Genetica Molecolare: Ploidia e Cariotipo, Dispense di Genetica

Scarica Genetica Molecolare: Ploidia e Cariotipo e più Dispense in PDF di Genetica solo su Docsity! LEZIONE 4 GENETICA MOLECOLARE PLOIDIA: variazione nel numero di cromosomi omologhi Con Ploidia si indica genericamente il numero delle serie (omologhe) di cromosomi presenti in una cellula, ogni serie si simboleggia con la lettera N. Questo termine racchiude le seguenti definizioni: • Euploide: numero normale di Ch ( numero cromosomico n) • Aploide: n Ch nelle cellule germinali (23) • Diploide: 2n Ch nelle cellule somatiche (46) • Aneuploide: Ch multipli imperfetti di n (23) – Polisomia: più di due Ch omologhi (Down 47XY+21, 47XX+21) – Monosomia : mancanza di uno dei due Ch omologhi (Turner 45, X) • Poliploide: aumento numerico del corredo di Ch (3n,4n ecc.) – Autopoliploide : corredi cromosomici della stessa specie – Allopoliploide : corredi cromosomici da specie diverse • Nulliploide: cellula senza nessun cromosoma 0N (globuli rossi e piastrine umani) Le poliploidie sono poco comuni negli animali, assenti in quelli sessuati. Sono molto diffuse invece nelle piante, le quali hanno così potuto acquisire utili capacità. CARIOTIPO (umano) Le aneuploidie accennate in precedenza sono variazioni del numero dei cromosomi. Pertanto, per individuare variazioni nella morfologia e nel numero dei cromosomi dobbiamo ottenere un cariotipo. Il cariotipo di una cellula eucariote è la costituzione del patrimonio cromosomico di una specie dal punto di vista morfologico. Con l'ausilio del microscopio ottico si valutano la lunghezza, la posizione dei centromeri, il pattern di bandeggio, eventuali differenze tra i cromosomi sessuali, ed eventuali altre caratteristiche fisiche. Il cariotipo di un individuo è dato pertanto dal numero e dalla morfologia dei suoi cromosomi. L'analisi del cariotipo permette di costruire una rappresentazione grafica ordinata del corredo cromosomico di un individuo, che viene definita cariogramma. METODICA Per ottenere un cariotipo, si può partire ad esempio da un campione di sangue. Si effettua una coltura cellulare dei linfociti attraverso semina e crescita in terreno di coltura. Poi, dato che ci interessano i cromosomi, i quali risultano particolarmente evidenti durante la divisione cellulare, bisogna stimolare quest’ultima aggiungendo sostanze come la fitoemoagglutinina. Incubare per 2-3 giorni a 37°C in modo che avvengano le divisioni cellulari. Poi, siccome la fase del ciclo cellulare in cui i cromosomi risultano più evidenti è la metafase, bisogna aggiungere una sostanza che blocchi le cellule in questa fase, come ad esempio la colchicina, la quale è in grado di bloccare la formazione del fuso mitotico, arrestando così il ciclo cellulare. A questo punto, siccome ci interessa il contenuto delle cellule, bisogna lisare le membrane, ad esempio attraverso l’aggiunta di una soluzione ipotonica. Questa soluzione porta ad un rigonfiamento cellulare con conseguente rottura delle membrane. La lisi cellulare dev’essere delicata per non alterare la posizione dei cromosomi. Successivamente si bloccano (fissano) i cromosomi in questa posizione aggiungendo un fissativo, ad esempio una soluzione (3:1) di metanolo e acido acetico. Il metanolo inizierà a disidratare i cromosomi che verranno ridotti dall’acido acetico in modo da prevenire l’azione di agenti ossidanti e in questo modo cerchiamo di mantenere i cromosomi il più possibile nella loro conformazione originale. Per analizzarli, si strisciano su un vetrino portaoggetti, dopodiché aggiungiamo un colorante (es. metodo giemsa). L’analisi viene fatta al microscopio e i cromosomi vengono ordinati al computer per ricostruire il cariogramma. Generalmente si cercano di ricostruire almeno 20 cariogrammi e si valuta il cariotipo più frequente (>80/90%). Se non vengono raggiunte queste percentuali bisogna ripetere tutto il procedimento. CARIOGRAMMA UMANO La ricostruzione del cariotipo o mappa cromosomica viene effettuata attraverso la costruzione del cariogramma, ottenuto appaiando i cromosomi metafasici omologhi e ordinandoli secondo un sistema di classificazione internazionale. Figura 1. Cariogramma maschile e femminile Sindrome dell’extra Y o di Jacobs La sindrome di Jacobs, o sindrome XYY, o disomia del cromosoma Y è un'aneuploidia eterosomica, cioè un'anomalia cariotipica, nella quale è presente, oltre ai cromosomi X e Y tipici del corredo normale maschile umano, un cromosoma soprannumerario Y. Tale polisomia è dovuta a una non-disgiunzione durante la seconda divisione meiotica nella gametogenesi maschile. Nonostante l'esiguità del contributo genico del cromosoma Y, diverse sono le caratteristiche individuate nei portatori dell'aneuploidia. Sebbene non particolarmente omogenee, risultano comunque avere frequenza significativamente superiore a quella con la quale medesimi caratteri si ritrovano nella popolazione generale. I soggetti vengono detti anche super maschi e possono presentare spesso un'altezza superiore a 180 cm (media 188 cm) e lieve ritardo mentale. Possono avere denti grandi o con radici grandi, possono avere problemi vascolari ed è stata ipotizzata l'associazione anche con difetti di lateralizzazione embriogenica. Contrariamente a quanto ipotizzato in passato (prima erano considerati particolarmente alti), i livelli di testosterone sono normali. Questa sindrome ha un’incidenza pari a 1:950 nati vivi. Sindrome di Turner: X0 Nella sindrome di Turner (monosomia X), le ragazze nascono con uno dei loro due cromosomi X in parte o completamente mancante. La diagnosi si basa su reperti clinici ed è confermata da un'analisi del cariotipo. La sindrome di Turner si verifica in circa 1/2500 femmine nate vive in tutto il mondo. Tuttavia, il 99% dei concepimenti con cariotipo 45,X è abortito spontaneamente. Circa il 50% delle ragazze affette ha un cariotipo 45,X; circa l'80% ha perduto il cromosoma X paterno. La maggior parte del restante 50% è rappresentato da mosaici (p. es., 45,X/46,XX oppure 45,X/47,XXX). Negli individui con mosaicismo, il fenotipo può variare da quello della tipica sindrome di Turner a quello normale. Occasionalmente, le donne affette presentano un cromosoma X normale e un cromosoma X che ha formato un cromosoma ad anello. Alcune donne affette hanno un cromosoma X normale e un isocromosoma delle braccia lunghe, formato dalla perdita delle braccia corte e dalla formazione di un cromosoma costituito da due braccia lunghe del cromosoma X, formato dalla perdita delle braccia corte e dalla formazione di un cromosoma costituito da due braccia lunghe del cromosoma X. Queste donne tendono ad avere molte delle caratteristiche fenotipiche della sindrome di Turner; perciò, la delezione del braccio corto del cromosoma X sembra avere un ruolo fondamentale nella determinazione del fenotipo della sindrome. Anomalie strutturali dei cromosomi Sindrome di Lejeune o cri du chat La sindrome del grido di gatto (o sindrome del cri du chat) è una malattia genetica rara causata dalla delezione di parte del cromosoma 5 ("delezione 5p- "). Ha un’incidenza di 1:50000 nati vivi. La sindrome prende nome dal pianto lamentoso, simile al miagolio del gatto, caratteristico dei soggetti affetti. La perdita di materiale genetico si associa a ritardo dello sviluppo psicomotorio e a grave ritardo mentale, ma l'assenza di malformazioni gravi in una notevole percentuale di casi può garantire una lunga sopravvivenza. Gli affetti sono in maggioranza di sesso femminile, probabilmente a causa di una maggiore mortalità dei maschi affetti. CARIOGRAMMA E BANDEGGIO (G) Per evidenziare meglio le anomalie strutturali nei cromosomi si combina il cariogramma con il cosiddetto “bandeggio”. Si utilizzano quindi dei coloranti (es. giemsa) per evidenziare le diverse regioni cromosmoiche. Un colorante Giemsa è una soluzione in glicerina ed alcool metilico (fissativo) di eosina e di blu di metilene. L’eosina acida colora in rosso- arancio le componenti cellulari basiche e forma un background. Il Blu di metilene forma prodotti di ossidazione (basici) che colorano di blu i componenti cellulari aventi reazione acida, come il DNA. I costituenti cellulari aventi reazione basica fissano l'eosina (acida) colorandosi in rosso-arancio. Il bandeggio G è probabilmente in relazione sia alla struttura della regione cromosomica in termini di condensazione (e proteine associate) sia alla composizione in basi del DNA. Bande chiare, per esempio, si ritrovano più abbondanti in regioni del genoma ricche di geni attivi e, pertanto, con contenuto maggiore dei nucleotidi G e C. Il Giemsa ha maggiore affinità per AT. Una banda citogenetica è lunga tra le 4 e le 10 Mb. La perdita o l’acquisizione di tratti di DNA sono apprezzabili con il cariogramma se ≥ 6x106 pb. In alternativa si può effettuare un’analisi molecolare (es. FISH). Nell’immagine soprastante, si evidenziano centromero, braccio corto (p) e lungo (q), regioni e relative bande numerate: come esempio, la freccia indica il locus 1q2.4, cioè posizionato sul cromosoma 1, braccio lungo, regione 2, banda 4. Figura 3. Rappresentazione del genoma umano.