Biologia Molecolare e l'Epigenetica, Appunti di Biologia

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REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI La struttura generale di un gene presenta due zone distinte da un punto di vista funzionale: ● una regione codificante che codifica per una proteina ● una regione non codificante che contiene sequenze di DNA che regolano l’espressione nella prima Il gene è presente solo sul filamento del DNA e viene trascritto in direzione 5’➝ 3’ In un gene di un organismo eucariote osserviamo diversi elementi con funzione differente ⭐ La regione codificante è compresa tra due particolari sequenze nucleotidiche: ● sito di inizio della trascrizione ● segnale di taglio e poliadenilazione Anche all’interno di questa regione Il gene presenta tratti che che vengono trascritti e tradotti in proteine chiamate esoni e sequenze che vengono invece scartate e non si trovano nella proteina finale, gli introni Più del 90% del genoma umano è costituito da sequenze ripetute che non codificano in alcuna proteina ⭐ Nella regione non codificante si trova il promotore, un tratto di DNA fondamentale per attivare la trascrizione ● il promotore contiene una regione chiamata TATA box che funziona da sito di riconoscimento per l’RNA polimerasi A monte, rispetto al promotore, si può trovare un sito chiamato enhancer o amplificatore oppure silencer o silenziatore a seconda del fatto che esso favorisca o inibisca la trascrizione del gene Queste sequenze possono trovarsi in prossimità dei promotore oppure in una zona distante da esso ATTIVAZIONE DELLA TRASCRIZIONE Affinché la trascrizione abbia inizio è necessario che un attivatore si leghi al relativo amplificatore ➝ ciò favorisce l’attacco di un fattore di trascrizione TFIIP al TATA box Il TFIIP è in grado di far legare al DNA numerose proteine che agiscono come fattori specifici per l’inizio della trascrizione tra cui l’RNA polimerasi, l’enzima in grado di sintetizzare l’mRNA a partire dal filamento del DNA stampo. L’insieme di questi fattori proteici viene chiamato complesso di preinizio Quando l’intero complesso si assembla l’RNA polimerasi comincia a scorrere sul DNA e inizia a sintetizzare l’mRNA. Il processo continua fino al segnale di arresto della trascrizione. Nel caso in cui l’amplificatore si trovi in una regione distante da quella codificante il meccanismo di attivazione della trascrizione prevede un passaggio in più: TFIIP lega al TATA box insieme agli altri fattori che costituiscono il complesso di pre inizio, tra cui l’RNA polimerasi. Successivamente un mediatore di tipo proteico si reca al complesso di preinizio nella zona di DNA, l’attivatore si lega all'amplificatore Il DNA si ripiega in modo che possa avvenire l’interazione tra il complesso di preinizio e l’attivatore per mezzo del promotore: questo innesca l’inizio della trascrizione nonché la sintesi dell’mRNA ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI A differenza dei procarioti, negli eucarioti la regolazione dell'espressione genica è un processo molto più complesso Vi sono quattro passaggi principali: 1. Regolazione pre-trascrizionale ➝ la cellula regola l'accessibilità del genoma. ↪ Nel nucleo il DNA si trova avvolto attorno agli istoni, una famiglia di proteine con le quali forma dei complessi chiamati nucleosomi. Questa organizzazione strutturale, oltre a compattare i DNA nel nucleo, permette anche di modulare l'espressione dei geni perché regola l'interazione del DNA con i fattori di trascrizione e la RNA polimerasi. 2. Regolazione trascrizionale ➝ permette o meno la trascrizione di un gene e regola la quantità ↪ In questa fase gli attori protagonisti sono i fattori di trascrizione, la cui interazione con le sequenze di DNA permette di esprimere o silenziare (reprimere) un gene. 3. Regolazione post-trascrizionale ➝ comprende i meccanismi attraverso i quali un trascritto eucariotico va incontro a traduzione e dà quindi origine a una proteina ↪ Negli eucarioti non tutti i trascritti sono tradotti. Il principale meccanismo di regolazione post-trascrizionale è lo splicing, che porta alla rimozione degli introni dagli mRNA 4. Regolazione post-traduzionale ➝ anche qualora la traduzione porti alla produzione di una proteina, il suo destino finale dipende da svariate modifiche post-traduzionali che ne modulano la funzione e la distribuzione all'interno dei compartimenti cellulari. Queste modificazioni possono portare a proteine attive o inattive, oppure possono contribuire alla loro degradazione. La trascrizione negli organismi eucariotici avviene nel nucleo Grazie alle proteine chiamate istoni, il DNA nei cromosomi delle cellule eucariotiche è densamente compattato nella cromatina. Studiando la struttura della cromatina, si è visto che nel nucleo il DNA è presente in due stati di condensazione differenti: ●l’eucromatina è la forma più aperta ed è tipica dei geni attivamente trascritti; ●l’eterocromatina è invece la forma più condensata in cui la trascrizione genica è repressa. Delle interazioni mantengono la struttura della cromatina nella forma chiusa Esistono tuttavia enzimi, detti istone acetilasi, che possono aggiungere gruppi acetile carichi negativamente alle lisine delle code istoniche In questo modo il legame tra istoni e DNA viene allentato, generando la forma aperta della cromatina. Quindi, l'acetilazione di specifiche lisine degli istoni è in grado di favorire la trascrizione. Una volta trascritto, il DNA può ricompattarsi in eterocromatina, grazie alle istone deacetilasi, enzimi in grado di rimuovere i gruppi acetile dalle lisine Un'altra modificazione molto comune è l'aggiunta di gruppi metile alle lisine, eseguita dalle istone metiltransferasi. La metilazione degli istoni ha un effetto inibitorio sulla trascrizione. Anche questa modificazione è reversibile grazie all'azione degli enzimi istone demetilasi. ↪ uno stesso istone può contenere, a livello delle sue lisine, diverse combinazioni di gruppi acetile e metile. Queste diverse combinazioni possono influenzare l'efficienza con cui un particolare tratto di DNA viene trascritto. Si viene in questo modo a formare un codice istonico, che si sovrappone al codice genetico che risiede nella sequenza di DNA. LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA È il meccanismo attraverso il quale un segmento di DNA può essere incorporato all'interno di un frammento di DNA più grande: è necessario che le due molecole di DNA che si uniranno abbiano dei tratti di sequenza identici (cioè omologhi). Esistono diversi meccanismi di ricombinazione, ma tutti hanno in comune gli stessi passaggi fondamentali. La ricombinazione prende avvio quando le sequenze omologhe identiche si appaiano e si forma una struttura a X chiamata chiasma Grazie all'intervento di enzimi specifici, il chiasma viene poi tagliato, liberando le due molecole ricombinanti che contengono le porzioni di DNA scambiate tra di loro Il trasferimento di geni nei batteri Lo scambio di materiale genetico tra cellule batteriche può avvenire con tre diverse modalità: ● la trasduzione ● la trasformazione ● la coniugazione Questi tre meccanismi si distinguono per il modo in cui il DNA è trasferito da una cellula all'altra e per gli eventi di ricombinazione che integrano il DNA della cellula donatrice nel genoma della cellula ricevente. LA TRASDUZIONE BATTERICA La traduzione si verifica quando il materiale genetico viene trasferito mediante un batteriofago da un batterio a un altro. Nel ciclo litico il batteriofago utilizza alcuni suoi enzimi per frammentare il DNA batterico; in questo modo si procura i nucleotidi che gli servono per sintetizzare il suo DNA Nelle fasi finali dell' infezione, le nuove particelle virali vengono riempite con il DNA del virus. Tuttavia, questo processo non è sempre preciso e a volte anche un pezzo di DNA batterico può essere incorporato all'interno delle particelle virali. Quando il virus così formato infetterà un'altra cellula, trasferirà alla nuova cellula ospite sia il suo DNA sia quello batterico acquisito dalla cellula precedente. Dato che il frammento di DNA batterico viene incapsulato nel virus in maniera del tutto casuale, si parla di trasduzione generalizzata Nel ciclo lisogeno il DNA virale si integra all'interno del cromosoma batterico sotto forma di profago Per fare da stampo per la replicazione virale il profago deve essere rimosso dal cromosoma batterico, ma anche questo meccanismo non è preciso e a volte rimangono attaccate al profago le sequenze di DNA cromosomico fiancheggianti. Queste sequenze batteriche verranno duplicate insieme al DNA virale e incapsulate all'interno dei nuovi virioni. Quando il virus così formato infetterà un'altra cellula, trasferirà al suo interno Sta il DNA virale sia quello batterico In questo caso si parla di traduzione specializzata, perché molti batteriofagi integrano il loro DNA in punti specifici del cromosoma batterico e tenderanno quindi a portarsi dietro sempre lo stesso frammento di DNA batterico. LA TRASFORMAZIONE BATTERICA Il secondo meccanismo di trasferimento di informazioni genetiche tra batteri si basa sui plasmidi molecole extracromosomiche di DNA circolare che contengono alcune informazioni genetiche accessorie Essi sono da 10 a 100 volte più piccoli del cromosoma batterico, ma hanno una loro origine di replicazione, grazie alla quale possono duplicarsi autonomamente all'interno del batterio. Per la loro duplicazione i plasmidi sfruttano l'apparato replicativo delle cellule batteriche. A partire da un'unica bolla replicativa, si generano due forcelle di replicazione che procedono in senso opposto e poiché il plasmide è circolare, quando le due forcelle si incontrano, la replicazione termina e genera due molecole identiche del plasmide I plasmidi possono passare facilmente da un batterio all'altro ⇢ per esempio, quando una cellula batterica muore o viene lisata, i plasmidi rilasciati sono assorbiti da cellule batteriche adiacenti attraverso il processo di trasformazione batterica. LA CONIUGAZIONE BATTERICA I batteri si riproducono mediante scissione binaria Il risultato è la generazione di due cloni, cioè due cellule figlie➝ geneticamente identiche alla cellula progenitrice Le cellule batteriche possono scambiarsi il materiale genetico attraverso un processo chiamato coniugazione. La coniugazione richiede l'unione fisica tra due cellule batteriche, attraverso un canale filamentoso proteico, detto pilo sessuale, che mette in comunicazione il citoplasma delle due cellule. Come nella riproduzione sessuale si ha l'unione di un individuo maschio e di una femmina, anche nella coniugazione si ha l'unione di un batterio donatore o F positivo (F+) e uno ricevente o F-negativo (F-) ↪ la distinzione si basa sulla presenza (o meno) del plasmide F, che porta i geni per la sintesi del pilo e per il trasferimento del DNA. Nei ceppi F+ il plasmide F può essere presente sia libero nel citoplasma sia integrato nel cromosoma batterico. Quando una cellula F+ si unisce tramite il pilo sessuale a una F, il plasmide F fluisce attraverso il pilo dal donatore al ricevente. Il frammento di DNA trasferito potrà poi ricombinarsi con il cromosoma batterico della cellula ricevente. I TRASPOSONI Un altro meccanismo di rimescolamento genico che contribuisce a plasmare la struttura del genoma è basato sulla trasposizione genica ed è mediato da sequenze di DNA mobili chiamate trasposoni. Un trasposone è una sequenza di DNA in grado di spostarsi autonomamente da un sito cromosomico a un altro, all'interno della stessa cellula: si tratta cioè di elementi genetici mobili. I trasposoni possono alterare la struttura dei cromosomi in due modi. 1. Interruzione genica ➝ l'elemento mobile può inserirsi direttamente all'interno di un gene, interrompendolo e causandone l'inattivazione, oppure può alterare una sequenza di DNA con funzioni regolative (per esempio un promotore o un terminatore). Lo stesso trasposone può «saltare» nuovamente in un'altra posizione 2. Ricombinazione omologa ➝ la presenza di numerose copie dello stesso elemento mobile sui cromosomi crea numerose regioni di omologia (cioè che contengono la stessa sequenza di DNA), a livello delle quali può avvenire la ricombinazione omologa. Come conseguenza, si può avere lo scambio delle regioni cromosomiche comprese tra due copie dello stesso trasposone, con un fenomeno analogo al crossing-over che si verifica durante la meiosi. L'origine dei trasposoni è stata a lungo dibattuta ➝ oggi gli studiosi ritengono più probabile che i trasposoni siano comparsi più volte e in modo indipendente nel corso dell'evoluzione L'ipotesi più accreditata è che in origine i trasposoni fossero virus, il cui genoma si è integrato nel corredo genetico delle cellule infettate ➝ questa integrazione non è però stabile e all'interno del genoma i trasposoni possono continuare a «saltare» da un sito genomico all'altro. Negli esseri umani l'attività dei trasposoni può causare alcune malattie genetiche, quali l'emofilia e la distrofia muscolare. VIRUS A RNA A FILAMENTO SINGOLO Un certo numero di virus animali contiene RNA a filamento singolo ➝ possono essere presi in considerazione due virus importanti: ● Il virus dell’influenza ● Il virus dell’HIV Il virus dell’influenza penetra nella cellula ospite per endocitosi, all'interno di una vescicola membranosa La fusione della membrana virale con quella della vescicola porta alla liberazione del virione all'interno della cellula. Il virus contiene l'enzima necessario per la duplicazione del proprio genoma a RNA ➝ questo enzima è un'RNA polimerasi particolare, che utilizza come stampo IRNA (a differenza delle RNA polimerasi cellulari che come stampo utilizzano il DNA) Il filamento di RNA virale così sintetizzato serve poi sia da mRNA sia da stampo per la sintesi, mediante appaiamento complementare delle basi, di nuove copie del genoma virale. I retrovirus come HIV presentano un ciclo riproduttivo più complesso ➝ in questo caso il virus penetra nella cellula per fusione diretta tra il rivestimento virale e la membrana plasmatica dell'ospite La caratteristica peculiare del ciclo vitale dei retrovirus è la sintesi di DNA guidata dall'RNA. I retrovirus possiedono un cromosoma di RNA e, quando infettano la cellula operano una specie di trascrizione al contrario cioè retrotrascrivono I'RNA in DNA Questo processo, catalizzato dall'enzima virale trascrittasi inversa, produce un pro virus a DNA formato da virali cDNA (DNA complementare, trascritto a partire dal genoma a RNA), che rappresenta la forma sotto cui il genoma virale si integra nel DNA della cellula ospite. Il provirus risiede stabilmente nel genoma della cellula ospite, attivandosi di tanto in tanto per produrre nuovi virioni. Quando ciò accade, il provirus viene trascritto in mRNA, che poi viene tradotto nelle proteine virali. Le glicoproteine virali si inseriscono nella membrana plasmatica della cellula ospite, che poi diventerà il rivestimento virale. Altre proteine virali formeranno il capside, che racchiude le molecole di RNA virale. La liberazione dei virioni dalla cellula ospite avviene per un processo di gemmazione molto simile all'esocitosi. In linea di principio, quasi ogni tappa di questo complesso ciclo può essere oggetto di attacco da parte di farmaci ➝ questo aspetto viene sfruttato dai ricercatori nel loro sforzo di debellare il virus.