CICLO CELLULARE E SUA REGOLAZIONE, Appunti di Biologia Cellulare

Scarica CICLO CELLULARE E SUA REGOLAZIONE e più Appunti in PDF di Biologia Cellulare solo su Docsity! INTRODUZIONE SIGNIFICATO: la biotecnologia è una tecnologia che prende in considerazione gli organismi viventi, ad esempio possono essere utilizzati per la produzione di proteine eterologhe*, oppure intendiamo la capacità di estrarre dalle cellule dei componenti (componenti sub-cellulari), tutto al fine di ottenere quantità commerciali di prodotti utili. Ad esempio, già i babilonesi utilizzavano un particolare organismo (cioè un lievito) per effettuare la fermentazione di vari alimenti. La risposta è che questo è l'unico modo attualmente conosciuto per produrre elevate quantità di proteina. Ad oggi le proteine ricombinanti vengono prevalentemente usate nel campo farmaceutico. È abbastanza chiaro che per soddisfare il fabbisogno mondiale di proteine è necessario produrne una elevata quantità. Uno degli esempi più comuni e conosciuti è l'insulina, prima estratta dal maiale con costi molto elevati, adesso prodotta in un minuscolo batterio in modo industriale. Un altro motivo per cui vengono prodotte proteine eterologhe riguarda lo studio delle relazioni struttura- funzione: ciò serve per l'individuazione di domini strutturali e funzionali e per la determinazione del ruolo di singoli residui aminoacidici (mutagenesi). Le proteine eterologhe sono importanti anche per la produzione di enzimi che intervengono nelle applicazioni industriali, oppure per la produzione di anticorpi, ormoni, anti-coagulanti, fattori della coagulazione, o antigeni per la produzione di vaccini (es. HBsAg). Ognuna di queste applicazioni ha dei requisiti diversi per la qualità e la quantità di proteina. Non è facile produrre proteine eterologhe! Produrre una proteina di un mammifero in un organismo batterico non può essere sempre fattibile, può funzionare con una piccola e semplice proteina come l'insulina, ma molte altre proteine umane possiedono modifiche particolari, dette glicosilazioni, che un batterio non è in grado di mimare. Per questo motivo molto spesso vengono utilizzate cellule molto più complesse, come cellule di mammifero (Chinese hamster ovary), che sono più simili a quelle umane e possono produrre proteine di elevata complessità. L'inconveniente delle cellule di mammifero, rispetto ad un batterio, è la minore produzione di proteina e la maggiore complessità nelle tecniche di coltivazione e di purificazione. Chiaramente questo causa un incremento dei costi delle proteine ricombinanti e dei conseguenti farmaci. La stessa organizzazione mondiale della Sanità afferma che è impossibile prevedere scientificamente quali saranno gli effetti a lungo termine degli OGM in agricoltura e nell’alimentazione. XENOTRAPIANTI Usare animali come fonte di trapianto nell’uomo (es. cuore di maiale: ottimo candidato). Problemi connessi al rischio di rigetto acuto e delle infezioni batteriche, virus, prioni (BSE). Questa è una soluzione transitoria, nel caso in cui non sia possibile aspettare un donatore compatibile. Consiste nel trapianto eseguito con l’utilizzo di organi prelevati a esseri viventi di una specie diversa da quella del ricevente. E’ stata considerata uno degli approcci più promettenti per il trattamento di gravi patologie nell’uomo; infatti, i trapianti di organi e tessuti dagli animali all’uomo potrebbero eliminare il grave problema della carenza di donatori, anche se sono molte le difficoltà da affrontare per poter utilizzare queste tecniche. TERAPIA GENICA APPLICATA ALL’UOMO (somatica ma non germinale) Per esempio per malattie legate al midollo osseo. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - CICLO CELLULARE (periodo che intercorre tra una divisione e l’altra) • ASPETTI GENERALI DEL CICLO CELLULARE Per dividersi e proliferare, tutte le cellule eucariotiche devono eseguire correttamente un programma genetico, definito ciclo cellulare, che sovrintende alla corretta replicazione e segregazione del materiale ereditario nelle cellule figlie. I cromosomi di una cellula eucariotica vengono duplicati in un ristretto intervallo temporale del ciclo cellulare, definito fase S, e segregano nelle cellule figlie in mitosi (fase M). La fase S e la fase M sono separate da altre due fasi, chiamate G1 e G2. E' importante che ciascun segmento del genoma sia replicato una volta e una volta soltanto durante la fase S; esistono dei meccanismi che controllano che la replicazione sia avvenuta correttaemnte e sia terminata prima che i cromosomi duplicati possano iniziare a separarsi durante la mitosi. Tali meccanismi sono chiamati checkpoint e sono discussi poco più avanti. La duplicazione dei cromosomi e la loro separazione nelle cellule figlie sono processi periodici estremamente precisi e ogni alterazione in questo processo provoca conseguenze catastrofiche in quanto, alterando il numero o l'integrità dei cromosomi, si modifica l'informazione genetica della cellula. Al contrario, la maggior parte dei componenti cellulari extracromosomici (proteine, ribosomi, organelli, ecc.) sono presenti in numero elevato e variabile all'interno della cellula e la loro sintesi, correlata alla crescita delle dimensioni della cellula, è pressocchè continua durante tutto il ciclo cellulare. Ne deriva che i meccanismi di controllo del ciclo devono essere in grado di integrare tra di loro i numerosi processi biochimici coinvolti sia nella crescita cellulare che nella corretta duplicazione e separazione dei cromosomi. Il ciclo cellulare è quel periodo che intercorre dal momento in cui la cellula si è appena divisa a quando si andrà a dividere nuovamente. Consiste di 4 fasi (consideriamo una cellula, come il fibroblasto), nel corso delle quali una cellula si sviluppa, replica i suoi costituenti molecolari e, infine, si divide in due cellule figle. 1. G1 (gap1, o intervallo prima della fase S), avviene in 11 h: la cellula attraversa un periodo durante il quale accresce il proprio citoplasma, raddoppiandone il volume. 2. S (sintesi), avviene in 8 h: viene considerata la fase centrale del ciclo, in cui la cellula duplica il proprio DNA nucleare. 3. G2 (gap2), avviene in 4 ore: dopo la fase S la cellula continua la sintesi di materiali citoplasmatici. A questo punto la cellula è pronta a dividersi. La divisione si svolge in fase M. 4. M (mitosi), avviene in 1 h: nel corso della fase M il materiale nucleare si condensa in cromosomi che, insieme agli organuli citoplasmatici, sono ripartiti equamente nelle due cellule figlie. non segue alcun accrescimento volumetrico; i blastomeri sono, quindi, cellule che si dividono rapidamente, saltando la fase G1 e gran parte della G2. Infatti, le prime fasi dello sviluppo dell'embrione utilizzano gran parte degli RNA e delle proteine che sono state sintetizzate in precedenza dalla cellula uovo. Molte cellule, dopo una serie di cicli, cessano di dividersi ed entrano in una fase di quiescenza, generalmente irreversibile, simile alla G0. In certi casi, questo stadio precede la senescenza e la morte cellulare. Si ritiene che questo stato dipenda dall'inefficienza della duplicazione dei telomeri. Nei metazoi i gameti vanno incontro a un particolare tipo di divisione che è detto meiosi; essa consta di una fase S e di due successive fasi M. Come risultato, dalla cellula diploide di partenza si formano quattro cellule, ciascuna con la metà del corredo cromosomico iniziale (cellule aploidi). ] FASI DEL CICLO CELLULARE • FASE G1 Nel corso della fase G1 il DNA nucleare trascrive vari tipi di RNA (con un processo chiamato trascrizione, catalizzato da un complesso enzimatico detto RNA polimerasi), alcuni dei quali dopo processing nucleare passano al citoplasma per la sintesi proteica. Sintesi di molecole, macromolecole ed organuli. (sintesi di tutti gli organelli cellulari). Nei procarioti esiste una sola RNA polimerasi in grado di sintetizzare tutti i tipi di RNA. Essa comprende una subunità che riconosce il promotore del gene da trascrivere e consente l'attacco della polimerasi. Nel caso degli eucarioti, invece, esistono tre diverse polimerasi nucleari che sintetizzano i diversi tipi di RNA; il prodotto della trascrizione non è mai un RNA definitivo, ma un precursore che deve subire una serie di modificazioni e deve essere assemblato a specifiche proteine per essere trasportato nel citoplasma. • FASE S (SINTESI DEL DNA): una volta completata la fase G1, la cellula, sotto lo stimolo del complesso G1/S-Cdk, entra nella fase di duplicazione del DNA o fase S. Prima di questa fase i cromosomi sono costituiti da una doppia elica di DNA e la quantità di DNA per nucleo corrisponde a un valore definito 2C; dopo la duplicazione i cromosomi sono costituiti da due doppie eliche di DNA e la quantità di DNA corrisponde a un valore di 4C. La duplicazione del DNA richiede, secondo il modello semiconservativo, lo srotolamento della doppia elica con allontanamento reciproco dei due filamenti paralleli e la costruzione su ciascuno dei due filamenti, che funzionano da stampo, di un nuovo polinucleotide con sequenze di basi complementari a quelle del filamento stampo. In questo modo, si creano due molecole identiche alla vecchia e costituite ciascuna da un filamento vecchio e uno nuovo. • FASE G2 (PREPARAZIONE ALLA DIVISIONE): dopo l'imponente sintesi di molecole, macromolecole e nuovi organuli che ha luogo in G1 e la duplicazione del DNA e dei rimanenti componenti della cromatina nella fase S, la cellula inizia un periodo preparatorio per la divisione cellulare, chiamato fase G2. In questo periodo si ha la sintesi di gran parte delle strutture microtubulari che formeranno l'apparato mitotico. Di questo apparato, alcune parti preesistono e sono state duplicate in S (centrioli); altre sono fabbricate in G2 sotto forma di proteine globulari, che poi polimerizzano in microtubuli. Sempre in G2 sono sintetizzati vari componenti di membrana che, al termine della divisione, sono utilizzati per la costruzione di parte delle nuove membrane plasmatiche delle due cellule figlie. Nella fase G2 avviene la sintesi dell'istone centromerico CENP- A, della ciclina mitotica (o ciclina B o M) e la sua unione alla Cdk per formare l'MPF che induce la cellula a entrare in mitosi. - Sintesi dei componenti dell’apparato mitotico - Sintesi di proteine che favoriscono la spiralizzazione del DNA - Sintesi di componenti di membrana - Ciclina mitotica • MITOSI (FASE M): è un fenomeno continuo, ma data la varietà e la complessità degli eventi che la caratterizzano la sua descrizione è comunemente distinta in fasi chiamate profase, metafase, anafase e telofase. “ 0 Mirotunui | Pegrcoszone Me Fig. 10,30 - Divisione mitotica in una cellula con quattro cro- mosomi. 4 4 1. PROFASE: uration Concensin..| Centiamel| — Prophase Netaphase | FUSO MITOTICO kinetochore polar microtuoules microtubules Depolimerizzaione ad un'estremità e polimerizzazione all'altra in una fibra del cinetocore, tramite perdita o ‘aggiunta di dimeri di tubulina. CENTRIOLTI: strutture formate da 9 triplette di microtubuli. Sano presenti a coppie nella cellula in divisione, orientati perpendicolarmente l'uno rispetto all'altro. Sono assenti in piante e funghi. CENTROSOMA: formato da 2 centrioli. Dal centrosoma si formano i microtubuli che formano il fuso mitotico. ASTER: microtubuli piuttosto corti che si irradiano da ciascun centrosoma. FIBRE POLARI: microtubuli che non si attaccano ai cromosomi ma si sovrappongono tra loro. Spingono le une sulle altre allontanando i centrosomi prima e i cromosomi poi. FIBRE DEL CINETOCORE: si ancorano al cinetocore e spostano i cromosomi verso il centro della cellula. All'anafase depolimerizzano a livello del cinetocore separando i cromatidi fratelli. La mitosi La condensazione dei cromosomi Almeno 3 classi di proteine coinvolte: istoni, topoisomerasi II e proteine SMC (Structural Maintenance of Chromosomes: hanno attività ATPasica). Hi: la fosorilazione di H1 è tradizionalmente considerata importante nella condensazione cromosomica, anche se non sembra essenziale. La sua fosforilazione potrebbe indurre un rilassamento del legame tra H1 e DNA che permette l'accesso ad altri fattori di condensazione. H3: la fosforilazione della serina 10 nella coda ammino-terminale di questo istone è strettamente associata alla condensazione dei cromosomi mitotici. Anche in questo caso la fosforilazione riduce l'affinità dell'istone per il DNA facilitando l'ingresso di altri fattori di condensazione. CICLO CELLULARE La mitosi La condensazione dei cromosomi Topoisomerasi IIa: la sua inibizione o immunodplezione inibisce la condensazione dei cromosomi. Non è chiaro cca come essa agisca nella condensazione. Agisce nella decatenazione dei cromatidi fratelli: taglia una delle 2 molecole a doppio filamento, passa l'altra molecola attraverso il gap e quindi risalda il gap. Questa è una Binding of Topo ll and nicking of one DNA molecule Pi fase necessaria per la sperazione delle due molecole figlie di DNA e per la seprazione dei cromatidi all'anafase. i Sali i Topo IIa è una componente i Ls Pmi pe! principale dello scaffold è souls a cromosomico ed è presente i UA pato lungo tutto il cromosoma alla. profase. Si pensa che la 1 ona decatenzione sia necessaria ° per la condensazione, e che la condensazione sia mantenuta da un processo di ricatenazione intramolecolare. topolsomarasa ll LU LUNIUETISUZIONE © MICIVITUS TUFUINSIO Ul. AVIT, IU preserizu USIÙ Topoisomerasi e la fosforilazione delle subunità non-SMC. Condensina I: SMC2, SMC4, CAP-D2, CAP-6, CAP-H Condensina II: SMC2, SMC4, CAP-D3, CAP-6G2, CAP-H2 DNA Condensa complex Topoisomerase | 0 <> LR Condensin con Topoisomerase È ne \ Le condensine promuovono un'azione di superavvolgimento della molecola del DNA: per farlo hanno bisogno di un innesco che consiste in un processo di fosforilazione e hanno bisogno di 2112,id che gli viene fornita attraverso ll] 3] di AT. 2. PROMETAFASE Nelle fasi avanzate della profase, che a volte sono anche definite prometafase, i microtubuli del fuso si attaccano ai cromosomi a livello del cinetocore secondo un processo che sembra essere casuale. In questa fase le estremità + dei microtubuli si allungano e si accorciano come se esplorassero l'ambiente. Quando l'estremità + di un microtubulo viene a contatto con un cinetocore si attacca a esso mediante una proteina motore. Inizialmente questo legame dipenderebbe dalla dineina, una proteina motore dei microtubuli che si muove verso l'estremità -, situata nella corona del cinetocore; l'attacco definitivo dipenderebbe, invece, dalla CENP-E, una chinesina localizzata nella piastra esterna del cinetocore. Se il contatto avviene fra il cinetocore e la porzione laterale del microtubulo, il cromosoma scivola lungo il microtubulo, probabilmente a causa di proteine motore, fino a che il cinetocore non raggiunge l'estremità + del microtubulo a cui si lega. Nelle cellule umane a ogni cinetocore si attaccano in media 20-30 microtubuli. - PROMETAFASE 1: Inizio disgregazione dell’involucro nucleare, completamento del fuso mitotico, cromosomi a massima spiralizzazione. Fuso mitotico: -fuso continuo o mantellare -fuso discontinuo o cromosomico I microtubuli del fuso si originano dal materiale pericentriolare del centrosoma: micotubuli del cinetocore si stabilizzano con l’attacco al cinetocore; microtubuli polari si stabilizzano dalla loro sovrapposizione al centro della cellula; i microtubuli astrali si estendono verso la periferia - PROMETAFASE 2: Disgregazione completa dell’involucro nucleare, attacco del fuso cromosomico ai cinetocori. - ANAFASE A: Consiste nel movimento dei cromosomi verso i poli del fuso attraverso la depolimerizzazione dei microtubuli cinetocorici e proteine motrici del cinetocore(-). Nello specifico, i cinetocori dei cromatidi di ciascun cromosoma sembrano essere tirati verso i poli opposti dai microtubuli cinetocorici; il materiale nucleare si suddivide così in due gruppi di cromatidi uguali fra loro, che si allontanano lasciando libero l'equatore cellulare, mentre i microtubuli interpolari rimangono inalterati. CICLO CELLULARE La mitosi L'anafase viene distinta in Anafase A: i cinetocori dei cromatidi di ciascun cromosoma sono tirati verso i poli opposti dai microtubuli cinetocorici. I cromatidi migrano verso i poli opposti lasciando la regione equatoriale vuota. I microtubuli interpolari rimangono inalterati, mentre i —microtubuli cinetocorici vengono depolimerizzati dalla chinesina MCAK (mrtotie centromere- REUEILIZOI ASSOCIATED KINESIN) @ i Cromosomi seguono l'accorciamento grazie a proteine motrici del cinetocore (es. dineina). CICLO CELLULARE La mitosi .Anafase A: movimento dei cromatidi verso i poli. 1. Meccanismo a “Pac-Man": alimentato dalla dineina a livello del cinetocore. Questa proteina rimane agganciata alle estremità + in depolimerizzazione tirando il cinetocore c uindi il cromatidio verso il MECCANISMO A PAC-MAN in uscita 2 Movimento diretto verso il polo i SE “== e FIBRA DEL POLO CINETOCORE in uscita n Subunità di tubulina nie inuscita 4 ®© : A i WE ©“ © è e 5 ese @ © » “è uo in uscita ©, < 00 °° ® se 0 © è © © , co. do se lic ANAFASE B: Si riferisce alla separazione di poli del fuso grazie all’allungamento dei microtubuli polari. I microtubuli sovrapposti scivolano l’uno sull’altro grazie a proteine motrici +. I poli del fuso sono tirati verso la parte opposta da proteine motrici – che si legano ai microtubuli dell’aster. Nello specifico: il movimento dei due cromatidi verso i poli opposti è accompagnato dall'allontanamento dei due poli del fuso mitotico a seguito dell'allungamento dei microtubuli interpolari. Lo spostamento dei cromosomi durante l'anafase A dipende da due meccanismi: la depolimerizzazione dei microtubuli del cinetocore e l'azione motrice di alcune proteine localizzate nel cinetocore. Durante la metafase i microtubuli del cinetocore mantengono una lunghezza costante. I cromosomi presentano un movimento oscillatorio, perchè si legano ai microtubuli mediante la dineina, che tende a trascinarli verso il polo del | microtubuli si , . Spostamento dei 0 d--. *., N quando. 2 . passa ole a «; t, cromosomi. Gee A ve . . Cinetocore — - * Lo spostamento dei cromosomi 105 ’, i 27 , Direzione durante l’anafase dipende da due 1a), si rormeno meccanismi: La proteina motrice 21 seen 1. Depolimerizzazione dei a “ 1 microtubuli del cinetocore il microzubulo 2. Azione motrice di alcune proteine del cinetocore. Proteine motrici che legano i microtubli e il cromosoma nel cinetocore Micoubalo trasportano i cromosomi verso j | de sretocore poli del fuso. 7 Cinetocore Protene {/ gel cinetocore © Fig. 10.39 - Interazione fra microlubuli del fuso e cineto- core in metafase e in anafase. È a, In metalase le estremità più ; dei microtubuli si accrescono verso il centromero fino a che le proteine motore del cineto- I core non si agganciano a essi. b, In anafase A la chinesina MCAK (mitotic centromere-as- sociated kinesin) provoca la depolimerizzazione dei micro- tubuli a livello delle estremità più e la coesina si disgrega consentendo la separazione dei cromatici che sono trasci- nati dalle proteine motore del cinetocore verso i poli opposti della cellula lungo i microtubuli che si depolimenizzano. 5. TELOFASE: il fuso si disgrega, i cromosomi si despiralizzano, si riforma l’involucro nucleare, ripristino del nucleolo. Nello specifico: la telofase conclude la mitosi. I due gruppi di cromatidi (ormai da considerare come cromosomi figli) sono migrati ai poli opposti della cellula e si vanno despiralizzando, mentre a livello dei cromosomi provvisti delle costrizioni secondarie si riforma il nucleolo. In seguito alla defosforilazione delle lamìne, si ricostituisce la lamina fibrosa attorno a ciascuno dei due gruppi di cromosomi figli e, di conseguenza, a essa aderiscono vescicole che in parte derivano dal vecchio involucro nucleare e in parte sono state neosintetizzate dal reticolo rugoso. Queste vescicole si fondono ricostituendo l'involucro nucleare a livello del quale si riformano i pori. L'apparato mitotico si depolimerizza con l'esclusione dei centrioli e di un gruppo residuo di microtubuli antiparalleli posto al centro della cellula, chiamato fuso centrale, che permane fino a che non si è diviso anche il citoplasma. 6. CITODIERESI: formazione dell’ANELLO CONTRATTILE grazie ai microfilamenti di actina e miosina. Nello specifico: nel citoplasma inizia la citodieresi (o citocinesi), che è un insieme di processi che determinano la divisione del citoplasma. Nelle cellule animali a livello dell'equatore si forma un anello contrattile (contractile ring) costituito da filamenti di actina e di miosina, orientati in maniera circonferenziale; questi, interagendo fra loro, provocano la contrazione che induce la strozzatura del citoplasma. In conseguenza dell'azione dell'anello contrattile, la membrana plasmatica si introflette e gradualmente avanza verso il centro della cellula dove incontra le pieghe provenienti dal lato opposto con le quali si salda. La cellula telofasica si divide così in due cellule figlie di uguali dimensioni, ognuna munita di un proprio nucleo e di propri organuli citoplasmatici, che si sono ripartiti in modo corrispondente ai due lati dell'equatore. L'esatta localizzazione dell'anello contrattile sembra determinata in alcuni casi dai microtubuli astrali e in altri dai microtubuli interpolari antiparalleli del fuso centrale. Nelle cellule vegetali, lungo la zona di separazione si portano alcuni microtubuli e, quindi, forse sotto l'influenza di questi ultimi, si accumulano vescicole prodotte dall'apparato di Golgi che si fondono producendo il fragmoplasto, un setto divisorio dal quale si origina la parete delle due cellule figlie. All'interno di ciascuna vescicola si trovano polisaccaridi che sono i precursori della parete cellulare che si forma all'interno del fragmoplasto. Con il procedere della divisione, le vescicole si estendono lateralmente fino a raggiungere la parete cellulare originaria. Le due cellule figlie sono così separate in modo incompleto dal fragmoplasto rimanendo in comunicazione mediante canali chiamati plasmodesmi. RIASSUMENDO: All’inizio della profase nella cellula sono presenti due centrioli, che sono stati duplicati nella fase S, e in così cominciano ad essere sintetizzati i microtubuli che cominciano a migrare ai due poli opposti della cellula. I cromosomi si condensano grazie alle proteine non-istoniche, in modo da raggiungere la massima compattazione possibile. L’involucro nucleare comincia a dissolversi. I microtubuli che si formano al momento della divisione cellulare, si dividono in astrali e interpolari (si sovrappongono nella parte centrale) e poi ci sono i microtubuli cromosomici o cinetocorici (si stabilizzano prendendo contatto con il con i cinetocori dei cromosomi e così facendo dispongono i cromosomi sul piano equatoriale della cellula, durante la metafase). Dopo avviene l’anafase, durante la quale i cromatidi fratelli si separano. Questa fase si divide in anafase A (i cinetocori dei cromatidi di ciascun cromosoma sono tirati verso i poli opposti dai microtubuli cinetocorici. In questo modo la regione equatoriale viene lasciata vuota. I microtubuli interpolari rimangono inalterati, mentre i microtubuli cinetocorici vengono depolimerizzati dalla chinesina MCAK) e B (la migrazione dei cromatidi è associata all’allontanamento dei due poli del fuso per l’allungamento delle fibre interpolari. L’allungamento dipende dallo scivolamento delle fibre polari le une sulle altre. Alcune proteine che intervengono in questa fase sono le chinesine). Durante la COSA SUCCEDE NEGLI EUCARIOTI SUPERIORI? Qui la situazione è un poi più complicata, perché la G1 si lega a una chinasi dipendente da ciclina denominata CDK4 e CDK6. Questo complesso attiva la sintesi della ciclina G1/S e della proteina chinasi CDK2 che si legheranno insieme. Il complesso neo formato (G1/S -Cdk2) fa si che venga stimolata a sua volta la sintesi della ciclina S, che sarà quella che si legherà al CDK2: praticamente la ciclina G1/S verrà poi sostituita dalla ciclina S, e a questo punto entra nella fase S. Come funziona il complesso G1/S-CDK2? Esso agisce andando ad attivare il complesso pre-replicativo, che a sua volta è costituito da un complesso di riconoscimento dell’origine di replicazione (ORC), e una proteina detta Cdc6 (proteina regolatrice) e da una DNA elicasi: il complesso pre-replicativo permette di iniziare la sintesi del DNA. Il complesso S/CDK2 non si disgrega durante la fase S, ma si dissocia all’inizio della mitosi. Il complesso S/CDK2 durante la fase G2 stimola la sintesi della ciclina M e della CDK1: questo forma un fattore di promozione della mitosi (MPF), analogo a quello visto precedentemente. Si tratta di un complesso inattivo se è fosforilato, per cui per renderlo funzionante viene rimosso il gruppo fosfato grazie a una proteina fosfatasi (è una proteina regolatrice indicata come cdc25). Se la replicazione non è terminata, cdc25 è bloccata e quindi il complesso diventa inattivo: in sostanza c’è un punto di controllo della regolazione del DNA ad opera della proteina cdc25, che ha funzione di defosforilare il complesso M/CDK1. Quando durante l’anafase si forma il complesso di promozione dell’anafase, M/CDK1 si disgrega. Il complesso di cui abbiamo appena parlato regola la divisione/separazione dei cromosomi e la loro localizzazione ai poli opposti della cellula; presenta come proteina regolatrice la cdc20. Come agisce il tutto? APC, una volta defosforilata da cdc20, va a staccare la securina dall’enzima separasi. L’enzima separasi ormai libero va a degradare le coesine permettendo il distacco dei cromatidi fratelli, i quali migreranno ai poli opposti del fuso. APC va poi a disattivare il complesso M-cdk1 e la cellula esce dalla mitosi. IN SINTESI: stacca la securina, che a sua volta libera le separasi ed è in grado di disgregare le coesine (le coesine permettono di tenere insieme i cromatidi fratelli a livello centromerico). In questo modo i cromatidi fratelli possono essere portati ai poli opposti della cellula. Cdc20 si attiva solo quando i cinetocori sono legati ai microtubuli del fuso. A questo punto avviene la separazione dei cromosomi ai poli della cellula. IN SINTESI: Intervengono cicline e chinasi dipendenti da cicline: CDK2,CDK4, Cdc20, APC (complesso di promozione dell’anafase), Cdk1… NELLO SPECIFICO: MOTORE DEL CICLO CELLULARE Il motore del ciclo cellulare è costituito da una famiglia di proteine chinasi, enzimi in grado di trasferire un gruppo fosfato dall'ATP a specifici amminoacidi di altre proteine. Tali chinasi sono essenzialmente prive di attività enzimatica nella loro forma monomerica e, per essere funzionali, devono associarsi ad altre proteine, chiamate cicline. Il loro nome deriva dal fatto che le cicline sono sintetizzate e degradate in modo ciclico all'interno della cellula e, di conseguenza, il loro livello varia considerevolmente nelle diverse fasi del ciclo cellulare. E' proprio in virtù della richiesta associazione con le cicline che si parla di chinasi ciclina dipendenti, o CDK (Cycin-Dependent Kinase). In S. cerevisiae esiste una sola CDK (il prodotto del gene CDC28), mentre nei mammiferi esistono numerose CDK. Sia in lievito che negli eucarioti multicellulari esistono poi numerose cicline, i cui singoli livelli quantitativi variano a stadi diversi del ciclo cellulare come risultato sia di una sintesi che di una degradazione differenziale. Alcune cicline raggiungono, quindi, il loro massimo livello durante la fase G1, altre durante la fase S e altre ancora durante la fase G2. Poichè l'attività delle CDK richiede la preventiva associazione con l'una o l'altra delle diverse cicline e i substrati che vengono fosforilati variano a seconda del tipo di ciclina associata alle CDK, ne deriva che sia il livello quantitativo che il tipo di ciclina che viene prodotto a stadi diversi del ciclo cellulare sono dei fattori essenziali che determinano il passaggio da una fase all'altra del ciclo. Il motore del ciclo cellulare è, quindi, essenzialmente lo stesso in cellule di lievito e di mammifero: l'unica differenza è che in lievito c'è una sola CDK mentre negli eucarioti multicellulari ce ne sono varie. Sia in un caso che nell'altro, tuttavia, la diversa specificità d'azione delle CDK è assicurata dall'associazione con diverse cicline, che sono altrettanto numerose in eucarioti uni- e multicellulari. Il legame con le cicline non è l'unico fattore che influenza l'attività delle CDK. Esistono almeno altri due livelli di regolazione altrettanto importanti: 1. la presenza di inibitori 2. lo stato di fosforilazione stesso delle CDK Sia in lievito che in organismi multicellulari sono state scoperte una serie di proteine che agiscono come inibitori delle CDK che vengono chiamate CKI (Cyclin-Dependent Kinase Inhibitors). Se le CDK possono essere considerate come il "motore" della "macchina" del ciclo cellulare, le proteine CKI possono esserne considerate i "freni". Alcune CKI sembrano controllare passaggi intrinseci del ciclo cellulare, mentre altre sembrano bloccare la proliferazione cellulare in risposta a stimoli esterni. Va infatti ricordato che il ciclo cellulare è anche influenzato da segnali esterni, quali fattori di crescita e antimitogeni, al fine di integrare la divisione cellulare sia con l'ambiente extracellulare che con i meccanismi alla base del differenziamento. Alcune CKI sembrano avere un ruolo essenziale proprio nello stabilire queste interconnessioni. Le stesse CKI, o analoghe proteine con funzione inibitoria, possono essere ugualmente importanti per completare i programmi dello sviluppo embrionale o per bloccare la crescita una volta che il programma sia stato completato. E' opportuno ricordare che la maggior parte delle cellule dei tessuti di un organismo multicellulare non sono e non debbono essere in fase di attiva proliferazione. E' quindi necessario che le cellule non proliferanti di questi tessuti escano permanentemente dal ciclo cellulare ed entrino in una fase di quiescenza (definita come G0). Un meccanismo che determini e mantenga un'elevata espressione degli inibitori CKI potrebbe essere idoneo a tale scopo. Il terzo livello di regolazione dello stato del motore del ciclo cellulare coinvolge il livello di fosforilazione delle CDK. Le CDK sono delle proteine chinasi che fosforilano altre proteine, ma la loro attività è modulata dallo stato di fosforilazione della stessa subunità catalitica delle CDK. (nota anche come p34). All'interno della proteina p34 esistono dei residui amminoacidici che devono essere fosforilati e altri che devono essere de-fosforilati affinchè la proteina p34 sia enzimaticamente attiva, e questi residui sono conservati in tutte le CDK degli eucarioti. In particolare, il residuo di tirosina in posizione 15 (Tyr15) deve essere de- fosforilato, mentre il residuo di treonina in posizione 160 (Thr160) deve essere fosforilato. Da queste considerazioni appare evidente che altre proteine chinasi e proteine fosfatasi (proteine che de-fosforilando specifici AA svolgono una funzione contraria rispetto alle chinasi) regolano positivamente o negativamente l'attività delle CDK. La proteina chinasi che fosforila il residuo di Tyr15 agisce come regolatore negativo inibendo l'attività delle CDK, mentre la proteina fosfatasi e la proteina chinasi che, rispettivamente, de- fosforilano il residuo Tyr15 e fosforilano il residuo Thr160, possono essere considerate come regolatori positivi. FATTORI CHE MODIFICANO IL CICLO CELLULARE IN RELAZIONE ALLE COLTURE CELLULARI Tra questi fattori dobbiamo ricordare: 1. interazione degli ormoni e fattori di crescita(i quali presentano recettori a livello della membrana) con recettori/proteine di membrana; 2. volume cellulare (il quale si raggiunge grazie alla disponibilità di nutrienti); 3. inibizione da contatto: quando le cellule sono vicine e si toccano, esse si rilasciano delle sostanze per comunicare tra loro: per esempio, quando i fibroblasti di topo si toccano rilasciano proteine che inibiscono la divisione cellulare. (gli interferoni inibiscono la crescita di molti tipi cellulari). 4. alterazione del trasporto di ioni 5. pH 6. proteine istoniche e non istoniche 7. poliammine Quando le cellule hanno riempito tutto lo spazio a diposizione (in vitro) smettono di accrescersi; nel caso del tumore ci troviamo di fronte a una crescita esponenziale di cellule che hanno perso il controllo della loro crescita, e quindi del ciclo cellulare, modificano la struttura anatomica di un organo che poi muore: quindi capire come avviene la regolazione del ciclo cellulare è importante anche quando si studiano le varie neoplasie, in modo da permettere una regolazione maggiore e in modo da vedere quali sono le varie fasi che permettono a una cellula di trasformarsi in una cellula tumorale. Altri fattori sono dati dall’alterazione del trasporto di ioni, da proteine istoniche e non istoniche, dall’alterazioni dei valori di pH. cellulare (quindi ci accorgiamo che le cellule si stanno dividendo in seguito a questa variazione di pH). Si è visto anche un aumento transitorio nella fase G1/S di ioni calcio che vengono liberati dal REL, che sappiamo essere un magazzino di ioni calcio; l’aumento di tali ioni si verifica anche durante l’anafase, quando si viene a creare la migrazione dei cromosomi sul fuso mitotico. 5. pH Aumento di 0.2-0.4 unità durante la tarda fase G1, la fase S e all’inizio della mitosi. Il pH si abbassa prima dell’inizio della fase di duplicazione del DNA. Le cellule di mammifero in coltura sono stimolate alla divisione se si aumenta il pH citoplasmatico. IN SINTESI: durante la fase G1/S e all’inizio della mitosi si verifica un aumento del pH nella cellula. Prima della duplicazione del Dna invece il pH si abbassa. Se si vuole stimolare alla divisione cellulare una cellula bisogna aumentare il pH citoplasmatico (per quanto riguarda le cellule di mammifero). 6. PROTEINE ISTONICHE E NON ISTONICHE La fosforilazione delle proteine istoniche e non istoniche fanno avvenire delle variazioni (qualitative e quantitative) a seconda del momento del ciclo cellulare. Avvengono modificazioni chimiche (fosforilazione) e variazioni quantitative e qualitative. Un esempio è dato dall’istone H1, il quale presenta vari siti di fosforilazione; quello che si è notato è che è presente un sito di fosforilazione detto G1, proprio perché esso viene fosforilato proprio in fase G1. Poi successivamente viene fosforilato il sito S e infine il sito M. L’istone H3 viene fosforilato invece all’inizio della profase della mitosi. 7. POLIAMMINE (hanno una forte carica positiva) Le poliammine fanno entrare la cellula in fase S , facendo quindi avvenire la duplicazione del DNA, legandosi ad esso grazie alla loro natura di carica positiva (per via dei gruppi amminici). QUINDI: le poliammine sono molecole con forte carica positiva (gruppi amminici) che sono fortemente reattive con DNA e RNA. L’aumento delle poliammine fa entrare le cellule in fase S e sono coinvolte nella riparazione di rotture o altre lesioni che si verificano normalmente durante la replicazione del DNA.