DNA e RNA: replicazione, trascrizione e sintesi, Appunti di Biologia

Scarica DNA e RNA: replicazione, trascrizione e sintesi e più Appunti in PDF di Biologia solo su Docsity! 4. GENETICA MOLECOLARE La genetica molecolare indaga i meccanismi chimici che permettono l’espressione delle informazioni genetiche in un individuo. L’unità base è il gene, ovvero il tratto di DNA responsabile della determinazione di un carattere. IL DNA Si scoprì che è il DNA il depositario dell’info genetica. NUCLEOTIDI Formati da una base eterociclica azotata legata a uno zucchero pentoso (ribosio RNA, desossiribosio DNA al C1’), legato a sua volta a una molecola di acido fosforico. Idrolizzando un nucleotide si ottiene: 1 molecola di acido fosforico e un nucleoside. Le basi azotate possono essere: pirimidine (citosina, timina e uracile) o purine (adenina e guanina). STRUTTURA DEL DNA Il DNA è un acido nucleico quindi un polimero lineare di nucleotidi in cui possono essere presenti 4 diverse basi azotate (A-G-C-T). Nei primi anni 50 Watson e Cric individuarono la struttura tridimensionale del DNA delineando il modello della doppia elica: molecola costituita da 2 filamenti polinucleotidici avvolti a elica intorno a un asse centrale. Ogni filamento formato da uno scheletro dI molecole di zucchero e gruppi fosfato alternati: gruppo ossidrilico del C5’ di un’unità di ribosio è legato al gruppo oss. del C3’ del ribosio successivo attraverso legame fosfodiestereo. A ogni zucchero è legata una base azotata. 2 filamenti legati da legami a idrogeno tra le basi azotate (tra una purina 2 anelli e una pirimidina 1 anello); le basi appaiate sono dette complementari: AT a 2 legami a idrogeno, GC a 3 legami a idrogeno. Struttura DNA simile a una scala a chiocciola e in ogni giro completo dell’elica comprende 10 coppie di basi. Ogni filamento ha un’estremità 5’ e un’estremità 3’ e i filamenti sono antiparalleli. Il DNA umano (diploide) disteso sarebbe lungo 2 metri (6 miliardi di paia di basi). REPLICAZIONE DEL DNA Per poter essere trasmesso, il DNA deve duplicarsi: il processo di duplicazione è detto replicazione, momento in cui i 2 filamenti dell’elica si separano grazie alla rottura dei legami a idrogeno tra le basi appaiate. Ciascun filamento funge come stampo per la sintesi di un nuovo filamento complementare. L’enzima DNA-elicasi e alcune proteine sono necessari per srotolare la doppia elica nel punto di origine della replicazione detto forcella di replicazione. La sintesi è invece catalizzata da un gruppo di enzimi noti come DNA-polimerasi. Nei procarioti il processo avviene nel citoplasma, negli eucarioti la replicazione avviene nel nucleo (= trascrizione). La DNA-polimerasi non può subito sintetizzare un nuovo filamento di DNA ma ha bisogno di un primer (breve tratto a doppia elica, permesso dalla sintesi di un breve filamento di RNA). Replicazione procede in direzione 5’-> 3’ poiché il DNA-polimerasi catalizza il legame di un nucleotide all’estremità 3’: dunque il filamento guida viene sintetizzato in maniera continua, mentre il filamento lento viene sintetizzato in direzione opposta sotto forma di piccoli frammenti discontinui, detti frammenti di Okazaki, poi uniti. La DNA-polimerasi è inoltre in grado di individuare l’eventuale aggiunta di un nucleotide sbagliato. Anche altri enzimi, detti nucleasi di restauro del DNA eliminano eventuali errori rimasti dopo la replicazione. L’IPOTESI UN GENE-UN ENZIMA Con il termine mutazione si intende un cambiamento nell’informazione genetica di un organismo e mutanti sono quegli organismi che presentano la mutazione. L’ipotesi un gene-un enzima: un determinato gene è responsabile della sintesi di un determinato enzima. Modificata in: un gene-una proteina primo amminoacido si stacca dal proprio tRNA. Il ribosoma si sposta di un codone (5’->3’) cosi il primo tRNA finisce nel sito E (exit) lasciando il ribosoma; mentre il secondo tRNA con i 2 amminoacidi occupano il sito P. Nel sito A arriva un terzo amminoacil-tRNA e si forma un nuovo legame peptidico e continua da capo fino a completare la catena polipeptidica. 3. Terminazione : quando il ribosoma arriva a uno dei 3 codoni di stop (UAG/UAA/UGA). La proteina release factor legge il codone di stop e la traduzione si interrompe. Energia per la sintesi: dall’idrolisi dell’ATP. Il filamento di mRNA può essere letto da più ribosomi, il cui insieme è detto polisoma. MUTAZIONI GENICHE Sono cambiamenti improvvisi del patrimonio ereditario (casuali e rari) che interessano un singolo gene, dovuti a errori durante la replicazione. Mutazioni puntiformi: interessano un singolo nucleotide e comportano la sostituzione di un nucleotide con un altro oppure perdita/aggiunta di un nucleotide: queste ultime portano allo spostamento della griglia di lettura, sono dette dunque mutazioni frame-shift che alterano tutto il filamento polipeptidico e sono responsabili di effetti molto gravi. La sostituzione di un nucleotide porta invece alla produzione di un codone sinonimo dando luogo a una mutazione silente oppure provoca 2 mutazioni: missenso, origina un codone che codifica un amminoacido diverso da quello originario; non senso, dà origine a uno dei 3 codoni di stop terminando la sintesi della proteina. Una mutazione può essere definita vantaggiosa (aumenta la probabilità di sopravvivenza), svantaggiosa (se la diminuisce) o neutra (non la modifica). Possono verificarsi anche mutazioni cromosomiche o genomiche (riguardano l’intero patrimonio ereditario). Mutageni fisici: raggi ultravioletti, i raggi X, radiazioni radioattive. Mutageni chimici: pesticidi e diserbanti. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI Avviene a livello della trascrizione: vengono trascritti in mRNA solo i tratti di DNA corrispondenti alle sequenza geniche che devono essere tradotte in proteine. Trascrizione controllata da specifiche proteine di regolazione, codificate da geni regolatori. Proteina di regolazione può agire come repressore (blocca la trascrizione) o attivatore (facilitano l’attacco dell’RNA polimerasi). Nei procarioti, dove il nucleo è assente, la trascrizione è accoppiata alla traduzione. Sistema di regolazione genica: modello dell’operone, individuato negli anni ’60 da Jacob e Monod studiando la regolazione genica in Escherichia Coli. Operone: tratto del cromosoma batterico costituito da un promotore, un operatore e dei geni strutturali. Operatore segue promotore (sito di attacco dell’RNA polimerasi) a cui si lega la proteina repressore, codificata da un gene regolatore. Esistono 2 tipi di operoni: - Operoni inducibili non espressi: la cui trascrizione richiede la presenza di un induttore che inattiva il repressore (legato all’operatore, impedendo all’RNA polimerasi di legarsi al promotore). Si forma il complesso repressore-induttore che si stacca dall’operatore (RNA poli si lega al promotore e inizia la trascrizione). Induttore diventa il substrato su cui agiscono gli enzimi. Un operone inducibile è l’operone lac. - Operoni reprimibili espressi: repressore inattivo finché non si lega a un corepressore, formando cosi il complesso repressore- corepressore che si lega all’operatore. Corepressore: prodotto finale della via biosintestica, come l’operone trp. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI L’mRNA trascritto subisce un processo di elaborazione prima di andare nel citoplasma per la traduzione e la regolazione dell’espressione genica riguarda diverse fasi. I geni degli eucarioti non sono raggruppati in operoni e la regolazione serve per permettere il differenziamento. Controllo conformazionale: cromatina si presenta in due forme= eucromatina (viene trascritta) e eterocromatina (non viene trascritta perché troppo compatta). Controllo della trascrizione: trascrizione selettiva dei geni= principale meccanismo di regolazione dell’espressione genica. Controllo coinvolge proteine regolatrici ed è legato a modificazioni chimiche a carico del DNA. Intensificatori (ehnancer) aumentano la velocità della sintesi dell’RNA, i silencer inibiscono la trascrizione. Controllo della maturazione e del trasporto dell’RNA: regolazione si può attuare attraverso la maturazione selettiva di RNA precursori= solo quelli maturi vano nel citoplasma, gli altri rimangono nel nucleo e poi vengono degradati. Controllo della traduzione: si attua attraverso legame dell’mRNA a proteine inibitrici nel citoplasma che si legano all’estremità 5’ impedendo il legame con il ribosoma. Controllo delle modificazioni post-traduzionali: attivazione e vita della proteina dipendono da modificazioni subite da catene polipeptidiche sintetizzate. Epigenetica: meccanismi di controllo dell’attività genetica che non alterano la sequenza di nucleotidi. ASPETTI PARTICOLARI DEL GENOMA DEGLI EUCARIOTI Il 98% di DNA non codifica per le proteine e viene definito non-coding DNA (ncDNA): una parte di questo ncDNA è inglobato nei geni sotto forma di introni mentre alcune sequenze vengono trascritte: prodotto ottenuto è tRNA, rRNA o RNA che regolano l’espressione genica. Altra parte dispersa nel genoma sotto forma di sequenze ripetute (costituiscono parti strutturali del cromosoma, come i telomeri che sono posti alle sue estremità e proteggono in DNA quando si replica) o sono elementi mobili detti trasposoni che possiedono un gene che codifica per l’enzima trasposasi responsabile del movimento. GENETICA DEI VIRUS Virus: aggregato di molecole organiche formato da una molecola di acido nucleico (DNA o RNA) racchiuso in un involucro di natura proteica e per funzionare deve penetrare in una cellula vivente in modi diversi: la maggior parte inietta nella cellula l’acido nucleico IL SEQUENZIAMENTO DEL DNA Il primo DNA sequenziato fu quello del batteriofago phi X 174 per mezzo del metodo Sanger negli anni ’70. Questo metodo si basa sul principio di complementarietà delle basi azotate dei nucleotidi che compongono filamenti di DNA: per determinare la sequenza esatta di nucleotidi all’interno dei frammenti di DNA si sfrutta il meccanismo replicativo. LE -OMICHE Proteomica: studia la struttura e la funzione di tutte proteine codificate dal genoma umano. Metagenomica: analizza il DNA presente in un particolare ambiente. Trascrittomica: analisi del trascrittoma inteso come l’insieme degli RNA messaggeri trascritti. Metabolomica: studia il complesso di metaboliti presenti in un organismo in un dato momento. Le discipline -omiche sono supportate dalla bioinformatica. IBRIDAZIONE Serve per verificare se un certo gene è presente in un campione di acido nucleico e per stabilire se un gene presenta mutazioni. L’ibridazione si basa sul fatto che un filamento di DNA si appaia a un altro solo se il secondo ha una sequenza complementare alla sua. Una sonda è un tratto di DNA a singolo filamento sintetizzato in laboratorio dotato di una sequenza di nucleotidi complementare a quella del gene target (marcata con colori fluo). Le nuove tecniche a ibridazione utilizzano il microarray a DNA, ovvero una matrice in cui ogni elemento contiene copie di una sonda diversa di DNA a singolo filamento per consentire di rilevare l’espressione di più geni i diversi tessuti. REAZIONE POMERASICA A CATENA PCR, è una tecnica di laboratorio che consente di produrre un elevato numero di copie nel tratto di DNA di cui si nota la sequenza nucleotidica. Sono necessari: DNA da amplificare/ 2 primer complementari ai filamenti di DNA/ DNA Taq polimerasi/ nucleotidi liberi per formare filamenti di DNA. Il tutto viene posto in un termociclatore (varia la temperatura per vari cicli di tempo). Ogni ciclo PCR consiste di 3 fasi: denaturazione (si rompono legami a idrogeno tra basi azotate); annealing (temperatura si abbassa cosi i primer si appaiano al DNA); allungamento (temperatura si alza cosi la Taq polimerasi sintetizza il nuovo filamento). Processo si ripete per 30-40 cicli. 3 applicazioni della PCR: - Produce quantità di un certo gene che deve essere studiato; - Permette di ottenere l’impronta di DNA di una persona (da un capello o da tessuto che contiene una cellula) poiché le sequenze di nucleotidi presenti nei genomi sono diverse in ogni individuo; - Utilizzata per individuare infezioni virali, anche se presente in un’unica copia (come il tampone molecolare per Covid). CLONAGGIO DI UN GENE Scambio di materiale genetico (come il crossing-over) in laboratorio si ottiene inserendo il gene di un organismo nel DNA di un altro organismo, creando DNA ricombinante (e organismi transgenici): ingegneria genetica (o tecnologia di DNA ricombinante). DNA ricombinante che entra in una cellula e si replica in essa, può essere un veicolo per il trasporto e la moltiplicazione del gene. DNA viene inserito in un batterio e si comporta come il DNA originario. Grazie alla rapida proliferazione batterica si possono ricavare in breve tempo cellule figlie geneticamente identiche (clone) dotate del gene estraneo. Batteri funzionano come fabbriche in miniatura. L’ingegneria genetica ha prodotto insetticidi, farmaci, bioplastiche, fibre resistenti ecc… GENOME EDITING Tecnica di ingegneria genetica con la quale è possibile eliminare/ sostituire un preciso gene in un organismo. Questa tecnica utilizza delle forbici molecolari come le CRISPR/Cas9, un sistema di difesa dei batteri: CRISPR indica sequenze di DNA ripetute che sono presenti nel DNA dei batteri e sono complementari ai frammenti di DNA di batteriofagi; Cas9 è un’endonucleasi ovvero proteina che taglia il DNA. Il CRISPR guida il Cas9 verso il genoma complementare e lo taglia (geni di tumori o malattie).