Dispense di Biologia Cellulare UNIPR, Appunti di Biologia Cellulare

Scarica Dispense di Biologia Cellulare UNIPR e più Appunti in PDF di Biologia Cellulare solo su Docsity! Teoria cellulare: 1. Tuttigli organismi sono composti da cellule (Hooke) La cellula rappresenta l’unità organizzativa di base e autonoma di tutti gli organismi (Schwann e Schleiden) 3. Ogni cellula deriva da una cellula preesistente (Virchow) Le cellule possono essere procariotiche o eucariotiche, entrambe hanno in comune la membrana plasmatica e il citoplasma. Le cellule procariotiche sono comparse per prime e sono prive di nucleo (archea e Bacteria). Le cellule eucariotiche sono più complesse, il nucleo è delimitato da una membrana che racchiude il DNA, all’interno presenta organelli con differenti funzioni tutti racchiusi da membrane (Eukarya). Gli organuli del sistema delle membrane lavorano in sinergia, vi sono degli scambi continui per portare avanti i processi biologici. Il nucleo, è il centro di controllo della cellula, contiene il DNA sotto forma di cromatina ed è l’organulo più grande della cellula. Contiene un NUCLEOLO che rappresenta la sede dei ribosomi, dove avviene la loro sintesi, importante per la traduzione dell' mRNA in proteina, si trova separato dal citoplasma da una doppia membrana e sono presenti numerosi pori nucleari attraverso i quali avviene lo scambio di macromolecole tra il citoplasma e il nucleo e viceversa. Il reticolo endoplasmatico rugoso (RER) si trova in continuità con la membrana del nucleo ed è rappresentato dalla presenza di tanti ribosomi, ha funzione di sintesi delle proteine e di produzione di componenti del sistema di membrane, assemblaggio e modificazione di proteine destinate a essere secrete dalla cellula. È costituito da numerose cisterne appiattite. La proteina sintetizzata dal ribosoma all’interno del RER inizia a subire le prime modificazioni, dopodiché sarà inglobata in una vescicola di trasporto che si andrà a fondere nell’apparato di Golgi. Il reticolo endoplasmatico liscio (REL) ha funzione di sintesi dei lipidi, è costituito prevalentemente da tubuli e demolisce le tossine e i farmaci nelle cellule del fegato. Può funzionare anche come sede di riserva per ioni Ca che possono essere rilasciati nel citosol della cellula in seguito a determinati stimoli nelle cellule muscolari. L'apparato di Golgi è costituito da sacchetti appiattiti impilati l'uno sull'altro membranosi discoidali stratificati, riceve le proteine e i lipidi dal RE attraverso vescicole che si fondono con esso, i sacchetti sono in grado di portare alla maturazione completa della proteina per poi fondersi con la membrana plasmatica e essere poi secreta. I lisosomi sono dotati di enzimi idrolitici in grado di digerire le proteine, lipidi e carboidrati che vengono endocitati dalla cellula dall'esterno attraverso vacuoli alimentari che si vanno a fondere con i lisosomi. Un'altra funzione è quella di digerire anche organuli danneggiati che devono essere rimpiazzati. | lisosomi contenuti all'interno dei globuli bianchi distruggono i batteri nocivi che sono stati ingeriti. Esistono lisosomi particolari detti PEROSSISOMI che contengono la perossidasi, un enzima in grado trasformare il perossido di idrogeno in ossigeno e acqua utilizzando ossigeno molecolare. I mitocondri demoliscono i carboidrati e producono ATP, svolgono la respirazione cellulare che porta alla sintesi di ATP e convertono l'energia chimica presente negli alimenti in energia utilizzabile dalla cellula (ATP), contengono DNA di origine materna. Sono dotati di una membrana esterna e una interna e numerose creste che aumentano la superficie interna dell’organulo. Il citosol o fluido cellulare rappresenta il 70% del volume totale della cellula, è costituito principalmente da acqua ma anche macromolecole e ioni. Il citoscheletro da forma alla cellula e ne guida i movimenti, contribuisce inoltre alla formazione delle giunzioni tra cellule, è costituito da: - Microfilamenti di actina > sono disposti in fasci o a reticella e svolgono un ruolo strutturale di fondamentale importanza. Consentono alle cellule di spostarsi con movimento ameboide o strisciando. - Filamenti intermedi > sono costituiti da diversi polipeptidi fibrosi e svolgono una funzione strutturale, sostenendo l'involucro nucleare e la membrana plasmatica - Microtubuli + sono costituti da una proteina globulare detta tubulina, formano dei canali cavi che agiscono come binari sui quali si spostano i vari organuli cellulari, lo scorrimento è reso possibile dalla presenza di molecole motrici associate ai microtubuli. Le ciglia e i flagelli sono costituiti da microtubuli, sono estroflessioni, le ciglia hanno lunghezza breve mentre i flagelli sono appendici più lunghe. | centrioli sono strutture formate da 9 triplette di microtubuli che vanno a costituire il CENTROSOMA, inoltre svolgono una funzione essenziale durante la mitosi in quanto sono coinvolti nell’assemblaggio del fuso mitotico. Le cellule animali sono connesse fra loro attraverso tre tipi di giunzioni: - Giunzioni di ancoraggio o DESMOSOMI, tengono unite le cellule adiacenti - Giunzioni occludenti o serrate, più strette dei desmosomi - Giunzioni comunicanti o giunzioni GAP (connessine), attraverso le quali componenti possono passare da una cellula all'altra. Nella cellula sono presenti due tipi di geni, i geni costitutivi che codificano per importanti proteine fondamentali per la vita della cellula stessa e geni DI LUSSO di numero superiore a quelli costitutivi, importanti per la differenziazione delle varie tipologie di cellule. Cellule dello stesso tipo si organizzano a formare i vari tessuti. ® = VISUALIZZAZIONE DELLE CELLULE CITOLOGIA + studia la cellula dal punto di vista morfologico e funzionale, nasce con l'avvento del microscopio ottico e migliora con le nuove tipologie di microscopia BIOCHIMICA > studia la struttura e le trasformazioni dei componenti delle cellule grazie a tecniche di ultracentrifugazione, cromatografia, elettroforesi e spettrometria di massa BIOLOGIA MOLECOLARE scienze OMICHE che analizzano: GENOMICA: i geni contenuti nel DNA EPIGENOMICA: modifiche epigenetiche presenti nel materiale genetico di una cellula TRASCRITTOMICA: studia tutti gli RNA messaggeri trascritti PROTEOMICA: il complesso delle proteine, strutture e funzioni METABOLOMICA: metaboliti di un organismo, i prodotti finali del suo metabolismo VIVIV* e MICROSCOPIO Inclusione del campione in paraffina che va a occupare lo spazio precedentemente occupato dall'acqua, una vota indurita a freddo permette di produrre dei blocchetti di paraffina facili da sezionare tramite un mitocromo. Una volta completata la preparazione si procede alla colorazione con il metodo più appropriato. Si utilizzano solitamente due colorazioni contemporanee: una colorazione che rivela le componenti del tessuto e una contro colorazione che colora il resto del tessuto facendo da contrasto. L'ematossilina viene utilizzata con l’eosina, è un colorante basico, viceversa l’eosina è un colorante acido che si lega a molecole cariche positivamente presenti nel citosol. Le zone bianche non colorate sono dove sono presenti fluidi o spazi interstiziali, lipidi e grasso. Altre colorazioni utilizzate sono : - Osmio o Sudan black per grasso lipidi e mielina poiché i lipidi non incorporano coloranti acquosi - PAS acido periodico-reattivo di Schiff per sostanze ricche in zucchero - Tricromica o Hazan-Mallory per i tessuti connettivi che si colorano in blu - Argento edoro per fibre delicate e processi cellulari - May Grunwald-Giemsa per cellule del sangue, simile al sistema ematossilina/eosina. Alcuni materiali biologici sono in grado, se colpiti da opportune radiazioni, di emettere fluorescenza, si parla di FLUORESCENZA PRIMARIA o AUTOFLUORESCENZA. Questa capacità è generalmente legata alle cellule vegetali, per le cellule animali sono necessari dei coloranti detti FIUOROCROMI o FLUOROFORI, in questo caso si parla di FLUORESCENZA SECONDARIA o INDOTTA. Alcuni dei coloranti utilizzati possono essere di origine naturale o sintetica e possono emettere fluorescenze di colori differenti. I fluorocromi sono molecole che hanno la caratteristica di assorbire la luce ad una determinata lunghezza d'onda (eccitazione) e di emettere dei fotoni di lunghezza d'onda maggiore (emissione), possono essere utilizzati per individuare nei tessuti e nelle cellule la presenza di specifiche strutture macromolecolari. Il microscopio a fluorescenza è in grado di generare una radiazione luminosa monocromatica, quindi di selezionare determinate lunghezze d'onda, che andranno ad eccitare poi il preparato contenente un fluoroforo. 1. Lalampada a vapori di mercurio emette radiazioni ad elevata energia Il filtro di eccitazione lascia passare le radiazioni ad una ristretta lunghezza d'onda 3. Tali radiazioni penetrano nell’obiettivo, sono riflesse dallo specchio dicroico e eccitano il fluorocromo legato al campione 4. Le radiazioni emesse dal fluorocromo passano sia attraverso lo specchio dicroico, sia attraverso il filtro di sbarramento che blocca le radiazioni non assorbite Le cellule vegetali naturalmente fluorescenti, non hanno bisogno di essere trattate per essere visualizzate al MF, emettono fluorescenza rossa se illuminate con luce ultravioletta. Per la fluorescenza secondaria si utilizzano sonde fluorescenti costituite da un fluoroforo e da un'altra molecola in grado di andarsi a legare a determinate strutture presenti nella cellula: - Reagenticito- e isto-chimici fluorescenti (DAPI e IODURO DI PROPIDIO per gli acidi nucleici) - Proteine fluorescenti (GFP e RFP) coniugate a molecole affini alle differenti strutture cellulari - Anticorpi coniugati con fluorofori (immunofluorescenza) - Sonde dialtro tipo (sonde ad RNA o DNA usate nell’ibridazione in situ) La capacità di fluorescere dei fluorofori è legata alla presenza di sistemi di doppi legami coniugati, ciascun fluoroforo è caratterizzato da un picco di emissione (massima emissione) e da un picco di assorbimento (massima eccitazione). 1. Reagenticito-isto-chimici fluorescenti Il DAPI è un agente molto affine al DNA è in grado di penetrare all’interno del nucleo e andare a fissarsi in corrispondenza delle basi A/T, in questo modo emetterà una fluorescenza nell'azzurro evidenziando i nuclei, dove si vede maggiore intensità si osservano i cromosomi addensati. Lo ioduro di propi eccita con luce blu. io PI si lega agli acidi nucleici sia del DNA che dell'RNA, emette fluorescenza rossa e si 2. Proteine fluorescenti Possono essere naturali come GFP e DsRed (provenienti da meduse) o semisintetiche come EGFP, CFP, YFP. Nel preparato è possibile vedere anche una doppia colorazione di due elementi differenti, esistono sonde che possono legarsi a livello di determinati organelli, è possibile ad esempio colorare microtubuli e mitocondri o colorare contemporaneamente i nuclei e la membrana cellulare. È possibile costruire delle sonde ibride che hanno la caratteristica di essere poco tossiche per le cellule e danno la possibilità di studiare il comportamento delle molecole delle cellule per lunghi tempi, viene costituita da due parti, una che ha affinità per un determinato costituente e l’altra che invece emette fluorescenza. Gli altri coloranti utilizzano delle radiazioni a bassa lunghezza d'onda ed alta energia che a lungo andare risultano tossici per le cellule, inoltre, le radiazioni non sono compatibili per alcune tipologie di microscopi a super risoluzione, per questo motivo si utilizzano le sonde ibride. Un'altra tipologia di sonde sono gli indicatori fluorescenti che individuano la concentrazione di ioni, costituiti da un fluroforo e una molecola affine per uno ione. La GFP è una proteina isolata dalla medusa Aequorea victoria che si trova nei suoi organi bioluminescenti, in tali organi un'altra proteina, l'AEQUORINA può emettere luce blu quando è attivata dal calcio, la luce blu a sua volta colpisce la GFP che così emette luce fluorescente verde. Le cellule possono essere programmate a produrre proteine fluorescenti utilizzando dei plasmidi contenti l'informazione di GFP inducendone la produzione nella cellula, il plasmide non riesce però a penetrare in tutte le cellule, per far si di ottenere un pull di cellule che producano GFP, si utilizza un sistema di selezione con un determinato antibiotico, solamente le cellule che hanno incorporato il plasmide potranno sopravvivere all'effetto mortale dell’antibiotico (puromicina), questo perché nel plasmide si fa codificare anche proteine resistenti all’antibiotico. Lo stesso procedimento si può utilizzare anche per la RFP. plasmidi si introducono all’interno delle cellule attraverso diversi metodi: - Trasfezione mediante calcio-fosfato: il DNA penetra nel citolpasma per endocitosi e viene poi trasferito al nucleo - Elettroporazione: impulsi elettrici portano alla formazione di pori nella membrana plasmatica che permettono l'ingresso di DNA, si utilizza un elettroporatore - Trasfezione mediante liposomi: DNA e RNA incapsulati in liposomi entrano nella membrana in seguito a fusione delle membrane -. Microiniezione: bombardamento con particelle metalliche microscopiche rivestite di DNA in vitro - Trasduzione: impacchettamento del DNA all’interno di virus animali La GFP può anche essere fusa ad un'altra proteina, in modo che il plasmide porti a una produzione di una proteina coniugata al GFP, la proteina in questo caso è detta CHIMERICA. Recentemente sono state trovate varianti della GFP con fluorescenza gialla, rossa, azzurra ecc. Esistono diverse tecniche utilizzate per studiare la dinamica delle proteine all’interno delle cellule di in vivo imaging che si avvalgono della GFP: 1. Trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) > si utilizza per sapere se una determinata proteina x si lega o interagisce con una determinata proteina y. All'interno della cellula abbiamo una proteina x fusa con una proteina fluorescente blu e un ipotetica proteina y fusa con una proteina fluorescente verde, illuminiamo il preparato con una luce violetta che stimola la luce blu, se le proteine sono distanti fra di loro vedrò solamente una fluorescenza blu, stessa cosa vale per l'eccitazione blu che stimola la fluorescenza verde. Se invece ci troviamo in presenza di interazione fra proteine, eccitando la proteina x con la luce violetta, si otterrà una fluorescenza verde eccitata dalla luce blu emessa dalla proteina x, si vedrà quindi solo la fluorescenza verde. 2. Fotoattivazione > la proteina di fusione contiene la proteina fluorescente, eccitando il preparato, la proteina fluorescente emette fluorescenza e si potrà vedere dal punto di innesco di fotoattivazione come le proteine si muovono nell'arco del tempo. È utile al monitorare del traffico, del turnover e delle vie di degradazione delle proteine. 3. Recupero della fluorescenza dopo fotosbiancamento (FRAP) > una porzione del campione viene sottoposta ad un’intensa e prolungata eccitazione (bleaching) per vedere le modalità di recupero della fluorescenza, si brucia la proteina fluorescente che viene sbiancata. Una volta sbiancata si attenderà il recupero della fluorescenza, il ritorno sarà dovuto al fatto che altre proteine presenti nella cellula vanno a localizzarsi a livello del sito sbiancato. Per aumentare l'ingrandimento bisogna aumentare il limite di risoluzione sostituendo la luce con gli elettroni. La maggiore risoluzione del ME permette di visualizzare strutture non visibili con il MO. Nel MO si ha sorgente luminosa che nel ME viene sostituita da una sorgente di elettroni, le lenti ottiche vengono sostituite da lenti costituite da magneti che dirigono gli e emessi dalla sorgente, l'immagine viene poi impressionata su una lastra fotografica. Il fascio di e va ad attraversare il campione e viene proiettato su una lastra, gli e vengono accelerati da un anodo, funziona sottovuoto, passano attraverso un primo campo magnetico che funge da condensatore che forma così un raggio sottile che va poi a colpire il campione, una volta attraversato il campione vengono raccolti da un secondo campo magnetico che funge da obbiettivo, dopodiché nel terzo campo magnetico che funge da oculare per poi essere proiettato su uno schermo fluorescente o su una lastra fotografica che rileva delle zone chiare corrispondenti a parti del campione attraversate da e ( zone elettron-chiare) e zone scure corrispondenti a zone opache agli elettroni (zone elettron-dense). Il materiale analizzato deve essere disidratato quindi non si possono osservare cellule vive, bisogna inoltre utilizzare sezioni molto sottili (0,1 micron o inferiore), si può aumentare il contrasto del campione utilizzando metalli pesanti. ® PREPARAZIONE CAMPIONE 1. Prelievo del campione, deve essere fatto a freddo i utilizza gluteraldeide o paraformaldeide a cui segue post-fissazione con tetrossido di osmio, poi deidratazione con passaggi in etanolo a soluzione crescente. L'osmio si lega ai lipidi redendoli elettrondensi risulteranno quindi neri 3. Inclusione: il campione viene incluso in plastica (piccoli blocchi di resine epossidiche) 4. Sezioni: si utilizza l’ultramicrotomo, usa lame di vetro o diamante montate su una bacinella con acqua, le fette vengono poi raccolte con un retino di rame 5. Colorazione: si utilizzano metalli pesanti opachi agli e come piombo, uranio, platino, oro, argento, ecc. MICROSCOPIA CRIOELETTRONICA Processo di vitrificazione del campione biologico. Si parte con il prelievo della soluzione contenete il campione per essere depositato su una griglia metallica, dopodiché la retina viene immersa in un liquido criogenico (etano) mantenuto a temperatura di -196 °C, il contenitore galleggia nell’azoto liquido, il campione viene criofissato per fare in modo che l'acqua si solidifichi in forma amorfa impedendo la formazione di cristalli di ghiaccio che andrebbero a danneggiare il campione. Una volta che è il campione è criofissato, viene trasferito nel ME e l'acquisizione dell'immagine avviene a temperatura criogenica. Nella tomografia crioelettronica il computer fonde un gran numero di immagini digitali bidimensionali del campione che sono state prese quando il campione è posto ad angolazioni definite relativamente al percorso del fascio di elettroni. e CRIO-FRATTURA O freeze-facturing, si utilizza prevalentemente per lo studio delle componenti proteiche e lipidiche delle membrane cellulari. Il campione criofissato viene immerso sottovuoto e con una lama viene inciso, si crea una frattura lungo il doppio strato della membrana plasmatica, si apre e la superficie fratturata viene ombreggiata con atomi di platino e in seguito viene rinforzata da uno strato di carbone, questo permette di formare un calco della superficie fratturata che andrà poi osservato al ME. Tutto il materiale organico viene digerito con opportuni reagenti fino a che non rimane solo il calco. La crio-sublimazione permette di vedere dettagli che altrimenti non sarebbero visibili, si possono svuotare le vescicole che altrimenti non sarebbero visibili e poi effettuare il calco. ® COLORAZIONE NEGATIVA Applicata per lo studio dei virus e delle macromolecole. Il preparato viene adagiato su un retino e viene colorato con una soluzione concentrata di metallo pesante (es acetato di uranile) e poi essiccato. Il metallo precipita intorno alla struttura dandole un contorno scuro che appare negativo, questo permette di poter distinguere gli spazi vuoti o visualizzare macromolecole ad alta risoluzione. ® OBREGGIATURA AL PLATINO Il preparato viene colpito con vapori di platino nebulizzati ad un angolo molto basso (5-15°), nel frattempo il campione vien ruotato. | vapori si depositano da una parte del campione mentre l’altra parte rimane più chiara, si ha effetto di ombra che permette di distinguere meglio il preparato. Viene utilizzata per lo studio di macromolecole e SEM Microscopio elettronico a scansione, vengono registrati gli e secondari emessi a seguito del loro urto con il campione rimbalzando, vengono poi captati da opportuni detector e rilevati sullo schermo, sono rivestiti di sostanze meccaniche che favoriscono il rimbalzo. Si utilizza principalmente per lo studio topografico della superficie dei campioni. L'immagine finale riproduce a livello tridimensionale il campione. La preparazione del campione non comprende l'inclusione. ® MICROSCOPIO A FORZA ATOMICA AFM Consente di visualizzare la superficie del preparato e di fornire informazioni su proprietà meccaniche e elettromagnetiche della superficie sondata. Esegue delle scansioni della superficie utilizzando una punta di silicio posta all'estremità di un'asta, le forze che agiscono sulla punta mentre si muove lungo la superficie provocano una flessione della microleva che viene misurata utilizzando un laser che la illumina, le variazioni sono percepite da un rivelatore che registra gli spostamenti, ci permette di valutare la superficie trattata. Consentono di rilevare ad esempio dove si trovano e quante sono le zattere lipidiche che galleggiano a livello della membrana plasmatica ricche di colesterolo e sfingolipidi, oppure permette di analizzare determinate interazioni tra il DNA e determinate proteine, visualizza anche eventuali piegature che il DNA subisce quando reagisce con queste proteine. Un altro utilizzo importante è l’investigazione delle proprietà meccaniche locali del campione (rigidezza, elasticità...) attraverso analisi delle forze di interazione punta- campione. O P La parola immuno sta per immunoglobulina, gli anticorpi sono glicoproteine prodotte dal sistema immunitario come difesa contro le sostanze estranee, ciascun anticorpo è in grado di riconoscere e legare solo un determinato antigene o bersaglio, contengono domini variabili in grado di riconoscere antigeni specifici. L'antigene è una qualsiasi sostanza riconosciuta come NOT SELF, considerata pericolosa e che può modificare l’unicum biochimico di quell’organismo, queste molecole scatenano una risposta anticorpale (generazione di anticorpi), chimicamente sono macromolecole solubili in acqua. Una volta che l’antigene è legato dai vari anticorpi potrà essere riconosciuto da altre cellule del sistema immunitario che rivelando l'accumulo di anticorpi sono in grado di fagocitare l'organismo e di degradarlo. Gli anticorpi sono formati da 4 catene polipeptidiche (forma a Y), due catene ad alto peso molecolare e le altre due a minor peso molecolare legate fra di loro da legami covalenti, la sede di specificità si trova nella REGIONE VARIABILE, l’anticorpo si lega a specifici elementi strutturali dell’antigene dette EPITOPI, un antigene può contenere più epitopi, ogni anticorpo è specifico per un solo epitopo e un antigene può essre riconosciuto da anticorpi diversi. Gli anticorpi si distinguono in: - Policlonali che derivano da più cloni, miscela di anticorpi geneticamente diversi che riconoscerà un epitopo diverso, si legano a epitopi differenti di uno stesso antigene - Monoclonali che sono geneticamente uguali, si legano a un solo epitopo di quelli presenti nell’antigene L'immunoistochimica si basa sulla capacità degli anticorpi di legare determinati antigeni presenti in un preparato, gli anticorpi si ottengono immunizzando determinati animali, nel caso di anticorpi policlonali si immunizzano con iniezioni particolari di antigeni per i quali si vuole studiare la localizzazione, gli anticorpi monoclonali si ottengono immunizzando i topi. Nel caso degli anticorpi policlonali, viene iniettato l’antigene che si vuole localizzare, i linfociti lo riconosceranno e inizierà la risposta immunitaria, i linfociti B andranno a riconoscere epitopi differenti dell'antigene, si attiveranno provocando un aumento dei linfociti, i quali differenzieranno in plasmacellule che produrranno gli anticorpi specifici contro gli epitopi presenti sull’antigene. Gli anticorpi poi presenti nel sangue, vengono prelevati. Nel caso degli anticorpi monoclonali, l'antigene viene inoculato nel topo, i linfociti B si attivano e vengono prelevati direttamente dalla milza o dai linfonodi, vengono fusi con cellule tumorali dette cellule di MIELOMA che a contatto con i linfociti e in presenza di un determinato reagente (glicole polietilenico) danno origine a un IBRIDOMA. Gli ibridomi formati non sono tutti vitali, per selezionare solo quelli vitali e funzionali, si utilizzano terreni di coltura selettivi contenenti differenti molecole, solo l’ibridoma vitale sopravvivrà nei terreni. In questo modo gli ibridomi riusciranno a produrre degli anticorpi specifici per l’antigene. Gli anticorpi successivamente vanno resi riconoscibili attraverso diversi “marcatori” come fluorocromi (microscopio a fluorescenza), enzimi, luciferasi o particelle d'oro (immunogold). La marcatura viene posizionato a livello delle catene pesante in modo da non ostacolare l'interazione antigene-anticorpo, nella zona Fc. interesse. Il foglio viene messo in incubazione a contatto con un anticorpo coniugato a un enzima che permette una reazione luminescente in grado di riconoscere quella determinata proteina, se presente, l’anticorpo si andrà a legare dove si trova la proteina. La rivelazione avviene ponendo una lastra fotografica su un filtro, la luminescenza impressiona così la lastra, dopo lo sviluppo fotografico si potranno osservare eventuali bande nere che corrispondono alla presenza della proteina studiata. e NORTHERN BLOT Utilizzato per studiare l’espressione genica dell'RNA estratto dal campione. L’RNA viene estratto e fatto separare in base alle dimensioni tramite elettroforesi, viene trasferito su un’opportuna membrana di cellulosa e fatto reagire con specifiche sonde marcate, infine dove viene localizzata la sonda si ha l'impressione della lastra con una banda scura. Stessa cosa avviene per il SOUTHERN BLOT che viene usato per rilevare la presenza di specifiche sequenze di DNA presenti in miscele complesse, in questo caso si taglia con opportuni enzimi di restrizione, dopodiché viene fatto correre su un gel secondo il processo di elettroforesi, in seguito viene trasferito su fogli di nylon o nitrocellulosa e successivamente viene incubato con determinate sonde specifiche marcate con radioisotopi le quali vanno a impressionare la lastra dando come risultato una banda di colore nero. e -OMICS Il miglioramento delle tecniche di biologia molecolare ha portato allo sviluppo di scienze OMICHE che studiano pools di molecole biologiche (geni, trascritti, proteine, metaboliti) con svariate funzioni all’interno degli organismi viventi nel loro insieme. Sono gruppi omogenei di cellule di origine tissutale che sono in grado di crescere e moltiplicarsi in vitro per numerose generazioni, vengono mantenute in terreni detti DI COLTURA che possiedono all'interno componenti che servono alla cellula per sopravvivere, e devono essere mantenute all’interno di contenitori sterili. Vantaggi: - Sistemi semplificati e altamente riproducibili - Consentono l’analisi di meccanismi cellulari e molecolari - Controllo ambientale - Economicità e rapidità di risposta - Disponibilità - Sistemi semplificati rispetto a un organismo integrato - Condizioni di esposizione alle sostanze diverse da quelle in vivo - Difficoltà di correlare le concentrazioni in vitro con quelle in vivo - Le sostanze somministrate possono interagire con il terreno di coltura Le cellule vengono coltivate per: - Studiare metabolismo, proliferazione, differenziamento, migrazione, morte cellulare - Studio del meccanismo di azione dei fattori di crescita, citochine, ormoni , farmaci - Studidi citotossicità - Studidi processi intracellulari - Studidi genetica - Studio dei meccanismi molecolari/cellulari coinvolti nelle funzioni cellulari - Strumenti per la biologia molecolare - Produzione di tessuti per trapianti, ricerca - Strumenti per la terapia Esistono diversi tipi di colture cellulari: di tessuto, colture primarie, linee cellulari continue o a breve termine, linee ingegnerizzate o co-colture. ® TAPPE - Prelievo delle cellule da un campione - Dissezione meccanica - Trattamento con tripsina per eliminare i contatti fra cellule - Inibitore per bloccare la digestione enzimatica - Trasferimento in coltura + coltura primaria - Adattamento e proliferazione delle cellule aumentando di numero - Diluizione delle cellule per evitare morte cellulare in quanto si esaurisce il terreno di sostentamento (sottocultura o passaggio) - Dal secondo passaggio si origina una LINEA CELLULARE che può essere continua se prolifera in maniera infinita, o finita se resiste in coltura per un numero limitato di cicli cellulari La coltura primaria è caratterizzata da un tempo di duplicazione lento, che aumenta nei successivi passaggi in coltura. Nella terza fase si nota la senescenza, con tempi di duplicazione progressivamente più lunghi. Coltura primaria > coltura iniziata da un espianto di cellule, tessuti o organi. Si definisce primaria fino alla sua subcultura, a questo punto diventa linea cellulare primaria Subcultura + coltura utilizzata per dare inizio a una nuova coltura, sinonimo di passaggio Linea cellulare > coltura cellulare che emerge da un espianto primario dopo la prima sub coltura. Il processo della trasformazione rende immortale una linea cellulare, il processo ha inizio con l'acquisizione da parte della linea cellulare della capacità di proliferare indefinitamente, richiede un certo numero di mutazioni in geni diversi. Questo avviene in coltura dove si osservano al microscopio dei foci di trasformazione, ovvero gruppi di cellule che non risentono della inibizione da contatto. Una volta ottenute le linee cellulari queste devono essere trasferite in appositi contenitori sterili nei quali le cellule si trovano adese al contenitore o in sospensione. Le cellule adese crescono formando dei monostrati occupando tutta la superfice del contenitore, nel caso delle cellule tumorali potranno anche formare dei pluristrati. Le cellule in sospensione crescono sospese nel terreno di coltura senza aderire ad alcun supporto. e CO-COLTURE Prevede la coltivazione nello stesso recipiente di due o più tipi di cellule differenti presenti in un determinato tessuto, questo permette di studiare in vitro le interazioni che avvengono tra diversi tipi di cellule appartenenti a un determinato tessuto e quindi ci permette di acquisire conoscenze sulla complessità dei vari tessuti. Possono essere distinte in dirette se le cellule sono a stretto contatto fisico e indirette se le tipologie di cellule sono sparate da membrane semipermeabili. | progressi dell'ingegneria hanno portato alla progettazione di sistemi di coltura basati su supporti tridimensionali biomimetici che riproducono gli stimoli biofisici dei tessuti naturali, si utilizzano diversi tipi di scaffolds a seconda del tessuto che si vuole studiare come idrogel, gelatine o impalcature. e LINEE CELLULARI INGEGNERIZZATE Sono cellule che sono state manipolate a livello genetico in modo da provocare dei cambiamenti predeterminati nel loro genotipo, indirizzati per far si che la cellula possa iniziate a produrre determinate proteine, determinati ormoni o fattori di crescita. 1. Cellule esprimenti proteine di fusione fluorescenti > grazie all'introduzione di determinati plasmidi che inducono la sintesi di proteine fuse con un fluoroforo 2. Ibridomi + manipolate per la produzione di anticorpi monoclonali, sono dati dalla fusione di una cellula tumorale e una cellula linfocita B di topo in grado di produrre un anticorpo monoclonale specifico per un determinato epitopo. Le cellule di mieloma donano all'ibridoma l'immortalità che la cellula B altrimenti non avrebbe 3. Cart-T cells > linfociti T modificati in modo da esprimere sulla membrana uno specifico recettore chimerico, in grado di legare un determinato antigene presente sulle cellule tumorali. Il sangue viene prelevato dal paziente, vengono isolati i linfociti T, si introduce il plasmide che permette di modificare le cellule e di sintetizzare il recettore, vengono amplificati i linfociti e infine vengono reinfuse nel paziente. Oltre al plasmide viene anche introdotto un “gene suicida” attivabile in caso di effetti collaterali. ® COLTURA CELLULARE Affinché le cellule possano crescere in maniera opportuna, l’ambiente deve essere sterile e controllato ad una certa temperatura, umidità e una certa percentuale di gas. Le cappe a flusso laminare garantiscono principalmente la protezione del campione da contaminazioni ma non la protezione dell'operatore e dell'ambiente. Un altro importante strumento è l'incubatore, dove le cellule vengono mantenute a 37°, percentuale di co2 al 5% e pH intorno a 7.4. La centrifuga permette di recuperare le cellule eliminando il liquido surnatante, il microscopio rovesciato è un altro strumento importante per l'osservazione delle cellule. Il materiale per colture cellulari è generalmente in plastica monouso, sterile e inerte. Affinché le cellule possano vivere in laboratorio devono essere rispettati i fabbisogni chimico-fisici ottimali per riprodurre le condizioni naturali dell'organismo, esistono quindi dei terreni di coltura specifici. Esistono differenti tipi di terreno base per le differenti linee cellulari utilizzate, differiscono per il contenuto dei costituenti base quali: - Sali inorganici che mantengono l'equilibrio osmotico, aiutano a mantenere la carica a livello delle membrane, sono importanti per l'adesione cellulare, sono cofattori enzimatici e costituiscono un sistema tampone carbonato/bicarbonato che garantisce un pH fisiologico Il colesterolo influenza la permeabilità e la fluidità della membrana, si trova intercalato fra i vari fosfolipidi in entrambi i due strati in un rapporto 1:1, ogni molecola si orienta in modo tale che il gruppo polare -OH interagisca con la testa polare di un fosfolipide tramite legami H. Il doppio strato lipidico è asimmetrico per quanto riguarda la componente chimica, i glicolipidi ad esempio si trovano solo nel lato esterno extracellulare, nel monostrato esterno è inoltre presente maggiore concertazione di sfingomieline e fosfatidilcolina, mentre nello strato interno si hanno maggiori concentrazioni di fosfatidilserina, fosfatidilinositolo e fosfaditiletanolamina. Tutti i fosfolipidi sono a pH fisiologico ad eccezione della fosfatidilserina e del fosfatidilisinitolo che hanno carica negativa. La membrana è fluida e il suo grado di fluidità dipende dalla temperatura e dalla composizione lipidica, può quindi muoversi grazie al movimento dei fosfolipidi, i movimenti che avvengono all’interno dello stesso foglietto sono molto frequenti e non necessitano di enzimi, quelli che portano da un foglietto all’altro sono invece molto rari e lenti e si chiamano FLIP-FLOP e richiedono l'intervento di enzimi e energia. Esistono diverse tipologie di enzimi che catalizzano questo movimento: - Flippasi > ha bisogno di energia. Trasferisce in maniera selettiva dal foglietto esterno a quello citosolico fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina - Floppasi > ha bisogno di energia. Trasferisce fosfolipidi dal lato citosolico a quello esterno, in particolare fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina - Scramblasi > necessita di ioni Ca, muove in ambe due le direzioni diversi tipi di fosfolipidi in maniera casuale - Flippasi a livello del RE> azione simile a scramblasi bilanciano l'accrescimento asimmetrico dei lipidi dimembrana | fosfolipidi vengono sintetizzati nelle membrane del reticolo solo nella faccia citoplasmatica, si ha quindi crescita asimmetrica nella faccia citoplasmatica rispetto alla faccia del lume, la flippasi riequilibra così i foglietti in modo che si abbia crescita simmetrica. La membrana plasmatica presenta una conformazione detta a mosaico a fluido, il doppio strato lipidico contiene una serie di proteine che possono spostarsi e posizionarsi in maniera variabile. Frey e Edidin nel 1970 hanno dimostrato che le proteine risultano distribuite in maniera casuale e che si muovono lungo la membrana. Normalmente i lipidi di membrana esistono in uno stato “cristallino liquido”, esistono dei fattori che possono influenzarne la fluidità come la temperatura, la lunghezza delle catene aciliche, l'insaturazione degli acidi grassi (maggiore insaturazione, maggiore fluidità), la presenza di colesterolo che contrasta un'eccessiva fluidità ad alte T e un'eccessiva rigidità a basse T e la presenza di proteine che diminuiscono la fluidità. ® PROTEINE DI MEMBRANA Le proteine di membrana costituiscono il 50% della massa della membrana e svolgono gran parte delle sue attività: -. Ancoraggio cellulare > alcune proteine come per esempio le integrine, ancora la cellula alla matrice extracellulare ed inoltre si connettono ai microfilamenti - Trasporto passivo > certe proteine formano canali che permettono il passaggio selettivo di ioni o molecole -. Trasporto attivo > alcune proteine di trasporto pompano i soluti attraverso la membrana, processo che richiede apporto di energia - Attività enzimatica > molti enzimi legati alla membrana catalizzano reazioni che avvengono all’interno o sulla superficie della membrana - Trasduzione del segnale > alcuni recettori legano molecole segnale e trasmettono l'informazione all'interno - Riconoscimento cellulare > proteine recettoriali che funzionano come segnali - Giunzione cellulare + le proteine di adesione legano le membrane di cellule adiacenti Gli esperimenti di criofrattura con il ME hanno sostenuto la teoria del mosaico a fluido, cioè che le proteine sono in gran parte inserite all'interno del doppio strato lipidico. Le proteine si dividono in: - Integrali > che attraversano il doppio stato lipidico - Periferiche > possono essere libere nel citosol oppure possono associarsi attraverso legami H sia alle proteine integrali, sia alle teste polari dei lipidi dimembrana - Anfitropiche > si trovano sia nel citosol che associate alla membrana a seconda del tipo di regolazione a cui sono sottoposte Le proteine integrali si dividono a loro volta in: - Tipile Il > formate da una sola elica transmembrana con orientazione opposta - Tipi IIl > formata da numerose eliche transmembrana - Tipo IV > presentano diversi domini transmembrana appartenenti a diverse catene polipeptidiche - Tipo V + presenta un’ancora lipidica - Tipo VI > presenta eliche transmembrana e ancore lipidiche È possibile tramite GRAFICI DI IDROPATIA determinare il numero di domini idrofobici presenti in una determinata proteina integrale, questi grafici sono sviluppati da determinati software che valutano la presenza di domini sulla base dell'energia necessaria a trasferire un aa da un ambiente idrofobico a un ambiente acquoso idrofilico. Alcuni barili beta possono formare grossi canali transmembrana. Le ancora lipidiche sono costituite da acidi grassi a lunga catena, isoprenoidi e derivati glicosilati del fosfotidilinositolo (GPI). Le proteine integrali possono essere estratte ricorrendo all'uso di detergenti quali SDS (ionico, solubilizza e denatura le proteine) o TRITON X-100 (non ionico, solubilizza senza modificare la struttura). La solubilizzazione avviene grazie alla rottura del doppio strato lipidico, le molecole di detergente vanno poi a circondare le componenti idrofobiche delle proteine rendendole solubili. Nella membrana esistono delle aree specifiche dette ZATTERE LIPIDICHE particolarmente ricche di sfingolipidi e colesterolo, concentrano e organizzano specifiche proteine creando dei domini che consentono alle proteine di svolgere in maniere efficiente le funzioni specifiche della membrana. È costituita da acidi grassi saturi a lunga catena. Ne esistono di due tipi: - Caveole + invaginazioni della membrana plasmatica a forma di omega rovesciata dovuta alla presenza di proteine chiamate caveoline che unendosi generano questa impalcatura - Zattere lipidiche planari > non presentano caveolina ma sono ricche di flotillina, si trovano principalmente nei neuroni Entrambe assicurano l'efficienza della trasduzione del segnale. Il movimento delle proteine nel doppio strato non è completamente libero, esistono diverse modalità per limitare la mobilità laterale delle proteine della membrana plasmatica: - Ancoraggio al cortex cellulare - Ancoraggio a molecole della matrice extracellulare - Ancoraggio alle proteine della superficie di un’altra cellula - Confinamento ad un particolare dominio di membrane da barriere di diffusione Il citoscheletro mantiene e rafforza la struttura delle cellule ma limita anche la diffusione delle proteine di membrana formando delle reti o recinti attraverso i quali possono muoversi le proteine. | filamenti del citoscheletro rappresentano barriere di diffusione che dividono la membrana in piccoli domini o recinti. Le proteine possono anche deformare il doppio strato lipidico, la deformazione è importante per molti processi, consente la gemmazione di vescicole, la divisione cellulare e il movimento. w 8 © © B). Alcune proeine inseriscono domini proteici idrofobici o àncore lipidiche in uno dei due foglietti di un doppio strato lipidico. L'aumento dell'area di uno solo dei foglietti causa la curvatura della membrana. C) Alcune proteine che piegano le membrane formano impalcature rigide che deformano la membrana o stabilizzano membrane già curvate . D) Alcune proteine che piegano la membrana causano il raggruppamento di particolari lipidi di membrana con un grande gruppo di testa (es fosfoinositoli), inducendo in questo modo una curvatura positiva. Invece, le fosfolipasi che rimuovono i gruppi di testa dei lipidi producono molecole lipidiche con forma invertita che inducono una curvatura negativa. Proteine e lipidi possono subire delle modificazioni quali glicosilazione, le glicoproteine possono essere attaccati a oligosaccaridi, possono attaccarsi una o più catene di polisaccaridi costruendo proteoglicani. e CARBOIDRATI Si trovano esclusivamente nella parte esterna della membrana, hanno un ruolo importante nel riconoscimento cellula-cellule e nell’adesione cellulare grazie alla presenza di determinati recettori, lo 1. Diffusione semplice attraverso lo spessore della membrana 2. Diffusione attraverso canali acquosi 3. Trasporto facilitato che avviene grazie a proteine Diffusione semplice Le molecole attraversano la membrana semplicemente diffondendosi tra le molecole costitutive della membrana stessa, le molecole che utilizzano questo trasporto sono: - Alcunigas - Molecole liposolubili (vitamine, ormoni steroidei) - Piccole molecole idrosolubili prive di carica o, Aminoacidi carichi, ca, Ho H*, Na* Aminoacidi polari N, Giicerolo H06z,.K* senza carica Benzene Etanolo Ca?*, CI Glucosio Urea Nucleotidi Gas _ qc e piccole Piccole molecole molecole idrofobiche non cariche AIMAN AITINA RARO SIVUUEUS COUS UL VUVU IU VU VUIEIUUVUIGU GUI VUDS CO GUGICoGUGIvovoo Il doppio strato fosfolipidico è permeabile solo alle molecole apolari idrofobe e alle piccole matecole-poltari. La diffusione si verifica quando tra due regioni di una soluzione esiste una differenza di concentrazione e sfrutta un processo fisico che è quello dato dal moto casuale termico delle molecole di soluto MOTO BROWNIANO che diffonde le molecole fino ad ottenere una situazione di equilibrio. La legge di Fick descrive la velocità con cui si muove una molecola permeabile attraverso la membrana da un punto 1 a un punto 2, è un processo spontaneo e non avviene in una sola direzione. La velocità di diffusione attraverso la membrana dipende da: - Solubilità nei lipidi - Dimensione molecolare - Spessore membrana (S) - Gradiente di concentrazione - Area della membrana (A) - Composizione strato lipidico Di cosi] di SiFusiow cv (04-24 AZ]NIThtTT Veticità. di difffpiona UV - TT, Trasporto facilitato Non è richiesta energia metabolica, è mediato o da proteine canale o da proteine carriere, i soluti si muovono sempre lungo il gradiente di potenziale elettrochimico, o secondo gradiente elettrochimico se si parla di ioni. Il gradiente elettrochimico è costituito dalla concentrazione di uno ione e dipende dalla carica che lo ione ha, combina il potenziale dimembrana. Le proteine canale formano un canale attraverso cui passano le molecole d’acqua o di uno specifico soluto, il flusso è molto più veloce e sono in grado di mettere in comunicazione direttamente i due ambienti separati. | canali ionici sono altamente selettivi e presentano fenomeno di GATING, meccanismo che governa le transizioni che controllano l'apertura e la chiusura del canale. Alla base del gating sta il fatto che nelle molecole del canale è presente un condotto percorribile dallo ione che presenta una regione critica contenente un filtro di selettività che consente il transito solo degli ioni di una determinata specie, si pensa che lo ione debba perdere il suo mantello di solvatazione (guscio d'acqua) per attraversare il filtro di selettività. Le molecole di acqua del mantello si orientano lungo il campo elettrico generato dallo ione, minore è il raggio dello ione maggiore sarà il numero di molecole di acqua che si addenseranno attorno allo ione. Il gate è costituito da un propaggine molecolare del canale capace di muoversi sul suo punto di attacco al resto della proteina, in modo da occludere o lasciare aperto il lume del canale, esistono 5 categorie di meccanismi di gating: - Canali controllati dal voltaggio > il gate varia in seguito a variazioni della differenza di potenziale elettrico a cavallo della membrana - Controllati dal ligando > i ligandi si legano a uno specifico recettore del canale che può trovarsi sul lato extracellulare o intracellulare, in seguito a questo legame la struttura del canale subisce delle modificazioni conformazionali che determinano il movimento del gate. - Controllati dalla sollecitazione meccanica 3 0 meccano-sensibili, sono connessi nella parte interna a livello del citosol con il citoscheletro che lo apre quando sopraggiunge una deformazione della superficie cellulare - Controllati dalla T > sono coinvolti nella percezione del caldo o del freddo e dei processi termoregolatori - Controllati della luce -. Canali ionici senza porta > (non-gated channels) si trovano sempre nello stato aperto e conferiscono alla membrana una conduttività di base, il flusso viene chiamato LEAKAGE che comporta una perdita di ioni presenti a cavallo della membrana La membrana contiene delle proteine che formano canali per l'acqua dette ACQUAPORINE che aumentano la permeabilità all' acqua della membrana stessa, sono associate a formare dei tetrameri, ciascuna proteina costituisce un canale idrico. Ogni molecola consta di 6 alfa- eliche trans membrana collegate da anse intra ed extra cellulari. La presenza di acquaporine aumenta la permeabilità osmotica delle cellule permettendo un veloce riequilibrio. Trasporto mediato da carrier Le proteine carrier assumono due conformazioni, trasportando il soluto all'interno della membrana nel momento in cui cambia forma. La proteina può trasportare il soluto in entrambe le direzioni. Consente il trasporto attraverso di membrane delle molecole organiche più importanti che altrimenti non sarebbero in grado di attraversarla (glucosio e aa). Un esempio sono i trasportatori del glucosio detti GLUT. Le proteine carrier devono essere specifiche per particolari gruppi di sostanze, una caratteristica cinetica importante è la saturazione, l'intensità del flusso è legato alla concentrazione delle proteine carrier presenti, non aumenta quindi in modo proporzionale al gradiente di concentrazione, tende asintoticamente a un limite massimo stabilito dal numero di trasportatori presenti. Si parla anche di competizione, quando due sostanze simili utilizzano lo stesso carrier, l'una tende a inibire il trasporto dell'altra. | trasporti presentano una cinetica di tipo Michaelis-Menten, l'entità di trasporto dipende dal numero di trasportatori e dalla velocità con cui ogni trasportatore effettua il proprio ciclo. e TRASPORTI ATTIVI Richiedono energia metabolica, quindi consumo di ATP, i soluti vengono trasportati contro gradiente di potenziale elettrochimico, si divide in: 1. Trasporto attivo primario 2. Trasporto attivo secondario Trasporto attivo primario E' mediato da pompe ioniche che trasferiscono ioni contro gradiente e permettono di mantenere la diversa composizione ionica dei liquidi intra ed extra-cellulari, le pompe operano come enzimi ATP-asici la cui differenze di concentrazioni costituiscono una sorta di forza elettromotrice che viene utilizzata dalle cellule per il trasferimento di segnali elettrici o per produrre ATP. L'idrolisi di ATP è accoppiata a cambiamenti conformazionali della molecola tali da consentire il trasporto contro gradiente. Esistono tre classi di trasportatori primari che hanno strutture differenti: - Pompedi classe P costituite da due subinità alfa e beta, passano in uno stato fosforilato durante il ciclo di trasporto - Pompe delle classi F e V che non hanno intermedi fosforilati, sono costituite da numerose subunità che hanno determinate funzioni. Si trovano prevalentemente a livello dei mitocondri o dei lisosomi - Proteine ABC che sono dotati di 4 domini, 2 transmembrana T e 2 citosolici A che legano l’ATP 1. P-ATPasi Il nome deriva dalla presenza di un sito di fosforilazione, è costituta da proteine integrali di membrana formate da due subunità alfa e beta. Durante il loro ciclo di attività passano attraverso due stati conformazionali: - E1,i siti di legame sono esposti al lato citoplasmatico e hanno elevata affinità per i substrati da trasportare dall'altro lato della membrana - E2, gli stessi siti sono esposti dall'altro lato della membrana e hanno bassa affinità per i substrati che sono già stati legati al lato intracellulare e alta affinità per i substrati che dal lato extracellulare dovranno essere importati in cellula Il potenziale d'azione consiste in una repentina e transitoria variazione del potenziale di membrana che si generano nelle cellule eccitabili in risposta a potenziali graduati che raggiungono il valore soglia. Durante il potenziale d'azione si verifica un’ampia e rapida depolarizzazione durante la quale si registra per un breve periodo un'inversione della polarità del potenziale di membrana, dal neurone prende origine dal tratto iniziale dell'assone detto monticolo assonico e corre lungo l’assone fino al terminale assonico senza attenuazione della sua intensità. Il potenziale d'azione consta di tre fasi distinte: 1. Depolarizzazione rapida + il potenziale di membrana passa dal valore soglia di -55 mmV a +30mV, si verifica un rapido e brusco aumento della conduttanza della membrana al Na+, al picco della fase ascendente la membrana ha cambiato polarità: il versante intracellulare e più positivo di quello extracellulare 2. Ripolarizzazione > questa fase è legata ad un aumento della permeabilità al K+, quando i canali per il K si aprono, il potenziale di membrana ha raggiunto il valore di 30mvV, il K è spinto ad uscire dalla cellula, ciò riporta il potenziale al suo valore di riposo. 3. Iperpolarizzazione postuma > la conduttanza al K rimane elevata per un breve periodo prima dopo che il potenziale ha raggiunto i livelli di riposo, in tale periodo il potenziale è più negativo che in condizioni di riposo . Quando canali del K si chiudono si ripristina un anormale permeabilità e il potenziale ritorna al valore di riposo. L'ampiezza del potenziale d'azione è indipendente dalla grandezza dello stimolo, viene sempre evocato con ampiezza e forma costante anche con stimoli molto grandi. Se una membrana è depolarizzata fino al valore soglia, parte il potenziale d'azione che ha sempre la stessa ampiezza. La propagazione dell'impulso può anche essere saltatoria negli assoni mielinizzati, circondati da cellule di Schwann che fanno da isolante, la propagazione negli assoni avviene in un'unica direzione a causa del secondo gate di inattivazione del canale Na+. Il canale si apre quando la membrana è depolarizzata fino al valore soglia, i gates di attivazione si aprono e il canale diventa permeabile allo ione, entra Na+ che determina la salita del potenziale d'azione, con l'incremento della depolarizzazione, il gate di inattivazione si chiude nonostante i gates di attivazione siano aperti, l'ingresso di Na si arresta. Durante la ripolarizzazione causata dall'uscita di K+, il gate di inattivazione si apre e i gates di attivazione si chiudono, il canale torna nella conformazione normale. Durante la fase di depolarizzazione la cellula non può essere riattivata per la presenza di un periodo refrattario in cui la cellula non può rispondere ad altri segnali, la sua funzione è quella di impedire il riverbero dei segnali che devono essere propagati in un'unica direzione e limitare la frequenza di scarica di un neurone. e LE SINAPSI ELETTRICHE Le sinapsi sono una struttura specializzata per la comunicazione tra cellule eccitabili e consentono i, trasferimento di segnali elettrici. Nelle sinapsi elettriche il segnale elettrico passa direttamente dalla cellula presinaptica alla cellula postsinaptica. Le membrane cellulare delle cellule adiacenti sono connesse mediante giunzioni chiamate GAP JUNCTIONS che formano un ponte citoplasmatico, le giunzioni sono formate da 2 subunità contigue chiamate CONNESSONI i quali a loro volta sono costituiti da 6 proteine specifiche dette CONNESSINE disposte a cerchio e che delimitano il poro del canale. L'apertura del connessone richiede un cambio conformazionale di tutte e 6 le connessine ed è modulata dal pH intracellulare, dagli ioni ca2+, da secondi messaggeri e dai neurotrasmettitori. Il connessone si chiude in presenza di stimoli che possono determinare un danno cellulare come un diminuzione del pH e variazioni anomale del potenziale di membrana. La chiusura preserva l'integrità del tessuto delle cellule che si trovano in prossimità di cellule danneggiate. Le sinapsi elettriche possono essere bidirezionali e in alcuni casi monodirezionali (rettificate). Si trovano localizzate nel snc, nel tessuto muscolare liscio e cardiaco e nei tessuti neuroendocrini. ®. SINAPSI CHIMICHE Sono formate da 3 elementi: 1. Il terminale presinaptico 2. Spazio sinaptico 3. Membrana post-sinaptica Il neurone presinaptico rilascia un neurotrasmettitore il quale diffonde nello spazio sinaptico e va a legarsi a specifici recettori presenti sulla membrana postsinaptica, il legame dei recettori modifica la permeabilità agli ioni della membrana postsinaptica, questa modificazione determina un cambiamento del potenziale di membrana. | contatti postsinaptici possono avvenire in parti differenti della cellula: 1. Sinapsi asso-dendritiche tra assone e dendriti 2. Sinapsi asso-somatiche tra assone e soma 3. Sinapsi asso-assoniche rea assone e assone La trasmissione sinaptica chimica può essere mediata da due tipi di recettori post sinaptici: 1. RECETTORI IONOTROPICI > responsabili di risposte rapide RECETTORI METABOTROPICI > accoppiati a proteine G, che modulano l’attività del canale o direttamente o indirettamente attraverso un secondo messaggero. Sono responsabili di risposte lente. Le modalità con cui si diversi postsinaptici vengono integrati tra loro a determinare l’attività elettrica del neurone postsinaptico e regolata da due processi: 1. SOMMAZIONE SPAZIALE > e la somma dell'effetto di input sinaptici multipli in punti diversi del soma e dei dendriti della cellula. Due stimoli eccitatori sotto-soglia possono, se sommati, dare una depolarizzazione che arriva a soglia. 2. SOMMAZIONE TEMPORALE>e la risultante della sommazione di depolarizzazioni successive dovute all’attività ripetitiva, in questo modo i PPS si sovrappongono. e CELLULE ECCITABILI Cellule del muscolo scheletrico e cardiaco, il potenziale di membrana prende il nome di potenziale di riposo. Le sinapsi tra cellule nervose e cellule muscolari scheletriche sono dette anche sinapsi neuromuscolari o PLACCA MOTRICE. Le cellule muscolari sono eccitabili Neurone motore Assone Cellula presinaptica (motoneurone) Fibra muscolare ‘Il potenziale d'azione arriva alterminale assonico. 7. L'acetilcolina viene scissa nelle parti costituenti, che vengono riassorbite dalla cellula presinaptica. In questo modo È l'acetilcolina e le vescicole sono riciclate. Terminale assonico * do Molecole 2..Si aprono canali del di acetilcolina Na, la depolarizzazione in une vescicole. provoca l'apertura dei Potenziale d'azione 6. Il propagarsi dela anal del Ca voltaggio- depolarizzazione attiva cipendenti. un potenziale d'azione nella membrana postsinaptica. Fessura sinapti 3.1l Ca? entra nella cellula e 5. | recettori attivati attiva la fusione delle vescicole aprono i caneli cationici contenenti aceilcolina con la (cioè di Nav, K'e È SI Recettore v membrana presinaptica. Feto Ca] e depolarizzano n la membrana postsinaptica. 4. Le molecole di acetilcolina diffondono attraverso la fessura sinaptica e si legano ai recettori posti sulla membrana pestsinaptica. Cellula postsinaptic: (cellula muscolare) 10. Compartimenti intracellulari e smistamento proteine Tutti gli organelli sono avvolti da sistemi di membrane e ognuno ha la propria funzione e struttura. L'origine degli organelli è di tipo endosimbiontica, le membrane nucleari e il RE potrebbero essere derivati da invaginazioni della membrana plasmatica avvenuta durante l'evoluzione delle cellule eucariotiche. | mitocondri deriverebbero dalla simbiosi tra batteri dotati di sistemi enzimatici con cellule eucariotiche primitive, in seguito i batteri avrebbero trasferito la gran parte dei loro geni al genoma dell’eucariote. Gli organelli si studiano dal punto di vista funzionale con l'utilizzo della ME e l'incorporazione di isotopi radioattivi oppure usando proteine coniugate a dei fluorofori, per le caratteristiche biochimiche e molecolari vanno invece isolati tramite rottura della cellula per separare i singoli organelli a seguito di centrifugazioni per poi studiarli. Le cellule vanno inizialmente rotte per disintegrare la membrana plasmatica, ciò può avvenire con vari metodi (ultrasuoni, potter, siringhe o detergenti), gli organelli vanno poi separati grazie all’ausilio di centrifughe di diverso tipo, a seconda del tempo e la velocità di centrifuga si ottengono i diversi organelli. Il coefficiente di sedimentazione di un organello indica quanto rapidamente un certo organello sedimenta quando è sottoposta a forza centrifuga, dipende dalla sua dimensione e varia da La faccia cis è la faccia di ingresso rivolta verso il RER, riceve le vescicole di trasferimento provenienti dal RER, dopodiché subiscono modificazioni. Esiste una regione mediale che si trova tra la zona cis e la zona trans, nella quale continuano la modificazione delle proteine, si hanno ulteriori aggiunte di determinati glucidi che portano alla corretta maturazione della proteina. Nella zona finale trans, si ha impacchettamento e condensazione delle proteine all’interno di vescicole, che gemmano e direzionano il loro contenuto o verso la membrana plasmatica o ad altri siti cellulari. All’interno del Golgi: 1. Si hanno ulteriori modificazioni delle proteine che provengono dal REL (glicosilazioni, solfatazioni, fosforilazioni) 2. Sintesi di glicolipidi e altri lipidi complessi (sfingomielina) 3. Sintesi e assemblaggio dei proteoglicani, proteine ricche di zuccheri importanti nella matrice extra- cellulare Le glicosilazioni avvengono in maniera sequenziale man mano che la proteina passa da una zona all'altra dell'apparato e possono essere di 3 tipi: 1. Glicosilazioni complesse che avvengono a carico di proteine secrete o di membrana 2. alto contenuto di mannosio nel caso di proteine destinate ai lisosomi 3. ibride e contenere entrambe le modificazioni Una delle funzioni principali è la FOSFORILAZIONE di un mannosio legato alle proteine legate ai lisosomi che avviene nella zona cis del Golgi, questa modificazione costituisce un segnale per il corretto indirizzamento degli enzimi che dovranno essere trasportati a livello del lisosoma. Il trasporto delle proteine maturanti avviene attraverso due modelli, entrambi i modelli probabilmente coesistono e si completano anche nella stessa cellula: 1. modello di maturazione delle cisterne > ciascuna cisterna matura migrando verso l’esterno della pila 2. modello del trasporto vescicolare > le cisterne sono statiche e le proteine vengono fatte avanzare attraverso vescicole che si dipartono lateralmente dalle cisterne Il trasporto di grosse strutture proteiche avviene attraverso il modello di maturazione delle cisterne mentre per proteine di piccole dimensioni è preferibile il modello di trasporto vescicolare. Esiste inoltre un trasporto RETROGRADO che permette di ricondurre al RER proteine solubili o transembrana residenti nel RER, queste proteine posseggono appositi segnali “di recupero”. La regolazione del trasporto delle vescicole al proprio sito avviene grazie a proteine che si legano alle vescicole, per l'andamento anterogrado presentano un rivestimento di tipo COP II, per il trasporto retrogrado invece le vescicole sono ricoperte da rivestimento COP I, le vescicole vengono inoltre trasportate grazie al sistema di microtubuli che agganciano le vescicole e le trasportano in un senso o nell'altro. Queste proteine motrici partono dal centro organizzatore dei microtubuli e si spostano verso l'esterno della cellula, posseggono un'estremità negativa e dove arrivano posseggono un'estremità positiva. Lungo i binari abbiamo proteine che vanno dal polo positivo al polo - e vengono dette DINEINE, le CHINESINE invece si muovono in senso opposto. e LISOSOMI Costruiscono il sistema digestivo della cellula, sono in grado di degradare materiale importato per endocitosi e anche componenti intracellulari danneggiati o vecchi. Sono delimitati da una membrana lipidica e contengono diversi enzimi idrolitici (circa 40): Nucleasi Proteasi Polisaccaridasi Oligosaccaridasi Lipasi Fosfatasi SRIAWNE Questi enzimi sono attivi solamente ad un pH acido, il mantenimento del pH è permesso dalle ATPasi che pompano all’interno del lisosoma protoni che permettono al pH di scendere e quindi di favorire l'attivazione degli enzimi. È sempre presente la fofatasi acida che è considerato un enzima marcatore dei lisosomi, mentre gli altri enzimi si presentano a seconda del tipo di cellula. ENDOCITOSI MEDIATA DA RECETTORE da è PINOCITOSI v, FAGOCITOSI Le sostanze raggiungono i lisosomi attraverso 4 vie: 1. Pinocitosi generalizzata PAS A ) srci . ; batterio 2. Endocitosi mediata da recettori e legame attraverso ligandi & Sy a 3. Fagocitosi Le dv 4. Autofagia \auroFaGIA ‘endosoma recoce PR 79 ®) ; © 2} diet: n REI dI I lisosomi si distinguono in: 94 1. Lisosomi primari > gemmano dal trans Golgi i . . . . > membrana endosoma 2. Lisosomi secondari > si fondono con un endosoma o di isolamento tardivo con un fagosoma 24 4 Genesi dei lisosomi licozona: autofagosoma — Vengono sintetizzati nel RER in cui avviene la glicosilazione a livello delle asparagine, all'interno del Golgi i residui di mannosio vengono fosforilati, le proteine sono così marcate e riconosciute dal recettore, le vescicole si staccano dalla faccia trans e costituiscono i lisosomi primari. Quando i lisosomi primari si fondono ai lisosomi tardivi diventano lisosomi secondari. In questo caso le vescicole presento rivestimento di CLATRINA. Esistono dei lisosomi SECRETORI che portano alla secrezione del loro contenuto all’esterno della cellula mediante un processo chiamato ESOCITOSI LISOSOMIALE, si trovano in determinate cellule del sangue come ad esempio i ganulociti, linfociti T o piastrine. | lisosomi secretori presenti nei linfociti NK contengono determinate proteine quali PERFORINE e GRANZIMI, le cellule presentano dei recettori che riconoscono la cellula bersaglio, in seguito rilasciano all'esterno queste proteine, le perforine si inseriscono e creano dei canali all'interno della cellula bersaglio per far penetrare i granzimi che innescano un processo di morte cellulare. Anche i lisosomi si muovono attraverso le corsie di microtubuli e le proteine motrici. ®* PEROSSISOMI o microcorpi Consumano ossigeno producendo il perossido di ossigeno che viene poi degradato in reazioni di detossificazione, si trovano in tutte le cellule eucariotiche e contengono enzimi ossidativi come la catalasi. Le reazioni ossidative trasfromano il perossido in acqua. Demoliscono gli acidi grassi attraverso la beta- ossidazione, ovvero accorciamento delle catene alchiliche degli ac grassi portando quindi a formazione di acetil-coA. Sono importanti inoltre per la detossificazione di molecole ingerite. Si formano a livello del RER grazie alla presenza di proteina Pex3p, le altre proteine vengono aggiunte nel citoplasma fino ad arrivare a maturazione originando il perossisoma stesso, nel processo di maturazione vengono inserite numerose proteine. L'assemblaggio del perossisoma avviene in due fasi: 1. Accrescimento 2. Scissione e MITOCONDRI Sono presenti in tutte le cellule eucariotiche ad eccezione dei globuli rossi, forniscono energia alla cellula producendo ATP mediante fosforilazione ossidativa. Il numero di mitocondri e di creste mitocondriali è proporzionale all'attività metabolica della cellula, contengono un DNA mitocondriale e sono sede di trascrizione di RNA e traduzione di proteine. Morfologia e dimensioni sono variabili a seconda del momento in cui si trova la cellula, possono disporsi in diverse posizioni della cellula, ad esempio le cellule dei tubuli renali sono orientate parallele lungo i tubuli, nell'intestino tenue sono distribuiti sia nella parte basale che nella parte apicale. Secondo l'ipotesi endosimbiontica, i mitocondri deriverebbero dalla simbiosi di batteri dotati di sistemi enzimatici del metabolismo ossidativo con cellule eucariotiche primitive. In seguito, i batteri avrebbero trasferito la maggior parte dei loro geni al genoma dell’eucariote. La morfologia delle invaginazioni della membrana interna dei mitocondri è variabile tra i tipi di cellule, e vengono classificati in: 5. Mitocondri classici con invaginazioni simili a creste 6. Mitocondri tubulari tipici delle cellule steroidogenetiche con invaginazioni simili a tubi I mitocondri sono rivestiti da doppia membrana, una membrana esterna e una membrana interna, lo spazio tra esse rappresenta la MATRCE MITOCONDRIALE. Il DNA mitocondriale codifica per determinate proteine importanti per la fosforilazione ossidativa, viene ereditato per via materna e non viene modificato nel passaggio alla cellula figlia, tuttavia la maggior parte delle proteine mitocondriali sono codificate dal DNA nucleare e vengono poi trasportate all’interno del mitocondrio a livello della matrice o nello spazio intermembrana attraverso dei traslocatori. Dopo una breve fase di accrescimento, i mitocondri si dividono in mitocondri più piccoli e presentano una vita media di circa 5-10 giorni, i mitocondri non funzionanti o obsoleti sono eliminati dalla cellula per autofagocitosi dal lisosoma. La principale funzione è lo svolgimento di metabolismo energetico, trasformano l'energia chimica dei metaboliti in energia facilmente utilizzabile sottoforma di ATP, sono inoltre la sede della p ossidazione degli acidi grassi. Altre funzioni importanti sono quelle nel metabolismo dei lipidi, partecipano alla sintesi degli ormoni stereoidei e sono responsabili dell'accumulo di ioni calcio, infine svolgono un ruolo nel controllo della morte cellulare per apoptosi. Ogni vescicola deve essere altamente selettiva e deve gemmare solo da parti appropriate del comparto di origine e fondersi solo con la membrana bersaglio appropriata. 7. Le modifiche post-traduzionali delle proteine Le modificazioni possono essere reversibili o irreversibili, e possono essere di diverso tipo: Glicosilazione Idrossilazione Lipidazione Ubiquitinazione Sumoilazione Fosforilazione e defosforilazione Acetilazione Metilazione QONSNIASWSNE Es. L'insulina viene sintetizzata nel pancreas, fa parte della importazione co-traduzionale, viene prima sintetizzata la sequenza segnale che avvicina la proteina al RER, da qui ricomincerà la sintesi della proteina. Qui subisce il taglio della sequenza segnale. Dopo questa modificazione, la proteina passa attraverso il Golgi dove subirà un taglio proteolitico che darà origine alla proteina matura e funzionante. La solfatazione è importante perché rafforza le interazioni proteina-proteina importanti in determinati processi biologici come ad esempio nel caso delle molecole di adesione, i recettori accoppiati alla proteina G e gli ormoni. e GLICOSILAZIONE Avviene sia durante la traduzione che successivamente a livello del RER e del Golgi, ha un ruolo fondamentale nel corretto folding, definisce la struttura corretta della proteina, la stabilizza e la indirizza nei compartimenti dove è necessaria. Sono due tipi di glicosilazione: l'aggiunta di uno zucchero a un atomo di 0 o di Ser o treonina (avviene nel Golgi) a un atomo di N nei residui di Asn (reticolo endoplasmaticoc). e IDROSSILAZIONE L'aggiunta di gruppi OH importanti nella stabilizzazione di proteine come il collagene. Coinvolge prolina e lisina a livello del RE grazie all'intervento di idrossilasi per la cui attività è indispensabile l'acido ascorbico. e LIPIDAZIONE Consiste nell’aggiunta di lipidi in maniera covalente a delle proteine. Il processo inizia con il riconoscimento della sequenza segnale della proteina, una volta riconosciuta i residui vengono scissi, si espone così il residuo target a cui un enzima promuove l’attacco covalente del lipide. Il lipide si inserisce nel doppio strato lipidico, localizza e stabilizza la proteina a livello del doppio strato. La lipidazione genera delle ancore lipidiche, possono essere aggiunti palmitati, ac. Miristico o gruppi prenilici e l'ancora fosfatidilinositolo che si agganciano all’esterno del doppio strato lipidico. Queste modificazioni possono avvenire in diversi momenti della sintesi della proteina, possono essere co- traduzionali o post-traduzionali. In merito a l'aggiunta di ac. Miristico, avviene appena viene esposto n- terminale di Gly, stessa cosa nel caso in cui determinati substrati vengano tagliati. La lipidazione è una modificazione reversibile grazie a enzimi che tolgono il lipide e dinamica. Le lipidazioni possono fare interazioni proteine-membrana e proteine-proteine che generano determinate funzioni, possono anche indurre cambiamenti conformazionali nella proteina che possono scoprire determinati domini creando nuove interazioni. ® UBIQUITINAZIONE Aggiunta di piccole proteine di ubiquitina importante per marcare le proteine da degradare in modo da essere riconosciute dal proteosoma, sono coinvolte anche in (nel caso di monoubiquitinazioni) : - Proliferazione - Differenziamento - Ciclo cellulare - Apoptosi - Trasporto proteico 4 ubiquitine sono il segnale minimo per il riconoscimento della proteina da parte del proteosoma. Il LID o cappuccio del proteosoma riconosce le proteine da degradare, successivamente le proteasi del cap eliminano il folding della proteina e la spingono nella camera di digestione presente nel core del proteosoma da cui poi fuoriescono i peptidi di piccole dimensioni. ® SUMOILAZIONE Processo similare all’uniquitinazione, consiste nell’aggiunta di piccole proteine simili dette proteine SUMO, questa aggiunta provoca nelle proteine modificazioni che agiscono sulla loro funzione, è un processo che richiede energia, durante il processo sono presenti 3 enzimi, anch'esso è un processo reversibile. e. FOSFORILAZIONE Alla proteina target viene aggiunto un gruppo fosfato grazie a una chinasi, la defosforilazione avviene invece a opera di fosfatasi. Esistono numerose chinasi che trasferiscono un gruppo fosfato dall’ATP a residui di ser, treonina e tirosina. La fosforilazione determina cambiamenti proteici strutturali che influenzano molte attività come quella enzimatica o la capacità di interagire con altre proteine, è importante anche nel turnover della proteina siccome può far si che venga degradata meno velocemente e le permette di essere riconosciuta da altre proteine. La fosforilazione può anche incidere sulla localizzazione di una determinata proteina. Gioca un ruolo fondamentale nell'attivazione delle vie Raf/Ras/MEK/ERK. e ACETILAZIONE È una modificazione reversibile che avviene a carico della lisina che viene catalizzata dall’ n-acetil transferasi, l’acetil-CoA rappresenta il donatore di acetili. L'acetilazione può essere riconosciuta da altre proteine che hanno un dominio specifico detto BROMODOMINIO. Può avvenire sia a livello degli istoni ma anche a livello di altre proteine, la modificazione induce cambiamenti quindi nella loro funzione. Un esempio di cambiamento lo ritroviamo nella cromatina a seguito di acetilazione degli istoni da parte dell'enzima istone acetiltransferasi, la cromatina si “rilassa” divenendo più lassa, in questo modo da la possibilità a determinati fattori di trascrizione di legarsi a opportuni promotori e promuovere così l'espressione di un determinato gene, una volta trascritto il gene si avrà deacetilazione da parte di istone deacetilase che provoca ricompattamento della cromatina. | residui di lisina sono carichi positivamente, mentre i residui fosfato del dna sono carichi -, quindi vi è forte attrazione tra questi gruppi che tiene in maniera serrata le eliche legate agli istoni, l’acetilazione neutralizzata la carica + dei residui di lisina in modo che non ci sia più questa attrazione e permette così di allentare la struttura. e METILAZIONE Processo dinamico e reversibile che consiste nell’aggiunta di gruppi metili a diversi residui amminoacidici che determinano un aumento della idrofobicità , può avvenire sia su atomi di N, O o S, la reazione è catalizzata da metil-trasnferasi, la reazione contraria avviene opera di demetilasi. Possono essere aggiunti più di un gruppo metilico sullo steso atomo. Possiamo ritrovare questa modificazione principalmente a livello degli istoni che si associano a una repressione genica. Processo attraverso il quale le cellule possono comunicare fra di loro, si parla di trasduzione del segnale. La comunicazione può riguardare ogni aspetto della struttura e della funzione cellulare, questo meccanismo fa in modo che ciascuna cellula sia dipendente dalle altre, ha lo scopo di mantenere l’omeostasi cellulare e tissutale importante per il corretto funzionamento di organi e tessuti. ® Saturazione > la velocità di stimolo crescerà fino a quando tutte le molecole del recettore saranno occupate ® Inibizione competitiva + se sono presenti due sostanze che hanno affinità per lo stesso recettore, entreranno in competizione inibendo ciascuna il legame dell'altra, quella presente in maggiore concentrazione e/o più affine si legherà in maggiore quantità Un ligando si dice AGONISTA di un recettore quando legando lo attiva, al contrario si dice ANTAGONISTA quando legandosi al recettore lo inibisce. Un ligando può avere più recettori e provocare reazioni diverse nella cellula a seconda del recettore attivato. La trasduzione del segnale è la conversione di segnali extracellulari in una risposta intracellulare, è un processo fondamentale per la vita, il primo messaggero è rappresentato dal ligando che va a legarsi con il recettore specifico, il recettore si attiva e innesca all’interno della cellula una cascata di segnali intracellulari chiamati secondi messaggeri, l'attivazione dei secondi messaggeri va ad attivare a loro volta delle proteine bersaglio (effettori) che innescheranno la risposta biologica della cellula. La maggior parte dei segnali è transitoria e pure la risposta dovrebbe essere transitoria. Se si accende un segnale, c'è anche bisogno di una via per spegnerlo. Per esempio, il mancato spegnimento di un segnale che fa aumentare le concentrazioni di Ca nel citosol è una delle cause che induce la morte cellulare. In molti sistemi di signalling accensione e spegnimento sono operati da PROTEINE DI FOSFORILAZIONE e/o da PROTEINE G. | segnali prevenuti tramite recettori legati a enzimi o associati a proteine G passano a complicati sistemi di trasmissione formati da una serie ordinata di molecole segnale intracellulari che si comportano quasi tutti come interruttori molecolari: ricevendo un segnale passano dallo stato inattivo allo stato attivato, facendo entrare in funzione altre proteine della rete di trasmissione e continuando ad agire finché qualche processo non lo disattiva. Le proteine G possono essere monomeriche o eterotrimeriche (trimero: subunità alfa, beta e gamma). Queste proteine ciclano dalla condizione inattiva a quella attiva, l’attività dipende dal legame con GDP (inattiva) o GTP (attiva), un esempio di proteine monomerica è la proteina Ras che ha attività GTPasica intrinseca, tende a idrolizzarlo in modo da ritornare allo stato inattivo con GDP. Lo stimolo attiva il fattore di scambio del nucleotide guanidico GEF che promuove la conversione di Ras da GDP a GTP, questa conversione provoca l'attivazione di Ras che trasmette il suo segnale ad altri substrati, una volta trasmesso Ras grazie alla sua attività GTPasica idrolizza il GTP a GDP e un gruppo fosfato tornando alla condizione inattiva. Lo stes o ciclo vale per le proteine eterotrimeriche. Le vie di segnalazione cellulare coinvolgono una serie di reazioni a cascata che portano ad un flusso lineare dell’informazione, le reti di segnalazione sorgono da interazioni in cui un componente di una via regola l’attività di una seconda via, esempi di vie sono le vie delle proteine G e la via Ras-MAPK. Il calcio rappresenta il messaggero universale, e mantenuto ad una concentrazione estremamente bassa nel citosol ma alta al di fuori della cellula e in alcuni organelli. In numerose vie di segnalazione l'azione del calcio è mediata da CALMODULINA, piccola proteina regolatrice attivata dal calcio, in grado di legare complessivamente 4 ioni Ca. Circuiti di trasduzione del segnale efficiente richiedono meccanismi di controllo a feedback dove il prodotto di una reazione influenza l’attività di un altro enzima che lo precede nella via metabolica. In un'interazione a feedforward il prodotto di una reazione enzimatica influenza l'attività di un altro enzima che lo segue nella via metabolica. ® RECETTORI DI MEMBRANA 1. Recettori annessi ai canali ionici 3 consentono il passaggio di un flusso di ioni che produce una corrente elettrica 2. Recettori accoppiati a proteine G + il legame di un ligando al recettore attiva una proteina che lega Il GTP e che a sua volta attiverà un enzima che genera secondi messaggeri 3. Recettori accoppiati agli enzimi > proteine transmebrana con il dominio per il ligando rivolto verso la superfice esterna ed il dominio citoplasmatico con funzioni enzimatiche o legate ad enzimi 3 Recettori tirosin chinasici , legano ormoni o fattori di crescita che sono idrofilici e non possono attraversare la membrana MPK sono fosfatasi a doppia specificità poiché disattivano le MAPK defosforilando i residui di treonina e tirosina nel sito di attivazione di MAPK Via Ras chinasica Regolazione della trascrizione attraverso la via Ras. >; L'interazione con il igando causa la dimerizzazione del recettore. \ 4 une _B-_, MEH fosforila e attiva MAPK, Ligandof S06 attiva Ras causando | | e attiva MEK inn MAPK agisce da importante molecola effettrice fosforilando molte proteine cellulari. Dominio -— della tirosin chinasi % — Fattore GRB2, una proteina contenente SH2, riconosce i residui di fosfotirosina. Un ligando, come un fattore di crescita, si lega a una RTK specifica e questo porta a un aumento della trascrizione genica in un processo che comprende 10 fasi. Boron, Walter F.,Boulpaep, Emile L. (2106-02-07T07:28:15). Esistono dei recettori associati a proteine che hanno attività tirosin chinasica, non hanno intrinsecamente un'attività enzimatica ma sono associati a delle chinasi e quando arriva il ligando, i recettori dimerizzano o subiscono cambiamento conformazionale per avvicinare il più possibile le due chinasi le quali, inizieranno ad autofosforilare se stesse per attivarsi e andranno a fosforilare determinati residui di tirosina presenti nel recettore. La fosforilazione dei residui fa si che altre proteine (fattori di trascrizione) che presentano dominio SH2 vengono reclutate dal recettore e verranno fosforilate, formeranno dei dimeri, entrano all’interno del nucleo grazie alle importine per svolgere la loro funzione di trascrizione. Esistono anche altri recettori che hanno attività serin/treonin chinasica, vengono fosforilati residui di serina e treonina a seguito di dimerizzazione. Il ligando viene percepito da recettori di tipo | e tipo Il e porta alla formazione di un complesso eterotetramerico che è in grado di fosforilarsi e di reclutare altre proteine Smad che viene a sua volta fosforilato, una volta fosforilato potrà entrare nel nucleo per esercitare la sua funzione. Altri recettori hanno attività guanilil ciclasica GCR, in presenza di un determinato ligando, dimerizzano e trasformano nel dominio intracitoplasmatico, il GTP nella guanosina monofosfato ciclico cGMP che rappresenta un secondo messaggero, l'aumento della sua concentrazione va ad attivare determinate chinasi quali PKG dipendenti da quest’ultimo, che a loro volta andranno ad agire su altri substrati. Esiste una forma citosolica di guanilil ciclasi che contiene un gruppo eme ed è attivata dalle concentrazione di NO, e va ad agire su determinati substrati che sono in grado di produrre un rilassamento nella cellula muscolare. Recettori accoppiati a proteina G Costituiscono la più grande famiglia di recettori di superficie, presentano un dominio extracellulare che lega il ligando, una catena polipetidica che attraversa 7 volte il doppio strato lipidico e una regione citoplasmatica che ha il compito di legare la proteina G. Questi recettori sono attivati da ormoni, mediatori locali, neurotrasmettitori o recettori olfattivi. La proteina G è una proteina trimerica, l'interazione con il recettore provoca nella subunità alfa la conversione da GDP a GTP per far si che ie trimero si stacchi, la subunità alfa GTP attivata divisa dal complesso beta+gamma. Quando una subunità alfa attivata incontra la sua proteina bersaglio e vi si unisce, la attiva, dopo qualche secondo il GTP viene idrolizzato dall'attività GTPasica della subunità alfa e quindi si riassocia al complesso beta-gamma e il segnale viene interrotto, la proteina G ricostituita è così pronta per essere riattivata da un altro recettore. | substrati delle proteine G sono rappresentati da adenilato ciclasi che converte ATP in AMP ciclico (secondo messaggero importante) e fosfolipasi C R che aumenta le concentrazioni di calcio. Alcuni batteri producono tossine che hanno come bersaglio le proteine G, intereferendo così nel processo di segnalazione della cellula ospite, un esempio è la tossina del colera. L'adenilato ciclasi può essere bersaglio di due vie di segnalazioni concorrenti, possono indurre l'attivazione o possono esserci ormoni e legandi inibitori che provocano inibizione di quel determinato enzima, dipende dalla concentrazione dei ligandi. Una risposta inibitoria può essere per esempio indotta dal sequestro di un recettore che viene spostato temporaneamente all'interno della cellula così da non avere accesso al ligando, nella sottoregolazione del recettore invece vengono distrutti nei lisosomi dopo internalizzazione. I recettori GPRC e le proteine G sono organizzati in domini funzionali, ovvero le zattere lipidiche Recettori annessi ai canali ionici Consentono il passaggio di un flusso di ioni che produce una corrente elettrica. La trasmissione dell'impulso nervoso è mediata dall'apertura di determinati canali ionici. Possono essere controllati dal cambiamento di potenziale di membrana, o dal legame con uno specifico ligando come un neurotrasmettitore che apre la porta in risposta a determinati stimoli. come CENTRI DI NUCLEAZIONE. Non sono strutture stabili ma sono in continua polimerizziamone e depolimerizzazione. La vita media della tubulina è di circa un giorno, la vita media dei microtubuli è invece di circa 10 minuti grazie alla instabilità dinamica. Regolano e determinano la polarizzazione delle cellule, un estremo della cellula si diversifica dall'altro sia nella forma ma anche da un punto di vista funzionale. | neuroni sono cellule tipicamente polari. Le proteine motrici che si spostano lungo i microtubuli sono di due tipi chinasi (verso il lato positivo, movimento anterogrado) e dinenine (verso il lato negativo, movimento retrogrado), utilizzano l'energia derivante dall’idrolisi di ATP per muoversi lungo i filamenti. Le dineine si dividono in citoplasmatiche e assonemali convolte nello spostamento di microtubuli nelle ciglia e nei flagelli, le dineine richiedono l'associazione con dinactina, un complesso proteico che crea interazioni tra dineine e vescicole da trasportare. ® CIGLIA E FLAGELLI Ciglia e flagelli sono strutture mobili costituite da microtubuli e dineine, i flagelli permettono un movimento ondulatorio per permettere agli organismi di nuotare in mezzi liquidi, le ciglia sono più corte e effettuano un movimento a frusta, consento di muovere singole cellule in un fluido o di muovere il fluido sulla superficie di un gruppo di cellule in un tessuto. Sono costituiti da 9 coppie di microtubuli disposti ad anello attorno ad una coppia centrale a formare l’ASSONEMA e sono avvolti da un’estroflessione della membrana citoplasmatica, le coppie di microtubuli sono tenute insieme da altre proteine come la nexina importanti per generare il movimento. La flessione di ciglia a flagelli è causata da scorrimento delle doppiette adiacenti. La crescita è la divisione di una cellula è orchestrata nel nucleo da meccanismi molecolari finemente controllati chiamati ciclo cellulare. Il termine “orologio del ciclo cellulare” si riferisce a un circuito molecolare che opera nel nucleo cellulare ed è in grado di processare e integrare un'ampia gamma di segnali che hanno origine all’esterno e all’interno della cellula, e decide se la cellula deve o meno entrare in un ciclo cellulare attivo oppure rimanere in uno stato non proliferativo. Nel caso in cui la cellula decida per la proliferazione, il circuito programma la sequenza di modificazioni biochimiche che permettono alla cellula di duplicare i suoi costituenti e dividersi in due cellule figlie. La funzione fondamentale del ciclo cellulare è la duplicazione del DNA e la distribuzione di una copia identica nelle due cellule figlie, si divide in mitosi e interfase diviso a sua volta in fase G1, fase S e fase G2. I checkpoint impongono un controllo di qualità per garantire che la cellula abbia completato correttamente tutte le tappe necessarie di una fase del ciclo prima che le sia permesso di avanzare alla successiva. L'entrata nella fase S viene bloccata se il genoma è danneggiato, anche la replicazione viene bloccata, l'entrata nella fase M viene bloccata se la replicazione del DNA non è completata, infine l'anafase viene bloccata se i cromatidi non sono assemblati sul fuso mitotico. Il sistema di controllo del ciclo cellulare governa gli apparati attivando e disattivando ciclamente proteine e complessi proteici chiave che innescano e regolano la duplicazione del DNA, la mitosi e la citochinesi. Per attivare o disattivate le proteine vengono utilizzati come strumenti la fosforilazione ad opera di proteine- chinasi e la defosforilazione ad opera delle proteine fosfatasi. Le molecole responsabili del controllo del ciclo sono di 2 tipi: 6. CICLINE > hanno funzione di accensione e spegnimento delle proteine-chinasi 7. CDK chinasi-ciclina-dipendenti > le proteine chinasi sono presenti in tutte le fasi, ma vengono attivate dalle cicline solo in momenti ben definiti del ciclo, la loro attività sale e scende con una certa periodicità. La concentrazione delle cicline è regolata mediante modulazione della trascrizione e proteolisi. L'aumento della ciclina fa si che possa interagire con la cdk che presenta sito catalitico chiuso, l'interazione tra ciclina e cdk apre il sito catalitico e induce una pre-attivazione dell'attività chinasica di cdk, subentra poi un'altra chinasi che va a fosforilare in treonina 161 il cdk promuovendo la piena attivazione del complesso ciclina-cdk. Esistono poi altre chinasi o fosfatasi che possono fosforilare altri residui come tirosina 15 o treonina 14 presenti nel dominio catalitico della cdk producendo un ainibizione del complesso a causa di fattori come ad esempio danno al DNA, la fosforilazione avviene ad opera della chinasi WEE1. Regolazione delle CDK attraverso fosforilazione e proteolisi ta © Crea : dici Weel di Ta: china. CDE. i Cosa. Mi DERP. Do La DIRE innesca 'aggiun di potrei sguia aa ciclina mediante Pbiquicin liga. L'attività dei complessi ciclina-cdk può essere arrestata da specifiche proteine inibitorie. Durante la fase g1 la cellula riceve segnali dall'esterno che inducono la cellulare a entrare nel ciclo oppure no, in questa fase possono agire alcuni fattori GF mitogenici in maniera positiva o fattori negativi come TGF-B che inducono segnali di inibizione. Il TGF-R inibisce la progressione cellulare poiché promuove l'aumento degli inibitori del complesso ciclina-CDK come p” e p°'. | fattori di crescita mitogenici invece promuovono la fosforilazione e la localizzazione citoplasmatica degli inibitori ciclina-CDK dove sono inattivi, si oppone all’azione del TGF-R. Il ciclo cellulare è influenzato da segnali extracellulari fino al punto di restrizione R, una volta superato R, si innesca un programma autonomo della cellula che riguarda differenti complessi ciclina-CDK importanti nelle diverse fasi del ciclo cellulare. Le prime cicline sono le cicline D che a seguito di segnali extracellulari iniziano a legarsi con le specifiche CDK 4/6 con conseguente superamento di R, se non sono disponibili fattori di crescita durante la G1, le cellule entrano in una fase quiescente del ciclo chiamata GO, le cellule rimangono metabolicamente attive ma non proliferano. I complessi ciclina-CDK regolano la divisione fosforilando specifiche proteine target quali la proteina del retinoblastoma pRb, le cicline attivate si legano alle CDK le quali andranno a fosforilare la pRb, la quale a sua volta risulta essere ipofosforilata, quando si arriva al superamento di R, interviene l’altro complesso ciclinaE-CDK2 che promuove una iperfosforilazione della proteina. La proteina Rb non fosforilata si lega a un fattore di trascrizione E2F che si lega a molti geni che devono essere trascritti per l'ingresso della cellula nella fase S, quali gene MYC, ciclina E ed E2F, una volta legato al promotore lega anche un enzima detto ISTONE DEACETILASI che deacetila gli istoni in modo da rendere la cromatina compatta e da impedire la trascrizione. Quando grazie al complesso ciclina-CDK si ha fosforilazione di Rb, si genera un cambiamento conformazionale che fa si che Rb si stacchi dal promotore E2F, ciò fa si che l'enzima non possa più deacetilare gli istoni, la cromatina si rilassa e viene permessa la trascrizione dei geni importanti per il proseguimento del ciclo cellulare. Durante la fase M, si ha la formazione del complesso ciclinaB-CDC2, si forma un complesso detto MPF che induce numerosi cambiamenti nucleari e citoplasmatici che conducono all'inizio della fase M: si ha la condensazione della cromatina tramite fosforilazione dell’istone H1, demolizione dell’involucro nucleare tramite fosforilazione delle lamine, frammentazione di Golgi e RE e infine la formazione del fuso. Una delle proteine più importanti che interviene nell'arresto in G1 indotto da danneggiamento del DNA è la p53 che risulta essere un inibitore del ciclo cellulare e viene attivata dal danno al DNA, se il danno non viene riparato la cellula viene indotta ad autodistruggersi per apoptosi. Solitamente viene continuamente ubiquinata dalla E3 ligasi MDM2 e degradata dal proteasoma, in situazioni di danno, la proteine viene fosforilata da una chinasi che fa si che MDM2 non possa più interagire per promuovere la sua degradazione in modo da aumentare la concentrazione di p53. Durante il ciclo, per monitorare la quantità di DNA presente nelle cellule (2n o 4n), si effettua un analisi con CITOFLUORIMETRO e IODURO DI PROPIDIO che legandosi alla doppia elica fornisce una informazione precisa sulla quantità che è in relazione all'intensità di fluorescenza. e MITOSI La fase M è scatenata da una cascata di fosforilazioni che inducono vari effetti tra cui la condensazione della cromatina, l'assemblaggio del fuso mitotico, la riorganizzazione del citoscheletro e la disgregazione dell'involucro nucleare. La mitosi si divide in 6 fasi: 1. PROFASE + i cromosomi replicati, ciascuno consistente in due cromatidi fratelli associati, si condensano. Il fuso mitotico si assembla fra i due centrosomi che si sono replicati e separati. 2. PROMETAFASE > l’involucro nucleare si dissolve, i cromosomi si attaccano ai microtubuli del fuso tramite i cinetocori. 3. METAFASE > i cromosomi sono allineati all'equatore del fuso, i microtubuli del cinteocore attaccano i cromatidi fratelli ai poli opposti del fuso 4. ANAFASE > i cromatidi fratelli si separano e vengono tirati lentamente verso il polo del fuso che li fronteggia, i microtubuli del cinetocore si accorciano e i poli del fuso si separano, si ha così la separazione dei cromosomi. 5. TELOFASE > le due serie di cromosomi giunte ai poli della cellula condensano, si ricostituisce un nuovo involucro nucleare e si forma il nucleolo, inizia l'assemblaggio dell'anello contrattile. La morte cellulare è solo metà del processo, l'eliminazione dei corpi apoptotici è parte fondamentale del processo in vivo è viene svolta dai macrofagi. Richiamo La cellula che sta per morire rilascia segnali solubili find-me affinché venga riconosciuta e legata al fagocita. 1) Richiamo Celuia apoptotica Macrolago Riconoscimento 2) Riconoscimento 5) Rilascio di citochine € legame e legame. gocita stabilisce dei contatti con la cellula apoptotica mediante la presenza di specifici segnali cat-mo o l'assenza di segnali don't eatrma sulla superficie delle cellule apoptotiche. Rscettor / Rilascio di citochine Una volta ingeriti i resti della cellula apoptotica, il fagocita inizia la produzioni 9) Segnalamento fagocitico a) Processamento di citochine anti © Internalizzazione © degradazione infiammatorie, quali IL-10 e TGF-b, per prevenire una risposta infiammatoria attorno al sito di morte della cellula apoptotica. Segnalamento fagocitico e internalizzazione Processamento e degradazione | legami stabiliti tra la cellula apoptotica e il fagocita stimolano la segnalazione citoplasmatica che favorisce l'inglobamento della cellula apoptotica e il suo avvio verso la degradazione. La fagocitosi viene indotta da segnali rappresentati dalla lisofosfatidilcolina che permette al macrofago di individuare il corpo apoptotico e dall’esternalizzazione della fosfatidilserina che avvia il processo. La lisofosfatifilcolina viene liberata a seguito dell'idrolisi della fosfatifilcolina ad opera della fosfolipasi A2 che viene attivata dalla caspasi 3. | fagociti incontrano le potenziali cellule bersaglio e interagiscono con loro attraverso le rispettive proteine CD31, se la cellula bersaglio è vitale avviene la repulsione se invece la cellula è apoptotica espone la fosfatidilserina che viene riconosciuta dai recettori del fagocita e attiva la sua attività. Il processo di fagocitosi avviene in due fasi: l'aggancio e la fagocitosi vera e propria. e CASPASI Le caspasi sono una famiglia di cistein-proteasi in grado di tagliare a livello di residui di acido aspartico, sono presenti nel citoplasma come forme proenzimatiche (inattive), si attivano dopo taglio proteolitico e tetramerizzazione. Le caspasi iniziatrici (2, 8, 9, 10) sono le prime che vengono attivate all'arrivo di uno stimolo pro-apoptotico, tagliano e attivano le caspasi esecutrici. Le caspasi esecutrici (3,6,7) tagliano e attivano i substrati cellulari come proteina FAK, proteine strutturali, regolatori del ciclo cellulare, proteine anti-apoptotiche, pro-apoptotiche (BID) e endonucleasi. La caspasi 3 causa l'attivazione dell'endonucleasi CAD, normalmente la CAD si trova nel citosol legata ad un inibitore, la caspasi distacca l’inibitore, dopodiché CAD trasloca nel nucleo dove causa un rapida frammentazione del DNA nucleare. Altre caspasi possono inattivare degli enzimi di riparazione del DNA come l'enzima PARP, inoltre inattivano enzimi coinvolti nella replicazione cellulare o distruggono le proteine strutturali del nucleo. Via estrinseca Uno dei principali recettori ella via estrinseca è FAS che viene espresso in un gran numero di cellule, FasL invece è espresso unicamente sui linfociti T e altre cellule del sistema immunitario, i linfociti individuano la cellula bersaglio che ha espresso i recettori Fas, i linfociti esprimono il ligando FasL, si avvicina e interagisce con la cellula bersaglio attivando il recettore, questa attivazione provoca l'attivazione della via estrinseca dell’apoptosi. Un altro importante recettore è TRAIL-R con ligando TRAIL che viene secreto, si lega al recettore e si innesca attraverso la trimerizzazione l'attivazione della via apoptotica estrinseca. Esistono recettori di TRAIL detti esca che hanno funzione di inibizione dell'attivazione della via estrinseca mediata dal ligando. Via intrinseca Il mitocondrio svolge un ruolo centrale nell’iniziazione sia nell'esecuzione della morte programmata, i meccanismi attraverso cui il mitocondrio promuove l’apoptosi sono 3: 1. Rilascio di fattori nel citoplasma quali AIF e citocromo C che è in grado di attivare le pro-caspasi 9 2. Distruzione della catena di trasporto degli elettroni 3. Modificazioni nello stato ossido-riduttivo con produzione di radicali liberi dell'ossigeno La permeabilità della membrana cellulare viene regolata oltre che da eventi traumatici che portano alla sua distruzione anche da un famiglia di proteine regolatrici a cui appartiene Bcl2, la famiglia può essere suddivisa in: 1. ANTI-APOPTOTICI > nel modello di attivazione indiretta la loro funzione principale è quelli di legare e inibire le proteine pro-apoptotiche BAX o BAK, le molecole BH3-only si legano alle proteine pro-apoptotiche per rimuoverle da BAX e BAK, queste ultime libere oligomerizzano formando così il poro. Nel modello di attivazione diretta, le proteine eBH3-only sono suddivise in attivatori e sensibilizzanti, la funzione principale delle proteine anti-apoptotiche è quella di legare e sequestrare sia le sottoclassi attivatrici che quelle sensibilizzanti. L'attivazione di BAX e BAK avviene quando il numero di molecole attivatrici supera la capacità neutralizzante delle proteine anti- apoptotiche. Le proteine BH3-only sensibilizzanti non attivano direttamente BAX e BAK ma abbassano la soglia per l'apoptosi occupando membri anti-apoptotici facendo così promuovere il rilascio di BH3-only attivatori per innescare l'oligomerizzazione di BAX e BAK. 2. PRO-APOPTOTICI + BAX, BAK L'APOPTOSOMA viene assemblato nel citosol quando le molecole del citocromo C vengono rilasciate dai mitocondri e si associa con Apaf-1, ciò provoca l'assemblaggio di una ruota a sette raggi in cui Apaf-1 forma i raggi e il citocromo le punte dei raggi. L'apoptosoma attivo si forma solamente in presenza di ATP. Alcune chaperonine HSP (heat shock proteins) sono in grado di inibire a diversi livelli il susseguirsi dei processi apoptotici o di agire in senso contrario. La proteina p53 gioca un ruolo importante nei processi pro-apoptotici, la sua concentrazione aumenta in casi di stress cellulari-fisiologici, rappresenta un sensore che è in grado di indurre una regolazione di proteine pro-apoptotiche e quindi di sbilanciare la cellula verso la morte cellulare aumentando la concentrazione delle proteine pro-apoptotiche. | farmaci antitumorali si servono di p53 per uccidere le cellule tumorali, l’etoposide causa danni al DNA per indurre un incremento di p53 che induce a sua volta la morte cellulare. e AUTOFAGIA Processo catabolico per organelli e materiale citoplasmatico a carico di AUTOFAGOSOMI che rende disponibili amminoacidi e acidi grassi per i processi anabolici, dipende dall'attivazione della proteina ATG con funzione di ubiquitinasi. Le cellule eucariotiche hanno due sistemi di degradazione principali: 3. Mediata dal lisosoma + degrada organelli e proteine, può essere selettiva e non 4. Mediata dal proteasoma > altamente selettiva, degrada proteine a vita breve e non correttamente ripiegate Esistono tre tipologie di autofagia: 1. MACROAUTOFAGIA + coinvolge la formazione di una doppia membrana che si richiude a formare l’AUTOFAGOSOMA 2. MICROAUTOFAGIA + deriva dall’invaginazione della membrana lisosomiale che sequestra proteine e organelli 3. AUTOFAGIA MEDIATA DA CHAPERONINE + degrada solo le proteine che vengono accompagnate verso i lisosomi dalle chaperonine HSP90 HSC70 La macrofagia contribuisce a: 1. Eliminare porzioni di citoplasma, organelli vecchi o danneggiati (autofagia basale), membrana plasmatica, proteine 2. Eliminare aggregati proteici citotossici 3. Contrastare la proliferazione di patogeni penetrati nella cellula 4. Differenziamento cellulare, rimodellamento dei tessuti ed embriogenesi In seguito al danno, la cellula induce molto rapidamente l’autofagia come meccanismo di sopravvivenza nel tentativo di rimuovere il danno, se il danno è troppo grave, viene indotta l’apoptosi che è in grado di inibire l’autofagia. L'autofagia diventa un vero meccanismo di morte quando l’apoptosi non funziona, solo in questo caso si attiva un'autofagia troppo prolungata che causa l’autodigestione delle cellule. e NECROSI Morte cellulare accidentale, può essere dovuta ad agenti fisici come altre temperature o traumi meccanici, ma anche agenti chimici come sostanze mutagene o carenze di ossigeno, può essere dovuta anche a causa di danni al DNA o carenze di proteine e vitamine. Se il danno è lieve la cellula può modificare alcune condizioni interne in modo da poter reagire ed adattarsi al danno. Le cellule necrotiche esplodono riversando il loro contenuto sulle cellule adiacenti e scatenando una risposta flogistica a carico dell’area occupata dai detriti, subentra così il richiamo chemiotattico dei leucociti per fagocitare i detriti, e rilasciare enzimi lisosomiali per favorire la dissoluzione delle cellule morte. In primo luogo, si arresta la produzione di ATP da parte dei mitocondri, si bloccano così anche le pompe attive ioniche di membrana, nella cellula di conseguenza entrano sodio e acqua che fanno rigonfiare la cellula e gli organuli, la cellula avvia la risposta allo shock termico con aumento della sintesi di alcune proteine che tentano di contrastare la denaturazione di proteine e della ubiquitina, si abbassa così il pH. Nella cellula entra il calcio che attiva le fosfolipasi che provocano la perdita di fosfolipidi delle membrane, il calcio attiva inoltre le calpaine, proteasi che danneggiano le strutture citoscheletriche e le proteine della