il traffico vescicolare e le proteine Rab, Sbobinature di Biologia Cellulare

Scarica il traffico vescicolare e le proteine Rab e più Sbobinature in PDF di Biologia Cellulare solo su Docsity! LEZ 17.11 TEMA CENTRALE: individuazione di alcuni meccanismi che permettono alla cellula di essere sicura che nell’ambito del traffico vescicolare queste vescicole siano ben indirizzate. Per fare questo esistono dei recettori o dei segnali che aiutano ad individuare da una parte la vescicola e dall'altra parte i dipartimenti di partenza e di arrivo. PI)P PI(A)P PI(4,5)P, PI(3,5)P, PI(3,4,5)P; Quindi il traffico intracellulare viene gestito con estrema precisione, e per conferire questa caratteristica abbiamo una sp. cità molecolare che va ad identificare quindi le vescicole e gli organelli donatori e di destinazione. La cellula utilizza il fosftidilinositolo dato che esso ha la possibilità di essere modificato in vari fosfoinositidi e questo è relativamente semplice perché il fosfatidilinositolo è presente sulle membrane; quindi occorrono delle chinasi o delle fosfatasi per aggiungere, togliere, o modulare e quindi variare la stato di fosforilazione dei fosfoinositidi. L'immagine ci mostra che nella membrana plasmatica troviamo il fosfatidilinositolo bifosfato 4-5, mentre gli altri comparti hanno altre forme di fosfoinositidi. Per quanto riguarda la formazione delle vescicole esistono delle diverse forme di adattatori come ad esempio quello della clatrina che è diversificato. Le proteine adattatrici si legano ai recettori e alla clatrina Sono identificate tre forme degli adattatori AP LGANDO n [Gola dove AP1 e AP2 RECETTORE è arimeinali sono i principali, e COMPLESSO cori DI ADATTAMENTO | il primo regola ) l’uscita e la QIATRINA formazione di vescicole di clatrina dal Golgi, mentre la seconda forma è quella classica che media l'assemblaggio, la formazione e il carico delle vescicole di clatrina che si formano sulla via endocitica a livello della membrana plasmatica. AP-3 mostrato in figura è specifico per andare verso i lisosomi. Questi adattatori sono composti da più proteine quindi si ha un complesso proteico molto sofisticato e il loro ruolo è molto importante in quanto mediano l'assemblaggio e il carico preciso di queste molecole. La specificità è data dall’adattatore Quindi l’AP-2 della clatrina per svolgere la sua funzione ha bisogno di identificare bene il dominio su cui andare a legarsi. Lui infatti deve svolgere le sue funzioni sulla membrana plasmatica dove deve interagire anche con i recettori del CARGO, abbiamo quindi un primo aggancio favorito da fosfatidilinositolo bifosfato 4-5 e tale meccanismo induce un cambiamento 24 conformazionale che fa si che la sub unità u2 (mi) del complesso AP-2 si modifichi ed esponga il sito ini d’interazione con il recettore stesso. Quindi l’aggancio è Golgi complex (- indipendente dall’interazione con il recettore, e Pidinsi4. 9A: ( l'interazione si stabilizza ulteriormente perché si ha Ù anche l'esposizione di un secondo sito di legame con il Plasma membrane e) fosfoinositide 4-5 bifosfato. Quindi abbiamo: tyrosine-bassd moti. e Primainterazione con un fosfoinositide e un cambiamento conformazionale che comporta due eventi successivi: > Interazione con il recettore perché si è esposto il sito >» Interazione con un secondo fosfoinositide, si ha quindi un’affinità più alta e un'interazione più stabile. GDI: (guanine nucleotide dissociation inhibitor) Le proteine Rab possono essere tenute in soluzione nel citosol, ma questo avviene soltanto se sono complessate con una proteina che è la GDI. Quindi questa proteina tiene in soluzione Rab in quanto crea un’interazione in cui Rab nasconde il gruppo lipidico che normalmente usa per associarsi alle membrane. se Qui Rab può essere associata alla î Seta) membrana, ma può anche essere dissociata dalla membrana secondo un sistema di ulteriore inibizione; viene è quindi portata in soluzione ma avendo fi Lo fi “MR SES pe una coda idrofobica ha bisogno di una a da l'ner proteina che la stabilizzi. Questo \ avviene soltanto quando la proteina è in uno stadio GDP in cui viene quindi stabilizzata dalla GDI. Quindi questa proteina in soluzione può essere rimossa dal citosol e reclutata sulla membrana della vescicola che si deve formare, esistono poi altre proteine che si chiamano GDF che la rimuovono dall'interazione con GDI e favoriscono l'inserzione della coda lipidica nella membrana. Quindi la coda lipidica è quella che le permette di legarsi alla membrana, ma è anche lo stesso lipide che non le permette di stare in soluzione se non c'è una GDI. Quindi la forma in soluzione passa alla membrana perché c'è una GDF che toglie GDI, a questo punto interviene GEF la quale fa scambiare il GDP con GTP e su questa vescicola quindi la Rab può lavorare. IHdisegno-fa-vedereto-switeh e2in nto studi di cris ia hann strato le regioni che fanno da interruttore; quando la proteina è attiva i due domini sono aperti e sono quelli che permettono l’interazione con l’effettore. Con il termine effettore intendiamo tutte le proteine che la Rab può reclutare per aggiungere una funzionalità alla vescicola su cui è presente. Nell'immagine centrale vediamo che nella via dell’endocitosi ci sono delle vescicole che si muovono dal comparto degli endosomi tardivi, e vediamo che questo ha due domini precisi che sono identificati dalle proteine Rab (Rab7/Rab9); quindi lo stesso organello utilizza due Rab diverse, in due regioni diverse perché così può formare due tipi di vescicole diverse: una ad esempio che va al lisosoma, un'altra che magari va al reticolo del Golgi. Quindi un organello può anche reclutare due proteine Rab diverse con il fine di far gemmare vescicole diverse tra di loro, se avesse la stessa Rab non potrebbe creare vescicole diversificate. a GDI-mediated Rab delivery Effector protein Lumen Db GDI-mediated Rab retrieval Il lipide che associa la Rab alla membrana è di gruppo prenile (Rab prenilata) e si possono trovare o sulla membrana o sul citoplasma. Complessi delle proteine Rab già con la coda prenilata sono legate a GDI e loro hanno tutte le informazioni necessarie per essere localizzate e iniziare a lavorare, hanno però bisogno di un fattore che è la GDF. Le GDF ovviamente sono specifiche per alcuni gruppi chiamati sottoinsiemi; in questo modo la GDF attiva la Rab e fa dissociare GDI e a questo punto la proteina viene a legarsi alla membrana. Il passaggio successivo è quello di attivarsi con GTP grazie ad una GEF, a questo punto la proteina Rab può interagire e va a reclutare le proteine effettrici che vanno a dare una funzionalità alla vescicola che si sta formando. La Rab poi deve anche a sua volta essere staccata dalla vescicola , quindi deve essere inattivata dalla proteina GEF facendola convertire in GDP, e anche le molecole effettrici si staccano. Si ha poi un recupero, a cui partecipa uno chaperone che aiuta la proteina GDI a recuperare una Rab dalla membrana. RabGOT è quello di una classica proteina con attività GTP-asica da un lipide, spesso di un Rab \ / anche se possiamo aggiungere 9 alcuni elementi. Infatti le Li proteine Rab sono modificate Vi, /N To gruppo prenile, quindi significa che la proteina Rab viene Micro f iniziale neoformato che deve Marsotsyndromes | sintetizzata senza la sua coda - e] ’ == 'è- & quindi esiste anche un pool 5 o essere ancora avviato. Quindi dopo la sintesi proteica queste proteine possono essere rilasciate senza la coda, ma senza tale struttura (possono essere rilasciate senza coda o con la coda) non possono circolare in maniera libera ma devono essere associate con delle proteine che si chiamano Rab escort protein (REP), ovvero proteine che le tengono complessate. Il fatto quindi di avere un’altra proteina che le complessa ci fa capire come tali proteine Rab siano controllate all’interno della cellula; quindi l'associazione di Rab con RAP permette l'interazione con la proteina che aggiunge il prenile, a questo punto questa proteina può entrare in interazione con la GDI, si associa alla membrana e funzionare. L'immagine ci mostra le diverse patologie legate ad alterazioni di componenti che partecipano alla regolazione del ciclo delle proteine Rab. Usualmente nel nostro genoma i geni sono più raramente in singola copia, ma normalmente abbiamo 3 geni di una stessa famiglia; sono quindi evoluzioni legate a duplicazioni del genoma. Per cui diciamo che l'evoluzione si è portata dietro l'aumento a partire da un singolo gene, quindi nei mammiferi un singolo gene è presente in 3 forme diverse, ovvero ha formato una piccola famiglia. Abbiamo trattato questo argomento perché per quanto concerne Rab il numero è 60 e questo significa che c'è stata una grossa pressione selettiva ad aumentare il numero di proteine della famiglia Rab vista la loro importanza. Infatti l’uomo non è fatto da un solo modello cellulare, ma abbiamo centinaia di tipi di cellule che variano, dalla cellula dell'intestino tenue fino ad un neurone del cervelletto, quindi è necessario che il nostro organismo codifichi tutto quello che è necessario per gestire la complessità di una cellula nelle sue diverse forme. Nell'immagine i numeri corrispondono alle proteine Rab di quella regione, e ad esempio le RAb 1 sono sulla via di uscita dal reticolo verso il Golgi, la RAB 2 torna indietro. Le vescicole COOP II, che sono quelle che si formano sul reticolo, sono associate con la Rab 1, mentre COOP I sono associate con Rab II. Troviamo anche che il passaggio all’interno del Golgi è mediato da vescicole che sono associate a Rab 6. Abbiamo poi un reparto complesso che è quello del trans-Golgi perché dal reticolo si passa alle cisterne Cis del Golgi, mediali e trans, e quindi si ha una modificazione di queste proteine. Una volta che queste sono state modificate e sono mature, a livello del trans Golgi devono essere smistate, quindi da qui partono vescicole molto diverse tra loro per contenuto e per destinazione, infatti il numero di proteine Rab associate al trans- golgi network è molto ampio in quanto questo è molto sofisticato. Molte volte abbiamo anche più Rab insieme e la specificità è data dalla combinazione, oppure eventualmente dal fatto che una Rab stia svolgendo una funzione analoga per vescicole analoghe ad altre. Sull’endocitosi qui vediamo il coinvolgimento della Rab 5, verso i lisosomi abbiamo invece la Rab 7 che è quella che trasferisce al lisosoma le vescicole per la degradazione. Ad esempio vediamo i melanosomi, organelli prodotti dai melanociti, deputati a sintesi ed accumulo di melanina; abbiamo quindi delle vescicole che vengono esocitate e sono identificate da un set di Rab (27,32 e 38) che definiscono bene questo comparto. Qualche Rab è coinvolta nelle vie di regolazione delle interazioni delle cellule, regolazioni mediate da integrine ad esempio, e quindi fanno parte anche del controllo dell’adesione cellulare. LL] Delucidazione ultima slide Nell’endosoma precoce arrivano delle vescicole dalla membrana plasmatica, a questo punto l’endosoma precoce raccoglie queste proteine dalle vescicole, però ha bisogno di avere dei comparti diversi. L’endosoma precoce quindi riceve vescicole Rab 5, ma poi manda vescicole Rab 4 ad esempio alla membrana plasmatica o all’endosoma di riciclo. Quindi in questo organello non si trova una sola Rab, ma due Rab. Questo occorre perché abbiamo anche un'identità di sub domini; l’endosoma precoce manderà a quello tardivo delle vescicole e queste raggiungono la zona caratterizzata da Rab 7. Quindi dall’endosoma precoce partiranno delle vescicole che hanno la Rab 5 che le manda ad esempio all’endosoma tardivo, questo però manderà le vescicole ai lisosomi e al Golgi, perciò a questo punto quindi l’endosoma tardivo ha bisogno di due stazioni in cui formare le vescicole. Alcune devono andare ai lisosomi e queste le fa partire associandole con il dominio Rab 7, quelle che devono andare al golgi invece si associano con la Rab 9. Una vescicola che ha una sola destinazione ha solo una Rab, quello che vediamo nell’immagine è che abbiamo degli organelli che per via della loro complessa natura e funzione ricevono e smistano a comparti diversi; quindi sono di per sé caratterizzati da Rab diverse (come Rab 11, Rab 4). L’endosoma tardivo di cui stavamo parlando deve mandare vescicole al Golgi e lo fa utilizzando Rab 9, ma quando deve mandare le vescicole al lisosoma utilizza Rab 7. Quindi nell'immagine vediamo la via endocitotica, in cui questa fa formare delle vescicole e le manda all’endosoma precoce, questo però deve smistare e quindi o manda indietro proteine alla membrana e le fa partire con l'assemblaggio Rab 4, oppure manda delle vescicole all’endodoma di riciclo. Quando l’endosoma di riciclo deve mandare delle vescicole alla membrana plasmatica, crea delle vescicole con Rab 11; quindi in una situazione in cui esistono più destinazioni quell’organello ha più Rab in quanto queste determinano il destino delle vescicole, e quindi due vescicole diverse partiranno da zone diverse dell’organello stesso. Quindi dall’endosoma precoce parte una vescicola con Rab 5 che va all’endosoma tardivo, esso prende queste vescicole, gli cambia la Rab mettendo la 7 e le vescicole con Rab 7 vanno al lisosoma. Sempre l’endosoma tardivo che ha ricevuto una vescicola con Rab 5, si fonde con il lisosoma e la membrana che emerge invece di ricevere Rab 7 riceve Rab 9 che assemblerà un carico che manda al Golgi. Quindi se un organello deve mandare vescicole in più direzioni si creano i sottodomini (compartimentalizzazioni che possono essere dinamiche anche in base alla necessità della cellula), ovvero zone specializzate più piccole lungo tutta la sua membrana e da dove partono vescicole con Rab diverse. Rab 4e Rab 5 inizialmente possono essere tutte e due reclutate dagli stessi fosfoinositidi, poi si creano delle zone in cui la 4 e la 5 si separano; quindi prevalentemente su un organello (membrana) abbiamo un certo tipo di fosfoinositide, ma abbiamo anche chinasi e fosfatasi che possono modificare la composizione, e quindi si creano anche delle situazioni dinamiche; per cui alcuni fosfoinositidi possono cambiare. Le Rab creano delle catene di segnale come quella Sf RabA 2: Bab che vediamo nell'immagine; infatti Rab A quando 0 -G Ba è attiva agisce attivando alcuni effettori, uno degli effettori è una GEF, ma questa non è la GEF della ZIN GEE ZI cH Rab A è la GEF della Rab B; quindi l'attivazione I della RAb A induce a valle l’attivazione di un’altra 3 * ® GAP 3 w è Rab la quale a sua volta ha diversi effettori e uno —: =“ di questi può essere una GAP, oppure un altro può essere una GEF. A seconda di quali proteine queste GAP e GEF vanno a regolare, si possono così avere una serie di segnali molto più sofisticati rispetto all'attivazione di una sola Rab. Ci possiamo quindi muovere da un organello ad un altro perché su in un organello su cui abbiamo la Rab A, abbiamo attivato una GEF che va a funzionare su una Rab B che è effettori effetton su un altro organello. a Positive feedback b Effector coupling Alcuni effettori der GDP GTP > GIP possono sa <=9 (ab ESS Rab interagire con ‘GTP una Rab, e con GDP d Rab conversion una GEF. Se (ca GDP GEF agisce sulla € Activation coupling stessa Rab legata Le A all’effettore, si crea un GTP Si feedback ®5D GDP positivo ( (a) perché GEF attiverà tale Rab, e questo meccanismo funziona fino a che GEF è attiva in quanto come visto sopra potrebbe essere eventualmente regolata da un’altra Rab. Nel’esempio (b) abbiamo che l’effettore lega addirittura due Rab diverse, quindi le tiene vicine e funzionali insieme. (c) effetto di combinazione: l’effettore lega RAb e lega una GEF, ma tale proteina agisce su un’altra Rab e si viene così a creare un sistema duale in quanto la Rab attiva una GEF che va a funzionare su un’altra Rab. Quindi quando parliamo di una Rab attivata o inibita, non è un sistema chiuso e statico ma è tutto molto variabile; si ha quindi un coordinamento di funzioni delle proteine RAb. (d): Rab si lega all’effettore che agisce su una GEF che a sua volta agisce su una Rab che va ad attivare un’altra Rab, la quale attiva una GAP. Questa è quella che andrà ad inibire la Rab iniziale che aveva attivato tutto il processo. In questo caso si crea un feedback negativo. e FEEDBACK POSITIVO: Rab lega un effettore (uno dei target) rappresentato da una GEF, se è una GEF che agisce su quella Rab specifica rimane sempre attiva, fino a che non interviene una GAP che la inibisce. Un feedback positivo si crea quando un complesso Rab effettore contiene fattori di scambio guanina nucleotide (GEFs), che catalizzano lo scambio di GDP/GTP, per lo stesso GTPasi Rab che li recluta in primo luogo. e EFFECTORCOUPLING: abbiamo l’effettore e un’altra Rab; in questo modo si ha l’interazione tra due membrane perché questo effettore può essere la proteina che media l'interazione con il target finale della vescicola; possiamo quindi avere ad esempio due microdomini nella stessa membrana. ® EFFETTO DI COMBINAZIONE: Rab lega un effettore sempre con una GEF che però agisce con una Rab diversa > attivazione a valle RAB CONVERSION: Rab lega l’effettore GEF che agisce su un’altra proteina RAb che è associata ad una GAP che va a bloccare la Rab iniziale > feedback negativo Si forma quindi una sorta di neetwork (rete) di segnale in cui le Rab si attivano tra di loro e si inibiscono. a Rabsi icole-vedì struttura-delta-GDt-purificatae-vistaaitaggitLa slide ci mostra la Rab che è attivata, viaggia con la vescicola, arriva a destinazione, poi viene riciclata grazie all'interazione con la GDI. Quindiconoscerete-strutture-di-questietementiei di-cavi ted lecele-sid cargo \ v-SNARE Rab-GTP Sessi effettore Rab (proteina di attracco) t-SNARE, N “CITOSOL membrana bersaglio — recettore del cargo Sl 7 Abbiamo quindi una vescicola con la sua Rab attivata, abbiamo già presente il recettore del cargo (caricato per merito di RAb che lo identifica) e ha fatto caricare anche un'altra proteina che è la v- SNARE. Ad un certo punto in prossimità della membrana la Rab media l'interazione con la proteina di attracco. Quindi tra le funzioni di RAb abbiamo che inizialmente ha fatto formare una vescicola con il recettore, ha fatto caricare la snare giusta, probabilmente avrà legato anche il motore per far muovere questa vescicola, e nella fase finale questa Rab riconosce anche la molecola d’interazione e quindi favorisce l'avvicinarsi della vescicola alla membrana, e a questo punto l’avvio della fusione che porta al rilascio del contenuto