biotecnologie: scopi Genetica batterica e strumenti di lavoro dell'ingegneria genetica, Appunti di Biologia, microbiologia e tecnologie di controllo ambientale

Scarica biotecnologie: scopi Genetica batterica e strumenti di lavoro dell'ingegneria genetica e più Appunti in PDF di Biologia, microbiologia e tecnologie di controllo ambientale solo su Docsity! LA DINAMICITA’ DEL GENOMA: L’informazione genetica è regolata in modo molto dinamico per esprimere i geni e trasmetterli alle generazioni successive. Vi è anche un scambio di materiale genetico tra organismi diversi→ FLUSSO GENICO ORIZZONTALE rappresentato da ELEMENTI GENETICI MOBILI, capaci di spostare orizzontalmente informazione genetica da una cellula all’altra. -VIRUS: rimescolano la loro informazione genetica con quella della cellula che infettano. -PLASMIDI: diffondono resistenza agli antibiotici nelle popolazioni batteriche. -TRASPOSONI: possono interrompere geni o causare la ricombinazione tra regioni cromosomiche diverse. CARATTERISTICHE BIOLOGICHE VIRUS: parassiti endocellulari obbligati che hanno bisogno di una cellula ospite per potersi riprodurre. -No struttura cellulare -Hanno un involucro proteico (capside) dove si trova il genoma, che può essere costituito da 1 o più filamenti di DNA/RNA. -Unici che possono usare RNA per espressione dei geni e trasmissione dell’informazione genetica. -In alcuni casi l’involucro è circondato da una membrana (envelope). -Possiedono molecole DNA a singolo filamento. -Dimensioni piccole tra 50 e 100 nm. -Genoma è più piccolo di quello dei procarioti poichè la maggior parte delle funzioni metaboliche viene offerta da cellula infetta. CICLO VITALE: Ogni virus ha capacità di infettare una o poche specie ospiti. All’esterno della cellula ospite le particelle virali sono prive di attività metabolica→ VIRIONI. 5 FASI: 1) Adesione: il virus si attacca alla membrana plasmatica ospite attraverso le proteine cellulari, i recettori . 2) Penetrazione: il virus entra nella cellula e rilascia il proprio genoma all’interno della cellula infetta . 3) Espressione dei geni virali e replicazione del genoma. 4) Assemblaggio dei capsidi, all’interno dei quali verranno inseriti i genomi virali. 5) Rilascio delle nuove particelle virali all’esterno delle cellula. In alcuni casi vi è rottura della membrana citoplasmatica e morte della cellula infettata. CICLO LITICO: produzione nuovi virioni con lisi cellulare CICLO LISOGENO: fase di latenza→ genoma virale permane nella cellula ospite senza produrre nuovi virus. BATTERIOFAGI (fagi): virus che infettano le cellule batteriche. RICOMBINAZIONE OMOLOGA: meccanismo attraverso cui un segmento di DNA può essere incorporato all’interno di un frammento di DNA più grande. Per farlo avvenire, le due molecole di DNA devono avere tratti di sequenza identici (omologhi). PROCESSO: 1) inizia quando le sequenze omologhe identiche si appaiano. 2) formazione di una struttura a X→ chiasma. 3) con enzimi specifici, il chiasma viene tagliato e liberate le due molecole ricombinanti che contengono porzioni di DNA scambiate tra di loro. ES: crossing over nella meiosi. TRASFERIMENTO GENI NEI BATTERI: scambio di materiale genetico tra batteri avviene in 3 modalità: trasduzione, trasformazione e coniugazione in base a come DNA è trasferito da una cellula all’altra. TRASDUZIONE BATTERICA: materiale genetico viene trasferito attraverso un batteriofago da un batterio all’altro. CONSEGUENZA: ricombinazione di DNA batterico proveniente da due cellule diverse. 1) Durante ciclo litico, il batteriofago utilizza alcuni suoi enzimi per frammentare il DNA batterico→ si procura così nucleotidi che gli servono per sintetizzare il suo DNA. Alla fine, le nuove particelle virali vengono riempite con il DNA del virus. Questo processo non è sempre preciso e a volte un pezzo di DNA batterico può essere incorporato all’interno delle particelle virali. Quando il virus che si forma infetterà un’altra cellula, trasferirà alla cellula il suo DNA e anche quello batterico. Il DNA batterico può ricombinarsi con il cromosoma del batterio ricevente nelle sequenze omologhe. Il frammento di DNA batterico viene incorporato dal virus in maniera casuale→ TRASDUZIONE GENERALIZZATA. 2) Durante ciclo lisogeno→ DNA virale si integra all’interno del cromosoma batterico sotto forma di PROFAGO. Per effettuare la replicazione virale, il profago deve essere rimosso dal cromosoma batterico, ma anche qui il processo non è preciso e a volte rimangono attaccate al profago le sequenze di DNA cromosomico che vengono duplicate insieme al DNA virale e incapsulate all’interno di nuove particelle virali. Quando il virus formato infetterà un’altra cellula, trasferirà al suo interno il DNA virale e quello batterico. e le sequenze di DNA batterico possono ricombinarsi con il DNA della cellula infetta a livello delle sequenze omologhe→ TRASDUZIONE SPECIALIZZATA: molti batteriofagi integrano il loro DNA in punti specifici del cromosoma batterico e tendono a portarsi dietro sempre lo stesso frammento di DNA batterico. TRASFORMAZIONE BATTERICA: si basa sui PLASMIDI, molecole di DNA circolare separate dal cromosoma batterico (contiene genoma) che contengono alcune informazioni genetiche accessorie. Sono da 10 a 100 volte più piccole del cromosoma batterico e possono duplicarsi autonomamente all’interno del batterio. REPLICAZIONE: utilizzano cromosoma batterico. 1) ha inizio nell’origine di replicazione, il sito ori 2) i filamenti si separano e replicazione procede in entrambe le direzioni 3) si generano due molecole di DNA circolare identiche. I plasmidi possono passare facilmente da un batterio all’altro. ES: quando cellula batterica muore, i plasmidi rilasciati sono assorbiti da cellule batteriche adiacenti grazie processo di trasformazione batterica. CONIUGAZIONE BATTERICA: batteri si riproducono attraverso scissione binaria→ generazione di due cloni. La coniugazione è un processo attraverso cui le cellule batteriche si scambiano materiale genetico. Richiede l’unione fisica tra due cellule attraverso un PILO SESSUALE, un canale proteico che mette in comunicazione il citoplasma delle due cellule. - Unione di un BATTERIO DONATORE (F+) e RICEVENTE (F-) che si distinguono in base alla presenza o non del PLASMIDE F→ porta geni per sintesi del pilo e trasferimento del DNA e può essere libero nel citoplasma o integrato nel cromosoma batterico. 1) Quando le cellule si uniscono, i plasmidi possono passare attraverso il pilo sessuale alla cellula ricevente. 2) I plasmidi diventano parte del genoma della cellula ricevente. Il batterio ricevente diventa F+. In questo modo si ha lo scambio di geni tra due batteri appartenenti alla stessa popolazione. -PLASMIDE R: resistenza agli antibiotici (farmaci che uccidono i batteri). Durante il processo può passare anche plasmide R (molto grande). Resistenza a 15 tipi diversi di antibiotici→ batterio riesce a resistere. -PLASMIDE T: produce tossine. TRASPOSONI: Un meccanismo di rimescolamento genico presente sia nei procarioti sia negli eucarioti è la TRASPOSIZIONE GENICA e avviene grazie ai trasposoni (“geni che saltano”)--> sequenza di DNA in grado di spostarsi autonomamente da un sito cromosomico a un altro, all’interno della cellula stessa. Sono elementi genetici mobili. Alterano struttura dei cromosomi in due modi: 1) INTERRUZIONE GENICA: il trasposone può inserirsi direttamente all’interno di un gene, interrompendolo e causandone l’inattivazione, oppure può alterare una sequenza di DNA con funzioni regolative (promotore) 2) RICOMBINAZIONE OMOLOGA: presenza di molte copie dello stesso elemento mobile sui cromosomi, crea molte regioni di omologia (contengono stessa sequenza DNA) dove 2) IBRIDAZIONE: temperatura a 50° per permettere ai primer di legarsi ai filamenti di DNA 3) ALLUNGAMENTO: temperatura a 60°. I nucleotidi trifosfato e la taq DNA polimerasi consentono la sintesi di due nuovi filamenti di DNA 4) dopo fase allungamento il campione viene riportato a 90° e avviene una nuova denaturazione dove molecole di DNA a 2 filamento si aprono → nuovo ciclo→ in poco tempo si possono ottenere milione di copie di DNA originale→ processo di amplificazione del DNA. APPLICAZIONI: chimica, genetica e biologia. Serve per analizzare in campioni clinici la presenza di agenti infettivi (HIV, epatite…). Può identificare il DNA del virus all’interno delle cellule umane. - Identificazione di piccole mutazioni dei geni responsabili di tumori e malattie (fibrosi cistica, anemia falciforme, distrofia muscolare). -Applicazioni in criminologia: permette di rilevare e identificare frammenti di DNA di individuo IL SEQUENZIAMENTO DEL DNA: permette di ricostruire l’ordine in cui le basi si susseguono lungo il filamento di DNA—> metodo SANGER. Utilizzo di nucleotidi modificati (DIDESOSSINUCLEOTIDI) che vengono incorporati nella catena del DNA e bloccano l’allungamento. Essi non hanno il gruppo 3-ossidrile dello zucchero che serve per la formazione del legame fosfodiesterico con nucleotide successivo. Vengono chiamati anche TERMINATORI DI CATENA (4 diversi). Per sequenziare il DNA viene usata la DNA polimerasi per generare una copia di filamento stampo. 1) Dopo essere stato denaturato per separare i filamenti di DNA, il frammento da sequenziare viene legato a un primer che permette la reazione di sintesi. 2) Il campione viene diviso in 4 provette sperare che contengono ciascuna: 1) miscela di reazione per la reazione di polimerizzazione 2) 4 desossinucleotidi 3) uno dei 4 didesossinucleotidi a concentrazione minore del corrispondente desossinucleotide. 3) In ogni provetta di formano frammenti di lunghezza diversa in base al punto in cui l’allungamento è stato interrotto dal didesossinucleotide, e i frammenti terminano tutti con lo stesso didesossinucleotide. 4) Al termine i frammenti vengono analizzati tramite elettroforesi su gel: procedendo dal frammenti più piccolo (in basso) a quello più grande (in alto) si ricostruisce l’ordine con cui i nucleotidi sono stati incorporati. La sequenza che si crea è complementare a quella che si voleva sequenziare. SEQUENZIATORI AUTOMATICI: il DNA da sequenziare è amplificato in una reazione PCR con didesossinucleotidi fluorescenti. I prodotti vengono separati con elettroforesi basato su un gel inserito in un capillare. Ogni volta che viene incorporato un didesossinucleotide fluorescente nella reazione di PCR, un raggio laser registra il colore e intensità. COLTIVARE MICRORGANISMI: Le cellule vengono fatte crescere in contenitori→ PIASTRE o CAPSULE DI PETRI. All’interno si controlla l’ambiente di crescita, le sostanze contenute, e le caratteristiche delle cellule. Vi è un sottile strato di materiale gelatinoso sterilizzato e vengono aggiunte sostanze. Sullo strato gelatinoso vengono deposte le cellule mantenute nella migliore condizione per la crescita. MICRORGANISMI→ BATTERI (escherichia coli) e LIEVITO DI BIRRA. Sono facili da coltivare, crescono rapidamente e sono piccoli. Tra di essi ci possono essere alcuni portatori di mutazioni. COLTURE VEGETALI: Le cellule delle piante sono in grado di dedifferenziarsi→ perdere le specializzazioni dovute al differenziamento, e tornano a essere cellule non differenziate.Con tecniche si può ottenere tessuto non differenziato partendo da una pianta differenziata→ CALLO che può dare origine poi a una pianta intera. PROCESSO: 1) Prelevazione di frammento di tessuto della pianta e viene messo in una piastra petri. 2) Le cellule si dividono e perdono le caratteristiche del tessuto di partenza. Si forma un tessuto non differenziato, il callo. 3) Dal callo si forma un embrione 4) Si ottiene una pianta formata da tutte le sue parti, che è un clone della pianta di partenza. COLTURE DI CELLULE ANIMALI: Cellule animali possono essere fatte crescere in coltura con metodi complessi. CELLULE DI TESSUTO UMANO: bisogna separare le cellule da un frammento del tessuto interessato attraverso enzimi e sostanze chimiche che distruggono la matrice extracellulare e portano a separazione delle cellule. 1) prelevazione di frammento di tessuto 2) cellule vengono isolate dal tessuto e messe in una piastra petri con sostanze particolari, i FATTORI DI CRESCITA aggiunti a un terreno di coltura liquido (soluzione acquosa di sali, sostanze nutritive e necessarie alla cellula). 3) cellule si moltiplicano e molte vengono trasportate per creare piastre secondarie. SISTEMI IN VITRO: Con colture cellulari si ottengono dei tipi cellulari omogenei, all’interno di microambienti dove è possibile controllare tutte le caratteristiche→ sistemi in vitro. Si possono condurre esperimenti in vitro→ diversi da esperimenti IN VIVO (su animali). Le cellule sono programmate per non crescere in modo indefinito e un metodo per ottenere cellule umane che si riproducono indefinitamente in coltura è TRASFORMARLE attraverso la rimozione di meccanismi di controllo del ciclo cellulare, per moltiplicarle all’infinito. Si ottengono cellule che possono assomigliare a quelle che in vivo causerebbero un tumore. Per trasformarle servono sostanze chimiche mutagene o virus modificati che modificano geni del ciclo cellulare. Si agisce riattivando geni diventati inattivi, come quelli della telomerasi. COLTURE DI CELLULE STAMINALI: per alcuni tessuti è più facile ottenere colture cellulari→ tessuti dove le cellule sono a rapido scambio (turnover) come pelle. Essa è esposta all’ambiente esterno e caratterizzata da abrasioni… e ha una capacità rigenerativa per riparare i danni e formare cicatrici che scompaiono molte volte. Questa capacità è dovuta alla presenza di CELLULE STAMINALI → cellule non differenziate in modo definitivo con capacità proliferativa e con capacità di trasformarsi in diversi tipi cellulari specializzati. Alcune cellule sono state ottenute da CELLULARI STAMINALI EMBRIONALI UMANE→ possono riprodursi indefinitamente e differenziarsi in qualsiasi tessuto umano. * 1) Dallo stadio di blastocisti, la massa delle cellule interne viene isolata 2) Vengono dissociate per ottenere piastre secondarie 3) dalle cellule totipotenti si possono ottenere i tipi cellulari desiderati (neuroni, cellule ematiche e pancreatiche). * PUNTO DI VISTA BIOLOGICO: utilizzate nell’ambito della MEDICINA RIGENERATIVA, dove bisogna sostituire un tessuto danneggiato a causa di una malattia. Idea è di trapiantare le cellule e portarle a differenziarsi per riparare il tessuto danneggiato. Dato che questi tipi cellulari sono ottenuti da embrioni umani,poi distrutti, il procedimento pone problemi: utilizzo delle cellule è come eseguire veri esperimenti su esseri umani. Si possono ottenere cellule staminali partendo da cellule differenziate o isolare cellule staminali da vari tessuti dell’adulto. Le cellule staminali di derivazione embrionale possono dare origine a qualsiasi tipo di tessuto → TOTIPOTENTI. Quelle che derivano da tessuti differenziati danno origine solo ad alcuni tipi di tessuto→ MULTIPOTENTI. ELETTROFORESI SU GEL: È una tecnica per isolare le biomolecole, che permette di separare frammenti di DNA o proteine in base alle loro dimensioni, sfruttando un campo elettrico. DNA ha carica elettrica negativa a causa dei gruppi fosfato. 1) Si taglia filamento di DNA con enzimi di restrizione. 2) Si prepara gel d’agarosio e si fa solidificare in una vaschetta con un pettine dentellato. Dopo averlo estratto, il pettine lascia dei pozzetti dove vengono caricati i campioni di DNA da analizzare. 3) Il gel è immerso in una soluzione tampone che si trova in una camera elettroforetica che genera un campo elettrico. 4) I frammenti di DNA vanno verso l’anodo, applicando il campo elettrico. Le molecole più piccole si muovono più velocemente di quelle grandi. 5) I frammenti possono essere visualizzati grazie a molecole fluorescenti che si legano al DNA e lo rendono visibile all’interno del gel. CLONAZIONE: tecnica che permette di clonare interi organismi. Primo mammifero clonato: pecora Dolly. 1) Prelevazione di una oocita da una pecora e rimozione del nucleo 2) Prelevazione di cellule dalla mammella della pecora che si vuole clonare che vengono private di nutrienti per bloccare il ciclo cellulare 3) La cellula della mammella e l’oocita vengono fusi e portati a dividersi 4) Si forma un embrione che viene inserito nell’utero di una terza pecora (madre surrogata) 4) Si sviluppa l’embrione e nasce una pecora uguale alla 2. SONDE DI IBRIDAZIONE: Per identificare la sequenza di basi di un frammento interessato all’interno di un campione complesso si può appaiarlo a un filamento complementare, chiamato sonda, di cui si conosce la sequenza. L'ibridazione permette di isolare un singolo cDNA. 1) Si inserire in una piastra petri le colonie della libreria e si applica un filtro di nitrocellulosa, carico positivamente. 2) Le cellule delle colonie aderiscono al filtro, che viene poi immerso in una soluzione che lisa le cellule liberando acidi nucleici 3) Sono carichi negativamente e rimangono attaccati al filtro e si separano i due filamenti di DNA 4) Si aggiunge una sonda a DNA radioattiva che si lega al DNA complementare. 5) Esponendo il filtro a una lastra radiografica, si visualizza la posizione della colonia che contiene il DNA cercato. SOUTHERN BLOTTING: tecnica che permette di individuare nel gel di agarosio il frammento di DNA che presenta il gene da clonare. DNA viene estratto da cellula e trattato con enzima di restrizione. I frammenti sono separati mediante elettroforesi su gel. 1) i frammenti di DNA devono essere denaturati a singolo filamento tramite rottura dei legami a idrogeno tra i due filamenti. i frammenti vengono trasferiti a una membrana di nitrocellulosa. 2) Dopo blotting (assorbimento) sulla membrana di nitrocellulosa si trovano i frammenti di DNA posizionati come sul gel. 3) La membrana è esposta a una sonda di DNA a singolo filamento complementare al gene da clonare. Il legame tra sonda e membrana si forma con legami a idrogeno. 4) La sonda contiene una sostanza fluorescente che permette di vedere l'unione con il gene. L'unione si può vedere quando la membrana è illuminata da raggi UV. WESTERN BLOTTING: Ci permette di identificare una determinata proteina in una miscela. Si divide in tre farsi: 1) separazione delle proteine su gel di poliacrilammide, tramite la tecnica dell'elettroforesi 2) trasferimento delle proteine su una membrana 3) rilevazione con anticorpi specifici per la proteina di interesse, non si possono utilizzare le sonde le quali servono solo per l'ibridazione del DNA.