Genetica batterica, mutanti, tipi di mutuazioni, Appunti di Microbiologia

Scarica Genetica batterica, mutanti, tipi di mutuazioni e più Appunti in PDF di Microbiologia solo su Docsity! Genetica batterica Una mutazione è un cambiamento ereditabile in una sequenza di basi dell'acido nucleico nel genoma di un organismo. Un ceppo che porta tale cambiamento viene detto mutante. Un ceppo mutante differisce dal ceppo parentale nel genotipo, ovvero nella sequenza nucleotidica del suo genoma. Inoltre le proprietà osservabili del mutante sono il fenotipo. È comune riferirsi a un ceppo isolato in natura come un ceppo di tipo selvatico. Adattamento fisiologico Consiste nella manifestazione di un nuovo fenotipo in relazione al cambiamento ambientale. Alcune mutazioni sono selezionabili in quanto conferiscono alcuni vantaggi agli organismi che le possiedono mentre altre sono non selezionabili anche se portano a un profondo cambiamento del fenotipo di un organismo. Una mutazione selezionabile conferisce al mutante un vantaggio in certe condizioni ambientali per cui la progenie della cellula mutante è in grado di crescere in modo tale da sostituirsi a quella parentale. Un esempio di mutazione selezionabile è la resistenza ai farmaci. I microrganismi antibiotico-resistenti possono crescere in presenza di concentrazioni di antibiotico che inibisce o uccide il parentale ed è così selezionato in queste condizioni. Un esempio di mutazione non selezionabile è quello della perdita di colore in un organismo pigmentato. Per le cellule mutate non presenta nè un vantaggio né uno svantaggio, rispetto alle colonie parentali pigmentati, quando crescono in piastre di agar. Adattamento genetico Comparsa di nuovi fenotipi che vengono selezionati positivamente dell'ambiente perché più adatti. L'isolamento di mutanti auxotrofi nutrizionali e la selezione con penicillina Possono essere identificati mutanti nutrizionali difettivi attraverso la tecnica del replica plating. Con l'ausilio di un velluto sterile una carta da filtro viene ottenuta una stampa delle colonie da una piastra madre su un'altra piastra di agar mancante di alcuni nutrienti. Le colonie di tipo parentali cresceranno normalmente ma non quelle dei mutanti. Quindi l'incapacità di una colonia di crescere sulla piastra replicata contenente un terreno minimo la segnala come mutante. La colonia sulla piastra madre che corrisponde al punto vuoto nella piastra replicata può essere quindi prelevata purificata e caratterizzata. Un mutante che presenta nutrizionale particolare viene detto auxotrofo. Il ceppo selvatico parentale da cui l’auxotrofo deriva è detto prototrofo. Per esempio i mutanti di Escherichia coli con il fenotipo His- sono detti auxotrofi per l'istidina. Un altro metodo largamente impiegato per l'isolamento degli auxotrofi è il metodo della selezione con penicillina. La penicillina è un antibiotico che uccide solamente le cellule che crescono, infatti essa viene aggiunta a una popolazione che cresce in un terreno privo del fattore di crescita necessario per ottenere il mutante desiderato, le cellule del mutante che non si sviluppano resteranno vitali. Pertanto dopo un'incubazione preliminare, in assenza del fattore di crescita in un terreno contenente penicillina, la popolazione viene lavata dalla penicillina e trasferita in piastre contenenti il fattore di crescita. Tra le colonie che si sono sviluppate, comprese alcune cellule selvatiche che sono sfuggite all'effetto della penicillina, ci saranno i mutanti per il fattore di crescita. La selezione con la penicillina è quindi una specie di selezione negativa perché essa non è a favore del mutante ma è contro il ceppo parentale. Tipi di mutanti Mutanti nutrizionali o auxotrofi Hanno perso la capacità di sintetizzare metaboliti e necessitano di un supplemento nutritivo per la crescita (Mal-, Lac-) Mutanti letali condizionali Sono capaci di crescere in certe condizioni ambientali e non in altre. Per esempio mutanti temperatura- sensibili sono capaci di crescere a 20°C e non a 42°C mentre il ceppo selvatico cresce entrambe le temperature. Mutanti resistenti Sono mutanti resistenti a sostanze antimicrobiche come antibiotici e virus. Test di fluttuazione Ricorrendo all'analisi della fluttuazione del numero di mutanti di E.coli resistenti al fago T1, imostrarono che le variazioni osservate nei batteri rappresentavano effettivamente delle mutazioni che insorgevano spontaneamente in coltura, in assenza di induzione da parte di fattori esterni, confutando in tal modo la teoria adattativa. Batteri provenienti da una coltura di E.coli, originata da una singola cellula sensibile al fago T1, vengono inoculati contemporaneamente in una beuta e in diverse provette contenenti terreno nutritivo. Ogni inoculo è costituito da un numero basso di batteri (50-500), in modo di avere una probabilità molto alta di non avere mutanti resistenti al fago. Quando si è raggiunta la crescita massima nelle colture, si semina un aliquota dei batteri di ogni coltura in provetta su una piastra, contemporaneamente a un numero di fagi da poter uccidere tutte le cellule sensibili. Analogamente aliquote di batteri vengono prelevate dalla beuta e seminate su diverse piastre insieme ai batteriofagi. Le piastre vengono poi inoculate per permettere l'uccisione delle cellule sensibili e la formazione di colonie da parte delle eventuali cellule resistenti. Se i mutanti si originassero in seguito alcontatto con il fago (teoria adattativa), dato che in ogni piastra è stato seminato un egual numero di batteri ci si aspetterebbe per tutte le piastre un identico numero di colonie (con variazioni minime). Se invece le mutazioni avvenissero a caso durante la crescita in coltura, prima cioè che le cellule vengano esposte in coltura (teoria genica), il numero di mutanti resistenti atteso per ogni provetta dovrebbe dipendere dal momento della comparsa del primo mutante e quindi fluttuare: prima avviene la mutazione durante la crescita, e più numerosi saranno i batteri resistenti alla fine della crescita. I risultati mostrarono che vi è effettivamente una grande fluttuazione nel numero delle colonie nelle piastre dove sono state seminate le colture indipendenti: infatti in alcune piastre le colonie sono assenti, in alcune sono pochissime e in altre più numerose. La ricombinazione genetica la ricombinazione comporta lo scambio fisico tra materiale genetico tra elementi genetici. Si parla di ricombinazione omologa quando lo scambio avviene tra sequenze omologhe di DNA di due origini differenti. (crossing over). Nei batteri la ricombinazione omologa coinvolge la proteina RecA. Il processo comincia con un taglio, in una delle due molecole di DNA con la formazione di un frammento. Una proteina che lega il DNA a singola elica si associa a questo frammento, seguita dalla proteina RecA, formando un complesso che facilita il riappaiamento con la sequenza complementare nel DNA duplice adiacente, mentre avviene in modo simultaneo lo spostamento del filamento residente (invasione del filamento). Affinché possano emergere nuovi genotipi è importante che le sequenze omologhe siano geneticamente distinte. Nei procarioti, si ovvia attraverso tre processi: trasformazione, coniugazione e trasduzione. Attraverso questi meccanismi i frammenti di DNA omologo vengono trasferiti dal cromosoma di una cellula donatrice a quella ricevente. Solo dopo il trasferimento, avviene la ricombinazione omologa. Trasformazione La trasformazione è il trasferimento di materiale genetico da un batterio all'altro mediato da frammenti di DNA extracellulare (questo DNA può provenire da cellule morte o può essere estratto e somministrato artificialmente a cellule riceventi). Essa inizia quando il DNA a doppio filamento viene agganciato da un recettore sulla superficie della cellula ricevente. Appena viene tirato all'interno, grazie alla trascrizione di alcuni geni che sono attivati in seguito a stimoli ambientali, un filamento del DNA viene degradato e l'altro, invece, risulta protetto dalla degradazione mediante una proteina di rivestimento. Successivamente questo singolo filamento di DNA trasformante invade il cromosoma della cellula ricevente appaiandosi con il filamento complementare del DNA e rimpiazzando quello ad essi equivalente. Il filamento sostituito viene quindi anch'esso degradato. Se le cellule donatrici e riceventi portano differenti alleli di un gene, la risultante doppia elica ricombinante avrà un allele su un filamento e l'altro sul secondo filamento. Questo tipo di DNA a doppia elica, che viene detto eteroduplex (una doppia elica “eterozigote”), segrega poi in due omoduplex quando viene replicato. La competenza All'interno di generi batterici "trasformabili", solo alcuni ceppi o specie sono in grado di essere trasformati. Una cellula in grado di assumere una molecola di DNA e di essere trasformata è detta competente, e questa caratteristica è determinata geneticamente. Nella maggior parte dei batteri naturalmente trasformabili, la competenza è regolata e vi sono proteine specifiche che hanno il compito di prelevare e processare il DNA. Esse possono comprendere una proteina associata alla membrana che si lega al DNA,un'autolisina della parete cellulare e varie nucleasi. Uno dei meccanismi di attivazione della competenza naturale in Bacillus subtilis, una specie batterica facilmente trasformabile, fa parte di un sistema "quorum-sensing", regolato da un sistema a due componenti. Le cellule, durante la crescita, producono e secernono un piccolo peptide e, in presenza di un'elevata concentrazione di questo peptide, divengono competenti. La trasduzione La trasduzione è una modalità di trasferimento genico, dove il trasferimento dei geni batterici è mediato da batteriofagi. Esistono due tipi di trasduzione: 1. la trasduzione generalizzata dove un frammento casuale di DNA batterico viene impacchettato nella testa del fago al posto del cromosoma fagico, con formazione di una particella trasducente. 2.La trasduzione specializzata dove si è verificato un evento di ricombinazione tra il cromosoma ospite e il cromosoma fagico, producendo quindi un cromosoma fagico che contiene un pezzo di DNA batterico e uno fagico. Nella trasduzione generalizzata, durante il ciclo litico nella testa del virus( temperato o virulento), possono essere incorporati frammenti di DNA batterico. Si forma una popolazione mista con fagi che contengono i geni virali di origine, e fagi con DNA batterico; questi ultimi possono poi inoculare i geni batterici in un nuovo batterio, così, il DNA inoculato si fonde con quello batterico. A differenza della trasduzione specializzata, vi saranno particelle trasducenti contenenti solamente DNA fagico o solamente DNA cromosomico La trasduzione specializzata è, invece, caratteristica di virus temperati che trasferiscono solo certi tipi di geni tra i batteri. Il batteriofago lambda è il fago trasducente specializzato conosciuto in modo più approfondito. Esso trasporta i geni gal (richiesto per l'utilizzo del galattosio come fonte di energia) e bio (essenziale per la sintesi della biotina) da una cellula di E.coli ad un'altra. Il sito specifico dell'integrazione del cromosoma circolare di si trova tra i geni gal e bio del cromosoma batterico, motivo per cui il fago trasduce questi geni in modo così specifico. Il cromosoma integrato va incontro a rare escissioni spontanee e in seguito alle quali entra nella via litica. L'escissione del profago può essere anche indotta irradiando le cellule lisogeniche con raggi ultravioletti. La normale escissione è essenzialmente l'opposto del processo di integrazione sito-specifica e porta ad un fago ed un cromosoma circolari intatti. • I fattori di fertilità o plasmidi F rendono possibile la coniugazione. Questi plasmidi possiedono circa 25 geni, tra cui quelli che codificano per le proteine dei pili sessuali e del tubo di coniugazione. Una cellula contenente un plasmide F viene indicata come F+ e può trasferire una copia del plasmide F a una cellula F–, trasformandola in F+. Talvolta il plasmide F si può integrare nel cromosoma principale; in tal caso, trasferendosi da una cellula all’altra attraverso il tubo di coniugazione, può portare con sé anche parte del cromosoma principale. • I plasmidi metabolici possono conferire insolite capacità metaboliche alle cellule che li contengono. Per esempio, alcuni batteri possono crescere sugli idrocarburi, utilizzandoli come fonte di carbonio. I geni che codificano gli enzimi coinvolti nella demolizione degli idrocarburi sono portati dai plasmidi. • I fattori di resistenza , definiti anche plasmidi R , portano geni che codificano proteine capaci di demolire o alterare gli antibiotici. Ogni plasmide R porta uno o più geni che conferiscono la resistenza a particolari antibiotici, oltre ai geni che rendono possibile la coniugazione. Per quanto è dato sapere, i plasmidi R che conferiscono antibiotico-resistenza esistevano già molto tempo prima della scoperta e dell’utilizzo degli antibiotici. Tuttavia, pare che in tempi recenti siano diventati molto più frequenti, probabilmente perché l’uso massiccio di antibiotici negli ospedali ha portato alla selezione di ceppi portatori di questi fattori. Coniungazione La coniugazione è un processo di trasferimento genetico in cui due batteri entrano a contatto diretto. Il processo coinvolge una cellula donatore, che contiene il plasmide coniugativo e una cellula ricevente che ne è priva. I geni responsabili della coniugazione sono contenuti all’interno del plasmide che usa questo meccanismo per trasferire una copia di se stesso a una nuova cellula. I geni si trovano in una regione plasmidica definita tra (geni coinvolti anche nella formazione dei pili). I geni tra si possono suddividere in: -Dtr (DNA transfer and replication), geni per il processamento del DNA; - Mpf (Mating pair formation), che include i geni per la formazione del pilo e del canale di contatto tra le cellule. Durante questo meccanismo, il DNA viene trasferito da una cellula donatrice ad una ricevente attraverso un canale intercellulare specializzato, un ponte di coniugazione, che si forma tra le due cellule. Le cellule donatrici hanno appendici sulla superficie cellulare, chiamate pili (F). Il pilo è una struttura tubulare esposta sulla superficie della cellula di lunghezza variabile costituita da copie ripetute di pilina. Quest'ultima proteina è sintetizzata nel citoplasma ed arriva nello spazio periplasmatico tramite il sistema di trasporto Sec La sintesi di questi pili F è controllata da geni vicini presenti su una piccola molecola di DNA circolare, chiamata fattore F (“fertilità”). I batteri, dunque, che contengono un fattore F sono in grado di trasferire geni ad altri batteri. Allora i pili F di una cellula donatrice prendono contatto con la superficie della cellula ricevente e si avvicinano. Successivamente si forma tra le cellule un canale diretto o ponte di coniugazione, dove avviene lo scambio di DNA (anche la formazione di questo ponte è controllata da geni presenti sul fattore F). Il fattore F può esistere in due stati: (1) uno stato autonomo, in cui esso si replica indipendentemente dal cromosoma batterico o (2) uno stato integrato, in cui è saldamente inserito nel cromosoma batterico e si replica con esso. Comunque una cellula donatrice che trasporta un fattore F autonomo viene chiamata cellula F+. Invece, una cellula ricevente che manca di questo fattore sarà una cellula F-. Quindi quando una cellula F+ coniuga con una F- viene trasferito solo il fattore F ed entrambi le cellule diventano F+ perché il fattore F viene replicato durante il trasferimento. Il meccanismo di coniugazione risulta il seguente: durante la coniugazione, un segmento della molecola circolare di DNA viene tagliato al sito oriT (origine del trasferimento) da un enzima, relaxasi, codificato dalla regione Dtr del plasmide e un'estremità viene trasferita nella cellula ricevente attraverso il canale che si forma tra le cellule in coniugazione. La relaxasi rimane legata al 5' del filamento e viene trasferita nella cellula ricevente con il DNA per effettuare la chiusura. Il fattore F, viene replicato durante il trasferimento mediante un meccanismo detto replicazione a cerchio rotante, perché la molecola circolare di DNA “gira” durante la replicazione. Durante la coniugazione nella cellula donatrice viene sintetizzata una copia del cromosoma in trasferimento, mentre nella cellula ricevente viene replicato il filamento trasferito a partire da un primer di RNA che si forma per la trascrizione di due geni denominati ssf e psiD. Questi due messaggeri, vengono anche tradotti per sintetizzare due proteine importanti: la prima è un omologo delle SSB (Sigle Strand Binding protein) di E.coli, ma specifica per il DNA di F, la seconda è una proteina che sopprime il sistema SOS della cellula ricevente che potrebbe attivarsi percependo la presenza di DNA a singolo filamento. Ceppi HFR Il plasmide F oltre a essere coniugativo è anche un episoma, cioè può integrarsi nel cromosoma dell’ospite. Se il plasmide è integrato, la coniugazione può dar luogo al trasferimento di una larga regione del cromosoma dell’ospite che potrà determinare la ricombinazione genetica tra ampie regioni del cromosoma tra donatore e ricevente. Le cellule che possiedono un plasmide F non integrato sono dette F+ mentre quelle che lo hanno integrato sono dette Hfr (per l’alta frequenza di ricombinazione tra donatore e ricevente). Entrambe le cellule agiscono come donatori ma Hfr dona anche il cromosoma dell’ospite, poiché il plasmide è parte di esso. La presenza del plasmide F porta a tre cambiamenti nella cellula: capacità di sintetizzare il pilo F, mobilizzazione del DNA per il trasferimento in un'altra cellula e alterazione dei recettori di superficie, in modo che la cellula non sia più in grado di comportarsi come un ricevente nella coniugazione. L’integrazione del plasmide F in un cromosoma ospite avviene in regioni di omologia tra il cromosoma e il plasmide detti siti di inserzione IS (IS2 IS3). Una volta integrato il plasmide non è più in grado di controllare la propria replicazione mentre i geni tra funzionano ancora per la sintesi del pilo. Se un ceppo Hfr viene in contatto con una cellula ricevente, comincia il trasferimento da oriT. Tuttavia, dato che il plasmide fa parte integrante del cromosoma, dopo che una parte del DNA plasmidico è stata trasferita, cominciano a trasferirsi anche i geni dell’ospite. Di solito poiché durante il trasferimento si ha rottura del DNA, solo una parte del cromosoma verrà trasferito. Gli Hfr non convertono le cellule F- in F+ in quanto solo raramente viene trasferito l’intero plasmide F. L’orientamento d’inserzione del plasmide nell’ospite determinerà quali geni verranno prima trasferiti. Il test di complementazione Il test di Complementazione viene effettuato incrociando fra loro individui che presentano mutazioni le quali danno luogo allo stesso fenotipo. I geni, infatti, regolano singoli eventi di una catena metabolica, per cui la presenza di un fenotipo mutato può essere causata da una mutazione su uno qualsiasi dei geni che appartengono alla catena metabolica che risulta essere mutata. Il test della complementazione permette di evidenziare se due individui o due cellule che presentano la stessa mutazione fenotipica abbiano subito una mutazione sullo stesso gene o su geni diversi. Nell’incrocio, infatti, se le mutazioni sono su geni differenti si ottiene un fenotipo non mutato e le due mutazioni si dice che “complementano”; viceversa se esse sono sullo stesso gene, il fenotipo rimane mutato e le mutazioni “non complementano” proprio perché riguardano il medesimo gene e di conseguenza il medesimo enzima. Nel test di complementazione vengono effettuate due prove: il test “Trans” in cui una mutazione si trova su un cromosoma e una sull’altro, ed il test “cis” in cui entrambe le mutazioni sono su un cromosoma mentre l’altro non presenta geni mutati. Se nel test “trans” le mutazioni complementano, ristabiliranno il fenotipo normale e questo significa che appartengono a geni diversi. Ciò però non è sufficiente, infatti la mutazione di un sito potrebbe interferire con l’espressione corretta dell’altro, perciò viene effettuato anche il test “cis”. Se in questo si presenta il fenotipo normale si può escludere l’ipotesi dell’inibizione del gene normale da parte di quello mutato e si può concludere che le mutazioni in questione appartengono a due geni diversi. Tale test, detto anche “test cis-trans” che ha dato origine anche al termine di “cistrone”, fu introdotto proprio da Benzer.