IMMOBILIZZAZIONE ENZIMATICA, Slide di Biochimica

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IMMOBILIZZAZIONE ENZIMATICA Approccio discontinu o pproccio discontinu o Approccio continuo pproccio continuo VANTAGGII • Riduzione dei costi • Miglior controllo della reazione • Sviluppo nuove tecnologie applicative • Esecuzione di più reazioni consecutive • i zi i c sti • i li r c tr ll ll r zi • il t c l i lic ti • s c zi i i r zi i c s c ti SVANTAGGII • Modificazioni conformazionali dell’enzima • Minor diffusione del substrato nei confronti dell’ enzima • ific zi i c f r zi li ll’ zi • i r iff si l s str t i c fr ti ll’ zi 1°CASO STUDIO SULL’IMMOBILIZZAZIONE ENZIMATICA CECII OLIGOSACCARIDI APPARTENENTI ALLA FAMIGLIA DEL RAFFINOSIO (RFO) OLIGOSACCARIDI APPARTENENTI ALLA FAMIGLIA DEL RAFFINOSIO (RFO) CO2, H2,CH4 = FLATULENZA, NAUSEA,CRAMPI, DIARREA CO2, H2,CH4 = FLATULENZA, NAUSEA,CRAMPI, DIARREA MATERIALI E METODI: COLTIVAZIONE DI ASPERGILLUS ORYZAE Isolamento di Aspergillus oryzae dal suolo Isola ento di spergillus oryzae dal suolo Coltivazione di Aspergillus oryzae in un mezzo chimicamente definito a 4°C Produzione di α-GALATTOSIDASI SOLUBILE galattosidasi da parte di Aspergillus oryzae Precipitazione di α-GALATTOSIDASI SOLUBILE galattosidasi grezza con 80% di solfato di ammonio e conservazione a 4°C Recupero di α-GALATTOSIDASI SOLUBILE galattosidasi e solubilizzazione in tampone di acetato 0,2 M MATERIALI E METODI: IMMOBILIZZAZIONE DELL’ α-GALATTOSIDASI SOLUBILEGALATTOSIDASI Soluzione in acqua distillata di alcool polivinilico (16%), alginato di sodio (4%) e α-Galattosidasi parzialmente prurificarta Soluzione in acqua distillata di alcool polivinilico (16 ), alginato di sodio (4 ) e α- alattosidasi parzial ente prurificarta Trasferimento della soluzione in acido borico saturo con 2% di cloruro di sodio Trasferi ento della soluzione in acido borico saturo con 2 di cloruro di sodio Formazione di microgranuli e successivo stazionamento in soluzione per 48h per completare il processo di solidificazione For azione di icrogranuli e successivo staziona ento in soluzione per 48h per co pletare il processo di solidificazione Lavaggio dei microgranuli con acqua distillata; trattamento con glutaraldeide allo 0,6% per 1h; rilavaggio con acqua distillata e consevazione in tampone di acetato 0,2 M Lavaggio dei icrogranuli con acqua distillata; tratta ento con glutaraldeide allo 0,6 per 1h; rilavaggio con acqua distillata e consevazione in ta pone di acetato 0,2 MATERIALI E METODI: PREPARAZIONE DELLA CREMA DI CECI Macinazion e dei ceci in farina e successiva sgrassatur a con esano acinazion e dei ceci in farina e successiva sgrassatur a con esano Sospension e della farina in 15 ml di acqua distillata Sospension e della farina in 15 l di acqua distillata Riscaldament o della sospensione fino ad ebollizione Riscalda ent o della sospensione fino ad ebollizione Centrifugazione della sospensione e successivo allontanamento dei residui non disciolti e recupero del surnatante Centrifugazione della sospensione e successivo allontana ento dei residui non disciolti e recupero del surnatante MATERIALI E METODI: TRATTAMENTO ENZIMATICO IN BATCH α-galattosidasi solubile - l tt si si s l il Aggiunta di 10 ml di enzima in 60 ml di crema di ceci Aggiunta di 10 l di enzi a in 60 l di cre a di ceci Reazione di idrolisi a 50 °C per 3,6,9,12h eazione di idrolisi a 50 ° per 3,6,9,12h Estrazione della miscela di reazione Estrazione della iscela di reazione Analisi per la verifica della degradazione degli oligosaccaridi Analisi per la verifica della degradazione degli oligosaccaridi α-galattosidasi immobilizzata - l tt si si i ilizz t Aggiunta di microgranuli in 60 ml di crema di ceci Aggiunta di icrogranuli in 60 l di cre a di ceci Reazione di idrolisi a 50 °C per 3,6,9,12h eazione di idrolisi a 50 ° per 3,6,9,12h Estrazione della crema di ceci per la determinazione della concentrazione degli oligosaccaridi Estrazione della cre a di ceci per la deter inazione della concentrazione degli oligosaccaridi Separazione dei microgranuli per filtrazione e trasferimento nel successivo campione di crema di ceci Separazione dei icrogranuli per filtrazione e trasferi ento nel successivo ca pione di cre a di ceci Ripetizione della reazione per 6 cicli Ripetizione della reazione per 6 cicli MATERIALI E METODI: TRATTAMENTO ENZIMATICO IN CONTINUO Impiego di un reattore a letto fluido, costituito da una colonna di vetro incamiciata, riempita con microgranuli di α-galattosidasi galattosidasi immobilizzata su alcool polivinilico I piego di un reattore a letto fluido, costituito da una colonna di vetro inca iciata, rie pita con icrogranuli di α-galattosidasi galattosidasi i obilizzata su alcool polivinilico Alimentazione dal fondo della colonna della crema di ceci, preriscaldata a 50°C, impiegando portate differenti pari a 30,60,90,120 e 150 ml/h Ali entazione dal fondo della colonna della cre a di ceci, preriscaldata a 50° , i piegando portate differenti pari a 30,60,90,120 e 150 l/h Prelievo del prodotto trattato enzimaticamente dalla parte superiore della colonna Prelievo del prodotto trattato enzi atica ente dalla parte superiore della colonna Analisi degli effluenti per determinare l’idrolisi degli oligosaccaridi (RFO) Analisi degli effluenti per deter inare l’idrolisi degli oligosaccaridi ( F ) RISULTATI E DISCUSSIONE: TRATTAMENTO ENZIMATICO IN BATCH Crem a di ceci re a di ceci Enzima solubile Enzi a solubile 3 ore di incubazion e 3 ore di incubazion e Idrolisi pari all’82% Idrolisi pari all’82% 6 ore di incubazion e 6 ore di incubazion e Idrolisi pari all’86% Idrolisi pari all’86% 9 ore di incubazion e 9 ore di incubazion e Idrolisi pari all’ 88% Idrolisi pari all’ 88% 12 ore di incubazion e 12 ore di incubazion e Idrolisi pari al 96% Idrolisi pari al 96% Enzima immobilizzat o Enzi a i obilizzat o 3 ore di incubazion e 3 ore di incubazion e Idrolisi pari al 70% Idrolisi pari al 70% 6 ore di incubazion e 6 ore di incubazion e Idrolisi pari all’ 82% Idrolisi pari all’ 82% 9 ore di incubazion e 9 ore di incubazion e Idrolisi pari all’86% Idrolisi pari all’86% 12 ore di incubazion e 12 ore di incubazion e Idrolisi pari al 92% Idrolisi pari al 92% 680 mg/100 ml di RFO 680 mg/100 ml di RFO Nessuna drastica riduzione della percentuale di idrolisi degli RFO anche dopo 6 cicli di utilizzo dell’enzima immobilizzato 2° CASO STUDIO SULL'IMMOBILIZZAZIONE ENZIMATICA pci per fnteenrsonal Jowmal af Fond fcimcramd Terno SIE, SA SU Original article Enzymatie mitigation of acrylamide in fried potato chips using asparaginase from Aspergillus terreus Rari Alsrarya & Gurunathan Baskar* (D Deprineni af bictecimalogy, SL Joeght College o! Eagiaresina, Chemi dii LI, ida {Rtnantand 20 dame 200%: sd capind n rartard fore 19 Auguri 2007) ACRILAMMIDE: PERICOLO CHIMICO NELLA CATENA ALIMENTARE L’acrilammide è un composto chimico cancerogeno che si forma a partire da asparagina e zuccheri a temperature superiori a 120°C. Si forma prevalentemente in alimenti ricchi di carboidrati cotti al forno o fritti. (Regolamento UE 2017/2158) Amminoaci di ZuccheriAcqua Acrilammide PROCESSO DI FORMAZIONE DELL’ACRILAMMIDE Il processo chimico che porta alla formazione di acrilammide è noto come “REAZIONE DI MAILLARD” ASPARAGINA + ZUCCHERI = N-GALATTOSIDASI SOLUBILEGLICOSILASPARAGINA + CALORE = BASE DI SCHIFF la quale può decomporsi direttamente per formare ACRILAMMIDE o idrolizzarsi per formare 3–AMMINOPROPIONAMIDE AGGIUNTA DI ADDITIVI E APPROCCI ENZIMATICI PER LA MITIGAZIONE DELL’ACRILAMMIDE CATIONI BIVALENTI (NaCl) Mezzo efficace per ridurre l’acrilammide mediante l’inibizione della formazione della base Schiff ENZIMA ASPARAGINASI Idrolizza l’asparagina in acido aspartico ed ammoniaca IN COSA CONSISTE IL PROGETTO? OBIETTIVO PRINCIPALE I I I I • Mitigazione del contenuto di acrilammide con l’impiego sinergico dell’enzima ASPARAGINAS I, prodotto da Aspergillus terreus, e di alcuni additivi (NaCl ed acido citrico) • iti i l t t i il i l’i i i i ll’ i I I, tt ill t , i l i iti i ( l i it i ) NOVITÀ PRINCIPALE I I I • Immobilizzazio ne dell’enzima ASPARAGINAS I su nanoparticell e magnetiche ad uso ripetuto • I ili i ll’ i I I i ll i i t t SINTESI DELLE NANOPARTICELLE MAGNETICHE ED IMMOBILIZZAZIONE DELL’ASPARAGINASI • Solubilizzazione di 0,811 g di cloruro ferrico e di 0,69 g di solfato ferroso in 50 ml di acqua distillata • l ilizz zi i , i l r r f rri i , i s lf t f rr s i l i istill t • Aggiunta di 1 M di idrossido di sodio fino ad ottenere un precipitato nero • i t i i i r ssi i s i fi tt r r i it t r • Decantazione ed essiccazione a 80 °C della soluzione• t zi ssi zi ° ll s l zi • Mescolamento e conservazione in shaker per 30 minuti di 0,5 g di nanoparticelle magnetiche e 50 ml di asparaginasi • s l t s r zi i s r r i ti i , i rti ll ti l i s r i si • Aggiunta dell’ 1 % di glutaraldeide e stazionamento per 2 ore al fine di recuperare l’enzima per i cicli successivi • i t ll’ i l t r l i st zi t r r l fi i r r r l’ zi r i i li s ssi i MATERIALI E METODI: ESTRAZIONE DELL’ACRILAMMIDE Aggiunta degli standard ad 1 g di patata fritta schiacciata i t e li st r i t t fritt sc i cci t Aggiunta alla soluzione di 5 ml di n-esano, 9 ml di acqua e 9 ml di acetonitrile i t ll s l zi e i l i -es , l i c e l i cet itrile Agitazione ed aggiunta di sali estrattivi per acrilammide, seguita da centrifugazione per 1 minuto it zi e e i t i s li estrattivi er cril i e, se it ce trif zi e er i t Rimozione dalla provetta dello strato di n-esano e trasferimento di 6 ml di acetonitrile in una provetta contenente solfato di magnesio e PSA i ozione dalla provetta dello strato di n-esano e trasferi ento di 6 l di acetonitrile in una provetta contenente solfato di agnesio e S Centrifugazione per 1 minuto della sospensione ottenuta e trif zi e er i t ell s s e si e tte t Trasferimento dell’acetonitrile in fiala per stimare il contenuto di acrilammide con la tecnica HPLC r sferi e t ell’ cet itrile i fi l er sti re il c te t i cril i e c l tec ic Confronto dei picchi cromatografici tra gli standard e il campione di cui bisogna quantificare la concentrazione di acrilammide onfronto dei picchi cro atografici tra gli standard e il ca pione di cui bisogna quantificare la concentrazione di acrila ide RISULTATI E DISCUSSIONE: EFFETTO DELLA CONCENTRAZIONE ENZIMATICA SULLA MITIGAZIONE DELL’ACRILAMMIDE PRIMA DELL’AMMOLLO I LL’ LL Asparagina 4,26 mmol kg -galattosidasi 1 sparagina 4,26 ol kg -galattosidasi 1 Glucosio 3,43 mmol kg- 1 lucosio 3,43 ol kg- 1 DOPO L’AMMOLLO CON NaCl +ASPARAGINA SI L’ LL a l S I SI Asparagina 1,48 mmol kg-1 sparagina 1,48 ol kg-1 Glucosio 2,45 mmol kg- 1 lucosio 2,45 ol kg- 1 • 4 U ml-galattosidasi 1 • (minore formazione di acrilammide pari a 1240 µg kg-galattosidasi 1) La concentrazione ottimale di asparaginasi è stata rilevata a: Studi di riutilizzabilità hanno dimostrato che l’attività dell’enzima legato alle particelle magnetiche è risultata attiva solo per i primi 3 cicli con successivo aumento dell’acrilammide fino a valori di 3795 µg kg-GALATTOSIDASI SOLUBILE1 RISULTATI E DISCUSSIONE: EFFETTO DELLA TEMPERATURA E DEL TEMPO DI FRITTURA SULLA MITIGAZIONE DELL’ ACRILAMMIDE Lo studio ha dimostrato che temperatura e tempo ottimale di frittura per la riduzione del contenuto di acrilammide nelle patate fritte sono stati di 170 °C e 15 minuti RISULTATI E DISCUSSIONE: QUANTIFICAZIONE DELL’ACRILLAMIDE NEI CAMPIONI DI PATATE FRITTE CON HPLC Confrontando i cromatogrammi delle patatine fritte imbevute di ASPARAGINASI e NaCl con quelli dei campioni senza alcuna condizione di ammollo è risultato che il contenuto di acrilammide nei campioni di patate senza alcun trattamento era notevolmente maggiore rispetto ai campioni pretrattati CONCLUSIONI Concludendo lo studio ha dimostrato che l’ ASPARAGINASI è effettivamente coinvolta nella mitigazione dell’acrilammide e che l’uso ripetuto di ASPARAGINASI IMMOBILIZZATA offre il vantaggio di ridurre i costi di lavorazione l l t i i tr t l’ I I ff tti t i lt ll iti i ll’ ril i l’ ri t t i I I I I I ffr il t i i ri rr i ti i l r i