enzimi industriali e immobilizzazione, Dispense di Biotecnologie Industriali

Scarica enzimi industriali e immobilizzazione e più Dispense in PDF di Biotecnologie Industriali solo su Docsity! Enzimi industriali Molti degli enzimi prodotti su larga scala, appartenenti alla categoria degli “enzimi industriali” sono delle depolimerasi. Nella maggior parte dei casi, le considerazioni economiche (costi di produzione) sono di importanza critica per il loro successo commerciale. ASPETTI POSITIVI • Gli enzimi agiscono in condizioni blande di pH, temperatura, e a pressione atmosferica • Agiscono sul substrato in modo specifico e selettivo • Migliorano le caratteristiche e le prestazioni dei tessili • Gli enzimi sono biodegradabili • Gli enzimi possono sostituire sostanze chimiche pericolose per la salute e per l’ambiente • I processi enzimatici sono ecocompatibili • Gli enzimi consentono di ridurre i costi per sostanze chimiche, energia, acqua (possibilità di recupero e riciclo), e trattamento reflui • Non richiedono investimenti in nuovi impianti Industria Enzima Effetto Proteazi Lipasi Cellulazi Degradazione proteine Rimozione grassi Brillantezza colori Cellulazi Laccasi Rimozione microfibrille Brillantezza colori Xilanasi fitasi Solubilità fibre Rilascio fosfati Amilasi Glucosio isomerasi Formazione glucosio Formazione fruttosio xilanasi biobleaching Pactinasi Cellulazi Xilanasi Chiarificazione succhi Estrazione succhi Xilanasi Alpha-amilasi Glucosio ossidasi Impasto Shelf life; lievitazione Qualità impasto Rennina lattasi Coagulazione proteine Idrolisi del lattosio Papaina Filtrazione Controllo della maturazione  @ Detergenti @ Prodotti ingegnerizzati geneticamente per essere più stabili nelle condizioni ostili delle lavatrici e in presenza di detergenti anionici, agenti ossidanti e alti pH. @ Proteasi: batteriche @ Lipasi: idrolizzano il legame estere tra il glicerolo e l'acido grasso. Prodotta in Aspergillus oryzae che esprime il gene di Humicola lanuginosa  @ Detergenti @ Amilasi:idrolizzano l’amido gelatinizzato, che tende ad incollarsi sulle fibre tessili e lega altri componenti dei coloranti « Cellulasi: rimuovono le microfibrille di cellulosa, che si formano durante il lavaggio e l’uso dei capi in cotone. L'effetto è un aumento della brillantezza dei colori e una maggiore morbidezza dei capi « Cellulasi alcaline: Bacillus « Cellulasi neutre e acide: Trichoderma e Humicola SBOZZIMATURA Rimuove la bozzima (amido) prima del candeggio e della tintura Enzima: AMILASI Rimuove efficacemente l’amido senza danneggiare la fibra Basse temperature (30-70°C), pH neutro (5-7) PURGA DEL COTONE Rimuove i componenti non cellulosici del cotone grezzo Enzimi: CELLULASI, PECTINASI, XILANASI, LIPASI Alternativa ecocompatibile alla SODA CAUSTICA Riduzione costi trattamento reflui Minori consumi di acqua e energia BIO-POLISHING Rimuove la peluria superficiale e le fibrille morte (tessuti in fibre cellulosiche) Enzima: CELLULASI + azione meccanica blanda Migliora il drappeggio e la brillantezza BIO-STONING Stone-washing dei capi Denim Enzima: CELLULASI Alternativa all’uso della PIETRA POMICE Azione specifica a livello della superficie delle fibre, riduce l’abrasione dei capi e l’usura delle macchine Una piccola dose di enzima sostituisce chili di pietra pomice Migliora la qualità dei reflui La ricerca biotecnologica in campo tessile si propone di: • Sostituire i processi chimici tradizionali con nuovi processi enzimatici eco-sostenibili • Individuare nuove attività enzimatiche in grado di interagire con i substrati polimerici che costituiscono le fibre tessili • Passare dalle reazioni di idrolisi/degradazione a quelle di funzionalizzazione e cross-linking • Produrre modificazioni superficiali o di massa delle fibre in modo da migliorare le proprietà tecnologiche tradizionali (tingibilità, mano, aspetto, resistenza meccanica, ecc.), introdurre nuove proprietà funzionali (attività antimicrobica, rilascio controllato di sostanze, ecc.), migliorare l’interazione con la pelle (benessere, comfort) • Estendere i trattamenti enzimatici alle fibre sintetiche « Pelle @ Lipasi e proteasi: rimuovono le parti non utili presenti nella pelle degli animali. migliorano la qualità della pelle (superficie più forte e più pulita, maggiore morbidezza e meno macchie).  @ Prodotti per igiene personale @ Proteasi e lipasi: pulizia lenti a contatto @ Catalasi: elimina l'eccesso di perossidi @ Glucoamilasi e glucosio ossidasi: dentifrici @& Amido —- Glucosio —» Acido gluconico+H,0; é NI & \glucoamilasi | glucosio ossidasi disinfettanti Enzimi industriali (Principali applicazioni) Added to animal feed 7% Dairy Processing 14% Other 10% Textile manufacture 13% ME Percentages Processing of beverages Added to detergents Perceniages Figure The major products and processes in which industrial enzymes are incorporated/ used, and their relative share of the total enzyme market. ‘Other’ includes starch processing (4 per cent), use in bakery/confectionary industry (5 per cent) and leather softenine/processing (I per cent). Reproduced (with modifications) from Rehm, et al. (eds) (1999) Biotechnology a Multi Volume Comprehensive Treatise, Vol. Sa, p. 191. Wiley-VCH, Weinheim Enzimi ricombinanti I vantaggi della produzione di enzimi ricombinanti rispetto a quella da fonti naturali sono: •Alti livelli di espressione •Prodotti con un maggiore grado di purezza •Vantaggiosi economicamente •Possibilità di produrre enzimi presenti in organismi non- GRAS •Possibilità di modificare le caratteristiche dell’enzima (ingegnerizzazione) •Possibilità di ridurre le dimensioni dei fermentatori •Riduzione di prodotti di scarto •Riduzione di proteine contaminanti Enzimi immobilizzati Produrre ed isolare enzimi costa. Se possibile, l’industria punta a riutilizzarli Enzimi immobilizzati Enzimi immobilizzati: Proprietà ed applicazioni Enzimi immobilizzati Enzyme EC number Product Aminoacylase 3.5.1.14 L-Amino acids Aspartate ammonia-lyase 4.3.1.1 L-Aspartic acid Aspartate 4-decarboxylase 4.1.1.12 L-Alanine Cyanidase 3.5.5.x Formic acid (from waste cyanide) Glucoamylase 3.2.1.3 D-Glucose Glucose isomerase 5.3.1.5 High -fructose corn syrup Histidine ammonia-lyase 4.3.1.3 Urocanic acid Hydantoinasea 3.5.2.2 D- and L-amino acids Invertase 3.2.1.26 Invert sugar Lactase 3.2.1.23 Lactose-free milk and whey Lipase 3.1.1.3 Cocoa butter substitutes Nitrile hydratase 4.2.I.x Acrylamide Penicillin amidases 3.5.1.11 Penicillins Raffinase 3.2.1.22 Raffinose-free solutions Thermolysin 3.2.24.4 Aspartame Some of the more important industrial uses of immobilised enzymes NR + OH2 Nitrile idratasi R O NH2 Amidasi OH2 R O OH + NH3 Nitrilase + OH22 Enzimi immobilizzati Immobilization of enzymes A definition: Immobilization means that the biocatalysts are limited in moving due to chemically or physically treatment” A insoluble enzyme - advantages as classical heterogeneous catalyst Reasons reuse of enzyme (reducing cost) easy product separation continous processing - facilitated process control - low residence time (high volumetric activity) - optimisation of product yield stabilization by immobilisation Limitations cost of carriers and immobilisation changes in properties (selectivity) mass transfer limitations - problems with cofactor and regeneration - problems with multienzymes systems activity loss during immobilisation VANTAGGI NELL'USO DI ENZIMI IMMOBILIZZATI • Consentono il riuso della componente enzimatica. • Ideali per operatività e continuità. • Il prodotto è libero da enzimi. • Consentono un controllo più preciso dei processi catalitici. • Migliorano la stabilità degli enzimi. • Consentono lo sviluppo di un sistema di reazioni multienzimatiche. • Offrono notevoli applicazioni in campo industriale e clinico. • Riducono i problemi di smaltimento dei rifiuti. Enzimi immobilizzati Reattori con enzimi immobilizzati continuous stirred tank reactor Product Qut substrate 3 product immobilized enzyme Substrate In Reattori Batch-fed stirred-tank reactor Immobilized enzyme Continuos fluidized-bed reactor Substrate Product Continuos stirred-tank reactor Substrate Immobilized enzyme Continuos ultrafiltration-membrane reactor Substrate Enzyme recycle ’ Product Continuos packed-bed reactor Substrate Immobilized enzyme column Product Donward flow Product Immobilizad enzyme column Substrate Upward flow re Product Recycle Immobilized flow enzyme column Substrate Recycle Immobilizzazione e Adsorbimento fisico * Intrappolamento * Legami covalenti entrapped in droplets • E’ il confinamento dell’enzima in un gel polimerico o in una membrana semipermeabile. Nel primo caso il preparato catalitico si ottiene facendo polimerizzare la matrice idrofilica in una soluzione acquosa dell’enzima. • Non ci sono interazioni fisico/chimiche tra enzima e polimero. • Si può graduare la diffusibilità dei substrati e dei prodotti in base alla consistenza della matrice polimerica. • L’enzima può inoltre essere intrappolato in membrane porose. • Accorgimenti: se i buchi sono molto larghi si può meglio confinare l’enzima mediante agenti reticolanti bifunzionali. IMMOBILIZZAZIONE (Intrappolamento) Immobilization by Entrapment • Gel entrapment places the enzyme within the interstitial spaces of crosslinked, water-insoluble polymer gels. • Polyacrylamide gels: • Polysaccharides: The solubility of alginate and -Carrageenan varies with the cation, allowing these soluble polymers to be crosslinked upon the addition of CaCl2 and KCl, respectively. • Variations of pore size result in enzyme leakage, even after washing. The effect of initiator used in polyacrylamide gels can be problematic. Il metodo più utilizzato per immobilizzare gli enzimi è quello di formare un legame covalente tra l’enzima ed un opportuno supporto solido. I supporti sono vari: Cellulosa, destrano, agaroso (ed altri tipi di polisaccaridi), allumina porosa, vetro poroso. In genere i supporti hanno gruppi idrossile che vengono utilizzati per legare (con una opportuna chimica) l’enzima al supporto. Nell’enzima i gruppi che generalmente vengono coinvolti nel legame covalente sono quelli riportati nella tabella. Gli enzimi possono essere fatti precipitare mediante co-polimerizzazione con glutaraldeide. Questo metodo produce particelle di enzima che vengono utilizzate in sospensione. Enzimi immobilizzati Most Convenient Residues for Covalent Binding CH2 NH34 + Lysine (Lys) CH2 SH Cysteine (Cys) CH2 OH Tyrosine (Tyr) NH N CH2 Histidine (His) CH2 C O O CH2 Glutamic Acid (Glu) CH2 NH3 C NH2 NH2+ Arginine (Arg) N H CH2 Tryptophan (Trp) CH2 C O O Aspartic Acid (Asp) • Amino acid residues with polar and reactive functional groups are best for covalent binding, given that they are most often found on the surface of the enzyme. • Shown are the most convenient residues in descending order. Covalent Attachment Techniques • Cyanogen bromide activates supports with vicinal hydroxyl groups (polysaccharides, glass beads) to yield reactive imidocarbonate derivatives: • Diazonium derivatives of supports having aromatic amino groups are activated for enzyme immobilization: • Other methods include diazo coupling, alkylation, etc. il quale reagisce col gruppo fenilico di un residuo tirosinico dell’enzima residuo anilinico sale di diazonio gruppo fenilico legame azoico In questa reazione il residuo anilinico del polimero viene derivatizzato, con una miscela di acido nitroso (HNO2) e acido cloridrico (HCl), in un sale di diazonio formando un legame azoico IMMOBILIZZAZIONE (Diazotazione) In questa reazione la funzione aldeidica del polimero Funzione aldeidica Reagisce in ambiente acido (H+) con la funzione amminica (in questo caso con l’NH2 di un residuo di Lisina dell’enzima) Per dare la base di Shiff. Base di Shiff IMMOBILIZZAZIONE (Formazione di una base di Shiff) In questa reazione il gruppo sulfidrilico di un residuo cisteinico libero e la funzione sulfidrilica presente sulla superfice del polimero Sono coinvolti nella formazione di un legame disolfuro mediante ossidazione con: ossigeno o esaferrocianato di potassio o dimetilsolfossido. IMMOBILIZZAZIONE (Interscabio Tiolo-Disolfuro) NR, ee . «pie emo Yo ona " ene Superfici con gruppi carbossilici si NR, o NH—R, ue e NR, ° 0 e NHS Ya o \ NH--R; ON I cd + 0=c {3 3 Nina | Succinimide ester activated CMD 9 va + HNT Ligand o o | v I A Ligand + Pri NHS c \ o 0 Immobilized ligand Figure 3.1. Chemistry for immobilization of tiomolecules to CMD via EDCINHS chemistry. Conseguenze dell’immobilizzazione (Sulla struttura dell’enzima e sull’accessibilità al sito catalitico) Effetto di partizione Matrici poliioniche hanno l’effetto di causare una partizione di ioni fra la fase bulk ed il microambiente interno dell’enzima. Matrici polianioniche concentreranno ioni idrogeno intorno all’enzima, per cui aumentando la concentrazione di protoni diminuirà il pH; al contrario matrici policationiche respingeranno gli ioni idrogeno, diminuendone la concentrazione rispetto alla soluzione in bulk, per cui aumenterà il pH. Conseguenze dell’immobilizzazione ( Effetti sul microambiente) Membrana polianionica IMMOB ILIZZAZIONE 100 2 Dipendenza dal pH È s Immobilizzato A fa 05° d 108 3° 3 Dis] e è 5 È a v 109 Og È î 00 3 E Oo È ©” o E a L L 1 I 1 1 Ì L 1 L i > 2 o o 5.0 55 60 65 7.0 73u 8.0 8,5 90 9,5 10.0 distanza 100 Membrana policationica È Immobilizzato distanza g 09° 8 ° o0Ì $ 1 doi 5_L ei z o3î oi 107 do o e > Ì L l l I l L l l 1 L 40 45 50 5.5 60 65H° 7.5 8.0 85 90