Genetica batterica e trasferimento di materiale genetico tra batteri, Dispense di Microbiologia

Scarica Genetica batterica e trasferimento di materiale genetico tra batteri e più Dispense in PDF di Microbiologia solo su Docsity! 1 Genetica batterica e meccanismi di trasferimento di materiale genetico Questo trasferimento è utilizzato per scambiare caratteristiche peculiari. Definizioni L’unità fondamentale dell’informazione genetica è il gene. Il​ gene​ è un tratto di DNA codificante per una proteina. Questo avviene attraverso diversi step. 1. produzione di mRNA 2. rRNA 3. tRNA L’insieme dei geni contenuti in una cellula è il ​genoma​. Le strutture contenenti DNA sono gli ​elementi genici​. Genoma batterico Per ​genoma batterico ​si intende tutto il DNA presente in una cellula batterica a prescindere dalla sua localizzazione (cromosomiale o extracromosomiale). Il cromosoma contiene i geni housekeeping, quelli fondamentali per la sopravvivenza del batterio e che sono quindi trasferiti alle cellule figlie in modo funzionale. Questo geni housekeeping si contrappongono a quelli accessori che si trovano sugli elementi mobili esterni al cromosoma. i 2 Localizzazione cromosomiale Il ​cromosoma batterico​ è: Il cromosoma contiene una sola copia di un gene su uno dei due filamenti. La ​lunghezza​ del cromosoma è importante perché il cromosoma può variare nelle dimensioni e nella quantità di geni ospitati. Può andare da cromosomi più piccoli, tipici dei batteri intracellulari obbligati (circa 200 mila paia di basi), ai più grandi (10 milioni di paia di basi). Le dimensioni del genoma batterico che risiede sul cromosoma sono differenti, la caratteristica peculiare che contraddistingue i piccoli cromosomi dai grandi è data dalla situazione ambientale in cui il batterio si trova. Se questi sono in nicchie molto protette, senza grandi esigenze adattative, i cromosomi batterici sono piccoli. Dove la correlazione degli ambienti esterni (come la colonizzazione dell'ospite o di nuovi distretti dell'ospite) conduce i batteri ad evolvere quindi ad acquisire nuovi tratti genetici che non vengono persi ma si mantengono e i cromosomi diventano sempre più grandi. Questo è il fenomeno del ​mosaicismo​, per cui i geni possono essere acquisiti anche da altre specie con guadagno di nuovi tratti caratteristici. Il batterio quindi avrebbe un genoma contraddistinto da geni di diversa provenienza. Attraverso il fenomeno del trasferimento genico orizzontale (come la trasformazione) i nuovi geni vengono acquisiti e inseriti, per inserzione, nel cromosoma. Nella cellula batterica, la maggior parte dei geni sono contenuti nel cromosoma (costituito da un doppio filamento di DNA) che, genericamente, è unico con alcune eccezioni. Generalmente questo cromosoma è circolare, ma ci sono casi di cromosomi lineari. Esistono delle ​eccezioni nella forma ​del cromosoma. Esistono cromosomi lineari come nel caso degli Actinomiceti del genere Streptomyces. Esistono delle​ eccezioni ​anche ​nel numero​, il cromosoma può non essere singolo. HAnno cromosomi multipli diverse specie come la Spirocheta, Leptospira interrogans piuttosto che nella Burkholderia pseudomallei che è un proteobatterio che affligge spesso i pazienti affetti da FC. * * 5 Questo ci aiuta a capire con chi abbiamo a che fare sotto il punto di vista della virulenza, della patogenicità, la capacità di poter resistere agli antibiotici e costruire i trattamenti del domani dal punto di vista terapeuti, vaccini per avere una protezione che duri nel tempo. Plasmidi I plasmidi sono elementi mobili, sono entità extracromosomiali di dimensioni rilevanti (fino a diverse centinaia di migliaia di paia di basi) oppure molto piccoli (nemmeno 1000 paia di basi). Questi non contengono geni fondamentali per la sopravvivenza del batterio ma contengono DNA accessorio. Sono dotati di autoreplicazione quindi a prescindere dal numero di plasmidi presenti nella cellula batterica tutti godono di replicazione autonoma. Questa è veloce nel caso di plasmidi di piccola dimensione che normalmente vengono ad essere rappresentati da un elevato numero di copie o più grandi presenti in meno copie. Queste caratteristiche peculiari formano la diversità plasmidica. Oggigiorno abbiamo sequenziato moltissimi plasmidi che subiscono una codifica e che sono trasponibili alla stessa specie o a specie diverse. Altra caratteristica peculiare che è stata vincolata ai plasmidi è la caratteristica gram positivo gram negativo. Queste due tipologie di batteri sono molto distanti tra di loro dal punto di vista evoluzionistico, i loro plasmidi invece possono essere scambiati, più facilmente tra stesso gram ma può avvenire che possano essere scambiati anche tra batteri di diverso gram. Il rapporto di distanza genetica che esiste tra i due gram dal punto di vista evoluzionistico è rappresentabile tra quella che c’è tra la specie umana e una pianta. Le caratteristiche codificate non sono essenziali per la sopravvivenza del batterio, tra le caratteristiche che possono portare ci sono: ● fattori di resistenza ● fattori di patogenicità ● fattori di tossicità → possono veicolare geni che codificano per tossine (batteriocine come nel caso di E. coli ovvero tossine che vengono espresse e che sono rilasciate nell’ambiente esterno con trasporti attivi, uccidono i batteri circostanti perché E. coli vuole prevalere e avere tutti i nutrienti). Normalmente queste caratteristiche peculiari (per E.coli ma anche per lo Streptococcus pyogenes che produce piro tossine) sono accompagnate da elementi che proteggono il batterio dalla autolisi ad opera di queste tossine (ci sono sistemi di protezione che impediscono la reintroduzione delle tossine nel batterio che le ha generate). Elementi extracromosomici: • 6 I plasmidi possono sopravvivere in una condizione episomale overo all’interno dei batteri integrati nel cromosoma. Quando serve diventano extracromosomiali e se rispettano determinate caratteristiche possono essere trasferiti, ad esempio con la coniugazione, ad altri batteri. Classificazione dei plasmidi In base alle proprietà di trasferimento possono essere di tipo: ● coniugativo​ → possono portare fattori di fertilità (fattore F plasmidico) che rende il batterio in grado di coniugare (produzione del pilo sessuale, è un ponte proteico). Il pilo può essere stabilito tra batteri della stessa specie o di specie diverse e può far passare elementi cromosomiali o extracromosomiali o anche integroni o trasposoni. ● non coniugativo In base agli effetti fenotipici possono portare: ● resistenza agli antibiotici​→ ad esempio il plasmide R1 codifica per la resistenza all’ampicillina (classe delle penicilline), cloramfenicolo, acido fusidico, kanamicina, streptomicina e ai sulfamidici. Questi elementi mobili formano delle cassette che, come un treno, portano geni che conferiscono diverse caratteristiche (ad esempio resistenza a diverse classi di antibiotici). Possono mediare per singola classe di antibiotico con un meccanismo riconducibile alle beta lattamasi (enzimi idrolitici che distruggono questi antibiotici). Possono essere riconducibili ad una tipologia di batterio ad esempio agli stafilococchi, più raramente agli enterococchi (gram positivi, meno evoluti dei negativi). Altri sono prevalentemente caratteristica delle enterobatteriacee, delle pseudomonacee (famiglie di proteobatteri più grossi, plasmidi più evoluti anche dimensionalmente). ● fattori di virulenza batterica​ → diversi ceppi di E. coli entero tossinogenici danno luogo a batteri tossici che a livello intestinale possono essere acquisiti dall’ospite. Producendo enterotossine danno la lisi della mucosa intestinale ad esempio. 7 Nella classificazione del plasmidi è utile il sito ​http://www.patlas.site​ ​che mostra la cultura di tipo plasmidico che oggigiorno abbiamo. La zona centrale può essere zoomata. Qui abbiamo i plasmidi riconducibili ai plasmidi gram negativi e poi a quelli gram positivi. Ci sono comunque eccezioni. Facendo una ricerca per plasmide o elemento caratteristico (es. NDM → mutante new delhi associato ad una beta lattamasi di tipo plasmidico a spettro esteso che conferisce resistenza ai carbapenemi), si trova la classificazione e si vede come la caratteristica può essere veicolata da vari plasmidi. Quando il plasmide inizia con P e un codice alfa numerico a seguire cliccando sul link si torna sul sito Genbank​ di ​NCBI​ e quindi si ottiene: ● la caratteristica principale ● come il plasmide è stato sequenziato, con quale tecnologia (illumina o ion torrent) ● la sequenza con le caratteristiche per singolo gene e dimensione totale Queste tecnologie non traducono in una informazione certa. Molte sequenze hanno come codice hypothetical protein, ovvero non è stata scoperta la proteina per cui si pensa codifiche, non si sa la funzione. Se queste funzioni si ritrovano sulle strutture cromosomiali risulta più facile capire chi fa cosa, sulle strutture extracromosomiali invece, che hanno una evoluzione più rapida e che provengono da un processo di rimaneggiamento genetico, risulta più difficile. Pubblicazione su Microbial Drug Resistance della prof ssa Cocuzza e del prof Musumeci (2011): andando a studiare l’antibiotico resistenza hanno decodificato e isolato plasmidi caratteristici e hanno trovato come in plasmidi più o meno grandi ci fosse un marcatore (gene AC6’’B variante CR ) che era l’unico gene che media una resistenza crociata tra due classi di antibiotici. Codifica per beta lattamasi a spettro esteso. Questo gene acetila sia gli aminoglicosidi che i fluorochinoloni. Hanno visto come questo gene è presente su diverse popolazioni plasmidiche e sempre accompagnato dal gene CTX-M. In E.coli (isolato da loro nel 2004-2006-2008), facendo un’analisi osservazionale e prelevando E.coli di tipo uropatogenico che nella routine diagnostica era analizzato per patologie del tratto urinario, scoprirono che queste caratteristiche non erano peculiarmente plasmidiche m potevano essere trasferite a seguito di integrazione anche sul cromosoma. Perché ciò è importante? Per quanto riguarda una caratteristica plasmidica essa può essere trasferita ad altri batteri per caso. Secondo la statistica per sapere quanto spesso la caratteristica è trasferita si va ad analizzare le dimensioni del plasmide (E.coli coniuga più frequentemente plasmidi di piccole dimensioni) e se il plasmide è coniugativo o meno. Integrando nel cromosoma si creano mutanti di resistenza che verranno mantenuti per sempre nelle cellule figlie. La replicazione quindi avviene sempre, non c'è più casualità e statistica. Quindi il ceppo batterico mantiene questa caratteristica in modo stabile, sarà quindi più performante. i 10 - trasduzione - trasposizione - coniugazione ● Acquisizione di plasmidi 1) MUTAZIONI Possono essere: ❖ Spontanee → Le mutazioni sono errori casuali che avvengono perché semmai durante la replicazione batterica ❖ Indotte → esistono antibiotici che possono indurre mutazioni, che possono portare ad una antibiotico resistenza. Ciò perché il gene che ha subito la mutazione dà luogo ad un cambio nucleotidico o nella tripletta di AA; quindi, si renderà inattivo quel locus che rappresentava il target farmacologico. Tutto ciò avviene con una certa frequenza in natura. Le mutazioni sono alla base dell’evoluzione dei batteri. L’espressione di queste mutazioni può avvenire in: - batteri aploidi - organismi a crescita rapida Le principali mutazioni: ➢ Puntiformi (singoli nucleotidi): ● Silenti → senza avere un effetto ● “Missense” → cambio di un AA della tripletta, in genere il 3°. ● “Nonsense” → la tripletta diventa un codone STOP. ➢ Cambiamenti più consistenti del DNA: ● Inserzione ● Delezione → porzioni di sequenze nucleotidiche sono perse ● Sostituzione Le mutazioni possono essere considerate degli errori in natura? - Si, se non sono corrette. - No, se sono conservative e portano ad un mantenimento dell’informazione - No, se sono legate all'evoluzione del batterio e quindi producono un vantaggio selettivo e quindi un’evoluzione della popolazione sottoposta a stress esterni. Da qui, la selezione naturale che premia solo le mutazioni che portano a una condizione favorevole ed elimina le mutazioni sfavorevoli. lala DNA pol batterica, che fa proofreding (correzioni laddove c'è un errore) potrebbe commettere errori. 11 Amplificazione selettiva dei mutanti resistenti Si vede come una popolazione nell’ordine di 10^9 (che in genere costituisce un infezione, quindi una numerosità di cellule appartenenti alla stessa specie) dà luogo nella stessa popolazione a cloni mutanti che, per esempio, sono associabili a trattamento antibiotico oppure ad una risposta del sistema immunitario. La popolazione reagisce in modo differente, seleziona degli elementi che hanno subito delle mutazioni favorevoli. Queste mutazioni favorevoli portano ad una selezione di mutanti che resistono o alla terapia o al sistema immunitario. Quindi, questa popolazione reverte. Non è più rappresentata da 1 elemento su 10^9. Si inizia a selezionare una sottopopolazione data da mutanti che si portano ad un rapporto 1:1 o 200:1. Nelle ore la sottopopolazione iniziale diventa poi la popolazione prevalente (costituita da mutanti che resistono nel tempo a terapia o sistema immunitario). . 2) RICOMBINAZIONE La ricombinazione comprende tutti quei processi che portano ad una variazione macroscopica dei tratti genetici. - In genere, la ricombinazione è unidirezionale → avviene tra cellule che fanno da donatrici di elementi genici e cellule riceventi. - Il materiale genetico trasferito consiste in elementi cromosomiali e plasmidici o interi o frammentati (ad opera di enzimi litici); può essere integrato a livello cromosomiale e plasmidico. - Il trasferimento genico può avvenire all’interno della stessa specie (trasposoni) della stessa cellula tra cromosoma e plasmide. Più macroscopicamente, può avvenire anche tra specie diverse. Ciò comporta l’acquisizione di nuove caratteristiche fenotipiche rilevanti. La ricombinazione può avvenire mediante: ● Trasformazione​: ​è un trasferimento genico che risulta in un’acquisizione di DNA nudo solubile dato da un donatore (che è andato incontro a lisi cellulare) ad un ricevente. I fattori che influenzano la trasformazione sono: - la dimensione del DNA da acquisire - lo stato del DNA (se è più o meno degradato) Una volta introitato è ulteriormente processato. C’è l’esempio di S. Pneumoniae, Bacillus, Haemophilus, Neisseria, E. coli* . Questi hanno dei fattori di competenza; fanno in modo di permettere il riconoscimento del DNA esterno. 12 Questi fattori fanno parte del quorum sensing: Il batterio sta replicando (è in una fase esponenziale) → produzione dei fattori di competenza → esportazione di questi fattori → ricaptazione di questi fattori quando si raggiunge una concentrazione critica (quando è stato riconosciuto il DNA esterno) → introitazione → ulteriore processamento per integrare sul genoma. *​In termini di competenza,l’E.coli è il batterio più competente nei sistemi fisici e chimici come l’elettroporazione (che in un batterio gram negativo come E. coli deve garantire l’apertura delle porine della membrana esterna per far introitare porzioni di DNA provenienti dall’esterno). Tutto ciò è alla base delle biotecnologie attuali. Il DNA acquisito deve ricombinarsi con il segmento omologo del DNA ricevente in modo da essere stabilmente mantenuto ed ereditato dalle cellule figlie. La maggior parte dei ceppi non sono naturalmente competenti; quindi possono essere artificialmente indotti a diventare competenti (mediante shock termici o elettroporazioni). L’esempio classico è quello della streptococcus pneumoniae, batterio che abusa di questo meccanismo di trasferimento orizzontale. Si può prendere a riferimento l’​esperimento di Griffith​ del 1928. Date due popolazioni batteriche di S. pneumoniae diverse: 1. liscia, capsulata e patogena 2. rugosa, non capsulata e non patogena. I due ceppi erano iniettati nel topo separatamente. I topi infettati con il ceppo 1 causava morte; il ceppo 2 non causava la morte. Se si uccidevano i batteri lisci (ceppo 1) con il calore e si iniettavano, il topo moriva. Se si iniettava il batterio rugoso (ceppo 2), il topo non moriva. Se si iniettava il batterio rugoso (ceppo 2) + il batterio lisci uccisi (ceppo 1 ucciso), il topo moriva. Esisteva un principio trasformante. Venne studiato, poi, da ​Avery, MacLeod e McCarty​ (1944). Si trattava l'estratto di batteri separatamente con enzimi che idrolizzano polisaccaridi, lipasi, proteasi, RNasi e DNasi. Nei primi 4 casi non si perdeva l’attività trasformante. Mettendo nell’estratto la DNasi, però, si perdeva l’attività trasformante. Quindi,​ si dedusse che il principio trasformante fosse nel DNA​ → il DNA era trasferito dal batterio ucciso a quello vivo e conferiva al vivo la caratteristica trasformante per diventare patogeno. non 15 E’ più complessa delle altre, è molto simile alla specializzata; fu trattata sulla rivista Science nel 2018. Prevede un’amplificazione della frequenza del numero di copie che la specie produce ad opera di un fago, che fa da iniziatore del processo. Prevede l’escissione in ritardo del profago per cui il DNA virale viene replicato mentre è ancora nel genoma dell'ospite batterico. Quindi il macchinario che replica il DNA virale potrebbe copiare anche una parte di DNA batterico. Quindi nella particella virale è integrata anche una parte di DNA batterico che, integrandosi nella particella particella virale, si può spostare alla particella batterica che andrà ad infettare una volta lesa la cellula batterica inizialmente infettata. Si è osservata in uno S. aureus infettato da un fago temperato. Quando il virus (batteriofago o fago) infetta S. aureus, vengono prodotte multicopie del DNA virale in parallelo con amplificazione della frequenza del numero di copie. ● Trasposizione ● Coniugazione ​→ formazione di un contatto fisico tra batteri in genere appartenenti ai Gram negativi. La coniugazione dei Gram positivi avviene grazie alla produzione di feromoni. Il DNA trasferito è plasmidico e, in alcuni casi, cromosomiale. Si ha una correlazione fisica tra batteri. Il donatore è un donatore che ha a livello plasmidico dei plasmidi coniugativi, così definiti perché posseggono un gene F+ di fertilità. Quando è espresso il gene, si induce la cellula a produrre il pilo sessuale. Questo coniuga un batterio donatore con un batterio ricevente. Consente di far transitare plasmidi coniugativi e anche non coniugativi. Quindi, il ricevente può diventare un batterio F+. Oppure, se il plasmide coniugativo non è transitato, la cellula ricevente sarà una cellula F-. Nel 1946 si è fatto un esperimento, dove si dimostrò la peculiarità di avere 2 specie diverse che avevano caratteristiche in comune. Essi concentrarono i loro studi su due ceppi di ​E. coli​ mutanti nutrizionali per tre metaboliti ciascuno. Coltivando i due ceppi separatamente Questo processo avviene anche nelle altre tipologie di trasduzione, ma questo ritardo aumenta la probabilità che la trasduzione avvenga. Inoltre, trasferisce pezzi più grandi di genoma batterico (soprattutto quando sono integrati più profagi) Spiega il perchè questo batterio si adatti così velocemente ai nuovi antibiotici*. *Sembra, infatti, che i siti inserzionali dei profagi siano vicini alle isole di patogenicità, che contengono geni di resistenza agli antibiotici che, con la trasduzione, sono trasferiti. --> elementi trasponibili (pagina 8) Auxotrofo --> ceppo mutante in grado di sintetizzare una sostanza richiesta per la sua crescita. Pproxotrofo --> incapace di sintetizzarla. Prot t f Auxotrofo 16 in un ​terreno​ povero di nutrienti i batteri non riuscivano a svilupparsi. Mentre facendoli crescere nello stesso terreno si ottenevano ​mutanti​ in grado di sintetizzare tutti e sei i metaboliti.​[1]​ Si ipotizzò che questi batteri, venendo in contatto tra loro fisicamente, fossero in grado di scambiarsi le ​informazioni genetiche​, ma la teoria poté essere confermata solo dopo la scoperta dei ​plasmidi​, segmenti di materiale genico trasferibile, che si trovano liberi nel citoplasma​ del batterio. Più avanti nel tempo, Bernard Davis disse che mettendo un setto separatore tra specie con le caratteristiche e specie senza, il setto faceva transitare subparticelle senza creare il contatto fisico, il trasferimento non veniva. Quindi il contatto doveva essere di tipo fisico. Quindi il pilo sessuale è il tramite meccanicistico. La coniugazione quindi che può avvenire sia nei gram positivi che nei negativi. Nei gram positivi (Enterococcus faecalis) vengono prodotti feromoni che donano una sostanza aggregante che fa legare le due cellule per avere il trasferimento Quindi si parla di più aggregati cellulari con trasferimento di plasmidi coniugativi. Nei negativi (Enterobacteriaceae) invece si ha la formazione del pilo sessuale. Il plasmide è F e caratterizza una cellula F+ (maschio) ma che può transitare ad una F- (femmina) o meno. 3) TRASFERIMENTO DI PLASMIDI Quando vengono trasferiti solo plasmidi abbiamo la coniugazione più semplice. inducono la pr duzione di una sostanza (anche qui si ha maschio e femmina). Oltre alla coniugazione semplice, può esserci... 17 F+ integrato nel cromosoma: Luca Cavalli Sforza, premio Nobel, ha analizzato che quando i plasmidi devono coniugare possono anche integrarsi nel cromosoma per cui F+ risiede nel cromosoma. Si inizia una replicazione del cromosoma batterico che va incontro ad un passaggio sotto forma di singolo filamente nel pilo sessuale e la cellula ricevente riceve il cromosoma. Normalmente la porzione F+ è la più distante dal sito di origine della replicazione quindi solo se il cromosoma è piccolo e il pilo resiste nel tempo si avrà la possibilità di trasferire l’intero cromosoma ma questo è altamente improbabile. Normalmente infatti il cromosoma di una specie batterica non viene replicato all’interno di un batterio appartenente ad un’altra specie. Quello che normalmente viene fatto è che si trasferisce una parte iniziale di corredo genomico cromosomiale e poi si interrompe il ponte. Quindi la cellula ricevente riceve frammenti differente. Il fattore F si integra nel cromosoma batterico con una bassa frequenza come pure i geni batterici si trasferiscono con bassa frequenza. Incrocio Hfr x F- : I geni batterici che integrano il plasmide prendono il nome di Hfr. Il meccanismo di incrocio tra Hfr ed F- fa si che vengano trasferite porzioni cromosomiali che poi si integrano nella cellula ricevente che rimane F-. Si ha quindi trasferimento di DNA e ricombinazione omologa. Questo comporta che è altamente improbabile che si trasferisca tutto il cromosoma batterico del donatore e che il pilo sessuale trasmetta piccole o medie porzioni in base al tempo per cui permane. Si può guidare negli esperimenti il tempo per cui il pilo sessuale resiste e quindi possiamo avere cicli replicativi che diano la mappatura di porzioni sempre più grandi introdotte nel batterio ricevente. La coniugazione ridotta può far capire dove di è integrato il gene trasferito. Si vanno a creare quindi delle mappe a tempo e possiamo andare e ricostruire la coniugazione Hfr con un gradiente di trasferimento deciso da noi. Hfr subisce escissione di F+: Un fenomeno alternativo è quanto in un batterio Hfr il fattore F si stacca per escissione dal cromosoma diventando un elemento mobile indipendente. Hfr quindi perde F+ per escissione e lo trasferisce, insieme ad altri geni (adiacenti al gene F) per ​sesduzione​* che rende F’ il batterio ricevente. Questo avviene perché durante la coniugazione si trasferisce F+ integrato a porzioni di cromosoma originale dato dalla prima cellula Hfr. E la cellula F+ iniziale diventa F- perchè il fattore F+ non è stato replicato. o i. Oltre alla coniugazione semplice, però, possono esserci...