Fisiologia cellulare 3, Dispense di Fisiologia

Scarica Fisiologia cellulare 3 e più Dispense in PDF di Fisiologia solo su Docsity! Fisiologia: Fisiologia cellulare 3  26 settembre 2019  Docente: Ilaria Rvolta  Fisiologia di membrana   Potenziale di riposo (resting potential)  Tutti i fenomeni elettrici che avvengono sulla membrana sono possibili grazie al fatto  che a cavallo di essa gli ioni siano compartimentalizzati.   Lo ione sodio ad esempio è 10 volte superiore nell’ambiente extracellulare per tutte  le specie, il potassio invece è 40 volte più concentrato nell’ambiente intracellulare. Il  cloro è variabile ma tende a seguire il sodio ed è quindi più concentrato in ambiente  extracellulare. Il calcio ha 4 ordini di grandezza di differenza tra la più bassa  concentrazione, quella citosolica, e la più alta extracellulare. In particolare siamo  nell’ordine delle nmol (100 nmol) per quella intracellulare (calcio libero citosolico) ma  poichè è anche immagazzinato negli istoni raggiunge anche le μmol (500-600 μmol).  Per quella extracellulare invece siamo nell’ordine delle mmol (1.2-1.8 mmol). In  alcuni momenti e luoghi della cellula però, la concentrazione di calcio può  aumentare è un secondo messaggero. In quel caso deve arrivare alle micromoli e  localmente anche alle millimoli.   L’assone del calamaro è il modello più studiato nel raccogliere questi dati perché ha  cellule molto grandi ma ha valori un pò diversi da quelli dei mammiferi. Ad esempio  il sodio è più alto perchè il calamaro vive in mare.   Come è possibile generare il potenziale di membrana?  1. La base di questa distribuzione asimmetrica di cariche è data dalla pompa  sodio potassio.   2. Presenza di conduttanze di leakage:  MODELLO DI RIFERIMENTO: MEMBRANA PERMEABILE SOLO AL POTASSIO  Per comodità si fa inizialmente riferimento ad un modello di membrana permeabile  solo allo ione potassio, molto simile a quella delle cellule gliali. Poiché ha solo canali  ionici passivi sempre aperti lo ione si distribuisce secondo il gradiente di  concentrazione. La pompa sodio potassio tende ad accumulare ioni potassio dentro  ma con canali aperti essi escono seguendo il gradiente chimico. Ottengo quindi un  flusso di cariche positive all’esterno della cellula. Man mano che esce localmente ho  un accumulo di cariche positive che tende ad autolimitare il flusso. C’è una  componente elettrica che contrasta il gradiente chimico. Quando la forza chimica è  controbilanciata dal gradiente elettrico ho un flusso netto di potassio nullo. Il  potenziale che misuriamo sulla membrana plasmatica in corrispondenza di flusso  1  Fisiologia: Fisiologia cellulare 3  26 settembre 2019  Docente: Ilaria Rvolta  netto nullo è il potenziale di equilibrio per quello ione. Nel caso del calamaro il  potenziale di equilibrio è di -75 mV ed è dato da un valore di potassio di 400 mmol  in ambiente intracellulare e 20 mmol in ambiente extracellulare.   Equazione di Nernst  Matematicamente, oltre che empiricamente, questo procedimento si può fare per  ogni ione.   Il potenziale di equilibrio di uno ione è dato da:   Ex= (RT/zF )•ln [xe] / [xi]  R= costante dei gas, T= temperatura in kelvin, z=valenza ionica, F=costante di  Faraday, [x]= concentrazione ione che sto considerando.   → Perchè:  RT/F= 25 mV a 25 gradi.   Posso convertire ln in log in  base 10: ln [xe] / [xi] = 2.3•Log  [xe] / [xi].  Poiché z del potassio è +1,  [xe]= 20 mmol e [xi]= 400 mmol  il potenziale di equilibrio Ex è  -75 mV.   Posso applicarlo a qualsiasi ione sapendo le concentrazioni in ambiente  intracellulare ed extracellulare.  MODELLO DI RIFERIMENTO: MEMBRANA PERMEABILE AL SODIO E AL  POTASSIO  Nella realtà si dovranno aggiungere sulla membrana le conduttanze al sodio. Il sodio  entra portando cariche positive dentro la cellula. L’equilibrio che si era stabilito per il  potassio si altera quindi ricomincia a fluire. Il sodio tende raggiungere un suo  equilibrio e così anche il potassio. Il potenziale della membrana sarà dato da un  contributo dovuto alla conduttanza al sodio e uno alla conduttanza al potassio.  Devo raggiungere flusso netto nullo per entrambi. Il valore del potenziale di riposo di  membrana però non è la media tra +55 mV (sodio ) e -75 mV (potassio). La  membrana è più permeabile al potassio quindi il valore tende all’ equilibrio del  potassio, è quindi negativo. Ci sono molto più canali per il potassio che di sodio o  cloro (per quest’ultimo con l’eccezione delle cellule muscolari scheletriche). Quindi Quindi la genesi  2  Fisiologia: Fisiologia cellulare 3  26 settembre 2019  Docente: Ilaria Rvolta                      Il fatto che il cloro sia un anione ci permette di invertire le concentrazione dello  stesso a numeratore e denominatore per eliminare il meno.   L’equazione vale solo se la membrana non è perturbata cioè solo quando il  potenziale è costante (condizione di riposo). Quando non lo è il potenziale varia e  non si può rappresentare la cinetica con l’equazione di Goldman. Serve un modello  più complesso affiancato da circuito equivalente.   Modello del circuito equivalente  Il doppio strato fosfolipidico è assimilabile ad  condensatore. In mezzo vi è il dielettrico che  corrispondono alle code dei fosfolipidi, mentre le teste  corrispondono alle armature.   Con questo modello di tiene conto non solo dei canali di  leakage ma anche dei canali ionici regolati, quelli che  normalmente sono chiusi. Siccome si ipotizza che queste  permeabilità all’inizio siano chiuse non vengono  rappresentate come conduttanze ma come resistenze (la  resistenza è l’inverso della conduttanza). Nel momento in  cui arriva lo stimolo la resistenza della membrana scende  perchè il canale aperto è una via di permeazione per gli  ioni. I gradienti che ci sono per i vari ioni sono rappresentati come la driving force  (pila) che genera il movimento. Questo modello è utilizzato per interpretare  variazioni del potenziale di riposo ovvero il potenziale d’azione. Si ipotizza una  corrente che entra e che si distribuisce alle vie con minor resistenza.   5  Fisiologia: Fisiologia cellulare 3  26 settembre 2019  Docente: Ilaria Rvolta  La conduttanza della membrana è infine la somma della conduttanza, così  calcolata, del sodio a quella del potassio a quella del cloro. Ma per ciascuno ione, la  conduttanza è data dal numero di canali che ho per la conduttanza del singolo  canale.   Registrazione di segnali elettrici  Direzione della corrente  E’ definita secondo i movimento delle cariche positive. Ad esempio in una cellula il  sodio tende ad entrare quindi si avrà una corrente entrante. Il potassio che esce  invece determina una corrente uscente. Il cloro che entra ma che è negativo invece  determina una corrente uscente.   Depolarizzazione e iperpolarizzazione  La depolarizzazione o corrente depolarizzante è la riduzione nella separazione delle  cariche. Se nella cellula ho un ambiente negativo, qualsiasi corrente che riduce la  distribuzione delle cariche è un evento depolarizzante, riduce il valore assoluto del  potenziale di membrana che diventa quindi meno negativo. Corrisponde ad una  corrente entrante come, ad esempio, quella determinata dal sodio che entra o dal  cloro che esce.   L’iperpolarizzazione o corrente iperpolarizzate, come ad esempio quella generata  dal potassio (ione positivo che lascia la cellula), invece è un aumento della  separazione delle cariche che determina un potenziale d’azione più negativo.  A livello di ​organismo​ è possibile rilevare, ma anche inviare segnali elettrici  posizionando degli elettrodi sulla superficie corporea.  A livello di ​tessuto ​invece è possibile:  - effettuare un elettrocardiogramma intracardiaco→ si utilizzano dei cateteri  per entrare all’interno del cuore e si stimolano particolari regioni, ad esempio  per valutare aritmie prima dell’installazione di un defibrillatore. Si tratta di un  esame invasivo.  - camera di Ussing→ dispositivo utilizzato per analisi in vitro fatto da due  ambienti separati. Nel caso dell’intestino ad esempio vi si pone in mezzo il  tessuto e si studia il movimento degli ioni.   - registrazioni da fettine di cervello→ in vitro, con modelli animali.  La bontà di queste tecniche sta nel fatto che permettono il mantenimento dei circuiti  tra le cellule, cosa che non avviene quando si studia la singola cellula. Le  6  Fisiologia: Fisiologia cellulare 3  26 settembre 2019  Docente: Ilaria Rvolta  informazioni sono quindi più dettagliate rispetto a quelle che si ottengono  utilizzando la superficie corporea.   Per studiare invece i segnali elettrici sulla singola ​cellula​ si usa la ​tecnica patch  clamp​: tutto parte da un pezzo di membrana (patch) e si clampa (clamp). E’ stata  ottimizzata da nel 1976 da due studiosi tedeschi, Erwin Neher e Bert Sakmann, che  sono stati premiati nel 1978 con il premio Nobel.   Permette di effettuare due processi:  - Voltage clamp mode→ si stimola la cellula con una differenza di voltaggio  costante e si misurano le correnti in risposta alla differenza di potenziale  secondo la legge di Ohm (V=I•R). La membrana infatti ha una sua resistenza.  - Current clamp mode→ si stimola la membrana con una corrente e si rileva il  voltaggio.   Setup da patch clamp:   - amplificatore che permette  di imporre il voltaggio alla cellula.   - convertitore analogico  digitale che permette di convertire  il segnale digitale del computer in  segnale analogico, l’unico  compreso dalla cellula.  - software del computer.  - una gabbia di Faraday che  permette di isolare elettricamente.  - microscopio, per osservare.   - micromanipolatore sul microscopio che permette di avvicinarsi alla cellula.  - tavolo antivibrante, per isolare della vibrazioni.   Si può perfondere le cellule o con una soluzione fisiologica, che mima l'ambiente in  cui generalmente si trovano oppure un farmaco e vedere che effetti ha. Il 70% dei  farmaci infatti ha effetto sui canali ionici. C’è anche una pompa che aspira per  mantenere un livello di di perfusione costante.   Esperimento di voltage clamp  1. Dal PC si impone un voltaggio e il segnale passa al convertitore analogico  digitale.  2. Il segnale è ricevuto dall'amplificatore che converte il segnale per la cellula.  7  Fisiologia: Fisiologia cellulare 3  26 settembre 2019  Docente: Ilaria Rvolta  cellula e, se vedo che il canale si apre, si può segnare sul grafico di relazione  corrente-voltaggio, l’ampiezza.   Dove l’ampiezza è più alta significa che ho  imposto un voltaggio più alto in quanto la  driving force è maggiore e di conseguenza  anche la quantità di corrente che passa per il  canale. Costruito il grafico, la pendenza della  retta corrisponde alla conduttanza di singolo  canale γ. Ogni canale ha la sua conduttanza.   Se il canale non è voltaggio dipende ma  ligando dipendente si può costruire il grafico  ma invece di imporre stimoli di perfusione si imporrà uno stimolo chimico ovvero il  ligando per cui il canale si apre. In assenza del ligando il canale è generalmente  chiuso anche se talvolta potrebbe aprirsi, perfondendo invece la probabilità di  apertura aumenta enormemente. La relazione non sarà corrente-voltaggio ma  corrente-concentrazione del ligando.  I canali, come le pompe possono essere bloccati da molecole specifiche. possono  ostruire fisicamente il posso o mantenere il canale nello stato chiuso. Il canale del  sodio ad esempio è bloccato da un farmaco: amiloride. In una condizione fisiologica  è un canale entrante, perfondendola si blocca.   Una volta che si sono raccolte abbastanza informazioni sul canale, si può valutare la  conduttanza della membrana per quella specie ionica. La variazione di conduttanza  ionica a cavallo della membrana è riconducibile alla variazione del numero di canali  che si trovano nello stato aperto.  g =γ•N₀  Questo è dato dal numero dei canali presenti nel patch per la probabilità (p₀) di ogni  canale di trovarsi nello stato aperto.  N₀=N ₒ •p₀  La probabilità per un canale di trovarsi nello stato aperto è uguale alla percentuale  di tempo che ogni canale passa nello stato aperto.  p₀=t₂₋₁/(t₂₋₁+t₁₋₂)  dove stato 2= aperto e stato 1=chiuso  10  Fisiologia: Fisiologia cellulare 3  26 settembre 2019  Docente: Ilaria Rvolta  Sommando algebricamente migliaia di tracce di singolo canale ottengo una visione  della corrente di tutta la membrana poiché essi si comportano più o meno tutti allo  stesso modo, come fossi in whole cell. Se ho una corrente entrante, ottenuta per  somma delle correnti entranti di singolo canale, la maggior parte di aperture e  quindi la maggior parte di corrente le avrò all’inizio della traccia. Se il canale ha un  tempo di apertura maggiore ad esempio, avrò una corrente che persiste per più  tempo. Tutto dipende dalle caratteristiche biofisiche del canale ionico.   Agendo direttamente in whole cell invece, i canali sodio, essendo voltaggio  dipendenti, si aprono tutti insieme non appena si invia lo stimolo alla cellula. Dopo  un certo periodo passano allo stato non conduttivo alternato ad una corrente  entrante (stato conduttivo). Questo dimostra che il comportamento del singolo  canale è assimilabile al comportamento di tutta la membrana.   Per un canale ligando attivato invece si ha zero corrente prima di perfondere, la  corrente alla perfusione, togliendo il ligando nuovamente zero.   Come si identifica il canale che si sta studiando?  Ipotizzando di avere un canale per il potassio e di essere in whole cell:  1. Identificare la direzione della corrente.  2. Controllo se il canale è bloccato dal tetraetilammonio che so essere un  inibitore aspecifico dei canali del potassio provando a perfondere.  3. Per capire quale canale del potassio è provo ad esempio a togliere il calcio  per vedere se sono del tipo calcio-potassio attivati. togliendo calcio dalla  soluzione in questo caso non avrò corrente.   Grazie a caratteristiche biochimiche e farmacologiche quindi è possibile identificare  una corrente ionica e quindi che canale si sta studiando.  Esperimento di current clamp   A= corrente imposta dall'operatore.  B= potenziale generato dalla membrana.   11  Fisiologia: Fisiologia cellulare 3  26 settembre 2019  Docente: Ilaria Rvolta    Questa tecnica ci permette di misurare i potenziali d’azione delle cellule eccitabili.  Ipotizzando si aver deciso di effettuare l’esperimento su un neurone: se si impone  sufficiente corrente (deve superare il valore soglia), ad esempio, è possibile vedere il  treno di potenziali d’azione.    I potenziali d’azione nervosi sono profondamente diversi da quelli generati dai  cardiomiociti sia in termini di morfologia che di durata (2 millisec per i neuroni e 200  millisec per i cardiomiociti). La morfologia cambia anche tra cardiomiocita  ventricolare e atriale.   Si può registrare anche il potenziale d’azione generato dai miotubi che risulta utile  nesso studio delle miotonie dove si evidenziano scariche si voltaggio non precedute  da perfusione di corrente.      12