Espressione Genica (DNA, replicazione, trascrizione e traduzione), Appunti di Biologia Genetica

Scarica Espressione Genica (DNA, replicazione, trascrizione e traduzione) e più Appunti in PDF di Biologia Genetica solo su Docsity! L'essenza dell'espressione genica è rappresentata dalla relazione tra la sequenza di basi nucleotidiche delle molecole di DNA e l'ordine lineare degli amminoacidi nelle molecole proteiche. La maggior parte dei geni eucarioti contiene sequenze non codificanti interperse fra le regioni codificanti, quindi i geni non mostrano una completa corrispondenza lineare con i loro prodotti polipeptidici. I GENI sono definiti come unità funzionali del DNA che codificano per la sequenza amminoacidica di uno o più polipeptidi o, alternativamente, per uno o più tipi di RNA che svolgono funzioni diverse da quella di specificare la sequenza amminoacidica di catene polipeptidiche. Il codice genetico è un codice a triplette. L'informazione nel DNA deve essere contenuta nella sequenza dei 4 nucleotidi che costituiscono il DNA stesso. Dato che il linguaggio del DNA deve contenere almeno "20" parole, una per ciascuno dei 20 amminoacidi che compongono le molecole proteiche, un codice a doppiette non sarebbe ancora sufficiente, in quanto 4 diversi nucleotidi presi due alla volta generano soltanto 42=16 differenti combinazioni. Mentre, se consideriamo 3 nucleotidi alla volta, il numero di combinazioni che possono essere prodotte con un alfabeto di appena quattro lettere è di 43=64. Questo numero è più che sufficiente per codificare 20 amminoacidi diversi. Il codice genetico è quindi un codice a triplette, in cui la lettura di un messaggio comincia in un punto specifico di inizio (per permettere la cornice di lettura corretta) e quindi procede tre nucleotidi alla volta, con la traduzione di ognuna di tali triplette nell'appropriato amminoacido fino a quando non è giunta la fine del messaggio. Se solo 20 delle 64 possibili combinazioni di nucleotidi avessero "significato" per la cellula, la probabilità di comparsa di triplette prive di significato nelle regioni in cui viene persa la cornice di lettura dovrebbe essere significativamente più alta ed andrebbero ad interferire con la sintesi proteica. Dal momento che esistono solo 20 amminoacidi, questo indica che il codice genetico è un codice degenerato, ovvero che un singolo aa può essere codificato da più di una tripletta di nucleotidi. La degenerazione svolge una funzione utile nell'aumentare l'adattabilità del sistema di codificazione. Un'altra caratteristica importante è che il codice genetico non è sovrapposto. In un codice sovrapposto, la cornice di lettura dovrebbe avanzare lungo il filamento di DNA solo per uno o due nt alla volta, così che ogni nt sarebbe letto due o tre volte. La natura non sovrapposta del codice: ogni nt è parte di una sola tripletta. Ci sono casi in cui una particolare regione del DNA è tradotta in più di un codice di lettura. Per esempio, certi virus con genomi molto piccoli posseggono geni sovrapposti, ovvero un gene è completamente compreso all'interno di un altro gene e, per complicare ulteriormente la situazione, un terzo gene di sovrappone ad entrambi. Nella sintesi dell'mRNA durante il processo di trascrizione è utilizzato come stampo uno solo dei due filamenti di DNA, detto appunto filamento stampo. Il filamento di DNA che non funziona da stampo, benché non sia direttamente coinvolto nella trascrizione, viene definito filamento codificante; infatti esso possiede una sequenza nt corrispondente a quella dell'equivalente mRNA che contiene il messaggio codificante. 1) Il meccanismo utilizzato per copiare l'informazione di sequenza da uno stampo di DNA in una molecola di mRNA a esso complementare si avvale delle stesse regole di appaiamento delle basi complementari tipiche della replicazione del DNA con l'unica eccezione che nell'RNA è utilizzata la base uracile (U) ogniqualvolta nel DNA sarebbe stata inserita una timina (T). 2) Il codice genetico si riferisce all'ordine dei nucleotidi nelle molecole di mRNA a singolo filamento che poi effettivamente dirigono la sintesi proteica. Le molecole di mRNA sono trascritte dal DNA per mezzo di un meccanismo che si basa sull'appaiamento delle basi complementari, simile a quello della replicazione del DNA, con due differenze significative: La sequenza di basi di una molecola di RNA determina l'ordine con cui gli aa vengono uniti durante la sintesi proteica. Quindi, l'RNA funziona come un messaggero che guida il processo della sintesi proteica. Le triplette nucleotidiche nell'mRNA, chiamate codoni, sono le vere unità codificanti. Tutti i 64 codoni sono usati nella traduzione dell'mRNA; 61 di questi specificano l'aggiunta di particolari amminoacidi al polipeptide in crescita e uno di questi (AUG) ha anche il ruolo prominente come codone iniziatore, in grado di dare inizio al processo della sintesi proteica. I rimanenti 3 codoni (UAA, UAG e UGA) sono codoni di stop, inducono cioè la cellula a terminare la sintesi della catena polipeptidica. Il codice genetico non è ambiguo: ciascun codone ha un solo significato. Tuttavia il codice è anche degenerato: molti degli amminoacidi sono specificati da più di un codone (aumentando l'adattabilità del sistema codificante). Codice genetico Espressione genica Pagina 1 Un'ulteriore proprietà del codice genetico è che esso è (quasi) universale. Schema riassuntivo del argomento successivo: replicazione. nt = nucleotide aa = amminoacido Espressione genica Pagina 2 filamento anticipato, è sintetizzato in modo continuo in quanto cresce nella direzione 5’→3’. Essendo i due filamenti antiparalleli, l’altro filamento di nuova sintesi, detto filamento ritardato, deve crescere in direzione 3’→5’. Dato che la DNA polimerasi non può aggiungere nucleotidi nella direzione 3’→5’, il filamento ritardato viene formato come una serie di frammenti di Okazaki corti e discontinui, sintetizzati in direzione 5’→3’. Questi frammenti sono poi uniti tra loro dalla DNA ligasi per formare un filamento di DNA nuovo con polarità 3’→5’. Come mai allora non si è evoluto un enzima capace di sintetizzare in direzione 3’→5’? Una possibile risposta è legata alla necessità di correzione degli errori durante la replicazione del DNA. La correzione delle bozze è possibile per il fatto che, oltre a catalizzare la sintesi del DNA, quasi tutte le DNA polimerasi hanno anche un’attività esonucleasica 3’→5’. Le esonucleasi sono enzimi che degradano gli acidi nucleici (per lo più il DNA) a partire da un’estremità e consente, quindi, la rimozione di nucleotidi appaiati scorrettamente all’estremità 3’ del filamento nascente. La loro azione è quindi diversa da quelle delle endonucleasi, che tagliano il DNA al suo interno. Quando avviene un errore nella replicazione, le risultanti basi sbagliate non riescono a stabilire il corretto legame idrogeno. Questo provoca lo spostamento del filamento neosintetizzato dal sito attivo in cui è catalizzata la polimerizzazione in un secondo sito in cui si compie l’attività esonucleasica. Dato che la DNA polimerasi può aggiungere nucleotidi solo a un filamento nucleotidico già esistente, come inizia la replicazione del DNA? Una volta accertati che: 1. I frammenti di Okazaki hanno all’estremità 5’ dei corti tratti di RNA, lunghi dai 3 ai 10 nucleotidi 2. La DNA polimerasi può catalizzare l’aggiunta di nucleotidi all’estremità 3’ sia di un filamento di DNA, sia di un filamento di RNA 3. Le cellule contengono un enzima detto primasi, che sintetizza i frammenti di RNA lunghi circa 10 basi usando come stampo il DNA 4. A differenza della DNA polimerasi, che può aggiungere i nucleotidi solo all’estremità di un filamento preesistente, la primasi può iniziare la sintesi dell’RNA dal nulla, semplicemente legando insieme due nucleotidi. La sintesi del DNA inizia con la formazione di corti primer (inneschi) di RNA. I primer sono sintetizzati dalla primasi, che usa come stampo una molecola di DNA a singolo filamento per guidare la sintesi di un tratto complementare di RNA. La primasi è una RNA polimerasi coinvolto solamente nel processo di replicazione del DNA. La primasi eucariotica, a differenza di quella procariotica che rimane relativamente inattiva se non è accompagnata da altre sei proteine con cui forma il complesso detto primosoma, è strettamente legata alla DNA polimerasi α, la principale DNA polimerasi coinvolta nella fase di inizio della replicazione. Dopo che si è formato un primer di RNA, la sintesi del DNA può procedere e la DNA polimerasi III può aggiungere, uno dopo l’altro, i desossinucleotidi all’estremità 3’del primer. Per il filamento anticipato è necessario un unico primer di RNA al momento della formazione di una forcella di replicazione, la DNA polimerasi può quindi aggiungere i nucleotidi alla catena in modo continuo in direzione 5’→3’. Il filamento ritardato, al contrario, è sintetizzato come una serie di frammenti di Okazaki discontinui, ciascuno dei quali deve essere iniziato a partire da un diverso primer di RNA. A partire da ciascun primer, la DNA polimerasi III aggiunge desossinucleotidi fino a che il frammento che è sintetizzato non raggiunge il frammento di Okazaki adiacente. A questo punto il primer di RNA, che non ha più alcuna funzione, è rimosso e rimpiazzato da desossinucleotidi. Contemporaneamente per riempire l’intervallo che si è creato, la DNA polimerasi I sintetizza il DNA nella normale direzione 5’→3’. I frammenti adiacenti sono poi uniti tra loro dalla DNA ligasi. Perché non sono stati usati direttamente dei primer di DNA? L’uso del RNA e non del DNA per iniziare la sintesi del DNA, garantisce che l’inserimento di basi scorrette durante la fase di inizio sia confinato in sequenze di RNA destinate a essere successivamente rimosse dalla DNA polimerasi I. Quindi anche in questo caso la risposta sembra essere connessa con la possibilità di correggere gli errori. Durante la replicazione del DNA i due filamenti della doppia elica devono essere separati a livello di ciascuna forcella di replicazione, in modo da esporre i singoli filamenti agli enzimi che gli devono coprire. Il processo di denaturazione è facilitato da tre classi di proteine: DNA elicasi: proteine direttamente responsabili della denaturazione del DNA. Le elicasi, utilizzando l’energia ricavata dall’idrolisi dell’ATP, denaturano il DNA dinanzi alla forcella di replicazione rompendo i legami idrogeno durante il loro avanzamento (in E. coli, la principale, che fa parte del primosoma, funziona in direzione 5’→3’ lungo lo stampo per il filamento ritardato). Proteine leganti il singolo filamento (SSBP): una volta cominciata la replicazione del DNA, ai singoli filamenti esposti si attaccano rapidamente queste proteine che hanno il ruolo di tenere svolto il DNA in modo che sia accessibile al Espressione genica Pagina 5 si attaccano rapidamente queste proteine che hanno il ruolo di tenere svolto il DNA in modo che sia accessibile al macchinario della replicazione. Quando un determinato tratto di DNA è stato replicato, le SSBP si staccano, sono riciclate e vanno ad attaccarsi al successivo segmento a singolo filamento. Schermano i possibili legami idrogeno che le basi vorrebbero formare, poiché l’elica spontaneamente si richiuderebbe Topoisomerasi: intervengono nel superavvolgimento e ingarbugliamento della molecola del DNA, in quanto la forza di torsione dopo un po' impedisce la divaricazione dei doppi filamenti. Questi enzimi creano dei punti di rotazione nella molecola di DNA, introducendo e risaldando rapidamente nelle rotture a singolo o a doppio filamento nel DNA. Allentano e rilassano la tensione imposta dall’avanzare della forcella di replicazione. Come abbiamo detto nelle molecole di DNA lineare, la DNA polimerasi può aggiungere nucleotidi solamente all’estremità 3’-OH di un filamento preesistente. Quando un filamento ritardato, allungandosi, raggiunge l’estremità della molecola di DNA e una attività esonucleasica 5’→3’ rimuove l’ultimo primer di RNA, quest’ultimo intervallo non può essere colmato, non esistendo un’estremità 3’-OH a cui la polimerasi possa aggiungere desossinucleotidi. Di conseguenza, le molecole di DNA lineare, a ogni replicazione, rischiamo di generare molecole figlie sempre più corte. Negli eucarioti, il problema della replicazione è risolto ponendo delle sequenze altamente ripetute, dette telomeri, alle estremità di ciascun cromosoma lineare. Questi speciali elementi telomerici consistono in corte sequenze ripetute arricchite della base G, che si trovano sul filamento 5’→3’. La sequenza TTAGGG, situata alle estremità dei cromosomi umani, è un esempio di sequenza telomerica (TEL). Queste sequenze non codificanti alle estremità dei cromosomi garantiscono che, anche se la molecola di DNA si accorcia un po' durante la sua replicazione, non si perdono importanti informazioni genetiche. Una DNA polimerasi speciale, la telomerasi, inoltre, catalizza la formazione di copie addizionali della sequenza telomerica, compensando così il graduale accorciamento che si verifica alle due estremità del cromosoma durante la replicazione del DNA. La telomerasi è un enzima insolito perché è una proteina che contiene anche RNA. In molti eucarioti l’estremità 3’ del DNA può ripiegarsi all’indietro e appaiarsi con il filamento di DNA opposto, creando un’ansa chiusa che sembra proteggere l’estremità telomerica. Negli organismi multicellulari, la telomerasi è attiva quasi esclusivamente nelle cellule germinali, da cui si originano gli oociti e gli spermatozoi, e in pochi altri tipi di cellule in attiva proliferazione. La presenza della telomerasi consente alle cellule germinali di dividersi indefinitamente senza che i telomeri si accorcino. Nella maggior parte delle cellule tuttavia la telomerasi è inattiva. Se la cellula va incontro a un numero sufficiente di divisioni, nelle cellule della discendenza i telomeri rischiano di sparire completamente, mentre Il DNA codificante rischia di essere eroso. Questo pericolo potenziale è rilevato da una via di distruzione cellulare, che viene messa in modo dall’accorciamento dei telomeri del DNA, conosciuta come apoptosi. (L’analisi di un grande numero di campioni di cellule umane, comprendente più di 100 diverse cellule tumorali, ha dimostrato che l’attività telomerasica è presente in quasi tutte le cellule tumorali e non nelle cellule derivate da tessuti normali). Espressione genica Pagina 6 Il DNA è il depositario dell’informazione genetica. L’informazione genetica controlla la sequenza degli amminoacidi nelle pro teine, ma il DNA non è lo stampo diretto per questa sintesi. Esiste una seconda molecola, l’RNA che copia l’informazione genetica, la trasferisce e dirige la sintesi delle proteine. Le caratteristiche del RNA sono: Lo zucchero è il RIBOSIO L’URACILE sostituisce la TIMINA La maggior parte è a SINGOLO FILAMENTO L’RNA si può ripiegare in strutture specifiche. Appaiamenti convenzionali e “non convenzionali” di basi permettono ad una mol ecola di RNA di ripiegarsi in una struttura tridimensionale che è determinata dalla sua sequenza nucleotidica. Possono esservi dei punti con regioni di complementarietà (A con U e G con C), in cui formano doppi filamenti con andamento antiparallelo, mentre altre regioni rimang ono a singolo filamento. Il contenuto di DNA all’interno della cellula è sempre il medesimo, mentre le cellule possono contenere una quantità variabil e di RNA in relazione anche alle dimensioni. L'RNA totale è formato da diversi tipi di molecole di RNA, ognuno con una funzione particolare. mRNA RNA messaggeri, codificano per proteine rRNA RNA ribosomali, formano la struttura base dei ribosomi e catalizzano la sintesi proteica tRNA RNA transfer, centrali nella sintesi proteica come adattatori fra mRNA e amminoacidi snRNA Piccoli RNA nucleari, agiscono in una varietà di processi nucleari, compreso lo splicing dei pre-mRNA snoRNA Piccoli RNA nucleolari, usati per processare e modificare chimicamente gli rRNA Altri RNA non codificanti Agiscono in diversi processi cellulari, compresi sintesi dei telomeri, inattivazione del cromosoma X e trasporto di proteine nel RE Gli RNA messaggeri raramente superano il 4% del totale (la maggior parte dell’RNA ha funzione strutturale o catalitica), ma s ono una componente caratteristica, chiamata trascrittoma, che viene continuamente rinnovata attraverso il cambiamento del profilo di trascrizion e del genoma. Gli mRNA hanno infatti una vita breve e vengono degradati poco tempo dopo la sintesi. Gli mRNA batterici hanno un'emivita di non più di pochi minuti e negli eucarioti la maggior parte degli mRNA viene degradata poche ore dopo la sintesi. Procarioti: Il DNA è circolare si trova sostanzialmente nel citoplasma. La trascrizione e la traduzione avvengono praticament e in maniera contemporanea. Nel momento stesso in cui la RNA polimerasi produce il filamento, da subito mRNA viene contattato dal ribosoma e inizia immediatamente la sintesi proteica. Eucarioti: La trascrizione di tutti gli RNA avviene nel nucleo, ma prima di raggiungere il citoplasma, devono subire una seri e di processi detti “processi di maturazioni del RNA”. Quindi, a differenza dei procarioti, trascrizione e traduzione avvengono in scomparti dive rsi della cellula e in momenti differenti. TRASCRIZIONE = SINTESI DI RNA Quali sono gli RNA importanti nella sintesi proteica? mRNA (RNA messaggero): singolo filamento non avvolto, contiene le informazioni per la sintesi di una proteina. Esso trasporta un messaggio genetico dal DNA al ribosoma ed è l’unico RNA ad essere tradotto in proteina. Determina la sequenza amminoacidica dei polipep tidi. tRNA (RNA transfer): singolo filamento che si ripiega su se stesso per assumere una struttura tridimensionale specifica. I tR NA fungono da intermediari, o meglio traduttori, in grado di tradurre la sequenza di basi dell’mRNA e trasportare l’appropriato amminoacido al ribosoma. I tRNA legano esclusivamente uno specifico amminoacido. Quindi, si lega agli amminoacidi e li porta alle posizioni corrette nella c atena polipeptidica in fase di sintesi. rRNA (RNA ribosomale): forma globulare. Componente essenziale dei ribosomi che servono come sito della sintesi proteica. È la forma più stabile di RNA e costituisce il 70-80% del RNA totale. miRNA (microRNA): regolano l’espressione genica nelle cellule eucariotiche. Definizione molecolare di GENE: Un gene è l’intera sequenza (successione di nucleotidi) che è necessaria per la sintesi di un a proteina. Le regioni del DNA che codificano per molecole di RNA (tRNA e rRNA) sono considerati geni. Negli eucarioti, i geni sono disposti fra zon e di DNA non funzionale che non codificano per proteine. I geni stessi possono contenere al loro interno regioni di DNA non codificante (i ntroni). TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI A monte (upstream): verso sx, prima A valle (downstream): verso dx, dopo RNA pol: RNA polimerasi RNA e trascrizione nei procarioti Espressione genica Pagina 7 Un fattore di trascrizione generale (chiamato anche fattore di trascrizione basale) è una proteina che è sempre richiesta perché l'RNA polimerasi possa legarsi al promotore e iniziare la sintesi dell'RNA. Gli eucarioti hanno molti di questi fattori di trascrizione: il loro nome normalmente inizia con: TF (per Transcription Factory), al quale segue un numero romano, che indentifica la polimerasi che aiutano, e infine una lettera maiuscola che identifica il particolare fattore. Si forma così un vero e proprio complesso di inizio della trascrizione (sequenza del promotore, TFIID e RNA polimerasi II). Per un elevato livello di trascrizione, sono necessari anche altri fattori, detti attivatori. Gli attivatori sono proteine che si legano a sequenze nucleotidiche dette enchancer (intensificatori). Esistono anche sequenze nucleotidiche che reprimono la trascrizione, dette silencer. In seguito all'inizio della trascrizione, la RNA polimerasi si muove lungo il DNA sintetizzando una copia di RNA complementare al filamento stampo del DNA. Se la RNA pol incontra un'area di DNA danneggiata, essa può temporaneamente arrestarsi, mentre il danno viene corretto da proteine che effettuano la riparazione per escissione del DNA. La terminazione della trascrizione è governata da una varietà di segnali diversi a seconda del tipo di RNA polimerasi. RNA pol I: un fattore proteico riconosce, sulla catena di RNA nascente, un segnale di terminazione di 18 nucleotidi. RNA pol III: i segnali spesso includono una corta sequenza di U e non sono richiesti fattori proteici ausiliari. In queste due RNA polimerasi (I e III) non sembrano essere coinvolte le strutture a forcina. RNA pol II: quasi tutti i trascritti destinati a diventare mRNA vengono tagliati in siti specifici prima che la trascrizione sia terminata. Il sito di taglio è posto, nella molecola di RNA in sintesi, 10-35 nucleotidi a valle di una sequenza AAUAAA. Il sito di taglio è anche il sito usato per l'aggiunta della coda di poli(A), una sequenza di adenine presente all'estremità 3' di quasi tutti gli mRNA eucarioti. Una molecola di RNA appena prodotta dalla trascrizione, chiamata trascritto primario, spesso deve andare incontro a cambiamenti chimici prima che possa svolgere la sua funzione nella cellula. Si utilizza il termine di maturazione dell'RNA per definire tutte le modificazioni chimiche necessarie per produrre un RNA funzionale dal trascritto primario, che funziona da suo precursore. Maturazione dell'RNA ribosomale L'RNA ribosomale è la forma più abbondante e stabile di RNA presente nelle cellule. Di norma, rappresenta circa il 70-80% dell'RNA cellulare totale, il tRNA costituisce circa il 10-20% e l'mRNA rappresenta meno del 10%. Espressione genica Pagina 10 Dei quattro tipi di rRNA presenti nei ribosomi degli eucarioti, i tre più grossi (28S, 18S e 5.8S) sono codificati da una singola unità di trascrizione, sintetizzata nel nucleolo dall'RNA pol I come un unico trascritto primario chiamato pre-rRNA. La presenza di tre differenti geni per gli rRNA all'interno di una singola unità di trascrizione assicura che la cellula produca questi tre rRNA in uguale quantità. Molti genomi eucarioti posseggono copie multiple di unità di trascrizione per il pre-rRNA, organizzate in uno o più blocchi di ripetizioni in tandem, che facilitano la produzione di grandi quantità di rRNA tipicamente richieste dalle cellule. Spaziatori non trascritti separano, all'interno di ciascun blocco di ripetizioni in tandem, le singole unità di trascrizione. Dopo che l'unità di trascrizione per il pre-rRNA è stata trascritta dalla RNA pol I, la risultante molecola di pre-rRNA subisce un processo di maturazione che coinvolge numerose reazioni di taglio, per rimuovere gli spaziatori trascritti e rilasciare gli rRNA maturi. Il pre- rRNA viene anche maturato mediante aggiunta di gruppi metilici. Il processo di metilazione, così come il taglio del pre-rRNA, è guidato da un particolare gruppo di molecole di RNA chiamate snoRNA (piccoli RNA nucleolari). Il pre-rRNA è più lungo delle tre molecole di rRNA da questo ricavate. La maturazione del pre- rRNA nel nucleolo è accompagnata dall'assemblaggio dell'RNA con le proteine a formare le subunità ribosomali. Il gene per l'rRNA 5S costituisce un'unità di trascrizione separata, trascritta dalla RNA pol III. La maturazione dell'RNA di trasferimento richiede: - La rimozione della sequenza leader all'estremità 5' del pre-tRNA - La sostituzione di due nucleotidi al 3' con la sequenza CCA (con la quale terminano tutte le molecole di tRNA mature). - La modificazione chimica di alcune basi. Circa il 10-15% dei nucleotidi viene chimicamente modificato. Le principali modificazioni includono la metilazione di basi e zuccheri, nonché la formazione di basi insolite quali diidrouracile, ribotimina, pseudouridina e inosina. (- La maturazione del tRNA per la tirosina di lievito è caratterizzata anche dalla eliminazione di un introne. Tuttavia, i trascritti della maggior parte dei tRNA non richiedono questo tipo di escissione). Il meccanismo di taglio-riunione coinvolge due enzimi distinti, una RNA endonucleasi e una RNA ligasi. Maturazione degli RNA messaggeri La maggior parte degli mRNA procarioti è sintetizzata in una forma che è pronta per la traduzione, ancora prima che la trascrizione della molecola sia stata completata. Al contrario, negli eucarioti la trascrizione e la traduzione sono separate sia nello spazio sia nel tempo: la prima avviene nel nucleo, mentre la seconda avviene principalmente nel citoplasma. L'eterogeneità di dimensione (i trascritti primari sono spesso molto lunghi) è alla base del termine RNA eterogeneo nucleare (hnRNA), che è utilizzato per identificare tutto l'RNA oltre a quello ribosomale e a quello di trasferimento presente nei nuclei eucarioti. L'hnRNA è costituito da una miscela di molecole di mRNA e dei loro precursori, i pre-mRNA. La maggior parte degli mRNA mostra modificazioni caratteristiche a entrambe le estremità. All'estremità 5', queste molecole posseggono un nucleotide modificato, chiamato cappuccio (cap) al 5', mentre all'estremità 3' esse normalmente posseggono un lungo blocco di ribonucleotidi adenina noto come coda poli(A). Espressione genica Pagina 11 Un cappuccio al 5' è costituito da un nucleotide guanosina che è stato metilato nella posizione 7 dell'anello purinico e che è posto in orientamento opposto rispetto agli altri nucleotidi, in quanto il legame che lo unisce all'estremità 5' della molecola di RNA è un legame 5'→5', invece del normale legame 3'→5'. Anche gli zuccheri dei due nucleotidi successivi possono essere metilati. Il cappuccio contribuisce alla stabilità dell'RNA, proteggendo la molecola dalla degradazione da parte delle nucleasi che agiscono al 5' delle molecole di RNA. Inoltre, svolge un ruolo importante nel posizionamento dell'mRNA sul ribosoma per l'inizio della traduzione e la sua uscita dal nucleo. All'estremità 3' della maggior parte delle molecole di mRNA eucariote è presente una coda di poli(A), lunga da 50 a 250 nucleotidi. Uno speciale segnale, costituito da una sequenza AAUAAA localizzata poco a monte di questo sito e da un elemento ricco in GC e/o in U a valle dello stesso sito, indica dove il poli(A) dev'essere aggiunto. Questo segnale determina il taglio del trascritto primario 10-35 nucleotidi a valle della sequenza AAUAAA e la poli(A) polimerasi catalizza la formazione della coda di poli(A). La sua funzione è quella di proteggere l'mRNA dall'attacco da parte di nucleasi e quindi, come risultato, la lunghezza del poli(A) influenza la stabilità dei messaggeri ( più lunga è la coda, maggiore è la è la vita media dell'mRNA nel citoplasma). Inoltre, il poli(A) è riconosciuto da specifiche proteine coinvolte nell'esportazione dell'mRNA dal nucleo al citoplasma, e può inoltre aiutare il riconoscimento dell'mRNA, come molecola che dev'essere tradotta, da parte dei ribosomi. Nelle cellule eucariote, i precursori della maggior parte dei mRNA (e di alcuni rRNA e tRNA) contengono introni cioè sequenze presenti nel trascritto primario che non appaiono nell'RNA maturo e funzionale. Questa fu una grande scoperta nell'ambito biologico che porto l'assegnazione del premio Nobel per la medicina a Sharp e Roberts, nel 1993. Quindi, le sequenze di DNA codificanti per un tipico mRNA eucariota non sono continue le une con le altre, ma son invece separate da sequenze interposte che non compaiono nell'mRNA finale. Le sequenze interposte che distruggono la continuità lineare delle regioni di un gene che codificano il messaggio sono gli introni (sequenze interposte) e le sequenze destinate a comparire nell'mRNA finale sono chiamate esoni (poiché sono espresse). Gli introni sono presenti nella maggior parte dei geni codificanti per le proteine, benché la grandezza e il numero di introni possono variare considerevolmente. Per produrre una molecola funzionale di mRNA da un pre-mRNA che contiene gli introni, gli eucarioti devono in qualche modo rimuovere gli introni e riunire (splice) i rimanenti segmenti di RNA (esoni). L'intero processo di rimozione degli introni e riunione degli esoni è chiamato splicing dell'RNA. L'importanza dello splicing dell'RNA per la salute dell'uomo è stata meglio compresa quando si è scoperto che circa il 15% delle malattie ereditarie umane sono dovute a errori di splicing nel pre-mRNA. Lo splicing dell'RNA dev'essere molto preciso, poiché l'errore di un singolo nucleotide cambierebbe la cornice di lettura dell'mRNA, rendendolo inutilizzabile. L'analisi delle sequenze di centinaia di introni diversi ha evidenziato che un tipico introne comincia al 5' con la sequenza GU e termina al 3' con la sequenza AG. La sequenza di basi della restante parte dell'introne sembra essere fondamentalmente irrilevante per il processo di splicing. Un'eccezione è rappresentata da una particolare sequenza localizzata parecchie decine di nucleotidi a monte del terminale 3' dell'introne e chiamata punto di ramificazione. La rimozione degli introni è catalizzata da spliceosomi, che sono grandi complessi molecolari che consistono di cinque tipi di RNA combinati con oltre 200 proteine. Gli spliceosomi si assemblano su molecole di pre-mRNA mentre questo è ancora in fase di sintesi, indicando che la rimozione degli introni può iniziare prima ancora che la trascrizione del pre-mRNA sia completata. Gli spliceosomi sono assemblati sul pre-mRNA formando un gruppo di complessi RNA-proteine più piccoli chiamati snRNP (small nuclear ribonucleoproteins) e proteine aggiuntive. Ciascun snRNP contiene una o due piccole molecole di un tipo speciale di RNA chiamato snRNA (small nuclear RNA). Il primo passo del processo è il legame di un snRNP chiamato U1, il cui RNA contiene una sequenza nucleotidica che gli permette di appaiarsi al sito di splicing 5'. Un secondo snRNP, chiamato U2, si lega quindi alla sequenza corrispondente al punto di ramificazione. Infine, un altro gruppo di snRNP (U4/U6 e U5) riunisce i due terminali dell'introne, formando uno spliceosoma maturo, un grande complesso paragonabile alla massa di un ribosoma. A questo stadio, il pre-mRNA è tagliato al sito di splicing al 5' e l'estremità 5' dell'introne appena rilasciata è unita covalentemente al residuo di adenina localizzato nella sequenza di ramificazione, creando una struttura a Espressione genica Pagina 12 La traduzione è la lettura di un mRNA per l'assemblaggio degli amminoacidi in un polipeptide. Nei procarioti la traduzione avviene ovunque nella cellula, mentre negli eucarioti avviene prevalentemente nel citoplasma. Nel caso dei procarioti, l'mRNA prodotto mediante la trascrizione è immediatamente disponibile per la traduzione. Negli eucarioti, invece, l'mRNA prodotto mediante splicing a partire dal pre-mRNA esce prima dal nucleo e poi viene tradotto nel citoplasma. La sequenza degli aa nella catena polipeptidica è determinata dalla sequenza dei codoni nell'mRNA, mentre il ribosoma agisce semplicemente agevolando il processo di traduzione. L'mRNA è tradotto dall'estremità 5' all'estremità 3', e la catena polipeptidica è assemblata dall'estremità N-terminale a quella C-terminale. Gli RNA transfer (tRNA) portano gli aa al ribosoma affinché questi possano essere aggiunti alla catena polipeptidica. I tRNA sono piccoli RNA che presentano una struttura che gli distingue inequivocabilmente. Tutti i tRNA possono avvolgersi in 4 segmenti a doppia elica, formando una struttura bidimensionale nota come struttura a trifoglio. All'estremità di uno dei segmenti a doppia elica è presente l'anticodone, cioè il segmento di tre nt che si appaia con un codone nell'mRNA. In posizione diametralmente opposta all'anticodone, all'altra estremità del trifoglio, è presente un segmento a doppia elica che lega l'aa corrispondente all'anticodone. In termini tridimensionali la struttura a trifoglio del tRNA si ripiega in una struttura a forma di L. L'anticodone e il segmento che lega l'aa sono localizzati alle estremità opposte della L. 61 dei 64 codoni del codice genetico indicano un aa. Ci si può quindi domandare se esistono 61 diversi tRNA che legano i codoni senso, e la risposta è no. L'ipotesi del vacillamento di Francis Crick che il completo seti di 61 codoni senso può essere letto da meno di 61 distinti tRNA grazie alle particolari proprietà di appaiamento delle basi degli anticodoni. Cioè, l'appaiamento dell'anticodone con i primi 2 nt del codone è sempre preciso, ma l'anticodone ha maggiore flessibilità di appaiamento con il terzo nt del codone. In molti casi lo stesso anticodone di tRNA può leggere codoni che hanno una U o una C nella terza posizione (per esempio, UUU e UUC codificano entrambi per la fenilalanina, un singolo tRNA è in grado di riconoscere i codoni UUU e UUC, in quanto entrambi codificano per lo stesso aa). In modo simile, lo stesso anticodone del tRNA può leggere 2 codoni che hanno A o G nella terza posizione. La base non usuale inosina (I), molto rara in altre molecole di RNA, è al contrario molto frequente nella posizione di vacillamento degli anticodoni del tRNA. L'inosina è la base più vacillante di tutte quelle che occupano la terza posizione dell'anticodone in quanto può appaiare con U, C o A. Il processo di aggiunta di un aa su un tRNA è chiamato aminoacilazione o caricamento (in quanto questo processo aggiunge energia libera nel momento in cui il complesso aminoacido-tRNA viene formato). Il prodotto finito del caricamento è un tRNA legato al suo corretto aa ed è chiamato aminoacil-tRNA. Esistono 20 enzimi differenti chiamati aminoacil-tRNA sintetasi che catalizzano la aminoacilazione (una per ogni aa). Prima che una molecola di tRNA possa portare il suo appropriato aa al ribosoma, l'aa deve essere legato covalentemente al tRNA. Gli enzimi responsabili del legame degli aa alle corrispondenti molecole di tRNA sono chiamati amminoacil-tRNA sintetasi. Quando per un determinato aa esiste più di un tRNA, la stessa amminoacil-tRNA sintetasi li riconosce tutti. Le amminoacil-tRNA sintetasi catalizzano l'unione di un aa al corrispondente tRNA mediante la formazione del legame esterico, accompagnata dall'idrolisi di ATP ad AMP e pirofosfato. Il processo di ammiloacilazione di un tRNA è quindi definito anche attivazione dell'aa, poiché non solo lega l'aa al corrispondente tRNA, ma lo attiva per la successiva formazione del legame peptidico. Traduzione Espressione genica Pagina 15 I ribosomi sono particelle ribonucleoproteiche che conducono la sintesi delle proteine traducendo l'mRNA in catene di aa. Il ribosoma legge i codoni in una molecola di mRNA e unisce gli aa corrispondenti formando una catena polipeptidica. Negli eucarioti, i ribosomi agiscono nel citoplasma sia liberi, in sospensione nella soluzione citoplasmatica, che attaccati alle membrane del reticolo endoplasmatico (RE), il sistema di tubuli o cisterne appiattite presente nel citoplasma. Un ribosoma completo è costituito da due parti di dimensioni diverse, chiamate unità ribosomali minore e maggiore. Ogni subunità è il risultato della combinazione di RNA ribosomale (rRNA) e proteine ribosomali. Nella traduzione, l'mRNA si vuole lungo una scanalatura del ribosoma, il quale ha anche siti di legame dove i tRNA possono interagire con l'mRNA. Nel sito A (sito aminoacilico) l'aminoacil-tRNA in entrata, che porta il successivo aa da aggiungere alla catena polipeptidica, si lega all'mRNA. Nel sito P (sito peptidilico) si trova legato il tRNA che porta la catena polipeptidica in crescita. Nel sito E (sito di uscita) si trova legato il tRNA in uscita prima che esso venga rilasciato dal ribosoma. La traduzione avviene in modo simile nei procarioti e negli eucarioti: Si distinguono 3 fasi principali: 1) Durante la fase di inizio, i componenti della traduzione si assemblano sul codone di inizio dell'mRNA 2) Nell'allungamento, il complesso assemblatosi legge la fila di codoni dell'mRNA uno alla volta mentre unisce gli aa indicati nella catena polipeptidica 3) La terminazione completa il processo della traduzione, con questa fase, dopo che l'ultimo aa indicato dall'mRNA è stato aggiunto alla catena polipeptidica, il complesso si disassembla. Ognuna delle tre fasi utilizza l'energia derivata dall'idrolisi del GTP in GDP + Pi. pirofosfato. Il processo di ammiloacilazione di un tRNA è quindi definito anche attivazione dell'aa, poiché non solo lega l'aa al corrispondente tRNA, ma lo attiva per la successiva formazione del legame peptidico. Espressione genica Pagina 16 Fase di inizio: I fattori di inizio (IF) facilitano l'inizio della traduzione e vengono rilasciati quando la fase di inizio è completata. Nella traduzione viene utilizzato come tRNA iniziatore uno specifico tRNA caricato con la metionina. Il tRNA iniziatore Met-tRNA ha un codone 3'-UAC-5' complementare al codone di inizio AUG. Il Met-tRNA legato ad una molecola di GTP si unisce a formare un complesso con la subunità ribosomale minore. Il complesso formato dal Met-tRNA + GTP e dalla subunità minore ribosomale si lega al 5' della molecola di mRNA e si muove lungo la molecola (processo definito scansione) fino a quando raggiunge il codone AUG nel sito P. Il codone di inizio si appaia all'anticodone sul tRNA iniziatore, Met-tRNA. La fase di inizio viene completata mediante il legame della subunità maggiore e l'idrolisi del GTP. Il ribosoma è pronto per la fase successiva della traduzione. Nei batteri, l'inizio della traduzione coinvolge Met-tRNA, GTP e IF. A differenza dagli eucarioti, la subunità ribosomale minore si lega direttamente alla regione dell'mRNA contenente il codone di inizio AUG. Ciò avviene grazie a un sito di legame per il ribosoma -una breve e specifica sequenza di RNA - posizionato immediatamente a monte del codone di inizio. La subunità ribosomale maggiore andrà poi a legarsi a quella minore per completare il ribosoma. L'idrolisi del GTP rilascia gli IF. Una volta che il tRNA iniziatore si è appaiato con il codone di inizio AUG, le basi nucleotidiche dell'mRNA verranno lette, nelle successive fasi della traduzione, tre alla volta. Per questa ragione, l'appaiamento tRNA iniziatore-AUG stabilisce la corretta cornice di lettura, la serie di codoni codificati dall'mRNA per la sintesi del polipeptide. Le reazioni cruciali della traduzione avvengono durante la fase di allungamento, nella quale gli aa vengono aggiunti uno alla volta alla catena polipeptidica in crescita. Il ciclo inizia nel momento in cui il tRNA iniziatore portante la metionina si trova legato nel sito P e il sito A è vuoto. Il ciclo di allungamento viene diviso in 4 fasi: 1) L'aminoacil-tRNA complementare si lega al codone nel sito A del ribosoma. Il legame è facilitato da un fattore di allungamento (EF) che si lega all'aminoacil-tRNA e viene rilasciato dopo che il tRNA ha legato il codone. Il GTP viene idrolizzato in questa fase. 2) Si forma il legame peptidico. La reazione viene catalizzata dalla peptidil transferasi che è parte della subunità maggiore del ribosoma e taglia l'aa dal tRNA nel sito P (in questo caso la metionina) e catalizza la formazione del legame polipeptidico tra l'estremità C-terminale del polipeptide legato al tRNA nel sito P e l'aa legato al tRNA nel sito A. Dopo la formazione del legame peptidico, vi è un tRNA vuoto (senza aa) nel sito P e un tRNA legato alla catena polipeptidica crescente nel sito A. Un tRNA legato a una catena polipeptidica di due o più aa è detto peptidil-tRNA. 3) Il ribosoma trasloca, si muove di un codone lungo l'mRNA, mentre il tRNA rimane legato all'mRNA nella stessa posizione. Questa fase è facilitata sa un EF che poi viene rilasciato. Dopo la traslocazione, il tRNA che era nel sito P si trova nel sito E, il peptidil-tRNA che era nel sito A si trova nel sito P ed il sito a è vuoto. 4) Il tRNA vuoto viene rilasciato dal sito E ed il ribosoma è pronto per cominciare un nuovo ciclo di allungamento. Ad ogni ciclo, la catena polipeptidica viene trasferita dal tRNA nel sito P all'aa legato al tRNA nel sito A. Espressione genica Pagina 17