidi vengono inseriti solo nello strato esterno della membrana del reticolo endoplasmatico liscio. È molto importante che la membrana cresca in modo simmetrico e questo è permesso anche dalle FLIPPASI, che si trovano nella membrana del reticolo endoplasmatico liscio. APPARATO DI GOLGI Il Golgi ha la caratteristica di membrane che formano delle CISTERNE PIATTE, separate tra di loro e impilate tra di loro, che hanno due lati, uno verso il nucleo e un lato verso l’esterno. SI chiamo lato cis quello verso il nucleo e lato trans quello che volge verso l’esterno. Nelle piante la posizione dell’apparato di Golgi è disposto in modo diverso a causa del vacuolo. La faccia cis dal punto di vista funzionale è quella che riceve le vescicole dal reticolo endoplasmatico rugoso e liscio. Lì le vescicole possono staccarsi e fondersi staccarsi e fondersi nelle altre cisterne. Nella faccia trans le vescicole possono uscire dal Golgi ed andare in un’altra direzione. Se io fondo una vescicola con la membrana, il contenuto della vescicola diventa libero all’esterno. La membrana va a far parte della membrana plasmatica. Quando la vescicola si fonde, aggiungo nuove lipidi alla membrana e le proteine che si fondono con la membrana, diventano proteine di membrana! C’è un’altra via. Vescicole trans del Golgi possono anche andare a formare degli altri organelli, fra questi organelli ci sono i LISOSOMI, che sono organelli speciali che vanno a formare un nuovo compartimento. Anche le vescicole del Golgi possono anche tornare al reticolo endoplasmatico. C’è anche un traffico RETROGRADO. Come è stato studiato tutto questo traffico? È stato trovato tramite esperimenti che volevano ad andare a trovare mutazioni. Si è trovato un mutante che andava ad accumulare moltissime proteine nel reticolo endoplasmatico rugoso. Si è trovato poi un mutante che impediva la secrezione di proteine e quindi queste proteine si ritrovavano bloccate nel Golgi. Tramite questi esperimenti si è capito il percorso delle vescicole e dei prodotti dei reticoli endoplasmatici. Nell’apparato di Golgi le PROTEINE SONO RIELABORATE: • O-GLICOSILAZIONE; • FOSFORILAZIONE DI OLIGOSACCARIDI (PROTEINE con destinazione LISOSOMI). Dal Golgi tutti gli zuccheri che si sono attaccati alle proteine, vanno a finire, quando la vescicola va a fondersi con la membrana plasmatica, verso l’esterno della cellula. Le cellule animali hanno un GLICOCALICE, proteine che mostrano verso l’esterno gruppi GLUCOSALICIDICI. I lisosomi invece si formano dal Golgi e hanno un ruolo molto particolare: quello DIGESTIVO. I lisosomi sono organelli tipicamenti ANIMALI, poiché nelle cellule vegetali ci sono degli organelli digestivi sono generati dal vacuolo. I lisosomi sono gli organelli digestivi della cellula. Per prendere delle sostanze nutritive dall’esterno, le cellule possono usare anche il processo di ENDOCITOSI. Quando c’è una vescicola all’interno delle cellule con le sostanze nutritive, i lisosomi si fondono alla vescicola, liberando enzimi digestivi, che degradano le sostanze. Dentro ai lisosomi ci sono circa 40 enzimi TUTTI IDROLITICI, potenzialmente devastanti per una cellula. Ci sono delle nucleasi, che digeriscono il DNA, delle proteasi, delle glicosidasi, delle lipasi, delle fosfatasi, delle solfatasi, delle fosfolipasi. Tutto che è contenuto in una cellula può essere degradato dagli enzimi contenuti nel lisosoma. Il pH all’interno dei lisosomi è pari a 5 e questo permette agli enzimi idrolitici, che funzionano solo in ambienti acidi, di funzionare. Come viene mantenuto il pH acido, grazie a delle pompe protoniche che funzionano ad ATP, che portano ioni H+ e mantengono il pH fortemente acido. I lisosomi sono difficili da riconoscere. Sono importantissimi anche per moltissimi altri processi, distruggono anche quello che c’è dentro, ma possono anche distruggere organismi patogenanti, come i batteri. Quando diventano grandi, i lisosomi si dicono lisosomi secondari. Se ci sono organelli difettosi, essi vengono degradati dai lisosomi, che in questo modo fanno ottenere alla cellula dei substrati utili. C’è un meccanismo di riconoscimento degli organelli danneggiati. Quando un organismo esterno entra in una cellula, si forma un fagosoma, che poi va ad unirsi con i lisosomi. Mentre gli organelli difettosi vengono circondate da auto-fagosomi. Lezione 16-11-2020 I lisosomi secondari, riescono a degradare tutto il materiale e una volta degradato tutto il materiale, possono rilasciare tutte le sostanze utili alla cellula o rilasciare al di fuori della membrana cellulare le sostanze indesiderate. Come si creano lisosomi secondari? I lisosomi che si formano a partire da regioni del Golgi specifiche si possono fondere per digerire con organelli difettosi o con nutrienti che provengono dall’esterno. Un esempio di scomposizione di nutrienti sono quelle dell’LDL. L’LDL viene riconosciuto da recettori specifici sulla membrana plasmatica e vengono introdotti nella cellula tramite endocitosi. Quando viene una sostanza che viene riconosciuta dai recettori, il recettore induce un cambiamento a livello interno, nelle clatrine, delle proteine all’interno della membrana, che dimerizzano e deformano la membrana a cui sono adese, facendo sì che la membrana si invagini e poi dall’invaginazione della membrana si forma una vescicola e può fare il suo percorso, ovvero maturare, acidificare il suo interno, fondersi con un lisosoma e diventa un LISOSOMA SECONDARIO, il materiale che viene perso prima della fusione del lisosoma sono gli elementi che servono ancora alla cellula, come i recettori, che vengono trasportati tramite vescicole di trasporto che si sono generate separandosi dall’endosoma. Questo è un esempio su come le cellule enzimi necessari per l’espressione genica e per la duplicazione del DNA. Tutti questi processi possono avvenire nella matrice grazie agli enzimi che sono presenti. I mitocondri sono membrana e come membrana sono in grado di cambiare la loro forma, sono PLASTICI. NON SONO SPARPAGLIATI A CASO NELLE CELLULE, ma sono collocati in corrispondenza di alcune strutture chiamate CITOSCHELETRO, in particolare in una zona del citoscheletro chiamata MICROTUBULI. Esperimento di DOPPIA MARCATURA a fluorescenza, ci permette di vedere come è la struttura dei microtubuli e ci permette di marcare la posizione dei mitocondri. Se andiamo a vedere delle cellule specializzate di animali, i mitocondri si dispongono in maniera particolare. In particolare nelle cellule del MIOCARDIO, i mitocondri sono disposti a fasce alternate all’apparato contrattile. Nel flagello di uno spermatozoo invece i mitocondri sono avvolti intorno ad esso, per garantire un sufficiente flusso di energia per farlo funzionare. I mitocondri si ipotizza che abbiano un’origine ENDOSIMBIONTICA, ma diciamo che le similitudini e le indicazioni della simbiosi sono dati da alcuni punti principali: • Metodo di duplicazione: si dividono per SCISSIONE SEMPLICE (FISSIONE). Hanno una capacità di dividersi simile a quella dei batteri; • Presenza di DNA circolare: è circolare come quello dei batteri, contiene pochi geni, poiché per esempio è NUDO, privo di istoni e contiene tante copie del DNA, anche 100-200 copie. Quello umano ha 37 geni codificanti. Tutto il resto dei geni è andato a finire nel DNA NUCLEARE. NON HANNO INOLTRE LA CAPACITÀ DI RIPARARE LE MUTAZIONI; • INTERDIPENDENZA FRA NUCLEO E MITOCONDRI: Simbiosi avvenuta grazie al fatto che c’è un’interdipendenza tra il nucleo e i mitocondri. Ci sono 1400 proteine nei mitocondri, ma la maggior parte di queste proteine sono sintetizzate da geni presenti nel NUCLEO e si sono persi nel DNA dei mitocondri, permettendo alla cellula di controllare l’organello. Se guardiamo l’ATPasi per la sintesi dell’ATP sono formate da 2 proteine sintetizzate da DNA mitocondriale e da 15 proteine sintetizzate da DNA NUCLEARE; • DIFFERENZA TRA I CODICI GENETICI: ci sono dei codoni utilizzati in modo diverso nei mitocondri rispetto che nel nucleo. I MITOCONDRI VENGONO EREDITATI PER VIA UNIPARENTALE: le cellule aploidi, che hanno soltanto una copia del cromosoma, portano il DNA in quantità uguale, ma non il citoplasma. La cellula aploide FEMMINILE, ha una quantità maggiore o la totalità del CITOPLASMA. I mitocondri vengono eriditati SOLO dalla cellula MATERNA, la cellula paterna non porta citoplasma, mitocondri. ECCEZIONI: esempio di eredità mitocondriale BIPARENTALE: alcuni funghi (Saccharomyces cerevisiae). EREDITÀ PATERNA: Nelle gimnosperme i mitocondri e i cloroplasti sono ereditati per via paterna. Qual è il vantaggio di guardare quante mutazioni ci sono nel DNA mitocondriale? Ci sono più mutazioni e per vedere che cosa è successo negli anni, posso guardare il DNA mitocondriale, poiché mutando velocemente, può mostrarmi cosa è successo nel tempo e costruire ALBERI FILOGENETICI. L’invecchiamento si è visto è influenzato molto dai mitocondri. Esistono anche molte malattie o mutazioni mitocondriali → VENGONO EREDITATE PER VIA MATERNA. Questo è una CHIMERA, poiché i mitocondri hanno molte copie del loro DNA, i mitocondri possono essere mutati, però ci saranno delle copie di DNA che non saranno mutate. Ci possono essere dei mitocondri che sono molto danneggiati, ma altri non saranno molto danneggiati. METABOLISMO ENERGETICO E MITCHELL Noi siamo organotrofi, utilizziamo l’energia che proviene da molecole ORGANICHE. C’è un metabolismo extra-cellulare che avviene nell’apparato digerente, un processo metabolico intra-cellulare che avviene nel citoplasma e un processo metabolico MITOCONDRIALE. I MITOCONDRI SONO PRESENTI IN TUTTI GLI EUCARIOTI E SONO INDISPENSABILI PER TUTTI GLI EUCARIOTI. A livello del citoplasma, solo una piccola parte dell’energia viene estratta dalle molecole organiche ridotte. La maggior parte delle molecole di ATP sono fatte dall’apparato RESPIRATORIO nei MITOCONDRI. Le reazioni di ossidoriduzione: NELLA MAGGIOR PARTE DELLE REAZIONI CELLULARI SI VERIFICA UN TRASFERIMENTO DI ELETTRONI DA UNA SOSTANZA CHE SI OSSIDA (RIDUCENTE) A UNA CHE SI RIDUCE (OSSIDANTE). Nel mitocondrio, quello che succede è che l’energia contenuta all’interno di composti organici ridotti, per esempio gli acetil-CoA che viene dalla glicolisi o dai lipidi, entra nella matrice mitocondriale e nella matrice VIENE OSSIDATO in un ciclo, in cui gli atomi di carbonio vengono ossidati, liberando due molecole di CO2, ma contemporaneamente gli elettroni si trasferiscono su dei trasportatori, NAD+ e FAD2+, che si riducono e diventano NADH, FADH2. Cosa succede adesso? Noi dobbiamo produrre ATP, che è una molecola con legami ad alta energia, mentre noi abbiamo molecole ridotte. Da una parte abbiamo un composto ridotto, che può soltanto ridurre qualcos’altro e ossidarsi, ma noi dobbiamo produrre ATP. Come si fa a passare da composti donatori di elettroni ad un composto ad alta energia. La risposta più tradizionale è che di solito il processo di trasferimento per produrre ATP avveniva in un substrato ad alta energia (IDEA degli anni ‘60). L’idea è che a livello della membrana ci sono molecole riducenti, che vengono ossidate, con l’ossigeno che funge da accettore degli elettroni, liberando energia che crea un gradiente elettrochimico di protoni, nello spazio inter-membrana mitocondriale, che poi andrà ad attivare la proteina di sintesi dell’ATP, l’F0-F1 ATPasi. Come faceva il NADH, che si può solo ossidare, a formare un legame fosforico per generare ATP. Tutti facevano esperimenti sui mitocondri, per trovare una molecola ad alta energia, che non la trovarono. Io dò il NADH e i mitocondri ossidano il NADH, ma non si produce ATP e nessuno sapeva spiegare il perché. Perché la membrana mitocondriale deve essere intatta, perché non succede la stessa cosa, se io rompo la membrana? Successe che al limite degli anni ‘60, nel 1961 si presentò in un congresso internazionale a Bari e portò una sua teoria, dopo aver studiato per molto tempo in laboratorio i mitocondri. Disse di avere una proposta su come avviene il processo di accoppiamento energetico tra il NADH e l’ATP. Aveva detto che il meccanismo di traslocazione degli elettroni, il processo di ossidazione che porta all’ossigeno, permette di trasportare dei protoni all’infuori del mitocondrio, per questo ci vuole una membrana intatta. Questi protoni, devono tornare dentro, poiché senno si creerebbe un gradiente. Allora i protoni rientrano attraverso l’ATPasi, che utilizza il gradiente formato come energia per sintetizzare ATP! Nel giro di qualche anno si dimostrò che questo era vero e che esisteva un complesso respiratorio che ossidava NADH e ogni volta che c’era un processo di ossidazione, gli elettroni venivano trasportati ad un’altra sostanza, mentre i protoni si accumulavano nello spazio inter-membrana, creando un gradiente elettro-chimico. I protoni poi passavano all’interno dell’ATPasi e metteva in moto un motore che consentiva la sintesi di ATP. L’ATPasi fa una reazione reversibile, ovvero può utilizzare ATP per spingere protoni nello spazio inter-membrana, per mantenere il gradiente di protoni. La reazione è REVERSIBILE. Altra cosa interessante è che la membrana interna mitocondriale è impermeabile ai protoni, se non per mezzo dell’ATP-asi! Mitchell svelò il segreto dell’energia nei VIVENTI! Quello che fanno i mitocondri, lo fanno anche i cloroplasti nella FOTOSINTESI! C’è una componente chimica (gradiente di concentrazione di ioni H+), ma anche una componente elettrica (Potenziale di membrana). Un modo molto semplice per dimostrarlo è forare la membrana. Se io utilizzo dei composti chiamati UNCOUPLER. Tutto funziona, ma l’ATP NON VIENE SINTETIZZATO! Questo è un elemento che ci ha permesso di scoprire un fatto curioso, ovvero il modo in cui gli animali che vanno in letargo producono calore. Si è scoperto che lo fanno attraverso dei mitocondri particolari presenti in un tessuto particolare, ovvero il tessuto grasso bruno. Quando si risvegliano dal letargo, c’è una proteina che fora le membrane dei mitocondri e l’energia che si genera dal gradiente, di solito va nell’ATP-asi, ma in questo caso con dei fori La vita è legata al fatto che l’ENERGIA PUÒ ESSERE INTRAPPOLATA. I protoni arrivano da due diverse situazioni, arrivano dall’AMBIENTE ACQUOSO DELLA MATRICE o possono provenire dalla REAZIONE CHIMICA STESSA, che libera due protoni, cioè dal NADH diventa NAD+, liberando due protoni. I protoni sono o già nella matrice, o liberate dalle reazione e vengono trasferiti nello spazio inter-membrana grazie a delle pompe, una volta che è presente l’energia necessaria. In un ambiente acquoso, l’acqua è sempre presente in H+ e OH-. Questi gruppi ferro-zolfo portano gli elettroni e l’accettore di questi elettroni è il coenzima Q, interessante poiché è un trasportatore di elettroni mobile, è un LIPIDE, per cui sta bene DENTRO LA MEMBRANA e si PUÒ MUOVERE ALL’INTERNO DELLA MEMBRANA, può essere nella forma ridotta, ubichinolo e nella forma ossidata ubichinone. L’ubichinone prende anche due protoni e potendosi muovere, può prenderli dalla matrice. Quando si ossida donerà i due elettroni e i due protoni, che verranno liberati nello spazio inter-membrana. Libera gli elettroni invece, nel complesso 3 dove sono presenti gruppi EME e un gruppo Fe2S2, che ossida l’ubichinolo ad ubichinone e trasferisce gli elettroni al citocromo c. I CITOCROMI sono strutture che LEGANO GRUPPI EME ( anelli tetrapirrolici ch coordinano atomi di Fe). Il citocromo c è una molecola solubile, che si muove, dallo spazio inter- membrana e si può muovere e porta gli elettroni nell’ultimo complesso, che è la citocromo ossidasi. L’ultimo complesso, porta l’elettrone portato dal citocromo c e lo porta all’ossigeno, che è l’accettore finale. Qui c’è una cosa un po’ integrande, il citocromo c va da Fe2+ a Fe3+, quindi può portare 1 solo elettrone. Quanti elettroni ci vogliono per andare a 4 H+ + O2 → 2 H2O, ci vogliono 4 elettroni, ma il citocromo porta solo 1 elettrone. Quindi c’è un processo in cui il citocromo porta un elettrone alla volta e l’ossigeno non diventa acqua finché non ci sono 4 elettroni. Succede una cosa interessante, che è quella di intrappolare gli elettroni con un gruppo eme e il rame, per raggiungere uno stato di ossidazione tale da liberare le molecole di acqua, consumando l’ossigeno. Questo complesso è estremamente interessante, poiché produce acqua a partire da ossigeno ed elettroni. Questo è anche il complesso enzimatico che viene bloccato dal cianuro. Il cianuro interferisce con i gruppi prostetici e blocca la citocromo ossidasi, bloccando il metabolismo energetico. Se arriviamo ad una molecola di acqua, quello che abbiamo fatto è spingere fuori 10 protoni, utili per tornare indietro, che è possibile solamente attraverso l’ATP-sintetasi o complesso F0-F1 o ATPasi. Ora guardiamo come si producono molecole di ATP. Vogliamo trasformare il flusso di protoni in un gruppo ad alta energia. Arriviamo all’ATP-sintasi. L’ATPasi è formata da due subunità, subunità F0 e F1. Le proteine c si formano delle strane strutture, come un anello. Formano degli anelli. Un certo numero di proteine c (12) formano questo anello. Come funziona l’ATP- sintasi? C’è una proteina che lega la subunità F0 a quella F1. I protoni passano attraverso l’interfaccia tra le proteine c e a. Ci sono degli amminoacidi specifici che sono in grado di protonarsi o deprotonarsi a seconda dell’esigenza. Se meccanicamente la subunità F0 ruota, facendo degli scatti, allora si sintetizza ATP. La rotazione è spinta dai protoni, che tornano nell’ambiente. La rotazione fa sì che ci sia la catalisi enzimatica. Ogni volta che F0 si protona e deprotona, quest’anello gira e al centro di questo anello c’è una proteina, chiamata proteina ɣ che ruota anche essa, sintetizzando ATP. Una ragione fa da statore (di cui fa parte anche la testa) che blocca tutto, dentro c’è una regione che ruota. Nelle subunità alfa e beta, c’è ADP + Pi (fosfato) e ATP legati a dei siti. Gli ADP sono disposti in modo che si possano legare al fosfato, formando ATP. Poi la proteina cambia forma e l’ATP viene liberato. Quando gira di nuovo la proteina si deforma di nuovo permettendo la sintesi di altri ATP. Ci sono tre siti catalici, che vengono deformati ad ogni giro delle proteine c. È uno dei meccanismi più incredibili. Normalmente in acqua, la sintesi di ATP richiede +7.3 kcal/mol, mentre nel sito attivo della proteina dell’ATPasi, non serve nessun contributo di energia. Questa è la magia delle proteine, la catalisi avviene dall’avvicinamento di ADP e fosfato fino a quando l’energia di legame è pari a 0. Questa macchina NON HA UNA DIREZIONE DI FUNZIONAMENTO. Se metto i protoni dall’altro lato, l’anello ruoterà dalla parte opposta, questo fa sì però che l’ATP trova dove legarsi, si idrolizza e libera ADP e fosfato. L’ATP-sintetasi può quindi produrre ATP o idrolizzare ATP, ma gli organismi possono bloccare questo processo di idrolizzazione, per esempio nelle piante c’è una proteina che blocca l’ATPasi, che in questo modo non consuma inutilmente ATP. Come hanno fatto ad individuare il funzionamento? Hanno preso le proteine alfa e beta e le hanno legate chimicamente ad un vetrino, in modo che fosse ferma e al centro di questa subunità, c’è la subunità gamma. Per vedere se era vero che la rotazione della subunità gamma era responsabile alla sintesi o all’idrolisi dell’ATP, viene legato un filamento di actina lungo micrometri, visibili al microscopio, in modo che le proteine siano fluorescenti. Posso dare alla proteina dell’ATP e se è vero che la subunità gamma si muove e dunque il filamento di actina si dovrebbe muovere. Quando dò ATP i filamenti di actina si muovono in modo vorticoso. In questo modo TUTTI GLI ESSERI VIVENTI PRODUCONO ENERGIA SOTTO FORMA DI ATP. L’energia del gradiente di protoni può essere utilizzata anche come energia. La membrana mitocondriale è ENERGETICA e può essere utilizzata per lo scabio ADP-ATP e la diga di protoni serve per spingere altre reazioni CHE RICHIEDONO ENERGIA. IL GRADIENTE DI PROTONI VIENE UTILIZZATO ANCHE PER LO SPOSTAMENTO DI METABOLITI. Lezione 23-11-2020 COMPARTIMENTI CELLULA VEGETALE I plastidi svolgono funzioni biosintetiche e metaboliche essenziali. Il differenziamento delle cellule NON È LINEARE. I cloroplasti fanno parte della famiglia dei plastidi. I plastidi hanno la capacità di avere un CERTO GRADO DI INTERCONVERSIONE (frecce nelle due direzioni). I plastidi si possono regolare in base alle esigenze della cellula. Dove si trovano i cloroplasti? Sono differenziati come plasmide e si troveranno in strutture cellulari che hanno una funzione fotosintetica, principalmente nelle foglie e nelle foglie si trovano in una particolare regione chiamata MISOFILLO, sotto la superficie della foglia. La foglia sia sopra che sotto ha il MESOFILLIO, che è formato da cellule che hanno al loro interno cloroplasti modificati. Una serie di IMPORTANTI ATTIVITÀ metaboliche hanno luogo nel cloroplasto: • Fotosintesi; • Assimilazione dell’azoto; • Processi di sintesi: ◦ Amido ◦ Lipidi: MOLTO IMPORTANTE ◦ Amminoacidi ◦ Pigmenti fotosintetici: MOLTO IMPORTANTI ◦ Nucleotidi ◦ Proteine codificate dal genoma del cloroplasto Come è fatto? È composto da due membrane, esterne e interne. Diverso dai mitocondri, poiché sia la membrana esterna, sia quella interna, sono PIATTE, invece nei mitocondri la membrana interna è fatta a cresta. Le membrane dei cloroplasti sono separate da uno spazio ridotto, sono abbastanza permeabili, anche se quella esterna è più permeabile di quella A cosa servono le proteine? Nei viventi, scopriamo che i pigmenti non sono liberi in soluzione, ma sono legati all’interno di strutture proteiche. Le proteine servono ad organizzare un NETWORK FISSO DI COMUNICAZIONE TRA I PIGMENTI, poiché NON POSSONO FUNZIONARE SINGOLARMENTE. La lunghezza d’onda di un certo fotone, riesce a dare l’energia necessaria per far passare l’elettrone ad uno stato eccitato. Ma l’elettrone tenderà a tornare al livello fondamentale e lo fa. Ricade allo stato fondamentale e libera l’energia in eccesso e come la libera? In due modi: • Calore; • Luce: emette luce ad energia minore, si chiama fluorescenza; L’energia a livello vibrazionale è persa in un istante, sotto forma di perdita di calore, ma in 10-9 secondi, l’energia è ridata indietro in parte come luce e l’elettrone torna al suo stato fondamentale. Questo processo non è utile, dal punto di vista della vita. L’interazione luce-materia, ha dei tempi precisi. Di livelli energetici ce ne sono molti. Ma da lì l’energia viene persa, poiché gli stati eccitati sono metastabili. Nel tempo piccolissimo in cui l’elettrone torna al suo stato fondamentale, la fotosintesi deve intervenire per poter utilizzare l’energia dell’elettrone eccitato, poiché può venire persa in pochissimo tempo. Il segreto sono le proteine a cui i pigmenti sono legati. Sono le proteine che permettono ai pigmenti di non seguire la via di rilascio dell’energia che hanno assorbito. Se la luce c’è, l’energia va a finire nella molecola. Sono le proteine che permettono ai pigmenti, di fare in modo che l’energia assorbita non venga disperta nel suo complesso, ma ne catturano parecchia. SISTEMA ANTENNA: proteina che assemblano i pigmenti, in modo che comunichino tra di loro. L’energia viene trasferita, fino ad arrivare ad un centro di reazione, dove viene trasformata in legami chimici tramite reazioni di ossidoriduzione. Le proteine antenna (Lhc) legano pigmenti. Lhc: Light Harvesting Complex. L’energia passa da un pigmento all’altro per risonanza, avviene solo in relazione alla distanza e alla posizione dei pigmenti. Se eccito un pigmento, questo rilascia l’energia, che si trasferirà però ad un altro pigmento. Ogni pigmento si eccita, si deiccita, ma il pigmento vicino per risonanza si eccita e così via. Dovunque arriva un fotone, per risonanza, continuerà a rimbalzare tra pigmenti, fino ad arrivare ad un centro di reazione, dove verrà trasformato in energia chimica, sotto forma di zuccheri. L’elettrone eccitato di particolari clorofille, che si trovano nel centro di reazione, va a finire su un accettore di elettroni che tramite una reazione redox si riduce. Nel centro di reazione c’è una reazione redox, mentre nel resto dei pigmenti avvengono solo reazioni fisiche e biofisiche. Nel centro di reazione c’è dunque un accettore di elettroni. L’elettrone perso però è reintegrato da un donatore di elettroni, che colmerà la lacuna nel centro di reazione. Abbiamo creato una molecola che ha molta più energia, poiché si è ridotta. Non tutta l’energia viene conservata: parte dell’energia luminosa viene riemessa come FLUORESCENZA. Parte dell’energia verrà riemessa dunque un fotone con meno energia, con luce rossa e dunque vedo fluorescenza rossa. Schema a Z, che descrive il trasporto elettronico nella fotosintesi, costruito in modo che sull’asse y ci sia il potenziale redox. Nelle piante superiori, i centri deputati alla cattura della luce, sono due. Questi due centri, lavorano in serie, nel foto sistema II un fotone è catturato e l’elettrone è eccitato, con parte dell’energia data dall’acqua, mentre nel fotosistema I si assorbe un fotone, ma parte dell’energia viene fornita dall’elettrone eccitato del fotosistema II. Devo arrivare ad un potenziale redox, MOLTO NEGATIVO, così negativo che posso ridurre il NADP+ a NADPH. Anche negli animali il NADPH viene utilizzato come donatore di elettroni, nelle vie di biosintesi (lipidi, proteine). La catena respiratoria nei mitocondri è simile all’apparato fotosintetico delle cellule vegetali. L’elettrone viene nel fotosistema II viene utilizzato per ridurre il plastochinone, che poi passa per un altro complesso proteico chiamato citocromo b, dove l’elettrone passa alla plastocianina, che andrà nel fotosistema I, dove viene ridotto il NADP+ per formare NADPH. Nel frattempo, durante il processo di trasporto di elettroni, si forma un gradiente elettrochimico di protoni nel lume tilacoidale, che verrà utilizzato dall’ATP-sintasi per produrre ATP. Una speciale coppia di clorofille, indicata come P680 è associata al centro di reazione del fotosistema II. Quando si trova nel centro di reazione del fotosistema II, l’elettrone viene trasferito su un accettore che, poi passerà l’elettrone ad un plastochinone, che può trasferire a sua volta l’elettrone ad un altro plastochinone mobile. Finché non ci sono due atomi di ossigeno che vanno a formare una molecola di O2, non vengono liberati. Questo fa sì che non si liberino delle nuvole tossiche. Servono quattro flash di luce e due molecole di acqua, cioè quattro elettroni, per liberare molecole O2. Ci vogliono quattro fotoni per liberare dalle due molecole d’acqua l’ossigeno e per formare l’O2. Il fotosistema I o P700. L’ultimo step del trasporto di elettroni è la formazione di NADPH, dalla riduzione di NADP+. Si può creare un circuito tra fotosistema I e citocromo b, che può creare protoni, grazie alla continua ossidazione e riduzione di NADPH. Questo ciclo permette di sintetizzare solo ATP, sotto determinati segnali. Se andiamo a vedere la maggior parte dell’ATPasi, sono nelle fasce esterne delle grana e delle lamelle, mentre i fotosistema II è principalmente nelle grana. L’anatomia dei cloroplasti è costruita in modo pratico e funzionale. La distribuzione dei complessi dunque non è omogenea, ma è volta alla funzionalità. La CO2 è il processo che segue la fotosintesi, è il processo che utilizza l’energia prodotta per trasformare CO2 in molecole organiche. La fase si chiama oscura, poiché non richiede luce direttamente, è tipica dell’ambiente STROMA, avviene nella fase solubile dell’interno del cloroplasto. Utilizza ATP e NADPH, riduce il carbonio a zuccheri. È un ciclo, chiamato Calvin- Belson. La reazione è questa: 6 CO2 + 12 H2O → C6H12O6 + 6 O2 + 6 H2O I reagenti sono la CO2 che proviene dall’atmosfera, l’acqua che proviene dalle radici e i prodotti sono glucosio, acqua e ossigeno. L’enzima responsabile della catalisi della fissazione della CO2 è il ribulosio bisfosfato carbossilasi/ossigenasi (RUBISCO). Nel cloroplasto la Rubisco costituisce quasi il 50% delle proteine solubili. 8 subunità L sono sintetizzate dal genoma del cloroplasto, mentre 8 subunità S sono codificate dal genoma nucleare. La reazione chimica è la carbossilazione, prende la CO2 e la lega ad uno zucchero preformato. Zucchero a cinque atomi di carbonio (pentoso) diventa uno zucchero a sei atomi di carbonio (esoso). Il ribulosio (zucchero pentoso) viene legato alla CO2 per formare un intermedio instabile, che poi formerà due molecole di 3-fosfoglicerato. Il problema della Rubisco è che la CO2 e l’O2 sono molecole, per l’enzima, molto simili. Si può formare dunque 2-fosfoglicolato, molecola NON UTILE DAL PUNTO DI VISTA DELLA FOTOSINTESI e deve essere riciclata in qualche modo. Oltre a diventare verdi (la protoclorofillide diventa clorofilla a), durante l’illuminazione, gli ezioplasti accumulano altre componenti che servono alla trasformazione a cloroplasto. Se lasciamo al buio delle piante, può avvenire la trasformazione contraria, i cloroplasti cominciano a diventare di nuovo ezioplasti. A differenza delle cellule animali, che hanno programmi ben definiti, le piante hanno molte più possibilità e quindi sono in grado di tornare ad un livello precedente in certe condizioni e di ricostruire tutto da piccole parti. CROMOPLASTI I cromoplasti sono strutture che accumulano pigmenti, tra cui carotenoidi e xantofille. Il colore dipende dal rapporto tra queste due classi di pigmenti: • gialla: xantofille (limone); • arancione: carotene (carota, arancia); • rossa: licopene (pomodoro). I pallini arancioni nelle cellule vegetali sono dei plastidi che si sono differenziati in cloroplasti. Danno il colore, quindi sono importanti dal punto di vista della comunicazione con l’ambiente esterno, ma hanno altre funzioni a livello cellulare. Si originano dai proplastidi e altra caratteristica di questi pigmenti è che possono originare anche da un RIDIFFERENZIAMENTO DEI CLOROPLASTI. Se guardiamo in certi organi, per esempio i frutti, sono verdi quando sono acerbi, mentre sono colorati quando sono maturi. Questo accade perché i cloroplasti evolvono in cromoplasti. Questo porta ad avere i cromoplasti, è un processo irreversibile, una volta convertiti in cloroplasti, non torneranno più ad essere cloroplasti. Una cosa interessante è che nonostante perdano l’apparato fotosintetico, ma mantengono la capacità di produrre ATP, per sintetizzare i pigmenti. Loro lo producono a partire da sostanze organiche, zuccheri. LEUCOPLASTI I leucoplasti in realtà, sono divisi in tre tipi, il cui tipo più importante è l’amiloplasto, poiché ACCUMULA AMIDO. Altri tipi di leucoplasti, sono le elaioplasti, che accumulano lipidi SOLO IN ALCUNE PIANTE e l’ultimo tipo è il proteinoplasto, che serve per accumulare proteine. AMILOPLASTO Organello per l’accumulo dell’amido. L’amido si accumula all’interno degli amiloplasti sotto forma di grumi. La forma di questi grumi di amido dipende dalla specie, da quanto sono mescolate insieme le parti dell’amido. La parte preferenziale delle piante per accumulare amido sono le parti dove di solito ci sono i depositi di risorse, ovvero radici, tuberi o nelle cellule vicino al tessuto vascolare, FLOEMA, che trasporta zuccheri. Ci sono zone di accumulo dell’amido che accumulano amido nella fase diurna, mentre li rilasciano nella fase notturna. Anche gli amiloplasti si possono formare dal CLOROPLASTO. Anche i cloroplasti possono generare dunque amiloplasti. Anche nei cloroplasti si possono osservare GRANULI DI AMIDO, specialmente durante il giorno, quando la fotosintesi è attiva. AMIDO PRIMARIO. Il cloroplasto in presenza di luce, produce zuccheri, che vengono utilizzate dalle cellule e vengono fatte circolari. Quando c’è però molta fotosintesi e la pianta ha più energia di quella che gli serve, si possono formare grumi di amido all’interno del cloroplasto, fino anche a far diventare il cloroplasto un amiloplasto. Ci sono poi degli amiloplasti speciali, presenti solo in alcune parti dela pianta, sono amiloplasti che hanno una funzione meccanica, che serve per rilevare le variazioni della forza di gravità. Gli amiloplasti che svolgono questa funzione si chiamano STATOLITI. Gli statoliti sono presenti solo nell’apice della radice. Questo amido negli statoliti non viene utilizzato. Se la cellula ha al suo interno degli statoliti, questi andranno verso il fondo. Or come fanno adesso a determinare la crescita della pianta? Per determinare la crescita troviamo gli statoliti, solo nell’ultima parte della radice. In corrispondenza del punto in cui gli statoliti si accumulano, si posizionano delle proteine di trasporto, che trasportano un ormone chiamata AUXINA, che è l’ormone della crescita, fa crescere le cellule, facendole allungare e dividere. La concentrazione degli statoliti è uguale in entrambi i lati e dunque la crescita della radice sarà uniforme. Se la radice è posizionata orizzontalmente, gli statoliti, non saranno più equidistribuiti, ma andranno a finire in una determinata regione e questo cambierà il trasporto in quella regione. Nella regione in cui non ci sono molti statoliti, passerrà meno auxina, mentre nelle parti in cui gli statoliti c’è molta auxina, inibendo la crescita delle cellule in quella zona. La direzione che prende l’apice della radice, sarà quella del centro della Terra. Questo è il trucco che utilizzano le piante per regolare la loro crescita. ELAIOPLASTI Sono presenti solo in pochi organi, sono plastidi privi di pigmentazione che sintetizzano e accumulano monoterpeni (odori, sapori, agenti farmacologici). All’interno hanno dei lipidi, sono spesso in contatto con il reticolo endoplasmatico e li troviamo solo in alcune cellule specializzate, che sono già differenziate per divetare ghiandole. Un esempio sono i tricomi, così come anche in certi frutti troviamo queste strutture. PROTEINOPLASTI Li troviamo solo in determinate strutture, per esempio i semi, sono molto specializzati e accumulano proteine, anche sotto forma di corpi cristallini. GERONTOPLASTI O CLOROPLASTI SENESCENTI Quando le clorofille vengono demolite, nel processo di recupero di tutte le sostanze utili alla pianta, prima del distacco della foglia si formano i gerontoplasti, dei cloroplasti che hanno perso la maggior parte dei loro strumenti fotosintetici, a parte alcuni carotenoidi che danno alle foglie il loro caratteristico colore autunnale. ORGANELLI IMPORTANTI DA IMPARARE: • PROPLASTIDI • CLOROPLASTI • CROMOPLASTI • AMILOPLASTI • GERONTOPLASTI • EZIOPLASTI PEROSSISOMI I perossisomi sono organelli/compartimenti sferici con diametri che vanno da 0.2 a 1.7 micrometri. NELLE PIANTE il ruolo dipende dall’organo o tessuto nel quale sono presenti. Nelle foglie sono coinvolti nell’ossidazione di un prodotto collaterale alla fissazione di CO2: il 2-fosfoglicolato I composti principali di questo tipo sono di tre gruppi principali: • Tarpenoidi: tarpeni sono noti 30000 composti, composti che sono di solito aromi. Piretro estratto di piante del genere Chrysanthemum; • Alcaloidi: sono molti comuni e diffusi nel regno vegetale. Contengono azoto Lezione 02-12-2020 PARETE CELLULARE A cosa serve? Serve a conferire una forma e dare resistenza alle cellule vegetali e condiziona fortemente le cellule, come crescerà, in che forma crescerà, condizionerà anche la comunicazione. Ha anche una funzione difensiva. Come è fatta la parete cellulare? Se prendo la cellula vegetale e rimuovo chimicamente la parete, ma lascio intatta la cellula, mi ritrovo protoplasti, cioè delle cellule con FORMA SFERICA. In laboratorio spesso si utilizzano i protoplasti, poiché sono cellule nude. È fatta da polisaccaridi, proteine e acqua → PARETE PRIMARIA La parete primaria è fatta da cellulosa e emicellulosa. La parte che genera le fibrille è SOLO CELLULOSA. Poi nella matrice amorfa sono presenti molecole di emicellulosa, pectine e. La cellulosa è quella lineare, sono strutture appiattite e si formano legami a idrogeno che stabilizzano i filamenti. Chi li fa queste molecole e chi le eietta dalla cellula? Il polimero fuoriesce fuori dalla cellula, generando la microfibrilla di cellulosa, legandosi tra di loro una volta eiettati all’esterno, grazie ad una proteina, la cellulosa sintasi, chiamata anche rosette. Troviamo le cellulosa-sintasi solo in certe parti della membrana e questo determina anche come si sviluppa la forma della cellula. È la disposizione dei filamenti che determina la conformazione durante la crescita della cellula. Le EMICELLULOSE fanno parte della matrice e sono molecole ramificate, che permettono di collegare tra di loro i vari filamenti delle microfibrille di cellulosa. Oltre alle emicellulose ci sono altre molecole nella matrice, tra cui le pectine, che formano gel idratati, sono zuccheri, più solubili e ramificati. LE PECTINE SONO ZUCCHERI ACIDI. Legano molta acqua, sono idratati e formano un gel. Quando ci sono questi zuccheri, si riempiono gli spazi tra le fibrille. In presenza di calcio e acqua, le pectine gelificano. Questa è la parte che genera il gel della parete e SONO UNA BUONA RISERVA DI CALCIO. Le proteine sono anche esse attaccate e sono importantissime, poiché ORGANIZZANO LA CRESCITA DELLA PARETE. LE ESTENSINE SONO PROTEINE STRUTTURALI che si legano alle strutture e SONO IN GRADO DI MANTENERE LA STRUTTURA. I legami possono essere modificati cambiando il pH del mezzo. Ci sono proteine difensive e di altro tipo. Ci sono delle PROTEINE ENZIMATICHE, come le ESPANSINE, molto importanti, poiché insieme agli XET, degli enzimi, permettono la CRESCITA DELLA PARETE. La parete se la cellula deve crescere, deve essere ammorbidita la resistenza all’espansione. Se ho il vacuolo che fa pressione e ha ricevuto un segnale di crescita, la parete fa resistenza. Io devo mollare la resistenza e la pressione interna del vacuolo, genererà la pressione sufficiente per distendere la parete, che però non genera la rottura della parete. Cosa succede? Succede che il primo segnale acidifica e questo indebolisce le interazioni e permette ai filamenti che tengono vincolati di essere più labili. Gli enzimi XET poi non fanno altro che tagliare i filamenti di EMICELLULOSA e questo fa sì che i filamenti siano più liberi di staccarsi, poi i filamenti possono essere rilegati e si è avuta una crescita della cellula. È un processo di indebolimento delle interazioni e rottura delle catene che tengono legati i filamenti, che poi vengono rilegati in maniera più ordinata. Fuori dalle cellule vegetali possono essere portate altre molecole, come le suberine, le cere e le cuticole, che sono molecole idrofobiche e che permettono di contenere la perdita di acqua e di impedire l’ingresso di patogeni. L’ultima modificazione più importante è quella della lignificazione, in cui la parete cellulosa primaria viene coperta da lignine, polimeri complessi aromatici, che polimerizzano ed, essendo idrofobici, non permettono più che entri nulla e la cellula non ha una comunicazione esterna e la formazione della parete secondaria la cellula muore. È talmente resistente il polimero che il legno è uno dei materiali più resistenti sulla Terra. Il processo di lignificazione permette agli organismi vegetali di resistere alla gravità. Lezione 9-12-2020 CITOSCHELETRO Consiste in un reticolo filamentoso di polimeri proteici, che permea il citosol. Permettono di compiere funzioni meccaniche, di sostegno, di resistenza. È una struttura dinamica. Servono per dare un organizzazione della forma, spaziale, ma anche degli organelli e delle strutture all’interno del citoplasma. In qualche modo permettono di organizzare spazialmente le strutture all’interno della cellula. Ci sono delle strutture, i mitocondri e i cloroplasti che si organizzano in modo diverso a seconda del citoscheletro. Inoltre il citoscheletro fornisce resistenza e stabilità alla cellulla. Le cellule vegetali, hanno già un sistema di resistenza dato dalla parete e dunque il citoscheletro sarà diverso a seconda delle cellule eucariotiche che consideriamo. Il citoscheletro svolge anche una funzione motoria, soprattutto durante la fase di divisione cellulare, dove ha un ruolo organizzativo e motorio. Sappiamo che non è una prerogativa degli eucarioti, poiché esistono delle proteine con funzione analoga, nelle cellule procariotiche. Ci sono alcune proteine batteriche, che ci sono in Bacillus subtilis, in cui le proteine sono state fuse ad una proteina fluorescente, per vedere come esse si organizzavano all’interno della cellula e si è visto chiaramente che queste proteine avevano un ruolo di organizzarsi in filamenti, per svolgere la funzione di alcune proteine del citoscheletro degli eucarioti. Come si divide il citoscheletro? Una delle tecniche più utilizzate per osservare il citoscheletro è la fluorescenza e si utilizzano tecniche di fluorescenza, che possono essere fatte sia su cellule morte, ovvero strutture cellulari FISSATE in un momento preciso della loro vita, fissate in modo che le strutture non possano più essere libere o degradarsi e sono state fatte reagire con anticorpi fluorescenti. Posso fare lo stesso processo di visualizzazione mediante fluorescenza, ma con cellule vive, ma non posso utilizzare anticorpi, quindi ho bisogno di fare qualcos’altro per vedere la fluorescenza in cellule vive. Una possibile tecnica sono le microiniezioni. Posso fare una proteina ricombinante, una versione fluorescente di una proteina del citoscheletro, come la tubulina. Questa proteina andrà a fare nel pool di proteine del citoscheletro e posso indurre la cellula a produrre il tipo ricombinato della proteina. Il vantaggio di osservare cellule vive è che posso vedere la dinamica di come si trasforma il citoscheletro. Se invece lo faccio in vivo, posso vedere come si organizza, si disorganizza, si trasforma a seconda di stimoli.