Genetica medica e farmacogenomica, Appunti di Genetica

Scarica Genetica medica e farmacogenomica e più Appunti in PDF di Genetica solo su Docsity! GENETICA MEDICA E FARMACOGENOMICA MALATTIE MONOFATTORIALI O MENDELIANE Circa il 2% delle patologie genetiche sono rappresentate da malattie mendeliane. All'interno dei questo range consideriamo un numero molto ampio di malattie che per definizione sono malattia rare, cioè una patologie con un indice di frequenza inferiore a 1/2500. Più diventano le patologie diventano frequenti all'interno della popolazione più le loro cause rientrano in contesti patologici multifattoriali con una incidenza a causa della probabilità di ritrovarle all'interno della popolazione. Le patologie mendeliane sono monofattoriali poichè causate da varianti in un singolo gene (differente dai disordini di origine cromosomica). Al giorno d'oggi conosciamo più di 3900 geni che sono causa di malattie di origine mendeliana. La nascita di un individuo con una mutazione si verifica 1 volta su 100000 nascite. Per lo studio di queste patologie è utile fare un'anamnesi del paziente, definito probando, analizzando il pedigree (albero genealogico) per individuare i modelli di trasmissione della possibile patologia. | pedegree vengono rappresentati utilizzando dei simboli standard convenzionali. Male Female. Sex unknown Male Female Sex unknown or unspecified or unspecitiea Identical | Nonidentical | Unknown mini matter Mm @ f ® Unaffected individual ; DI] O o Sme member comin to Twins a no o ® ' presta, BM © Pip FO " Consanguinity " (mating between related individuals) does not have the trait) nre: one boy dn to gs in br rr Asympromatie carrier (unaffected at this time []] (DI but may late exhibit trai TTI Adoption rachers encose O O idoptd ini. Dashed ie deotes dope parent; gl lie notes Bologica n OL] Indicates parent consanguinity Multiple individuate 6 E] E Decenseg indivi —{ D7T RdS © N Rappresentare in maniera ottimale il pedigree ci permette di e Supporrei pattern di ereditarietà valutando il tipo di trasmissione ereditaria e Qualèìillivello di manifestazione clinica valutando la storia della malattia ® Evidenziare variazione nei livelli di espressione patologica del fenotipo (penetranza incompleta) gene sequenza di basi di DNA che dirige la int una specifica catena polipeptidica 9 i “fica posi locus gehetico specifica posizione di un gene su un cromosoma allele forme alternative di un gene omazigosità | allli identici ad un dato locus eterozigosttà - allelt differenti ad un daro locus genotipo costituzione generica di un individuo fenotipo il risultato osservabile dell'interazione del get coni fattori ambientali autosomico locus presente su uno dei 22 cromse x ed locus presente sul cromasama X dominante carattere che si esprime anche negli individui eterozigoti per quell'allele recessivo carattere che necessita della presenza di entrambi. gli alleli per essere espresso Normalmente ciò che si cerca di individuare con un'analisi genetica, successivamente allo studio del pedigree, è la ricerca di una mutazione genetica all'interno di una sequenza nucleotidica e naturalmente la verifica della presenza dell'allele in eterozigosi o in omozigosi. Nella maggior parte dei casi lo studio fa riferimento alla linea germinale che rappresenta le cellule che facendo meiosi dividono il proprio corredo cromosomico producendo i gameti aploidi. Possiamo valutare anche la presenza della mutazione in una linea somatica ma questa non può essere trasmessa in maniera ereditaria. Di conseguenza non è definibile una ricorrenza a livello familiare in una patologia genetica di origine somatica. e MODALITA' DI TRASMISSIONE DELLE PATOLOGIE MENDELIA NE Le modalità di trasmissione sono: 1. Autosomica dominante 2. Autosomica recessiva 3. Recessiva legata al cromosoma X 4. Dominante legata al cromosoma X 5. Legata al cromosoma Y e AUTOSOMICHE DOMINANTI Patologie autosomiche dominanti Pedigree illustrating autosomal dominant transmission mo Ritroviamo l'espressione fenotipica della patologia in tutte le generazioni parentali del probando sia in eterozigosi che in omozigosi. Quindi affinché si manifesti il fenotipo patologico basta la presenza dell'eterozigosi essendo una patologia dominante, mentre se un individuo è omozigote recessivo non sarà affetto da patologie. Anche alcuni tratti della nostra fisionomia vengono trasmessi secondo questo modello di trasmissione come avere il dito mignolo incurvato. Durante un'analisi genomica è importante valutare il rischio di trasmissione ereditaria tramite il quadrato di punnet. b db B b Sc un genitore è normale (bb) © l'altro è Se entrambi i genitori sono affetti (Bb) da una B| Bb Bb affetto (0h) da una malattia autosomica B| BB Bb malattia autosomica dominante, allora il 75% dominante, — dei figli sarà affetto (BB or Bb), e il 25% sarà b bb bb il 50% dei figli sarà eterozigote affetto b| Bb bb ‘omozigote normale (bb). {B0), ed 50% sarà omozigote normale (bo) Punnett square Punnett square Spesso l'acondroplasia si manifesta generando una mutazione de novo durante le fasi della spermatogenesi delle linee germinali con una frequenza di 1/26000. Questa è una patologia correlata con l'età paterna perché più è elevata l'età del padre maggiore è la probabilità di ottenere la patologia. e Penetranza ridotta individui che esprimano Il cdrattere Penetrana a Individui portatori dell'allele che codifica per quel carattere Penetrance: The proportian of individuals of a specified genotype who show the expected phenotype Una patologia mendeliana autosomica dominante di norma ha una trasmissione verticale che si presenza in ogni generazione ma in condizioni di penetranza ridotta la manifestazione fenotipica non è sempre presente. Per penetranza si intende il rapporto tra gli individui che hanno un fenotipo patologico sugli individui che invece hanno il gene mutato ma un fenotipo normale. [ PENETRANZA RIDOTTA 6. DO i Conoscendo l'on-set della patologia cioè l'età di avvento possiamo contestualizzare l'evidenza della mutazione, poiché se la malattia si manifesta solo a tarda età tutte le mutazioni di quella malattia non si manifesteranno ad età precoce quindi è possibile che in un pedegree degli individui che hanno l'allele mutato ancora non manifestano il fenotipo patologico. m mv * Espressività variabile Cioè la correlazione tra la mutazione presente nell'allele con la gravità dello spettro patologico che può essere prodotto. La neurofibromatosi di tipo 1 che ha un ampio spettro di possibilità patologiche Un esempio dell'espressività variabile è il mosaicismo somatico che è dovuto all'inattivazione ca suale dei cromosomi X. L'inattivaziona variabile può presentare un fenotipo in alcuni distretti cellulari ed uno differente in altri distretti cellulari. * Eterogeneità genetica Il fenotipo patologico può essere causato dalla mutazione in più loci differenti. Basta che vi sia una mutazione in un gene della globina può influire producendo lo stesso fenotipo. Il fenomeno dell'epistasi si verifica quando le mutazioni in un gene contribuiscono a mascherare il fenotipo normalmente prodotta da un altro gene. Questo può complicare l'individuazione dell'analisi. Quindi abbiamo diversi geni che causano la stessa malattia. * Eterogeneità allelica Vi sono diversi alleli dello stesso gene che possono causare uno diverso spettro clinico o comunque differenti manifestazioni patologiche. Un esempio è la fibrosi cistica (autosomica recessiva) in cui le possibili mutazioni sono più di 2000 e ognuna di queste può causare conseguenze fenotipiche differenti. * Esordio (on-set) Indica il momento in cui esordisce la malattia utile per valutare quando potrebbe verificarsi la manifestazione clinica della patologia. e Anticipazione Di norma la severità di una patologia aumenta da una generazione alla successiva sviluppando in alcuni contesti un esordio patologia precoce rispetto alla generazione parentale. In particolare possiamo evidenziare questo fenomeno nelle patologie che derivano da espansione di alcune porzioni geniche come le triplette. Quando il loro livello di espansione supera un certo limite di tollerabilità si rientra nella manifestazione clinica. Repeat Numbers Normal Affected Disease Inheritanca pattern | Repeat | Gene Huntington Disesse | Autosomal domineni | CAG | HD <36 240 FragileX X linked CGG | FRI <60 >200 Myotonic dystrophy | Autosomal dominant | CTG | DMPK <30 80-2000 Friedrich ataxia Autosomal recessive | AAG | FRDA <34 36-100 * Triplet repeat expansion (CAG repeat i O leading to expansion of polyglutamine) mi * Autosomal dominant = cloni «i * Progressive neurodegenerative disorder « n 56109 * Anticipation: there is an earlier and - earlier age of onset from generation to = “ © °3 n. generation MICI TT I so 2% 4 so so io to 120 Tutte queste situazioni possono andare ad aumentare i classici esempi di genetica mendeliana applica all'uomo. e TIPI DI DOMINANZA Tipo di dominanza —AYA' = 474? AA?ibrdi d A! è dominante su A? Completa x ma “L ‘A? è recessivo rispetto ad A' A? è dominante su A' Gonpeta i E eee A' e A? sono dominanti veda «RM fo l'uno rispetto all'altro e Dominanza incompleta Un esempio è l'ipercolesterolemia familiare in cui si ha un aumento delle concentrazioni di colesterolo nel sangue. In questa condizione la presenza di eterozigosi comporta la formazione di un fenotipo intermedio fra la condizione wild type e la condizione mutata. e Codominanza Codominance Example: Speckled Chickens è 88 = black fathers WW= white feathers BW = black & white speckled feath # Notice= No GRAVI NO BLENDI Each featheris either black or white Gli individui mostrano entrambi i fenotipi omozigoti, alcuni in certi distretti cellulari ed altri fenotipi in differenti distretti cellulari. O comunque può presentare l'espressione di entrambi i fenotipi in tutte le strutture cellulari come la codominanza per il gruppo AB sanguigno. e Imprinting genomico L'epigenetica può controllare il silenziamento di un gene, questo causa che alcuni loci di provenienza materna o paterna possono avere alcuni tipi di metilazione, derivanti dalla linea germinale, che possono interferire con l'espressione di un gene. 10. Genomic imprinting Deletions on chromoscome 15 can result in Prader-Willi or Angelman syndrome Prador-WIlli Syndrome «initial failure to thrive distinctive facial features Paternal “developmenta delay Avpogonedism li Angelman Syndrome jerty, ncoordinatac MOVEMENtS Liaiarnai “unprovoked smilng/Iaughter lack of spesch «severe developmental delay * Alleli multipli Vi sono diversi geni ed alleli che codificano per lo stesso carattere. Esempio gruppo AB sanguigno. e EREDITARIETA' LEGATA LA SESSO | primi esperimenti di questo tipo di ereditarietà è data dagli esperimenti di morgan nello studio della drosophila. | geni x ed y contengono del materiale genetico in comune mentre altre strutture geniche sono specifiche per la determinazione del sesso come il gene SRY o AZF. redit Comparisons among the sex na sin RESA chromosomes of different mammal groups Be X chromosome indicate that the X and Y chromosomes received addiions of material from other — chramosomes. Dai Genes on the Y chromosome criginated ben Ychromosome from the ancient X-Y pair, or from these adoitions, or were copies cf genes on one an fue] ro of the autosomes. Il Only genes with important male-specific functions, such as sex determination and spermatagene: retained on the differential region of the Y 900-160 genes 70-200 genes chromosome. Il cromosoma X è molto più grande del cromosoma Y. In altre specie il sistema di trasmissione del sesso è leggermente diverso. ei © © : (c) The Z-W system , a TÀ © © & © (4) The haplo-diploid system Gli uomini sono definiti emizigoti poiché contengono un unico cromosoma X che non presenta il cromosoma diploide. Durante la fase di gestazione, circa a 16 giorni, si ha l'inattivazione casuale di uno dei due cromosomi X che una volta inattivato andrà a formare il corpo di barr. In base a quello che viene inattivato si parla di mosaico somatico che può portare a esposizioni fenotipiche. X chromosomes an and the tortoiseshell cat. "°° ille for = orange fur Early emb cl 5 nre: — Allele for black fur Cell division and X chromosome Tuo cell inactivation populations in adult cat: CS E ix Active x—_teman} active Xp) Black fur Orange fur \ Nelle condizioni genetiche x linked recessive ogni individuo maschile è malato mentre tutte le donne sono portatori sane. Naturalmente l'individuo maschile non può trasmette la mutazione al figlio maschio in quanto il padre trasmette il cromosoma Y. Xinked recessive, carier mother tatner mother x = Femmina normale LX = Femmina portatrice. li il XK bri mate Ml vrantcie x è = Maschio normale ]Ateciea CI carie dd RI IL Carne anogntr.— degne x Y = Maschio malato Le caratteristiche sono che: e Colpisce principalmente il maschio e genitori di norma sono sani e Ledonneaffette sono delle casistiche molto rare ® Assenza di trasmissione da un maschio malato al figlio, mentre tutte le donne sono sempre portatrici sane « l individuo affetto è più frequentemente un maschio * i maschi affetti sono comunemente nati da genitori sani — la malattia viene ereditata dalla madre che è portatrice sana (elerozigola) e può avere parenti maschi affetti - le femmine portatrici sono fenotipicamente normali (asintomariche) — nmedia, 1 sud fli è afeto XH «in media il 50% dei maschi di una famiglia è affetto * NON vi è trasmissione da padre a figlio maschio Xu Qh XHXH | xi yH XHY | XhY — ma un matrimonio di un maschio affetto con una femmina portatrice può simulare una trasmissione da maschio a maschio Sindrome dell'X fragile normale (XY) x portatrice sana (XX) 50% femmine, normali 50% femmine, portatrici 50% maschi, normali 50% maschi, affetti MALATTIE Frequenza per 10.000 maschi Daltenismo 800 Ritarco mentale X fragile 5 Distrofia muscolere ci Duchenne Emofilia A (citt di colaguizione da defi i faticre VIN) 2 Emofilia B (feto i oraguiazione da defici sifattcre x} 03 La distrofia muscolare di Duchenne ll nome “X-Fragile” deriva dal fatto che la mutazione del DNA provoca una modificazione della struttura del cromosoma X che visto al microscopio presenta una “strozzatura” nella regione terminale del cromosoma X (927.3), dove è situato il gene FMRI1. i ME Colpisce molto più frequentemente i maschi rispetto alle femmine: infatti queste ultime possedendo 2 cromosomi X hanno anche una copia. del gene che può funzionare correttamente. Lo sviluppo mentale delle persone affette da FraX è molto vario. Alcune mostrano capacità cognitive quasi = normali, altre un lieve ritardo mentale, altre ancora un ritardo mentale più grave. * La distrofia muscolare di Duchenne è una malattia legata al sesso e di solito colpisce soltanto i maschi. | soggetti affetti diventano progressivamente più deboli, a partire dai primi anni di vita. * Qual è la probabilità che una donna con un fratello affetto dalla malattia generi un bambino anch'esso affetto? * Qual è la probabilità che il bambino abbia ricevuto l'allele? * Se fosse invece stato il fratello del marito ad aver avuto la malattia, quale probabilità vi sarebbero che il figlio abbia ricevuto l'allele? Esistono anche delle patologie x-linked dominanti che possono portare a delle condizioni molto gravi. Ma esistono anche delle patologie y-linked che producono patologie unicamente maschili e spesso sono legate allo sviluppo dell'infertilità o comunque a condizioni dell'organo maschile. * generalmente le femmine sono affelle il doppio delle volte dei maschi — certe malattie sono letali nel maschio + le femmine sono spesso affette più lievemente e con più variabilità dei maschi fovuto all'inattivazione del cromosoma X (0 Lyonizzazione) * padri affetti possono avere solo figlie femmine affette ma non figli maschi affetti * in media il 50% di tutti figli di una madre affetta saranno affetti FREQUENZE ALLELICHE E GENOTIPICHE Studiare la genetica di popolazione richiede la comprensione di quali sono gli alleli che possono essere distribuiti equamente oppure potrebbero essere più o meno presentati nella popolazione. Ogni individuo possiede due alleli, uno per ogni cromosoma e la combinazione di questi due genera il genotipo dell'individuo. Le somma delle frequenze alleliche e genotipiche è sempre 1. AA aa Aa alla GENOTIPO Genotype Frequeney {frequency of A4) + (irequency of Ao) + (frequency of aa)= 1 Allele Frequency: (frequency of A) + (frequencyofa) =1 La combinazione dei due alleli ci da la combinazione del genotipo. Le somme di tutte le combinazioni genotipiche è sempre 1 e quindi la frequenza delle combinazioni di tutti gli alleli in un individuo è sempre 1. e Frequenze alleliche La somma degli alleli A grande e a piccolo è uguale ad 1. Assumiamo di avere due alleli uno dominante (p) ed uno recessivo (q) * Counting Alleles * assume 2 alleles= 8, b * frequency of dominantallele (8) = p * frequency of recessive allele (b) = q * frequenciesmustaddto 1 (100%), so p+asi a A A sr Ja ] Se un allele recessivo ha una frequenza di 0,4 l'allele dominante ha una frequenza di: 04=q p= 1-q= 0,6 (ro) PICO Accetode ENOTPICHE MUTAZIONI Nel codice genetico le triplette dell'RNA codificano per un singolo amminoacido ma il codice è ridondate in quanto vi sono molte triplette che possono codificare per lo stesso amminoacido ma è anche possibile che la variazione di una delle basi del codone possa causare un cambio amminoacidico o meno. se #5 oi Normalmente in genetica medica il concetto di mutazione è associato per lo più ad una condizione patologica. Quindi è meglio indicare la differenziazione di un paio di basi con il termine variazione se questa non è patologica. Le alterazioni rapide del genoma, di norma, sono associate ad un rapido cambio della complessiva sintesi proteica cellulare dovuta a regolazione nei contesti epigenetici. Ma, vi sono anche delle variazioni casuali che avvengono nel nostro genoma in quanto è una molecola abbastanza fluida. Nonostante la sua dinamicità il genoma è abbastanza stabile nel tempo e impiega molti anni per raggiungere e diffondere una variazione positiva. Per capire se una variazione genetica è associata ad una patologia bisogna correlarla con un'espressione fenotipica. Le variazioni di norma sono cambi della sequenza nucleotidica che possono portare a miglioramenti evolutive e possono essere causate da errori durante le fasi di duplicazioni del DNA precedente alla meiosi (es. l'acondroplasia con l'espansione di triplette). Le mutazioni possono o non possono essere associati a cambi amminoacidici. Esistono vari tipi di mutazioni: e Mutazioni puntiformi -> cambia un unico nucleotide. Possiamo definirle sostituzione di trasversione (purine con pirimidine) o di transizione (purine con purine e viceversa) in base al modo il nucleotide viene sostituito. ® missenso -> causa un cambiamento di un amminoacido. Può causare sia una perdita di funzione che un acquisto di funzione. Può avere anche un effetto non funzionale. Più queste mutazioni sono presenti in un dominio conservato maggiore è la probabilità che siano patologiche. ® nonsenso->se causa la formazione di un codone di stop (UAA, UAG, UGA) nell'mRNA. e silente ->se la variazione nucleotidica non causa la mutazione amminoacidica Se dobbiamo valutare il livello di patogenicità di sicuro la nonsenso ha una probabilità maggiore rispetto alle altre due. Successivamente troviamo la missenso mentre, di norma, la silente non è patologica. Leu Phe ser Cys Glu Leu Tyr Missente © Ley Leu Ser Cys Glu Leu Tyr Nonsense ATE TTE AGG TGA GAG GTA TAT Leu Phe Ser Stop Silent —Leu Phe Ser Cys Glu Leu Tyr e Delezione-> eliminazione di uno o più nucleotidi. Questa può avvenire sia a livello di un nucleotide che di un intero esone. Nel secondo caso di sicuro produrrà proteina funzionalmente patologica. (distrofia muscolare di duchenne) ® Inserzione -> aggiunta di uno o più nucleotidi. Creo un danno enorme causando lo slittamento del frame di lettura. Se questo succede all'inizio di un esone tutta la proteina avrà amminoacidi differenti rispetto all'originale. Quindi normalmente è una mutazione patologica. e Mutazioni frame shift -> spostamento del codice di lettura. Ciò non avviene se inserisco o elimino 3 basi, in questo caso avremo un inserimento o un'eliminazione di un amminoacido ma il codice di lettura della sequenza successiva alla mutazione produce una catena proteica identica alla proteina wild-type. e Splicing site -> mutazioni per le quali si ha una variazione all'interno dell'introne che può provocare un deficit dello splicing (GT-AG). In alcuni casi questi meccanismi sono fisiologicamente utili per creare delle isoforme. Splice Site Mutation Erto eni fpgonenfip Errcerenrcnmer scaredpare are 9/10/11 Erra 9/11 * Regolatorie * Espansione -> espansioni di polinucleotidi come triplette o quadruplette. Se dobbiamo approcciarci ad una indagine particolare su un gene dobbiamo essere in grado di evidenziare e valutare tutte le possibili mutazioni all'interno della sequenza. Naturalmente tutte le alterazioni che possono rilevare a livello di un singolo gene le possiamo ritrovare anche a livello cromosomico in cui non si ha la mutazione di un nucleotide ma di un intero gene. Infatti possiamo avere gli stessi esempi. Caprie O Te ie Compa, 1 Pomo ep o i CaGGUE e n Compra Ve Poma enni kan Deleted Duplicated i dit — BEE — 5 Eect of base dupications depend on location too mueh information is est it may be fatal to rare the organism and may result in early death (e.g., Ù suplication resides in c or non-codi Giu chatmdtome large dele rom REBONOTONA co" ‘cero rencodine iromosome #5 CnEmgIO Te ct Conca. e Poma mus o di Inverted VERE aL) — paci) ° Il danno in questo caso dipenderà da ciò che è avvenuto nell'unione delle giunzioni. i CÒ EEE NEI rig a VIET si “icone ivomsames comma ig Aeoctd iti iorms ol isteria -oncagene trenta o mene rego te menos lic e Be ei La nomenclatura delle mutazioni è abbastanza complessa ma al giorno d'oggi tutte le mutazioni vengono definite allo stesso modo per evitare confondimento nel riferirsi alla medesima mutazione in punti del globo differenti, La creazione di una nomenclatura globale è dovuta a: The Human Genome Structural Variation Consortium The Human Genome Structural Variation Consortium fk}GSV) aims to define a high-quality map of structural variation and develop few methods to take advantage of the burgeoning array of genomics assays now available to define genomic structure, including long reads, chromatin confirmation assay, strand sequencing and synthetic read and read cloud technologies. To avoid confusion in he description ol a varianti sod be precede by a let indicati te type ol reference sequence used The reference sequence used must contain the rsiue() desried 10 be change. Possible reference sequence types se Eur); fora coding DNA sequence ke -76A>T) 25 fora genomic sequence like g41®-\>1) “n° for a mitochondriai sequence (Uke m8993TC, sce Reference Sequence) a fora mon<oding RNA reference sequence (gene prodcing an RNA transit bu not a protln sce for an RNA sequence (ike :762>u) +"p" fora protein sequence (like p.Lys76Asn) 4 I } 8 i 8 i s $ i. £ £ E i o ii E I 3 5 i: $ f 3 i < #7 i i 1 8 g z g i ii i | È Foronzef = | i © |, _snbamt | uroni | ama | Zid inten |P, Sritecam mena DNA lei 364 O tra Y ROERO cl gel civil perio le ol nose ue “affected (like c.76 7Ode1ACT, see Discussion) ce [prc AT90AC0,/CAG pag eg ocATT 100 pente locat0/!cATTAcunc e pre “adicaes «delega (ke cT66e10) trap spa nano azien e se pon qu vp" indicates a duplicaton (ike c-7odupA); aplicating insertions are described dad! ©Ò© © 5 : A i: as duplications, not as insertions; ACTTTGIGCC to ACTTIGIGGCE is described enomi reference sequence ‘as cAdupG (no as A. 9insG, eo Discussion) ins indicaces a insertion (like ©-76_77n56) lil cirie + in” indicates an inversion (like 76 83nv) Lo ale dh nia a noli saio LL, + con indicutes a conversion (ite c-123_678conNM_004006.1:c.123._ 678, see "i Recamme tons) indicates an llle (ke (7GA>TI, see Recommendations) «0 is used when the exact position of a change is not known, che range ofthe protein reference sequence (1 TT uncertain is described as precisely as possible and listed between brackets (like ° _ 0(67_70)insG, see Unoertuinties) n _—___+; ESTRAZIONE DEL DNA Il DNA può essere estratto da qualsiasi tessuto e per farlo ho bisogno di alcuni enzimi che rompano le strutture proteiche presenti nel tessuto come le proteinasi ad esempio la proteinasi K in grado di degradare le strutture proteiche che mantengono la conformazione tissutale. Dopo aver degradato il pellet e aperto le membrane cellulare possiamo centrifugare per migliorare la divisione in fasi del lisato. Oltretutto possiamo utilizzare la tecnica fenolo-cloroformio dividere in maniera ancora più performante la fase proteica (inferiormente) dalla fase nucleica (superiormente) . 2 Eliminazione api proteine è cardoarat(enoio Cirotsmo Isomiio Si otengono diverse fasi Superiore contiene gl aci nucleici < Intertase di protene denaturate interiore contene lpdi e protone. con amminoacdi dolo Dopo di che svolgo le fasi di purificazione fino ad ottenere un pellet di DNA da risospendere in una determinata soluzione di interesse. Per quantificare il DNA raccolto possono utilizzare lo spettrofotometro tramite un'analisi a 260 nm. Tramite questo strumento posso calcolare anche il livello di purezza della soluzione calcolando il rapporto dell'assorbimento a 260/280. infatti se il rapporto è inferiore a 1,8 la quantità proteica all'interno della soluzione è molto bassa o nulla. 1 OD; Unit = 50ug/m for dsDNA 1 ODigo Unit = 40ug/mi SSANA D La quantità di luce assorbita è proporzionale alla concentrazione del DNA/AN. Posso anche verificare la qualità del DNA tramite elettroforesi, infatti tramite la migrazione diventa evidente se ho raccolto un DNA altamente degradato (visualizzerò uno smirn) oppure un DNA integro (possibilmente dopo PCR). Dopo l'estrazione il DNA può essere manipolato tramite enzimi di restrizioni. Questi hanno il ruolo di tagliare il DNA in porzioni specifiche. Gli enzimi di restrizione sono stati riscoperti all'interno di batteri come strategia di difesa all'ingresso del materiale genetico durante le infezione batteriofagiche. Gli enzimi di restrizione sono delle forbici molecolari che tagliano il DNA double strand in punti specifici. Queste ci permettono di svolgere lavori di precisione sul nostro genoma. In particolare le endonucleasi svolgono uno scan del DNA in tutta la sua lunghezza fino a riconoscere una sequenza target per poi efettuare un taglio netto. Ne esistono Ill tipologie, dove il primo ed il terzo tipo riconoscono una sequenza ds o ss per poi svolgere dei tagli random mentre la seconda tipologia effettua dei tagli specifici all'interno della sequenza a cui si aggancia. Spesso questi enzimi riconoscono delle sequenze palindrome (identiche se lette al contrario) ed il taglio può essere svolto sia in maniera blunt o in 5'/3' sticky. Il taglio sticky ci indica delle estremità " appiccicose" con dei nucleotidi sporgenti mentre con il taglio blunt ci indica un taglio netto e simmetrico. stichy ends da a Ema nre di " N/A ’ \MA: Restriction enzymes have corresponding symmetry to facilitate A ai I NA. recognition and usually cleave the DNA on the axis of symmetry VALITTIAA Eni cone All'interno del genoma umano si hanno circa una variazione ogni duecento paia di basi, di conseguenza in alcuni individui il sito di taglio dell'enzima di restrizione può essere mutato impedendo all'enzima di agire in quanto non riconosce la sequenza target. Questa differenza individuale ci permette di svolgere delle mappe di restrizione per differenziare gli individui in diversi contesti. mu Uno degli utilizzi più efficaci degli enzimi di restrizione è la possibilità di inserire inserti all'interno di un plasmide tramite dei tagli che producono delle estremità coesive in grado di associarsi in maniera specifica. Questo meccanismo ha permesso di creare tutti protocolli del DNA ricombinante. Prima della PCR i geni venivano individuati tramite il southern blott senza l'ausilio dell'amplificazione. Questa tecnica richiedeva l'utilizzo di enzimi di restrizione per il taglio del genoma. Successivamente veniva corso in elettroforesi su gel per poi interrogare i tagli che ho fatto interagendovi tramite una sonda diretta contro una sequenza target. CN INRNA Sl Sit | nl UE a = = | = prno BOI c ni provata BB sete Se = n tica i — Saro RESI iis i — E | 3 Sapia cio venere salt cpr | qui vent SEE ma SIRO e rie) LE rione “developed by Edwin Southern PCR - Polymerase Chain Reaction (K. Mulls, 1993) UL LULU AHL-ITIL ITKL I Ti 8 molecole di DNA in 3 cieli Resa teorica: 2° P=(2PT Il prodotto di PCR (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n). P_dipende da T, numero di copie di stampo di DNA di partenza Resa effettiva: effetto plateau Wl processo di duplicazione non procede “all'infinito”, esso è limitato da: Quantità dei primers Attività della Taq polimerasi Reannealing dei filamenti 5 Raggiunto il plateau non sì osserva più un incremento nei prodotti Molto importante è l'analisi tramite enzima di restrizione. Infatti, se l'allele è mutato nella sequenza di taglio riconosciuta dall'enzima di restrizione quest'ultimo non sarà in grado di effettuare il taglio. La mancanza del taglio manterrà il frammento unito quindi il suo scorrimento in elettroforesi sarà inferiore rispetto ai filamenti prodotti dal taglio dell'allele wild type. Alle 2 Y co amor || 20 cerotti ver mercio enzo | 00 san acine gt crt I) 1) i] | Ales 11 22 12 Un esempio era l'analisi con l'enzima di restrizione per il fattore VIII mutato negli individui affetti da emofilia. Infatti l'allele mutata conteneva un sito di taglio polimorfico per Bcl Il che in condizioni wild-type era assente. Quindi se individuavamo i frammenti tagliati l'individuo era malato. Un approccio molto importante che si basa sulle tecniche di PCR è la valutazione della presenza di marcatori microsatelliti STRs. Dall'amplificato viene svolta un'analisi capillare in cui si originano dei picchi riferibili alla presenza di più o meno ripetizioni di STR. * il eromosoma Y ha un ruolo importante nella spermatogenesi. + E' stata localizzata sul braccio lungo del cromosoma Y una regione che controlla la spermatogenesi nell'uomo e che codifica per lo human azoospermia factor (AZF) + Individui con difetti nella spermatogenesi 0 con azoospermia presentano delezioni in corrispondenza della regione AZF. » lean a caco di uno o pù ciAzif (AZFa, AZFb e AZFc) comportano la drastica riduzione delle cellule germinali fino alla loro completa assenza. Il test del cromosoma Y per la valutazione dell'azoospermia si basa proprio sull'amplificazione in cui i primer sono disegnati per associarsi alla porzione in cui si potrebbe verificare la mutazione. Se la PCR non si verifica l'individuo è sicuramente affetto. ® Realtime PCR -> diagnostica e Sequenziamento -> Diagnostica Sequenziamento Sanger x Sequenziamento Sanger + classical sequencing (Sanger) Page ser ES leda 1577 The “modem ere” ol DNA sequencing begins shotgun sequencing, assembi.inishing + "next generation" methods: pyroseguencing. CRT, SOLID applications resequencing. epgenets, RNA Sec « "third generation” SSMRT, nanogore, e. ” GESCCTEGCAGGATTGCCT HI IN ' 8 I Wild-type | a PI sequenaimento N65 : a ” Comparing Sequencers Mutato i Î\ Gremist Prosequencihg — Pohmerse based _ Lgatonbasd Ampfcion = EmulsonPER -— MigeAmp Emu PeR | sia \ ntfrn 200 1000 2000 IR IE IERI SSIS A > nesdieneh © © 25000 224069 aste costperrun ton) 8058 sasso so SOSTITUZIONE C->T Contpermo © Stazo so ssi Illumina Sequencing Workflow Dal DNA estratto si ha un taglio enzimatico utile per la fissare degli adattatori alle estremità delle sequenze. Gli adattatori agganciandosi alla matrice ci permettono di sviluppare un cluster di sequenze che verranno amplificate e sequenziate in contemporanea. siper | ssquence | Cluster Generation | + Cluster Generation steps: TL — Template fragment |) Hybridization | I | - Amplification | — Linearization è E | i - Blocking Li MAMA | adapter T fow.cell — Primer Hybridization bibita ku ] T Vie = Cluster 1 Cluster 2 Cluster 3 VARIANTI PATO LOGICHE Il progetto genoma umano ci ha informato che abbiamo circa una variante ogni 200 paia di basi, quindi è importante valutare quali di queste varianti sono patologiche e quali no. Di norma le patologie mendeliane sono rare e quindi spesso le varianti più frequenti non sono patologiche. In genetica medica è importante identificare la variante patologica e individuando quale fra queste causa un fenotipo alterato. Per valutare quale variante è patologica bisogna considerare gli strumenti che si hanno a disposizione: e Database scientifici * Pubblicazioni che dimostrano la veridicità di una condizione patologica e Database La conoscenza ad oggi è abbastanza frammentata e divisa fra molti database: Human reference genome Sequencing projects The Cancer Genomo Atas © Genome- and loc Variants associated with phenotype tend) sordi | Attualmente il genoma umano ha un nome di riferimento basato sugli studi più recenti, di conseguenza più sono gli studi effettuati e più vengono acquisite conoscenze maggiori saranno le release affidabili. Attualmente il genoma umano più affidabile è identificato col codice GRCh38. History of reference assembly GRCA8/Mternce pera: vis 2, ipa resource th bas i cina reserch community coordinate Singer ca con bad fm iluman GenomeBofct multe init HGP_ mmm GRC:reference maintainin, Improving and updates MP made 200}: each genomi rei as egeseted ti one sequence -@ _@-@@._ Number f AUT LOCI Gumren model ALT LOG nd 1 represent popiaton perc diversity i pi ao0 ———=<"—— - 15 May 2014 - New UCSC Gene Track Released for GRCA18/h938 Were happy 1 announce te reease ola new UCSC Genes rack (or ine GRCN38/h938 human Genome Browser Tre n roae ha 1078 Panzer vi £00 in ho previ ein go. Te i rumbne alcanencal genes has increase om 3Ì ME lo 48424 Companng me now gene set we Quindi nella valutazione di una mutazione è importante evidenziare il genoma di riferimento e di confronto. Deletion (2 bases): 13-32914209-ACT-A (GRCh37) Aucnee Genemer Tot Eternal Resources mo © -—] si tema oa © Feedback Il database dbSNP è fondamentale per mantenere un codice di riferimento unico in tutto il globo. Ogni ricercatore che ritrova una sequenza polimorfica comunica l'informazione ad NCBI che ne produce un codice identificativo per poi inserirlo nelle genoteche globali. Data Flow in dbSNP [ sea T Grossa Sol] RAI I__ Sappiate) Research be rea — TGAIICIOTA= lg cquncis t Location OO squnding center NOBI cy | rent |, rneeaenmo riga Bi Pubmed” am Tenecicia= on ono vin uo $ Map view ostabass Vatoon are — TIGAIGICICTA= ® Database di patologia: Sono database specifici che racchiudono informazioni sugli alleli coinvolti in specifiche patologie. Il problema è che alcuni funzionano benissimo altri invece diventano obsoleti a causa della mancanza di aggiornamenti. Questi database di norma sono specifici su una particolare condizione fenotipica e ci informa su quali sono le varianti che producono determinata patologia. Uno dei primi progetti che nacque nel 2002 è LOVD ed ha provato a creare dei piccoli database per ogni variante fenotipica conosciuta anche se non è molto aggiornato. Clinvar è un database di NCBI che ci indica da chi è stata scoperta la variante e in che condizioni fenotipiche è stata associata. +. Data coming f Jan 27% 2018: 580,861 submi ions on 375,116 unique variants from 880 submitters from 63 countries ClinVar ci indica anche lo status della variante indicando il livello di attendibilità dei dati in base al numero di stuti che sono stati svolti. When the highest CinenAoproved and PendineEpert Pane ® Database di sequenza: ci indicano qual'è la sequenza del determinato allele o di un determinato punto all'interno del nostro genoma. Oltretutto ci informa su quali sono i trascritti principali del gene considerato. Di norma il più usato è il database dell'NCBI. Altri database molto utilizzati sono UCSC o Ensemble. Quindi per valutare una variante patologica devo prima valutare la sequenza dell'allele per poi valutare se sono presenti all'interno dei database patologici. e Algoritmi predittivi in silico Sono software sviluppati che ci permettono di valutare il danno patologico di una proteina mutata o il livello di conservazione durante lo sviluppo della specie. Category Name Website Rai Masense pedeton — Consutt to comsuttst tu ac Erolutonan comenston farma ht atte brocompute ong uù Euolutnay conservation Mutstondssesci | Nip/imutsticansesior 9 Bsolutnay comersation mnmeR er pantrerdo orgADoMsr9SCOOm sp Evotonay consenta mosm itp/inp: boloki orgpbsnpphcnp himi Brolutonay comenston sr itptt onor Saco He/anprend a bonne Pot sciefictn Aipovco MA Mi po frac aci sere beams stiate Meine perni Atto re mate Ica sto Cotone rici imap 9 Mc sto cemenota roymenà to pnt ann ce sco perdi motan MA ri Sagerne dci Ae ist suc “ripa namento spina © hire tc mec spot sce e con vt apr Certi SP an at Ferrino cuoo irc aio etto mocaini i ed stones ate nam indizi “naate pesco —— Conco ito cca canoa — — Medornocee Mman Spina Finder Manica eten tecgice ron Nice cm cemento pesco rasi ij Fra questi gene. spishtmi terr md DMS 9 enes ma ec burgelabimanentimanentscan sco mi rr cb tu bervceieGene2 tp rr rutiy orgia, tolviplce him to arr sftbery comberny primi rapisce FOO LT men tanto uit mie n itpAC0mPGE cd comell chart ip Accmpgen bs comell ecu) tp compe cd comwll epr repage pico usati sono il sift ed il poliphen. Postion dependent lege Masi enrepy principi Nessa] retworts Neural retworis Sorci sce he predetor ® A based on siga matnces Gero escdtonay tate pong scormg and sent fato o conser elementi Ad oggi cerchiamo di identificare ogni variante allelica in 5 gruppi in base al grado di associazione alle condizioni patologiche o meno. UERENnRÀ Ct Se una variazione è interpretata come benigna vorrà dire che al 99% non ha ruolo in una patologia, mentre nelle varianti incerte non si ha la certezza della possibilità patogenica o benigna. Se trovo una variante patogenica di sicuro queste è coinvolta in uno sviluppo patologico. Le VoUS (varianti di classe 3) sono varianti che danno molti problemi nella diagnostica poichè producono un livello di incertezza nel loro ruolo che non ci permette di identificarli ne come patologiche ne come mutazioni benigne. Per stabilire il livello di associazione benigna o patologica di una variante si utilizza la classificazione ACMG. Vi sono molti parametri che ci permettono di classificare i dati come: ® Frequenza nella popolazione (Gnomad) poiché maggiore è la frequenza minora sarà il rischio patologico della variante ® Variazione della variante -> poiché se avremo una variazione non-senso probabilmente la condizione è patologica e Osservazioni cliniche ricaptate da clinvar * Sestati svolti studi funzionali della cinetica proteica in vitro o in vivo interpretation of sequence variants DE Recta Parona CATENA Strength of Evidence song | supporting | supporting | moderate | suono 4 oscsotrtogesca | -ss7 | 200 | 20 | an | tar | sso roviinom | SS n rs Lil "pon “ ” = i #3 — 3$| compone si m mu i ie mi m met m ns * È [ronson |__s3 n “| cr ses m Vi sono molti sistemi che svolgono in automatica la classificazione secondo le linee guide CMG. Fra questi abbiamo varsome dove possiamo inserire l'RS della variazione e il tool ci indicherà il catalogazione della variante. Anche il colon e il pancreas possono essere interessati dalla patologia poichè la secrezione di muco appiccicoso, dovuto al malfunzionamento della proteina canale, impedisce il corretto flusso di liquidi per lavare il tessuto creando dei ristagni batterici. La malattia è conosciuta dal 1938 in cui fu descritta da una dottoressa che si accorse che se il bambino possedeva il sudore della fronte salato avrebbe riportato una patologia incompatibile con la vita. Il sudore è salato a causa dello sbilancio elettrolitico dovuto al malfunzionamento della proteina. Questa condizione fu identificata nel 1952 e fu utilizzata per testare la patologia nei bambini tramite lo studio del sudore. Nel 1965 la fibrosi cistica fu identificata come una malattia autosomica recessiva che produceva un alterato equilibrio del cloro. Nel 1985 tramite il clonaggio posizionale che si basa sulla clonazione di tantissime porzioni geniche che si pensano responsabili del fenotipo fino ad individuare quella corretta. Dopo la clonazione del gene l'aspettativa di vita degli individui affetti è aumentata passando dai 5 anni di età nei primi anni del 1940 fino ai 37.5 anni nel 2010. Crati boss: media survival ge, 1940-2007 Median sua pe [ves 1940 1950 1960 1970 1980 1999 2000 2010 Cri Fibrosis Foundation Registry 2007 Il gene clonato nel 1985 è il CFTR, si trova nel cromosoma 7 ed in particolare nella posizione 7q31.2. Questo è un gene abbastanza complesso formato da 27 esoni. romosome 7 * locus: 731.2 - The CFTR gene is found in region q31.2 on razza the long (a) arm of human chromosome 7. Gene Structure: The normal allelicvariant fr this gene is about 250,000 bp long and contains 27 exons. * mRNA: The intron-free mRNA transcript for the CFTR gene 18 6129 bp long. legni * Coding Sequence (CDS): 443 bp within the mRNA code ranza for the amintu'acid sequence of the gene's protein product. Exone vige — CFTR Tana (o) — resa MATRIMONI Il gene produce un conduttore della trasmittanza transmembrana che contiene vari domini regolatori che permettono il passaggio del cloro. CFTR is a membrane protein. TMD-1 and TMD-2 are transmembrane domains. Protein Size: The CFTR protein i 1480 amino aids ng and has a molecular weight 0f 168,173 Da, Protein Funetion: The normal CFTR protein product is a chloride channel protein found in membranes of cells that line passageways of the lungs, liver, pancreas, intestines, reproductive tract, and skin. CFT Is also involved in the regulation of other transport pathways CFTR is made up of five domai sso membrane spanne “omains (SDA and MSD2) that form the chloide ion +two nucleotide-binding domains (NBD1 and NBD2) that bind and hydrolyze ATP (adenosine triphosphate) *and a regulatory (R) domain. All'interno del canale passa principalmente il cloro ma anche altri ioni. Il canale si trova aperto nel momento in cui si ha la fosforilazione dipendente dalle cAMP kinasi del dominio R tramite l'utilizzo energetico di ATP. A questo punto il dominio R si sposta e il canale si apre. Questa proteina è espressa su tutti gli epiteli del nostro organismo. Principalmente si inserisce nelle membrane apicali piuttosto che sulle membrana basale. Quindi la ritroviamo a contatto con il lume dell'organo ma il flusso del cloro è differente in base all'area in cui si trova. Lumen Blood Blood . se =» t. _ x È cAMP al È \KUT CIR cr» Nelle ghiandole sudoripare normalmente il cloro viene spinto verso l'interno bilanciandolo con l'ingresso del sodio da parte di altri canali. Se non si ha l'ingresso del cloro all'interno del lume non si ha l'ingresso del sodio che rimarrà quindi stagnante nel sudore rendendolo salato. Mentre nel polmone il CFTR si occupa di far fuoriuscire il cloro dal lume alveolare alla porzione esterna mucosa. La quantità di cloro nella mucosa aiuta a mantenere una certa quantità di soluti (regolando l'osmolarità) che impediscono un eccessivo riassorbimento di acqua per osmosi dalla porzione mucosa al lume alveolare. Se il cloro non viene pompato nella porzione mucosa la quantità di soluti nel lume sarà decisamente maggiore e richiamerà una grande quantità di acqua fino alla deidratazione delle mucose che ristagnano nelle porzioni polmonari. ® Analisi del gene CFTR L'analisi molecolare del CFTR non permette di escludere ne accertare lo sviluppo della patologia. Infatti la condizione patologica può essere determinata in maniera genica solo dopo ad un primo sospetto clinico. lo posso svolgere una diagnosi della fibrosi cistica se è correlata con una storia familiare tipica, una caratterizzazione genica degli alleli mutati ed un contesto patologico specifico. La caratterizzazione della mutazione nella fibrosi cistica è positiva nel 90% dei casi mentre nel 10% si ha una condizione in cui viene identificato un unico allele mutato, ma questo non esclude la condizione patologica. olirreritiy 1903 s listed in the CFTR METTA Si ha una grandissima eterogeneità allelica responsabile dello stesso quadro clinico infatti al giorno d'oggi sono più di 2000 le mutazioni che porteranno ad dei quadri clinici che hanno diversa gravità. Di norma nel 75% dei casi ritroviamo la condizione una delezione di tre nucleotidi che producono la mancanza di una fenilalanina in posizione 508 della proteina. PHE 5081 793 DL ES ae = Anno Ad Me te Oy Va I vari danni molecolari sono classificati con diverse classi. Le mutazioni di classe 1 producono una terminazione dell'RNA messaggero prematura che di conseguenza non produrrà nessuna proteina creando un fenotipo estremo. Le mutazioni di classe 2 comprendono delle mutazioni nell'mRNA che non gli permettono di essere tradotto e di conseguenza non si avrà l'aggiunta della proteina alla membrana creando una condizione patologica grave. Le mutazioni di classe 3 invece producono una proteina che non è in grado di rispondere ai segnali, mentre la classe 4 produce una struttura proteica che non è funzionalmente attiva. Infine ritroviamo le mutazioni meno gravi di classe 5 in cui si ha una diminuizione della funzionalità classica che viene correlata con un fenotipo meno grave. One Way of Classifying CFTR Mutations Severe lung disease Milder lung disease Mid lung disease Pancreatic insufficiency Pancreatic sufficiency Pancreatic sufficiency Abnormalsweat chloride -—Abnormal sweat chloride | Equivocal sweat chloride DFS08 R117H (57) RI17H (77) ® o i Sa 38494 1018 CtOT 38494 108 C1OT E |P Pea x $ @ 65510 2789456104 6515 W1282X R33AW D1152H Normal Class Classil —Classill —ClassiV-—ClassV N1303K case AASSE Sco md a "feti muri RSSIX 601R È sntiom pepate cosà han pic a dv DE 3120 + IG-t0T R347P suerte 1078 delT R347H RISK R3G7L In cui nella fase di ibridazione si utilizzano delle sonde che contengono alle estremità le sequenze riconosciute dai primer che si utilizzeranno nelle successive fasi di PCR che oltretutto si posizioneranno nell'area del polimorfismo. Le sonde sono due, se si ibridano correttamente nelle successive fasi di ligazione produrranno un frammento unico mentre se non si uniscono correttamente a causa del mishmatch durante le fasi PCR non si avrà una nessuna amplificazione del prodotto. La diminuizione del prodotto viene rilevata tramite elettroforesi capillare per mezzo dei fluorofori presenti nei primer della PCR. Each peak is the Do amplification produetofa |. ||* specific probe. n Samples are compared to | | I{[ a control sample. ILL | | Lin A difference in relative k height or peak area indicates a copy number change of the probe target sequence AI termine delle varie fasi svolgo un'elettroforesi capillare per identificare i vari esoni e le loro quantità. Dopo di che confronto il segnale di riferimento tra i campioni controllo e il campione di esame. Se ottengo una diminuizione del segnale per un determinato esone sicuramente avrò una quantità minore di questo esone dovuta al fatto che l'amplificazione non è avvenuta correttamente a causa della presenza della delezione o del polimorfismo. Combinando i tre livelli delle analisi riesco a caratterizzare il 92% delle mutazioni e di conseguenza di individuare la patologia nel 92% dei casi. Proprio a causa dell'8% che non riusciamo a identificare la negatività di una di queste analisi, in contesti specifici e possibilmente sintomatologici, non è in grado di escludere la malattia. ll test è indicato per + Soggetti con sospetto clinico di forme class * Soggetti affetti da forme lievi o atipiche di FC + Familiari degli affetti + Diagnosi Prenatale in coppie a rischio în cui sono note le mutazioni * Diagnosi prenatale quando si evidenziano anse intestinali fetali iperecogene Partner di soggetti portatori sani o affetti da FC * Soggetti azoospermici o con grave oligozoospermia da assenza congenita dei dotti deferen-ti, bilaterale (CBAVD) 0 monolaterale (CUAVD) Attualmente le difficoltà sono: ® La correlazione genotipo-fenotipo poiché è difficile correlare la variabilità del fenotipo con la presenza di diversi alleli nel genotipo, anche poiché a livello statistico avendo 2000 mutazione è difficile identificare il fenotipo di un individuo che ha lo stesso genotipo di un altro individuo. e Quali varianti sono patologiche e Qualè il loro significato clinico e Qualè il danno molecolare Per rispondere alle ultime tre domande si possono utilizzare i database online come DB che ci permette di osservare tutte le possibili mutazioni correlate con la patologia. Il problema è che non si riusciva a vagliare lo studio genotipico con la reale possibilità di avere un fenotipo clinico. A causa del prolema questo database è diventato obsoleto ed è stato sostituito dal database CFTR 2.0 che si pone proprio di superare questi limiti inserendo i dati clinici che sono correlati con le varie mutazioni del gene. Fibrosi Cistica 1008 39,545 patients 28 registriesiclinics Sweat Chloride || Lung Function Pancreatie SFTR Genotype | | Concentration || (FEVi%predicted) Status I sarepatiente with -—|—1440 patente 16204 patients 5309 — 1 mutatio unknowm rising sweat data missngReT. Com data (aspapatnt it so messoremens © |_ eine enduded 3 measurements <5% predicted encudedi 70,466 CF chrotnistmaa 24,892 23,338 30,236 with a mutation patients patients patients . identified Ci si è posto il dubbio quali fossero per certo le mutazioni patologiche e per rispondere a questa domanda le mutazioni che dovevano essere clinicamente consistenti e dovevano associarsi a queste caratteristiche: se Cli vated sweat chloride concentra! * Reduced FEVI % predicted * Exocrine pancreatic disease * Infection with Pseudomonas aeruginosa ically cansistent mutation * Other features (meconium ileus, male infertility (CBAVD) È molto difficile ottenere i dati clinici per le mutazioni rare mentre per le mutazioni frequenti è possibile stimare la condizione genotipica caratteristica. Ad esempio per chi ha la mutazione più frequente delF508 è stato possibile studiare la correlazione tra concentrazione di cloro nel sudore correlandola la genotipo dell'individuo: fi Mean 103 + 168 meg/i 1500 60 mEg/L 1000 Co) Number of patients % 100 180 Sweat chloride concentration Oltre a questo sono stati svolti gli studi funzionali per queste mutazioni classificando i vari livelli patologici che producono queste mutazioni caratterizzando la tipologia genotipica. Clinically consistent mutation pere darti ir Functionally consistent mutation — Genetically consistent mutation CF-caus In questo tipo di database è possibile associare una variante allelica ad un'altra per verificare il possibile fenotipo patologico. Naturalmente solo nel caso in cui questa variante sia stata appositamente studiata. ® Patologie associate alla fibrosi cistica La variazione nel gene CFTR può causare sia la fibrosi cistica sia delle patologie associate definite forme atipiche della fibrosi cistica. Normalmente in quest'area patologica ritroviamo assenza congenita dei vasi deferenti, pancreatiti acuti e rinosinusite croniche. Queste sono patologie che sono presenti nella fibrosi cistica comune ma nel quadro atipico si ha solo il coinvolgimento di questa particolarità fenotipica. Per causare la fibrosi cistica classica ho bisogno di avere entrambi gli alleli mutati mentre se ho solo una mutazione allelica CFTR con l'associazione ad altre porzioni geniche posso riscontrare il fenotipo atipico in cui la sintomatologia patologica si manifesta specificatamente in un tratto o in un organo. Fra quelle atipiche ritroviamo l'CBAVD che è causata da una mutazione classica delF508 nel gene CFTR associata ad una mutazione |VS8-5T nel corrispondente allele del CFTR sul cromosoma omologo. frequency in CBAVD n 5-409%) is imes higher than in the general population Se ho questo tipo di mutazione viene svolto uno splicing anomalo. Questa condizione causa una grave azooligospermia data all'assenza congenita dei vasi deferenti. Le più comuni sono le patologie da espansione di triplette e possono seguire modalità di trasmissione di tipo dominante(corea di Huntington), recessiva (atassia di Friebriech) o X-linked (X-fragile). Naturalmente, più è larga l'espansione più è probabile che la condizione causi un fenotipo patologico. L'espansione eccessiva può produrre anche il fenomeno dell'anticipazione. Se durante il passaggio generazionale il numero di triplette (o quadruplette ect.) si espande può produrre un on-set precoce cioè un avvento prematuro della patologia rispetto all'esordio parentale. In base a dove e a quali espansioni si manifestano possiamo ottenere un fenotipo diverso: Huntington | AD CAG Coding region disease (exon 1) Fragile X_|X-linked CGG syndrome untranslated n region Myotonic [AD CTG 3- dystrophy untranslated i % region Friedreich | AR GAA Intron ataxia Nella sindrome dell'X fragile se le ripetizioni superano un certo range di espansioni si produce una iper- metilazione producendo un blocco della trascrizione. Situazione completamente diversa risiede nella distrofia miotonica, in cui il danno molecolare prodotto dalla ripetizione nella regione 3'UTR si manifesta dopo la trascrizione del gene in mRNA. La porzione 3'UTR dell'mRNA è in grado di sequestrare i maniera eccessiva molti fattori di splicing necessari per le attività di splicing cellulare. Questo crea una mancanza dei fattori ed un con seguente splicing anomalo sia nel suddetto gene che in altri geni fino a produrre il risultato patologico nell'individuo. Infine, nella corea di Huntington l'espansione produce una proteina tossica per le funzionalità del sistema nervoso e di altri organi. Vengono considerate delle patologie mendeliane ma le consideriamo separatamente poiché possiedono queste caratteristiche: tendency toward earlier age of onset and/or greater severity in each subsequent generation, due to progressive expansion of the repeat length. * Parent-of.origin effects + Skewed X-inactivation +. Methylation effects incomplete penetrance * Variable expressivity + Premutation alleles: ‘asymptomatic, but unstable, with a tendency to expand in the next generation La pre-mutazione allelica è una condizione in cui l'individuo possiede un range di espansione che non causa la patologia ma potrebbe trasmettere la condizione alla successiva generazione o manifestarla a livello somatico. Purtroppo queste condizioni esulano dalla attività di sequenziamento poiché è difficile stimare un'espansione tramite i NGS moderni. La maggior parte dei sintomi sono cognitivi o neurologici e di norma l'on-set è quasi sempre tardivo (a parte I'X fragile che invece è immediato) dopo i 30-40-50 anni. In questi casi la consulenza genetica è molto difficoltosa sia sul lato psicologico dell'individuo sia sull'aspetto fenotipico e prevede un test diagnostico di pre-anticipazione dell'esordio e della severità della patologia. | nostri sistemi di riparo del DNA sono in grado di riparare i bassi numeri di ripetizione ma dopo un certo livello il sistema di riparo non è più in grado di recuperare il danno. Contracton Expansion CN Ci bemesmonzi "O. Gone * Protein role in impara ONA pae ancon o protein Id NA regale 10 inreased DNA demane e Condizioni associate ad espansioni di CAG (Corea di Huntington) In questo tipo di patologia si ha un range di ripetizione compreso tra 30 e 100. Di norma, porta ad una condizione neurotossica poiché l'eccessiva ripetizione probabilmente produce una proteina aberrante con interazioni tossiche. Il problema di queste patologie è che se produco un knockout di topo, eliminando il gene, non sono in grado di ottenere il fenotipo neurologico nel modello murino. Mentre posso ottenerlo solo se produco un topo transgenico introducendo un certo livello di espansioni. Questo significa che il fenotipo patologico non è dato dall'eliminazione del gene ma proprio dall'espansione della tripletta nel gene. Fra questa tipologia di espansioni ritroviamo la corea di Huntington che è un patologia che ha un on-set tardivo di norma compreso tra i 30-40 anni. È una patologia che ha una progressione patologica di circa 25 anni che spesso porta alla morte in un range di tempo compreso tra i 10-25 anni. Phase Vears Symptoms =——r<7<y<———— Transitional _—03 f moodswings behaviara disturbances, hyperreflexia, memory impairment, Increased clumsiness,impairment of voluntary movements, eye movement abnormalities farty 35 | dysarthria chorea gait abnormalities. Middle 8-10 |. bradykinesia, rigiity global dementia, dystonia, dysphagia tate 15-28 | incontinence, wasting, aspiration, bed ridden death | sintomi clinici più gravi sono: i movimenti coreici; problemi nell'equilibrio; disfun zioni cognitive e cambi di personalità. Fondamentalmente a livello anatomico abbiamo un'atrofia del nucleo caudato e del putamen che si traduce in una seguente atrofia dei nuclei striati che ci porta alla perdita di una serie di neuroni dei nuclei cerebellari. L'incidenza della corea di Huntington è di circa incidence of Huntington Disease per 100,00 People African Blacks 006 South African Whites 24 Japan 038 Finland 0s Hong Kong 25 American Blacks 37 Western Europeans 7 American Whites 7410 North Sweeden 196 Tasmania, Australia ma Moray Firth, Scorland* 560 (5 people in <1000) 2ulla, Venezuela 700 Questa patologia è stata scoperta anche grazie a Woody Guhtrie che era un noto cantautore. Nel 1983 è stato identificato il gene tramite un meccanismo molto complesso. Nonostante siamo stati in grado di clonare la proteina non siamo ancora in grado di identificare il preciso processo molecolare che porta alla condizione neurologica. Le triplette possono diventare instabili aumentando il livello di espansione fino alla creazione di un certo livello di instabilità. L'instabilità non si sviluppa solo durante le fasi meiotiche, può avvenire anche durante le fasi mitotiche all'interno delle cellule somatiche creando un certo mosaicismo in certi distretti cerebrali; in particolare nel tessuto striatriale piuttosto che in quello cerebellare. w- tn n) om 40: osta s <35: Nomal alle 9 Krone 8 18 Non-HD chromosomes ‘———— $ 16 m HD chromosomes $ 14 Interganerational instability Somatic instability H 12 5% 8 E n... 5 6 Generations A 4 4 ;: il nt È lin Anticipation 1 stor 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 Meine i Number of CAG repeats Da questa immagine vediamo che mentre le persone sane hanno un range di espansione tra i 10 e i 20, le persone malate hanno un range di espansioni che va dalle 40 alle 60 ripetizioni. L'Huntington essendo una patologia molto studiata ha prodotto un gran numero di dati che ci permette di valutare in maniera adeguata la correlazione fenotipo-genotipo. Normal result. Peopl it ts rest sk o veloping HD, or re tes ch zone” resute. People win hs rsu ar n ut kl doveloing HD ihemeatve, bui el chron May st bot ik o imbering an abnormal gene adi leveling HD. Gray zone” resi PEGAE VA rsu may oe may not veg HD ihemeelv. Their chien are at SRL norm n abrcrmal gene an veloing MD. Abrormal result. Peogl wi th resut ll develop HD thomseles a some point. Thes chdren ar a rik ol ‘oherdng an stmomal gene an eeloing HO. 0 5 10 15 20 25 30 35 40.46 | range di ripetizioni compresi tra 27 e 35 non presenteranno, sicuramente, la patologia ma hanno una buona probabilità che nella successiva meiosi producano un allele espanso, che se ereditato dalle generazione filiale potrebbe causare la patologia della corea di Huntington. Tra le 36 e 39 espansioni, la patologia potrebbe presentarsi in maniera lieve con penetranza incompleta, soprattutto in età avanzata di 60-80 anni. Il range con un numero di ripetizioni inferiori a 27 è sicuramente associato un soggetto sano mentre se è superiore a 40 ha sicuramente un fenotipo patologico. L'on-set diventa sempre inferiore con l'aumento del numero di ripetizione fino ad arrivare a condizioni in cui si può verificare la patologia giovanile con un esordio a 10-20 anni quando il numero di ripetizione è superiore a 60. Age of onset CAG repeat >80 36-39 so |a |a GAI TCS e — e Contiene solo porzioni codificanti e non vi sono introni ® Trascritto Policistronico -> tutti i geni vengono trascritti insieme e Non sviluppa ricombinazione (al contrario del fenomeno di crossing over eucariotico) * Ereditarietà principalmente materna e Codice divergente da quello eucariotica (es. tRNA eucariotici non sono compatibili per le attività mitocondriali poiché alcune triplette non hanno lo stesso linguaggio del genoma mitocondriale) Latte iran DNA fiere coda Snc ato 30000 BART e gen Il genoma nucleare contiene solo per il 3% una porzione codificante mentre il genoma mitocondriale ha circa il 93% di aree codificanti. Il genome nucleare è caratterizzato dall'avere un'organizzazione molto complessa poiché: contiene istoni, vari livelli di package e porzioni non codificanti. Mentre il genoma mitocondriale non è protetto da binding proteici, quindi è molto soggetto agli stress esterni, come ad esempio i radicali liberi che si formano all'interno del mitocondrio. Anche il numero di mitocondri è variabile all'interno della cellula poiché sviluppano dei meccanismi di replicazione totalmente differenti dai meccanismi eucariotici. Dentro il concetto di genoma umano dobbiamo includere anche il genoma mitocondriale: Hoc Atrani gnome RON dii pen vano EL (mtonA) Sea procainici che con queli eucarioti: geni sono privi iintroni vengono trascritti come MANA poliistronii a partire da due promotori [{=i > su clascun filamento della doppia elica de un sito di inizio della sintesi di DNA D®> 4 > le sequenze di DNA poste tra | geni codificanti per proteine codificano per i RNA La regolazione dell'espressione genica all'interno del mitocondrio non avviene nello stesso modo della regolazione del genoma nucleare, oltre al fatto che la produzione è policistromica. Il DNA mitocondriale non è autosufficiente poiché tutto il processo della fosforilazione ossidativa è data da strutture proteiche che contengono porzioni sia di origine nucleare che mitocondriale. L'unica cosa caratteristica del genoma mitocondriale sono i transfert utilizzati per la traduzione degli mRNA mitocondriali. Questo ci esalta la mutuale dipendenza dei genomi sia mitocondriali sia nucleari, poiché senza l'uno l'altro non riuscirebbe a sopperire ai meccanismi energetici della fosforilazione ossidativa. Con patologie mitocondriali facciamo riferimento: e Mutazioni nei geni nucleari che causano problemi nel mitocondrio (ereditarietà mendeliane) * Mutazioni nei geni mitocondriali Ciò che complica molto l'ereditarietà mitocondriale è la presenza di molti mitocondri in una singola cellula, poichè la mutazione che è presente in un mitocondrio non è detto sia presente negli altri e di conseguenza durante la divisione cellulare non è detto che le cellule figlie ereditano il mitocondrio con il genoma mutato. Con il termine eteroplasmia si indica la presenza di mitocondri che hanno genomi differenti all'intero di una singola cellula. Definiamo omoplasmia quando tutti i mitocondri all'interno della cellula contengono lo stesso genoma. ‘mitocondri normali | mitocondri ereditati dall'individuo originano una ripartizione casuale durante le fasi mei otiche delle cellule materne. In questa situazione possiamo ottenere una cellula figlia che ha meno mitocondri mutati ed una che ne ha un numero maggiore. Proprio per questo è evidente che il genoma mitocondriale non segue le leggi dell'ereditarietà mendeliana. Questo meccanismo avviene anche nelle fasi meiotiche durante la generazione dell'ovocita. La ripartizione mitocondriale è casuale e di conseguenza in base alla casualità con cui l'ovocita verrà fecondato si ha la possibilità di esporre fenotipi patologici. $% do 050 )_(a 97 0890 098 _ : od Le patologie mitocondriali mostrano un ampio spettro di variabilità anche nella stessa famiglia proprio perché si queste strutture si replicano e segregano casualmente nelle cellule figlie. Spesso quando si studiano patologie mitocondriali sarebbe utile studiare più tessuti. Tramite la biopsia si prelevano varie aree da studiare come il muscolo considerando od anche le porzioni epiteliali, per verificare il livello di l'eteroplasmia mitocondriale. Il genoma mitocondriale è soggetto ad un livello 10 volte maggiore di modificazioni e mutazioni rispetto al genoma nucleare, sia perché non ha nessun livello di protezione istonica o proteica sia perché è situato in zone in cui si ha un alto quantitativo di prodotti ROS. Oltre a questo, l'elevato livello di replicazione del genoma mitocondriale porta all'accumulo di un gran numero di errori durante queste fasi duplicative (al contrario del genoma nucleare che di norma replica unicamente quando si succedono le fasi di mitosi). Le attività di replicazione del genoma mitocondriale sono indotte dall'aumento della richiesta energetica. Infine il mitocondrio non contiene efficienti attività di proofriding (correzione delle bozze). Le malattie mitocondriali rappresentano un gruppo eterogeneo di sindromi cliniche accumulate da un deficit energetico nel metabolismo mitocondriale. Nonostante il mitocondrio sia sede di vari metabolismi cellulari i problemi principali sono ritrovate all'interno della catena fosforilativa. Per uno studio più efficiente di tali patologie si hanno dei database specifici che raccolgono informazioni sui geni e le proteine associate a tali malattie. Normalmente le patologie mitocondriali vengono ereditate dalla madre. Quindi spesso soltanto le femmine affette riescono a trasmettere il carattere. La spiegazione di ciò risiede proprio nei meccanismi di fecondazione. Lo spermatozoo durante l'ingresso nella cellula uovo perde la propria coda che contiene l'assetto citoplasmatico e di conseguenza i mitocondri. Mentre, la cellula uovo conserva un gran livello di citoplasma in cui sono contenuti i mitocondri che verranno ereditati dallo zigote. Lo spettro dei disturbi mitocondriali è vasto, ed essendo presenti in tutti i tessuti e possibile che la patologia colpisca vari organi a differenti livelli. tollepy ) Stroke — Muti} Aging và ezine penna ove dn Spesso sono interessate le cellule muscolari e le cellule nervose poiché sono le cellule che richiedono un maggior apporto energetico soprattutto durante lo sviluppo. Le patologie mitocondriali vengono definite neuromiopatie-mitocondriali. Si hanno alcune eccezzioni come la neuropatia ottica ereditaria di Leber che colpisce principalmente le porzioni oculari. Questa tipologia di patologie si esprime principalmente durante lo sviluppo puberale poiché durante questa fase si ha un aumento di espressione delle porzioni mitocondriali per soddisfare il fabbisogno energetico. » if if L Agenti I gene codifica per DDPI (deafness/dystonia protein-1) une compenente del Sistema di trasporto della membrana esterno È Superossido ditmutasi CuZn-dipendente ct nvcuzan cus amigo di scesi terze gnetrefice) no 7 Outer membrane Ogatnose. co AS "ratonta ama serene Se ® errare space ra nori inner membrane = ri Morostany spastic parapalegia —Friedreich ataxia cn diseaso x K ” \ | T.@ S È CA Compri © Complerli Compiti © Complex iv compia stele © 5 i : : Frotossina: protein legante ferro ATP.ase traspertatrce di rome Pereplegna se a metal pressi {ste ronnie dicono. Vi sono molti geni nucleari che traducono proteine che collaborano all'interno del mitocondrio nel sistema OXPHOS (fosforilazione ossidativa). Se si hanno alterazioni in tali geni nucleari la conseguenza sintomatologica può essere confusa con alcune patologie associate al genoma mitocondriale Le patologie che causano danno al mitocondrio possono essere: (A) Eredità materna nella Leber hereditary optic neuropathy (LHON); la donna trasmette la mutazione ad ogni nascituro, mentre l’uomo non trasmette mai alcuna mutazione; (8) Eredità autosomica dominante nella dominant optic atrophy (DOA): uomo e donna hanno la medesima possibilità del 50% di trasmettere la mutazione ad ogni nascituro; (C) Eredità autosomica recessiva nella Friedreich ataxia (FRDA): ogni allele mutato del genitore ha un possibilità del 50% di essere trasmesx alla generazione successiva, ma la malattia si manifesta sono quando il nascituro riceve l’allele mutato da entrambi i genitori. Molte patologie si pensano siano causate da problemi del mitocondrio come la fasi di invecchiamento date da un eccessivo aumento dei prodotti ROS. Ad oggi vi sono anche dei meccanismi che tentano di spiegare come il DNA mitocondriale possa essere tossico in quanto è sottoposto a mutagenesi elevata. Per preservare il mitocondrio se il DNA mitocondriale ha un livello di mutazioni eccessivo viene esternato dal mitocondrio e disperso nella cellula. Quest'ultima lo recepisce come DAMp stimolando i meccanismo infiammatori. Alcune di queste condizioni spesso sono associati a meccanismi che legano le attività neurologici a quelli infiammatorie. Il DNA mitocondriale alcune volte viene utilizzato per la medicina forese per l'identificazione del genere femminile in quanto non ricombina e quindi ci permette di identificare la parentalità. Oltre a questo, può essere considerato anche per la valutazione dell'evoluzione biologica associata all'individuo. PATOLOGIE CROMOSOMICHE LE MALATTIE CROMOSOMICHE | cromosomi durante il ciclo cellulare i cromosomi replicano e sì La pozione dl ceomer conce na cnr formano due cromatidi fratelli tenuti insieme dal METICENTICO SUBMETACENTICO ACROCENTRCO — TELOCENTACO centromero braccio corto = p (petit) braccio lungo = q (lettera successiva) { metacentrici, se il centromero è centrale 1, 2, 3, 16, 17, 18, 19 submetacentrici, se il centromero non è centrale e non è vicino ad un'estremità 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 20, X,Y acrocentrici, se il centromero è vicino ad un'estremità 13, 14, 15, 21,22 Le patologie cromosomiche sono delle alterazioni evidenti a livello microscopico della struttura cromosomica in cui possono essere presenti delezioni, inserizioni o fenomeni di aneuploidia. In questi studi è importante conoscere il luogo in cui è situato il centromero perché alcune patologie si possono sviluppare solo in particolari tipologie cromosomiche. | cromosomi sono numerati da uno a 22 in base alla lunghezza. RC IRR nos Ta ErOA — «SIOE CRETA ATRIA) VEIL OC ha ga dò LIL.) 3158109900 Pratrni x a AA AA 1520810090 var2ZInOG Un danno cromosomico può essere visto da una lente microscopica proprio per questo è evidente in maniera diretta mentre i danni microscopici ai geni sono impossibili da osservare con metodi diretti come l'osservazione microscopica ma abbiamo bisogno di utilizzare tecniche indirette. L'analisi della completezza cromosomica è definita cariotipo. Viene studiata grazie al bandeggio delle varie aree cromosomiche utilizzando diverse metodiche di colorazione. In base alla tecnica di colorazione troverò un numero di bande differenti. Le bande sono porzioni ben definite del genoma. Quindi una loro assenza ci permette di dire con sicurezza in quale punto è avvenuta la mutazione riscontrata. Normalmente la bandeggiatura viene eseguita durante la prometafase o la metafase della mitosi. Nelle due fasi abbiamo un estremo livello di condensazione cromatinica necessaria per visualizzare i cromosomi. in metafase (a) in prometafase (p) ameno Per svolgere un'analisi del cariotipo ho bisogno di avere essenzialmente delle cellule vive mentre le applicazioni della biologia molecolare possono essere svolte anche avendo delle cellule non vitali. È più conveniente lavorare in prometafase perché ottengo un numero maggiore di bande e di conseguenza aumento il livello di risoluzione. | cromosomi in metafase hanno un livello di condensazione massimo e quindi hanno un numero di bande inferiore rispetto alla pro-metafase in cui essendo leggermente più distesi, i cromosomi, mostrano un numero maggiore di bande. rate | "nona |" siro zaro e ienescizza mi ti cretino | otte? | cponmnao Seipnotite | mim |a | Sepe e fi atm ee ba Le cellule necessarie per l'analisi possono essere prelevate sia dal sangue periferico che da una biopsia tissutale. Le cellule vengono aggiunte ad un terreno di crescita in cui è presente un fattore stimolante per la di; mitotica in modo da indurre la divisione. A questo punto vengono inserite in coltura. Appena le cellule intraprendono il percorso mitotico vengono bloccate in metafase o in prometafase per poi osservare l'immagine con un microscopio tramite colorazioni specifiche. Più sono le bande presenti nel cariotipo più è alta la risoluzione. In metafase possiamo evidenziare fino a 300 bande mentre in prometafase fino a 850. Normalmente le monosomie sono incompatibili per la vita soprattutto se riguardano i cromosomi autosomici. Anche le trisomia sono molto frequenti negli aborti spontanei poiché spesso non sono compatibili per la vita, tranne che per le uniche trisomie (13,18,21) che attualmente sono compatibili con la nascita dell'individuo. e ANOMALIE DI STRUTTURA Le anomalie di struttura coinvolgono problemi in cui si ha la rottura cromosomica. Normalmente le anomalie strutturali le possiamo definire bilanciate se non si ha una perdita netta del materiale cromosomico. Mentre sono definite sbilanciate se hanno una perdita netta di materiale genetico. Nel secondo caso è molto probabile presentare alterazioni fenotipiche. Le anomalie di struttura sono abbastanza varie: ANOMALIE DI STRUTTURA EI Dvierone HEI rsone SBILANCITE CDENREO- DER CDEOEEO - CANBORD La INSERZIONI | ODGOERO- COETD CDENEED - ODERDAO ISOCROM: MI Rec n ca SOCROMOSOMI QDGnERD- CDGOEAEAD — CREOERD- COEN ninni @9ann)» - ARANTETD INVERSIONI X TRASLOCAZIONI eanE_gpa cap Con delezione intendiamo perdita della porzione cromosomica che può essere: ® terminale se manca una porzione telomerica. Può essere generata, ad esempio, da una rottura di un cromosoma acrocentrico. * Interstiziale se la rottura avviene centralmente al cromosoma. In questo caso ho bisogno di avere due rotture nella porzione prossimale del centromero. In base a quale porzioni perdi puoi avere un tratto patologico o meno. Nelle duplicazioni si duplica una porzione cromosomica. Può essere in tandem se rispetta la direzionalità oppure invertita in tandem se le porzioni cromosomiche sono posizionate in maniera speculare l'una all'altra. Le delezioni e le duplicazioni spesso derivano da crossing over in cui i cromosomi non si allineano correttamente e questo causa una scorretta ricombinazione delle porzioni cromosomiche. Gene per Tremesoni non l'opsina l'opsina comettamente Sea dando luogo al » un crossing over 4 ineguale [Crossing-over Viene prodotto ineguale (16 dupicazone >» so» etalto o» comosoma fon hail gene per l'opsina verde (una delezione) Il fenomeno della duplicazione è molto importante in quanto è connesso con l'evoluzione genica. La possibilità di avere due copie del gene permette di mantenerne una costantemente espresse e contemporaneamente variare l'altra per ottenere dei benefici nell'attività. Un esempio di questo processo è avvenuto con le globine che si sono evolute tutte da una sequenza genomica ancestrale comune. Ancestra lobi gene Duplication of ancestal gene Mutation in Both copies Transpositon to different chrorrosomes Further duplications. and mutatio Brolutbnary tre TO Muten © TT 88 Gobi geme fam Gion gene family ‘0 cher osome 16 ‘n chrorcsome 11 Il meccanismo dell'inversione richiede una duplice rottura nell'asse del cromosoma ed una rotazione di 180 gradi delle porzioni escisse e un successivo ligaggio. Un'inversione può essere pericentrica se interessa il centromero, mentre se è paracentrica non interessa il centromero. Il problema è che il gene potrebbe ricongiungersi in maniera errata nel punto della rottura causando la perdita dell'attività genica. Sono delle condizioni molto difficili da mettere in evidenza. eterozigote per un'inversione è un soggetto normale. gn paracennica - TEGRARGRET i egerio eri ‘lun anelo Spesso le inversioni non portano a variazioni patologiche. Possono però generare dei gameti che se fecondati danno luogo a patologie. Dopo le fasi mitotiche somatiche la ricombinazione cromosomica che avviene nel crossing over non avviene correttamente a causa della formazione dell'anello di inversione (vedi immagine) nei cromosomi omologhi che presentano l'inversione. Questo può causare una scissione inadeguata delle porzioni cromosomiche con conseguente perdita di funzione. Un'altra anomalia strutturale molto importante è la traslocazione. Questa è un'anomalia è molto frequente. Avviene principalmente nei cromosomi acrocentrici grazie ad uno scambio di porzioni cromosomiche tra due cromosomi differenti. Esistono due tipi di traslocazione. Le traslocazione reciproche si verificano tra due cromosomi non omologhi. cromosomi CDW{ LI eve DIDO DAD L'individuo che è portatore di una traslocazione reciproca bilanciata può dar luogo sia a gameti bilanciati che a gameti sbilanciati. Se vengono fecondati i gameti sbilanciati otteniamo monosomia o trisomia parziale. I Mentre la traslocazione robertsoniana interessa sempre due cromosomi non omologhi ma che hanno una struttura acrocentrica cioè un centromero vicinale al telomero. 1 11 22 1202 In questo caso nonostante siano stati perse le braccia corte dei cromosomi si ha può verificare una condizione bilanciata. | bracci corti dei cromosomi acrocentrici di norma non contengono geni quindi si può sopperire alla loro mancanza. Spesso in alcune traslocazioni robertsoniane bilanciate l'individuo non mostra il fenotipo patologico. Ma durante la formazione dello zigote è possibile che il figlio ottenga uno sbilanciamento della struttura cromosomica. gameti bilanciati | primi due saranno bilanciati mentre gli altri quattro saranno sbilanciati. Fertaston by a roma amete + + + + + + 2 (if) (i GUI (o Ci) Clo Moma] (Bsinendì _ [(isomy 14) _[Monoscmy 16) [tonosomy 2) [tsemy 21 In tutti questi casi solo tre zigoti daranno origine ad un individuo. Quindi durante l'analisi genetica devono dire che solo 1 probabilità su sei di dare origine ad un individuo sano ma ha 3 probabilità su 6 di dare originare un individuo di cui 1 su tre di dar origine alla sindrome di down. Classificazione dell alterazioni cromosomiche UN PO' DI NOMENCLATURA 46,0% cariotipo normale femminile 46,00 cariotipo normale maschile Anomalie di numero 45,0 470X421 4700 Anomalie di struttura delezioni 46, della)(p16.3) 46,70, del(5)(q13933) inversione 46,0, inv(11)(p11p15) duplicazione 46,0% dup(1)(q2225) inserzione 46,70, ins(2){p13921031) traslocazione reciproca 46,7%, t(2;6)(035;p21.3) traslocazione Robertsoniana _ 45, XX, der(14:21) Il fenotipo è di tipo maschile ma mostra dei tratti di sviluppo femminile come lo sviluppo delle mammelle, poco testosterone, ipogonadismo e sterilità. Vi sono molti saggi enzimatici che si possono svolgere ma il gold standard viene svolta con il cariotipo. Se analizzato nelle fasi puberali puoi indurre l'utilizzo di farmaci ormonali per un ottimo sviluppo. Questa patologia è dovuta ad una | non disgiunzione meictica. e TrisomiaX Lo stesso ovulo alterato della femmina può essere fecondato da una X di origine paterna. Ha delle caratteristiche fenotipiche ben definite. ® Nel caso dell'XO (sindrome di turner) È una tipologia di alterazione cromosomica dovuta ad alterazione degli zigoti di origine maschile. È un tipo di monosomia compatibile con la vita. DIAGNOSI PRENATALE Un test genetico può essere generato in vari momenti della vita dell'individuo: ® Test prenatale -> insieme di tecniche strumentali e di laboratorio finalizzate ad identificare patologie prima della nascita ® Test neonatale sono principalmente dedicati alle patologie metaboliche ® Test pre-sintomatici svolto in età adulta ® Testdisuscettibilità -> svolto in età adulta per valutare allergie e intolleranze ® Test post mortem -> analisi forense, viene svolto poiché il DNA rimane integro Il concetto di diagnosi prenatale comprende sia tutti i test strumentali (ecografie) che di biochimica clinica. Spesso tutti i percorsi che si fanno durante la gestazione combinano tutte queste analisi strumentali e di laboratorio. È difficile affermare che esista un percorso ideale da seguire nella diagnosi prenatale, ma è variabile nel tempo ed è dipendente da: e Rischifamiliari Età materna e paterna Epoca gestazionale Suggerimenti ecografici per altre indagini Fra le tecniche utilizzate ritroviamo sia tecniche non invasive che tecniche invasive. Fra le tecniche invasive possiamo ritrovare le analisi dell'amniocentesi e della villocentesi. Queste hanno delle caratteristiche molto simili però possono essere richieste in diverse condizioni. Quindi la scelta deve essere obiettiva e condivisa anche da chi si sottopone a determinate analisi. Una diagnosi prenatale viene svolta in: ® Screening pre-concezionali -> se entrambi i genitori sono malati o portatori sani ed ha senso valutare la possibilità di dare origine ad un figlio malato. Questo screening viene svolto prima del concepimento del bambino. Posso analizzare se sono portatore della SLA, della fibrosi cistica, degli alleli dell'X fragile, od altre malattie di tipo genetico; ® Rischio di aneuploidie -> un esempio potrebbe essere nei genitori portatori sani di traslocazione robertsoniane bilanciata, per valutare se ho dato origine ad un feto affetto o un feto sano od un portare sano di una condizione bilanciata. ® Familiarità con determinate patologie che segregano nell'albero genealogico della famiglia dei genitori * Evidenza ecografica di alterazioni anatomiche che induce ulteriori analisi Nell'utilizzo delle analisi pre-natale vi sono sia aspetti positivi che aspetti negativi. Non tutti si sottopongono ad una indagine pre-natale poiché, anche se riusciamo ad individuare la presenza di alterazioni cromosomiche nel feto non tutti accettano la possibile soluzione di interrompere la gravidanza volontariamente. Di norma chi si sottopone a determinate analisi spesso è consenziente allo svolgimento di aborti volontari. «Pro * Trattare alcune anomalie in utero/ ottimizzare il trattamento dopo la nascita (parto in strutture attrezzate, cure tempestive) * Offrire la possibilità di una interruzione volontaria di gravidanza per le agomalie più gravi * Contro * search and kill Chi si sottopone spesso a queste analisi sono le donne con età superiore a 35 poiché a causa delle caratteristiche dell'oogenesi le probabilità di presentare alterazioni cromosomiche sono elevate. A causa di questo la sanità pubblica rimborsa le spese di diagnosi prenatale alle donne con età superiore a 35 anni che si sottopongono a questi test. TECNICHE DI DIAGNOSI PRENATALE sempe zione sc d Il fenomeno dell'anomalie cromosomiche è un parametro molto rappresentato nelle cause di morte, nonostante in alcuni casi non sia evidente, poiché non vengono studiate la cause degli aborti spontanei. Le analisi di diagnosi prenatale possono essere svolte a diverse settimane di gestazione in base alla tipologia del test. Fra le tecniche inserite nel grafico sottostante le due tecniche invasive sono l'amniocentesi e la villocentesi. Lul i fi [ti (i Kresseomessesi] K(eocememzen | f Il vantaggio della tecnica di villocentesi è che viene svolta tra la 11 e 13 settimana quindi posso rientrare nelle fasi di aborto terapeutico. Mentre se svolgo un'amniocentesi non rientro in questi periodi. La villocentesi è una biopsia poiché vado a prelevare il villo coriale, ed è una tecnica abbastanza invasiva per il feto e per la madre. Entrambe le tecniche possono indurre l'aborto e attualmente il rischio è intorno ad 1:1500. e Villocentesi Questo test si svolge tra la 11 e la 13 settimana e ci consente di rientrare nei periodi in cui è possibile indurre l'aborto terapeutico. I villi coriali sono delle strutture esterne all'embrione e ne aiutano sia ad indurre il nutrimento sia ad eliminare le sostanze negative. Durante questo test si procede verso un'analisi eco-guidata in modo da bucare in maniera molto precisa. lai (chorionic villus sampling o CVS) Durante questa fase la villocentesi è molto rischiosa poiché i villi coriali sono molto vicini alla struttura del feto. Nel villo coriale sono presenti le cellule del feto che verranno poste in coltura per svolgere i vari esami cromosomici o genetici. e Amniocentesi Si svolge solo tra le 15 e 16 settimana, periodo che non rientra più nella finestra in cui è utilizzabile l'aborto terapeutico. In quest'analisi si preleva il liquido amniotico in cui si ha una buona concentrazione di cellule del feto da poter mettere in coltura. In entrambi gli esami invasivi il downstreaming è lo stesso, si preleva il contenuto e si inserisce in coltura per valutare il cariotipo. PATOLOGIE MULTIFATTORIALI Questo tipo di condizioni patologiche sono state evidenziate in seguito all'analisi del progetto genoma umano, poiché si sono riscontrati molti tratti genetici che intervengono nella formazione di uno specifico contesto fenotipico. Spesso per le malattie complesse non siamo in grado di fare un test predittivo proprio perché la componente genetica è così labile che realisticamente non abbiamo un'informazione certa. Sicuramente la prima osservazione da analizzare è che Mendel è stato in grado di analizzare la frequenza di trasmissione poiché ha scelto, fortuitamente, dei caratteri dominati da un singolo gene. | caratteri mendeliani sono dei caratteri qualitativi poiché rispondiamo alla domanda: è presente o no? Mentre per i caratteri complessi si ha un carattere quantitativo poiché il fenotipo è determinato da quanti caratteri vi sono. La maggiorparte della fisionomia è definiti da caratteri complessi e in alcuni casi sono misurabili. Quando osserviamo una patologia complessa, come il diabete di tipo Il, si quantifica il rischio o meno a tale condizioni patologica in base alle presenza di determinati alleli su più geni. Per queste patologie si ha anche difficoltà a determinare con certezza la formazione del tratto. Alcuni tratti sono prodotti dall'interazione di due o tre geni ma vi sono alcuni tratti che sono determinati da circa 200-300 geni. Gli esempi di caratteri complessi potrebbero essere: * Circonferenza cranica * Colore della pelle * Intelligenza * Peso corporeo * Pressione sanguigna * statura Il concetto di carattere quantitativo può essere diviso in due grandi rami: * Allelia multipla, cioè vi sono più alleli che presenti nello stesso locus codificano per varianti dello stesso carattere Un esempio interessante potrebbe essere i quattro alleli che codificano per il manto del coniglio o l'allele termosensibile del gatto siamese che va a modificare il fenotipo e Modello poligenico cioè effetto additivo di sistemi genetici biallelici (0 più) Più il gene è complesso più si cerca di identificarlo. In base qual è l'allele si svolge un prodotto proteico con proprietà fast e proprietà slow come il caso del gene ACP1. Questo è un gene mendeliano che può essere quantificato. Un esempio di modello poligenico è rappresentato dai geni che codificano per l'altezza dell'individuo. Attualmente sono conosciuti 180 geni che producono l’aspetto fenotipico dell'altezza. Ognuno di questi è implicato in maniera differente. Se loci Ae D sono indipendenti, e partiamo da un'altezza media dî 100 cm potremo vere nella popolazione i genotipi. AGE = 1200m 4 geni dominanti che contribuiscono cascuno per 3 cm: 200 + (518 }; AARO, AABA = 110 em % geri dominanti che cort-ibuiscone ciascuno per 5 em e 1 recessivn che diminuisce di Sem l'alcezza: 100 + (519) -5; AAbO, 2230, AnD = 100 cm 2 geni dominanti che contribuiscono clascuno per 5 cm e 2 recessivo che iminuiscono di Sem l'altezza: 100+ (512) - {5 2aBb, Aabb = 50 cm 1 gene dominante che contribuisce per 5 cm e 3 recessivi che diminuiscono € Sem l'altezza: 100 + 5 [13); 2abb = 80 cm 4 geni recess vi che dimmnuiscono di Sem l'altezza: 100 Il peso degli stessi geni ha una spinta differente a causa dei fattori ambientali causando una differente aspetto fenotipico nell'individuo nonostante si possieda lo stesso corredo genetico ed allelico. Se trasliamo questo ad un discorso patologico possiamo capire quanto è difficile quantificare e comprendere i geni che sono concomitanti nelle patologie. Le malattie multifattoriali hanno una differente frequenza patologica nella popolazione. Più le varianti comuni sono presenti maggiormente sono presenti le malattie comuni. La frequenza della variante * Frequenti. Varianti comuni = malattie comuni CV = CD Orge Re rotori * Modello di eredità ambientali) ger non ben definito (più geni, fattori suscettibilità + Definizione della malattia non chiara (eterogeneità fenotipica) + Soltanto gli individui geneticamente predisposti sviluppano la NO n malattia, ma soltanto se esposti ai fattori ambientali fi scatenanti ee «Chi eredita geni di suscettibilità ad una data malattia, non ii toi ce eredita la certezza di ammalarsi, bensì un rischio maggiore Oni Malefica rispetto alla popolazione generale di svilupparia Highrecurrence rate Low recurrence rate Le malattie multifattoriali cercano di studiare quanto sia nell’aspetto fenotipico il peso genetico e quanto invece è stabilito dalla componete ambientale. Gioele Discosce Complex isesses SSA I IRRA Das sa Waste î î Se consideriamo insieme i tre aspetti: e Genetica multifattoriale * Penetranza non completa * Poligenetica Possiamo identificare le patologie complesse. Le patologie semplici presento dei geni molto rari >1/2500 mentre è una patologia comune se ha un rapporto <1/2500. Nelle patologie complesse invece si hanno molte varianti comuni in più loci e grande variabilità. Purtroppo, lo studio di queste malattie è molto difficile poiché è complesso studiare una popolazione omogenea nello studio di patologie complesse. Uno studio fatto sull'obesità è stato valutare il confronto delle zone in cui si ha la maggior presenza di mc donald con l'obesità (studi epidemiologici) Proprio per questo si cerca di assumere un gruppo di persone con caratteristiche molto simile. Per calcolare il rischio si svolge questo metodo: ® Valutare i probandi con il carattere poligenico (es. autismo) ® Valutare se i fratelli dei probandi sono affetti Dal rapporto dei fratelli affetti sulla popolazione totale possiamo risalire al rischio che si ha se vi è un fratello affetto. Disease A i Schizophrenia 12 Autism 150 aa Bipolar Disorder 7 } Type 1 Diabetes Mellitus 35 Crohn Disease 25 Multiple Sclerosis 24 In genetica lo studio dei gemelli è fondamentale poiché, se studi un tratto complesso sfrutti la caratteristiche che gli omozigoti condividono il 100% del genoma. ie Contordanca {deal Mon centi 1 gemelli monozigoti condividono il 100% del proprio patrimonio sa 0a genetico Moni dspresime pi priv pena DA Chef ip and pati aa | gemelli dizigoti condividono soltanto il 50% del proprio patrimonio genetico Flat arti mr Asthma SR a Se un tratto presenta una predisposizione genetica, MÌ Aspetto. coronyrtery ierse si è che la contemporanea presenza della malattia in entrambi i gemelli sia più frequente tra i MZ rispetto ai DZ Disbetesmelltus s6r ni Da questi risultati possiamo indurre che vi è una certa contaminazione di tipo genetico. Nonostante questo, vi sono dei caratteri che magari non corrispondono a questo gene. Uno studio effettuato su gemelli omozigoti ha verificato che in alcuni casi un gemello possiede la patologia mentre l'altro non ha nessun fenotipo patologico nonostante condividano lo stesso genoma. Questo tipo di approccio vale anche per altri tratti come l'altezza: rta Mambro i par or stay type fr ia data seta) Raf 104 mn sas an a da Da queste basi, che ci aiutano a capire se si ha una variante genetica nella patologia, si cerca di identificare in laboratorio quali sono le componenti genetiche che si occupano realmente dell'avvento della patologia. L'approccio per studiare le patologie genetiche si basa sulla stratificazione di popolazione più estese. Quello che si svolge è fare un reclutamento molto grande della casistica in ingresso. L'obiettivo è suddividere i casi e i controlli ed analizzare il genotipo verificando una maggior presenza dello stesso tipo di genotipo sia nel contesto patologico che nel contesto sano. TO csiogie di mappata [CASI [conta Gata di atea n © on Ape A! nuo nos n° Gli studi di associazione ricercano d'ferenze ra le frequenze alleliche ra Un dm. gUEPAd case UNOdicontalli Rivelano associazioni tra allei Una volta che ho fatto uno studio osservazionale e abbiamo trovato un primo livello di associazione si cerca di studiare le attività molecolari della proteina prodotta dal gene. Tuttavia il limite principale dello studio caso-controllo risiede probabilmente nella sua suscettibilità a diversi fattori di distorsione (bis) Il bias di selezione può originare dalla scelta inadeguata dei casio più comunamenze, dei controlli. Infatti e i contralli non sono rappresentativi della popolazione generale, l'essociazione eventualmente osservata nel campione potrebbe non essere presente nella popolazione o viceversa Un bias di informazione può invece derivare del fatto che i casi tendono mente ed attribuire l'insorgenza della loro patologia ad avvenute | bias da confondimento derivano dalla presenza di fattori associati sia all'esposizione che al rischio della patologia, denorrinati confondenti Da questo grafico possiamo determinate che nonostante ci sia un elevato livello di attendibilità statistica la partecipazione del polimorfismo genetico è molto prossima a 1, quindi il peso della variante nello sviluppo del diabete pur essendo certo è molto basso. Questo tipi di studi sono stati fatti anche su caratteri complessi come: Selected T1D associated genes 2011 3 RG SSa Sessi È È Odds Ratio lina. SÈ SELL In studi GWAS fatti sul diabete di tipo 1 hanno trovato un alto rischio di associazione tra una mutazione nel gene HLA e lo sviluppo del fenotipo patologico. Tutti questi studi devono essere replicati su un numero sempre maggiore di individui. Altri studio è stato fatto per valutare il fegato grasso e per l'obesità. e Diabete Nel diabete di tipo 1 è molto probabile che si ha un familiare che possiede lo stesso fenotipo. ARE RR CRA - Usual age of onset <20 years (but -50% over 20 240 years but. MODYI HNFAA 200129131 Hepatneyte nuelear kecwor n se HW Fs TIA doni co sn ati censo SE feetose pone) see La MODY4 (PF 139121 Insulin promoter factor-1. Fem | Family history <15% with 1° degree relative -—Common L Ces nu | (GADA, CA, IA-2A, IAA, ZNTBA) Nella patologie diabetica si hanno tipologie con un ODD ratio tangibile che è quello immunomediato. Poi si hanno le forme di diabete di tipo 2 in cui i geni hanno un'ODD ratio di peso molto basso, mentre si ha una forma diabetica che ha un livello di trasmissione mendeliana. Il diabete di tipo 2 si può verificare perché si hanno tutte i polimorfismi studiati e caratterizzati ma questi hanno un valore davvero irrisorio nella possibilità di causare la patologia, poiché interviene anche una componente ambientale. Un esempio lo ritroviamo anche col Parkinson in cui ci sono forme monogeniche che si trasmettono in maniera mendeliana mentre v'è ne sono altre che invece sono causate da un pool genico. DISORDINI METABOLICI Con le malattie metaboliche facciamo riferimento ad alterazioni sia alle vie cataboliche che degradano sia in quelle sintetiche dell'anabolismo. La via che parte da un qualsiasi alimento e porta alla formazione di energia prevede l’utilizzo di molti enzimi. i ce 4 La suddivisione delle malattie metaboliche può essere fatta sia in base all'organello interessato sia al tipo di macromolecola interessata. Il principio di queste patologie è che, se andiamo lungo il processo metabolico, l'assenza di un singolo enzima causa la mancanza dei metaboliti prodotti dall'enzima, probabilmente fondamentali per il decorso metabolico. Normalmente quello che succede in queste patologie è difficile da riassumere, poiché lo stesso enzima che va ad intaccare la produzione di C ha un certo peso anche nell'equilibrio di A e B, nonché nella produzione di un metabolita tossico. Nelle analisi di tali patologie devo trovare: ® Bassa concentrazione dell'enzima nel saggio enzimatico * Differente concentrazione dei cataboliti del pathway. Queste patologie sono chiamate IEM inborn errors of metabolism. Sono delle patologie metaboliche che sono causate dalla mancanza di un enzima con conseguenze in ambito patogenetico. | fenotipi sono abbastanza difficili da inquadrare poiché gli enzimi contengono diverse tipologie di funzionalità nell’organismo influenzando sia la gravità che l'onset della patologia. Se andiamo a sommare tutte le patologie enzimatiche si stima un'incidenza di 1 su 5000. Ne sono stimate oltre 1000, quindi sulle patologie genetiche che conosciamo circa 10000, 1 su 10 è una patologia metabolica. Per la maggiorparte seguono una ereditabilità autosomica recessiva. Questo perché spesso nell'individuo un solo allele può sopperire al funzionamento metabolico. Le categorie sono: Amino acid metabolism disorders Carbohydrate metabolism disorders Lysosomal storage disorders *Small molecule disease Fatty acid oxidation disorders * Carbohydrate Urea cycle defects « Protein Peroxisomal disorders * Lipid * Nucleic Acids Mitochondrial disorders Protein DI *Organelle disease + lysosomes * Mitochondria * Peroxisomes * Cytoplasm rdei Medium Chain Acyi CoA Dempdrogenase Deticreney Long Chain Acyi CoA Genydrogenaso Deficieney Very Long Chain Aeyi CoA Denpdrogenase Deficieney Possono essere suddivisi in altre categorie come: e CARBOIDRATI Una fra queste condizioni patologiche metaboliche riguarda la GGPD. Questo è un enzima che viene espresso in maniera house keeping e la sua mancanza causa l'enzimopenia eritrocitaria (anche definito favismo poiché le fave sono il fattore scatenante). La via dei pentoso fosfati e la produzione del glutatione Nella via dei pentosi fosfati è importante per la generazione di NADPH che è a sua volta indirettamente importante per i meccanismi REDOX del glutatione. Se si ha una carenza avremo dei ridotti livelli di NADPH e di glutatione. Questo si traduce in una minor produzione dell'emoglobina poiché il glutatione dovrebbe sopperire ad evitare l'ossidazione prodotta dell'emoglobina. Di norma i soggetti sono abbastanza asintomatici ma l'evento emolitico può essere indotta da: * Ingestione di FAVE * Assunzione di farmaci con azione ossidante intracellulare * Esposizione a sostanze con azione ossidante intracellulare * Infezioni (medio-gravi) I fattori scatenanti elencati, sebbene apparentemente eterogenei, hanno in comune l'azione ossidativa sui globuli rossi; FAVE (Vila fa5a major) ningeszione di fave è la causa più frequente di csi emolit he (faatsmo) in sogetd GGPD enzimepanic. nattacco di favismo ela sua gravità diperde fortamente dalla quantità cime Ingerie n rapporto peso corporeo]: cuesto è uno del merli per ui Il favismo. si ho soprattutto aci varbini ele sostanze chimiche responsabili sono | glicosici cina e convcina: cuest sono presenti a alla concentrazione (fino a 7% del peso sexcc) elle fave, ma la loro concentrazione è assi variabile in diversi cegoî ci“. «bi che contengono fari cause di favismo ND: Tutti 2 NON causano crisi emolitiche. di fave es. certe merendine e gelst) sono potenziali mi altri da fave NON conrengono v'cina e convicina | soggenti GGPD enzimopenic POSSONO quindi assumere leguri come piselli, fagioli, fagiolini, ced 0 501. tl golne celle piarta di fave (0 la presenza nelle viciranza di coltivazioni di ave) NON seusa risi amiche. Se il PAH è alterato la fenialanina aumenta la propria concentrazione sia nel sangue e nel cervello. Più il fenotipo è severo più la concentrazione è in aumento nel sangue: 50-110 pmol/L3normal 600-12001 Mol/L3 Mild >1200 uMol/L 3classic PKU Se invece la PAH funziona e riusciamo a convertire la fenialanina in tirosina possiamo avere altre tre condizioni che riguardano alterazioni in questo pathway: Fenisinina rossa Tirozinas Fentalanina 0 Tuono 2 Melania GR) Giomemo] Onogentisato | orvone rasato cossa Dopkmina TALCAPTONURIA] Niaellacetoacetato du I Fumare eroacetato Adrenalina tamara Nell'ultimo caso la diminuizione della produzione di dopaminergici causa delle condizioni molto simili al parkinson in cui sono difettivi i neuroni dopaminergici. Il trattamento in questo caso è l'assunzione di L-dopa in maniera esogena che può essere metabolizzato in dopamina. e LIPIDI Ogni famiglia lipidica è associata a varie patologie differenti fra queste andremo a considerare i pathway degli sfingolipidi. Quasi tutte le patologie riguardanti il pathway lipidico vengono associate a danno mentale, danno epatico ed al danno di mielina. In particolare, la mancanza dell’enzima glucocerebrosidasi non riesce a sciendere la glucosilceramide in ceramide e glucosio. Questa è la base della patologia di Gaucher. Tale patologie è molto diffuso e spesso associata a difetti cerebrali. Il problema di questa patologia è che ne esistono molti sottotipi che sono associati con diverse mutazioni del gene. Normalmente per la gaucher esiste: ® Iltipo1cheha solo un coinvolgimento dell'apparato splenico e del fegato ® Il tipo 2 rapida degenerazione neurologica, episodi convulsivi, rigidità degli arti * Iltipo 3 ha problemi neurologici, sanguigni e problemi respiratori La cosa interessante è che il gene GBA deve essere mutato in tutte e due gli alleli, ma essere portatore di un singolo allele mutato fa risultare il paziente positivo negli screening per la patologia di parkinson. A livello evolutivo è uno pseudo gene coinvolto in due contesti neurologici quali la sindrome di gaucher e la sindrome di parkinson. È difficile da studiare perché a livello evolutivo si è evoluto da uno pseudo gene. Sempre per rimanere all'interno dei lipidi possiamo considerare il pathway che coinvolge le ceramide. Questo coinvolge la Niemann-Pick che porta un accumulo di lipidi in molti organi e non è compatibile con la vita. In questa condizione la patologia è causata da geni diversi Type-A and -B © Trpe 8 Vicea vene form = Type € ubout/juvnt form Type-C1 Normalmente viene studiato solo il primo gene SMPD1, ma essendo una patologia poligenica è necessario studiare tutti e tre i geni offrendoci una risposta completa. Normalmente quello che succede è che la sfingomielina si accumula all'interno dei lisosomi e di conseguenza può essere anche catalogata come patologia lisosomiale da accumulo di lipidi. e Acidi nucleici Gli acidi nucleici rappresentano un'altra macroarea fra le patologie metaboliche e sono legate principalmente alla formazione delle purine. Key functions Provision of Energy e.g. ATP, GTP Building blocks for DNA and RNA (along side pyrimidines) n Basic conenzymes i.e. NAD and po NADH Play role in signal transduction e.g GTP, cAMP, cGMP La sorgente fisiologica delle purine è principalmente endogena poiché proviene dalle vie biosintetiche. Anche la degradazione di queste molecole è un processo complesso perché gli acidi nucleici sopravvivono allo stomaco ma sono degradati nell'intestino grazie alle nucleosidasi e le nucleoside fosforilasi riottenendo le basi e lo zucchero. La cosa importante è che durante il processo metabolico il prodotto finale è ‘acido urico che per altro è insolubile quindi è poco tollerabile nel circolo sanguigno. L'accumulo di acido urico nel sangue è definito iperuricemia. ca Am [irceal Vione 1 Guanosine Adonosine | msn Guaine ingsine | een Iposantine cr © | Porn xantine nie Ale! Vi sono dei valori standard Major Categories of Disorders A block. desradarion escur with stadromes vol; erviepatiy cr erenal calca. — LL Thoss ihararisa from a Blockaga in purine inclestide degradati patty Increased degradation of nucleorides scturs Li syndromes characterized by * hyperur cemia anc pout, erenal calci, sanania or acute hypoxia È. i Arising from increased activity cf nucleotidi mmm. dogradation pay Un esempio è la PRS superactivity ereditato in maniera X-linked. Se si ha questo enzima iperattivo metabolizza una grande quantità di ribosio producendo una grande quantità di acido urico e di purine. riboseSP + ATP meme Î sten Histidine x. pre, Î AOP + SAMP IP + VP — GP reset rn tiso = xan © Gue Un'altra patologia è dovuta alla deficienza dell'enzima ADSL. In queste condizioni si ha l'accumulo di un intermedio tossico per l'organismo. EREDITARIETA’ DEI TUMORI La maggior parte dei tumori non è ereditabile ma alcuni di questi hanno una piccola componente genetica che comporta una certa suscettibilità. Un tumore è definito come un gruppo di patologie che sono accomunate dalla capacità di sfuggire ai meccanismi regolatori della replicazione cellulare. Quindi è una struttura che si replica velocemente, non ha inibizione da contatto e soprattutto può metastatizzare andando ad invadere gli altri tessuti. Per fare ciò la cellula tumorale deve sfuggire al controllo del ciclo cellulare che è regolato grazie a dei checkpoint in cui vi sono dei meccanismi che informano la cellula sulla possibilità di replicare. Characterized by Cell Proliferation Spindle Apoptosis Assembly Checkpoint Checkpoint Î Mitosis. CC Pm DJ AI 0 7 V DNA Damage ss Checkpoînts fori - 5 Gi tromosomes topiasm replicate doubles “ DNA Damage Checkpoint Oltretutto si ha un meccanismo implicito nella nostra vita che regola ulteriormente la vita cellulare. Infatti, cellule possiedono un accorciamento dei telomeri intrinseco ad ogni ciclo di replicazione, mentre le cellule tumorali hanno la capacità di attivare le telomerasi che si occupano di mantenere stabili i telomeri permettendo di non arrivare alle fasi di senescenza, a causa dell'accorciamento dei telomeri, dopo circa 50 divisioni. Nei tumori è necessario dividere: Germline mutations È Somatic mutations Parent Child pos Inherite Mutation AII cells Somatie d in eggor mm affected in mutation (eg, spem offspring breast) » Present in egg or sperm + Oceurinnongemline iL, a ns . « Are heritable tissues 0 BRCAT nd BRCAZIN breast came e + Cause cancer family + Are nonheritable Even in those cases where susceptbiliy Is clear Inherited, somalo changes are required for 9 cancer devio» syndromes Uno dei tumori più gravi in cui le mutazioni somatiche derivano da un contesto ambientale è iltumore ai polmoni. La maggiorparte di questi sono dei tumori in cui non si conosce per nulla l'ereditarietà ma sono considerati totalmente ambientali. emal tasse Nei tumori non basta che vi sia un singolo errore ma vi sono diversi livelli di mutazioni che si accumulano nel tempo. Le prime mutazioni di norma sono mutazioni passengers, questi possono non avere una permanenza elevata poiché possono essere corretti ma se nel contesto si aggiunge una mutazione driver le mutazioni passeggere non vengono corretti e si sviluppa l'oncogenesi. Coll Status: Normal | Normal Transtormed | Transformed (metastatie) Mutations: None Passenger -—— Driver’ Passengeridiver (adcitiona) ®© © @ P_ PP _P —_rnÒ- Tumorigenesi © Passenger mutation © Driver mutation Spesso le mutazioni driver che devono verificarsi sono molte e si cerca di stabilire quanti sono le mutazioni driver che posssono favorire la progressione tumorale in base al tipo di tumore. di for cancer type Oltretutto la condizione è molto associabile ad alcuni contesti ambientali Table 23.2. Eramples of geographic variation in the incidence of cancer ncience Treo Cancer Locate ato” uo Canada (sewtounciane) ssa Brnz (Fortaleza) 1a Nasophanma Hong Kong ano United States (tan) 05 colon Unted States (we) mi indi (Bombay) sa Lung United States vom nico Orieae, Si cerca di sviluppare una classificazione dei tumori in base al pathway che viene alterato in modo da creare un approccio farmacologico differente in base al tipo di alterazione molecolare piuttosto che in base alla posizione anatomica. Per analizzare il pathway ritroviamo delle tecniche di microarray che ci permettono di analizzare quanti sono i geni sregolati in una cellula tumorale: (DI NNO INNONNINID GU Di Datini ARE Luminal AMI) Luminal BIS Per le mutazioni somatiche del tumore possiamo consultare il cancer genoma atlas in cui sono caratterizzati sia i profili di espressione genica che le mutazioni che sono state identificate. L'esempio più semplice da sviluppare è mechanisms inside or ret ® Quali sonoi tipici modelli di alterazione genetica nel cancro Abbiamo: * Molecular changes *Chromosome number changes *Chromosomal franslocation * Amplifications * Exogenous sequences Se parliamo di cambiamenti nel numero di cromosomi quello che si verifica più spesso è la perdita di omozigosità, in alcuni casi si può presentare una grande delezione che causa una loss of function di un determinato gene impedendo al singolo allele di sopperire alla funzione originale. Un altro esempio è la traslocazione cromosomica cioè la traslocazione che si verifica tra il gene BCR che sta sul cromosoma 22 e il gene ABL che si trova sul 9 cromosoma. Questo è spesso correlato alla leucemia î î Ì î nomi ai ni Ii ti ciromoseme Un altro tipo di mutazione tumorale tipica è l'amplificazione di una porzione genica che potrebbe essere duplicata fino a 100 volte provocando una sovraespressione della proteina di interesse. Infine, potrebbero interagire anche le sequenze esogene date dall'integrazione di un virus all'interno del nostro genoma. Il danno è provocato dal posizionamento della sequenza nel nostro genoma andando magari ad inserire il promotore virale per l'espressione di un gene oncogeno producendo una sovra espressione proliferativa. +Tumor viruses contribute gares resulting n abnorma cl qroath »Carvical cancer Pv (human pasiloma viruses) +Burkit: Iymphoma I] + Hepatacellular carcinoma + epatite iuses La condizione tumorale che è più conosciuta in questo senso è provocata da una integrazione virale del virus HPV nella cervice dell'utero. Cervical Cancer V Normalmente nella cellula infettata non si riesce ad arrestare il ciclo cellulare nella fase G1. Normalmente quando il virus si integra viene degradato p53 inibendo la capacità di indurre la cellula in apoptosi e stimolando la proliferazione cellulare. Dagli esempi citati possiamo ricavare l'elevata variabilità sia nei metodi di avvento tumorale che di diagnosi. Altri geni coinvolti sono i geni implicati nel riparo al DNA. Le classi principali di geni riparo coinvolti sono: e Geni coinvolti nell'escissione dei nucleotidi e Mishmatch repair Nel primo caso Cemagadnu (TRETTTR una Un esempio di patologia che contenie determinate mutazioni è la xenoderma pigmentosa. Mentre alcune patologie che presentano mutazione nei geni MMR sono: * Hereditary NonPolyposis Colorectal Cancer * increased incidence of cancers of the colon, endometrium, ovary, stomach, and upper urinary tract. * autosomal dominant «HNPCC due to germline mutations in mismatch repair genes * hMSH2, hMLH1, MSH6, (PMS1, PIMS2) Quello che avviene nella sindrome di Lynch (HNPCC) è che la mutazione nei geni sopracitati inducono la mutazione in ulteriori geni provocando l'instabilità microsatellitare ed un controllo alterato della crescita cellulare. se mer _. Memo Rep dl pe Da questa immagine possiamo evidenziare che due tumori che si verificano nella stessa area sono causate da differenti condizioni predisponenti. Un altro esempio per le mutazioni in geni oncosopressori sono i geni BRCA che spiegano di norma il 10% di predisposizione di ereditarietà di tumori al seno. Breast Cancer Families |—’Contibution of known genes to familal aggregaion ol breast cancer Ai toy Bndist and Ovarian foce \X Cancer Families Sa Quello che sappiamo attualmente è che se si ha un rischio di popolazione di sviluppare il tumore alla mammella essere portatori di mutazione dei geni BRCA1 e 2 aumenta il rischio di svilupparlo per circa il 50%. Quindi si parla di una suscettibilità molto molto tangibile. Quando si osservano gli alberi familiari in cui segregano i tumori alla mammella è difficile l'identificazione dei portatori che non sono affetti a causa della penetranza incompleta. BRCA Genes: Basic Knowledge | geni di BRCA si occupano della ricombinazione non omologa e a livello clinico è importante studiare il pathway di questi geni per progettare dei farmaci che possono influire positivamente in questo pathway. FARMACOGENETICA E BIOPSIA LIQUIDA L'attività di farmacogenetica si basa sulla possibilità di produrre degli enzimi in grado di sviluppare delle reazioni utili in maniera più o meno efficace. In generale la disci plina della farmacogenetica si basa sulla correzione di condizioni come i SNP. Ci si rifà sempre ai database di popolazione per valutare la frequenza allelica di condizioni che sono frequenti nella popolazione e spesso condizioni polimorfiche. Si ha una elevata variabilità interindividuale sia per la sicurezza del farmaco sia per l'efficacia nelle patologie mendeliane. BACKGROUND Elevata variabilità inter-individuale nella efficacia e sicurezza delle terapie farmacologiche La maggior parte delle terapie risulta efficace nel 50-f0% dei pazienti trattati (Spear BB et al. Trends Mol Med. 2001; 7: 201-204) ADRs (ADVERSE DRUG REACTIONS): v IV causa di morte negli USA dopo IMA, tumori e stroke (Lazarou{ et ol, JAMA 1998; 279: 1200-1205) + Una delle principali cause di ospedalizzazione (Pirmohamed M etal, BM! 2004; 329: 15-19) Suddividendo per la tipologia di farmaci che vengono utilizzati la finestra di efficacia è quella vista in viola: Hypertension Drugs 10-30% pittitidià AGE libros Heart Failure Drugs 15-25% Beta Blockers Anti Depressants 20-50% Cholesterol Drugs 30-70% Statins Asthma Drugs 40-70% Beta2-agonists Da questo possiamo dire che non tutta la popolazione è in grado di assumere un farmaco ed ottenere una buona efficacia. Questo tipo di intolleranza dipende da: ® Dalla severità della patologia * Il trattamento con altri farmaci che possono interagire in maniera cross reattiva * Il tipo di individuo, il gender, l'origine, gli stili di vita.. ® Levariazioni genetiche | fattori genetici hanno un livello di influenza nella risposta ai farmaci compresa tra il 20 ed il 90%, il range è molto ampio poiché gli studi applicati in quest'ambito hanno ottenuto risultati differenti anche in base al differente farmaco preso in considerazione. Pitagora ("510 A.C.): “Alcuni individui {ma non altri), dopo aver mangiato le fave, si ammalano” {‘favismo’ = deficienza di GGPD; gene su cromosoma X; >200 milioni nel mondo). Pharmacagenetics: The role of genetics in drug responses. F. Vogel. 1959 In 1975 Bob Smith, a laboratory director at St Mary's Hospital Medical School in London, ingested 32 mg of debrisoquine, as did some ot his co-workers. “Within txbi hours severe orthostatic hypotension [low blood pressure] set in with blood pressure dropping to 70/50 mm Hg. Hypotensive symptoms persisted for up to two days after the dose...°. His colleagues, who had taken a similar dose, had no significant effects. Vi sono tantissime definizioni per la farmacogenetica e la farmacogenomica. Per la farmacogenetica si associa il concetto di relazioni semplici poiché si cerca di valutare l'interazione di un singolo polimorfismo con la risposta ad un farmaco. Anche concetto di ereditabilità è molto associato alla farmacogenetica poiché questo tipo di suscettibilità/intolleranze ai farmaci possono essere trasmessi. Mentre la farmacogenomica è una disciplina più complessa perché si occupa di valutare come la molecola interagisce col nostro genoma e viceversa. Lo scopo di questa disciplina si occupa di valutare il farmaco e la dose associata per ciasciun individuo in modo da performarne l'effetto e diminuire il rischio di effetti collaterali. Manipulating Therapeutic Outcomes La disciplina è nata negli anni 2000 in seguito al completamento del progetto human genom project. Per alcuni farmaci nel bugiardino devi dichiarare se il farmaco interagisce con alcuni polimorfismi allelici. | farmaci sono molecole con caratteristiche chimiche differenti che vengono eliminate in maniera differente principalmente attraverso l'azione del fegato. Farmaci Molecole con differenti caratteristiche chimico-fisiche, soprattutto se la differenza è che alcuni farmaci devono essere assorbiti/distribuiti, ed altri devono essere eliminati Vie essenziali di eliminazione: + Estrezione urinaria > Escrezione biliare e fecale + Espirazione polmonare + Traspirazione - li fegato, puo operare delle trasformazioni sui farmaci, grazie alla presenza di alcur Cellule del Fegato 3 Cellule parenchimali, che raperesentano il 65% del volume del fegato = epatociti + Cellule non parenchimali, che rappresentano circa I restante 35%, è costituito da cellule endoteliali, cellule di Kuptfer, cellule stellate e cellule dei detti biliari Anche il gene CYP2C9 possiede un elevato numero di aplotipi Over 0 haplotypes (star alles) have been defined for (YP2D6 Cengio somme * Responsabili della metabolizzazione di almeno il 10% dei farmaci più importanti. n He N Hi 2. Privi di tività 15 Attività ridotta Tutti gi anticoagulanti orali (Warfarin, dicumarolo) n Quasi tutti gli ipoglicemizzanti orali FANS Antiepilettici (Fenitoina, valproato) Cannabinoidi Di questo gene sappiamo che chi è omozigote per l'aplotipo 3-3 non ha attività funzionale quindi ciò potrebbe causare alcuni effetti collaterali piuttosto elevati in seguito a somministrazione di particolari farmaci. Un esempio si verifica nell'assunzione del farmaco Warfarin che riduce l'attività della vitamina K andando ad interferire con la formazione del coagulo. Il warfarin è metabolizzato soprattutto dall’enzima CYP2C9 del citocromo P-450. Due allozimi comuni (il CYP2C9*2 e il CYP2C9*3) hanno un'attività enzimatica ridotta rispetto al wild-type (CYP2C9*1). | pazienti con una o due di queste varianti alleliche richiedono pertanto dosaggi più bassi di warfarin e sono a maggior rischio di sanguinamento rispetto ai pazienti omozigoti per CYP2C9*1. In ogni caso gli effetti anticoagulanti del warfarin sono controllati anche dall’attività della subunità 1 del complesso vitamina K epossi do reduttasi (VKORC1) che considerata insieme all'attività di CYP2C9 giustifica per il 30-40% le variazioni richieste nella dose di warfarin. Anche il metabolismo dei cannabinoidi è associato a questo gene quindi in base all'aplotipo si possono avere anche differenti livelli di tolleranza. Alcune variazioni nel gene CYP2C9 possono causare fino a 3 volte la differenza nell’assorbimento del cannabinoide psicoattivo THC nel corpo umano. Gli studi hanno dimostrato che questa cifra può spiegare la differenza tra coloro che sono facilmente “sotto effetto” di cannabis e quelli che ne hanno meno probabilità. Inoltre il gene può prevedere per quanto tempo la cannabis rimarrà nel corpo e per quanto tempo una persona dovrà aspettare dopo aver fumato cannabis per sottoporsi a un test delle urine di successo. Probabilmente con determinate variabili genetiche ci vogliono solo pochi giorni per eliminare la molecola pertinente dal sistema, mentre per altri ci vogliono fino a 30 giorni o più. Da <https://www.freeweed.it/perche-la-cannabis-agisce-ciascuno-modo-differente-e d-suo-rapporto-nostro-dna/> Un altro gene è CYP2C19 =) 9 @ CYPZCLO GENOTYPE - PHENOTYPE PAIRS. b Artaepresante @ sotsicivetavp — @ Antepiepto: Antdepresonte | @ One: @ Poor indio Tar icia e Tr tire Gattini n e Farmacocinetica Un altro studio che si svolge è all'interno della farmacocinetica è studiare i geni dei singoli trasportatori presenti nella membrana favorendo o sfavorendo l'attività di passaggio dei vari farmaci. Un esempio sono le proteine ABC che si trovano nella membrana cellulare ed è ritrovato nella barriera ematoencefalica ed in altri tessuti. Liver Kidney: Brain capillaries: hepatot tubular secretion |’ barrier function NEC 2 © _A ABCBI test - paving the way for personalized antidepressant treatment Questo gene è stato studiato nel campo degli antidepressivi, infatti, valutando la concentrazione di questo trasportatore si valuta l'efficienza del farmaco in base a quante molecole vengano trasportate attraverso la barriera ematoencefalica. Poiché chi ne presenta di più ha bisogno di una dose minore e viceversa. The ABCBI test predicts which antidepressants are best suited for the individual patient. That applies for initial treatment and for a switch in therapy. The ABCB1 test result leads to recommendations from which antidepressants and supporting measures the individual patient will benefit most. The ABCBI test guided antidepressant therapy helps to achieve the best possible clinical outcome and irtereases the chance of full remission. Un farmaco molto utilizzato nel trattamento del cancro al colon è l'Irinotecan. Questo farmaco viene assunto e trasformato nella sua forma attiva grazie al prodotto proteico del gene UGTIAI1 che presenta un'elevata variabilità dell'esone uno. sun An impaired SN38 detoxification by an UGTIA1”28 polymorphic form increases the risk of acute severe pere] toxicity vena f Î iìîr>ierr 5 RESEEGÈ e *1/%1 or *1/"28 patients have lower toxicity than ‘28728 140%" AA ba i a 3. Esecuzione del test L'estrazione e l'analisi del DNA devono essere effettuate con procedura vliata per uso diagnostico e conforme alle normative in vigore (CE-VD), La variante del gene UGTIA! oggetto di analisi è (TA};TAA (UGTIA1*28, 158175347). Pirosequenziamento, sequenziamento Sanger 0 analisi de microsateliti sono le piattaforme tecnologiche preferibili È possible eseguire l'analisi anche con PCR real-time anche se tale spglicazione è da validare Internamente e meno diffusa. Genotipo UGTIAI Wild-type Eterozigote Omozigote mutato Un altro esempio sono le fluoropirimidine che hanno una struttura simile alle pirimidine ma sono di sintesi chimica e riescono ad inibire la sintesi del DNA nella cellula tumorale. enne O La FDA ha predisposto come linea guida l'inserimento di marker farmacogenetici per la produzione di alcuni farmaci. Attualmente la farmacogenetica è studiata a priori nello studio applicativo di un farmaco. Normalmente nella produzione di un farmaco si tiene conto se un enzima è responsabile per il 50% o più dell'attività della molecola, in questo caso devo inserire uno studio farmacogenetico nella fase 1 della sperimentazione. Anche nelle patologie genetiche di tipo mendeliano è utile analizzare il meccanismo molecolare di azione del farmaco. Nel caso della fibrosi cistica di norma viene elaborato un farmaco che aumenta l'attività del complesso trasportatore del cloro ma se quest’ultimo non è prodotto il farmaco non avrà effetto ma se utilizzo un farmaco che cerca di aumentare la trascrizione genica questo può avere un effetto anche sulle forme di fibrosi cistica 1 e 2. v5208 RA MASSE x Mutaton 607 raes08 RSS 6498 RIS 1680.8864>G erample® —— Wi282X Gal ‘65510 SIZISR O 26s745A = 91412X N1303K Rescue Corea Restore Restore Maturton/ — — Promote Requied | © prote protein channel channei Comeci proten 2p0rachES sintesi foking conductance _conduetance _ mispicing stabi Possiamo utilizzare la farmacogenetica anche nei casi terapeutici in condizioni tumorali. Un esempio possono essere i geni BRCA1 e BRCA2. Il sistema PARP è in grado di riparare a single strand ma se questo sistema non riesce entrano in funzione i geni per la ricombinazione omologa cioè BRCA.