Immunologia cellulare e molecolare: schemi riassuntivi dell'Abbas, Schemi e mappe concettuali di Immunologia

Scarica Immunologia cellulare e molecolare: schemi riassuntivi dell'Abbas e più Schemi e mappe concettuali in PDF di Immunologia solo su Docsity! Iodice Serena UniBS 1 IMMUNOLOGIA Cellule del sistema immunitario ▪ Circolanti nel sangue ▪ Nella linfa ▪ Negli organi linfoidi ▪ Sparse nei tessuti Derivazione: cells staminali ematopoietiche (HSC) Diverse popolazioni di cellule dovute a espressione di diverse proteine di membrana: - Linfociti T helper esprimono CD4 - Linfociti T citotossici esprimono CD8 CD = cluster of differentiation → classificazione di molecole di superficie con struttura definita, riconosciute da un cluster di anticorpi monoclonali Formula leucocitaria CELLULE INTERVALLO NORMALE (NUM/MM3) INTERVALLO NORMALE (%) NEUTROFILI 1800-7700 40-60 % EOSINOFILI 0-450 1-4 % BASOFILI 0-200 <1 % MONOCITI 200-800 2-8 % LINFOCITI 1000-4800 20-40 % TOT (LEUCOCITI) 4500-11000 Fagociti a) Neutrofili b) Macrofagi-monociti Funzioni primarie:  Ingerire ed eliminare microrganismi  Rimuovere tessuti danneggiati Fasi della difesa: 1. Reclutamento cellula nel sito di infezione 2. Riconoscimento microbo e attivazione 3. Fagocitosi: ingestione e eliminazione microbo Comunicano con altre cellule mediante: • Interazione diretta • Rilascio di citochine Capacità di migrare Linea mieloide → fagociti e cellule dendritiche (DC) Linea linfoide → linfociti Marcatori: permettono identificazione e distinzioni di diverse popolazioni cellulari. Hanno anche significato funzionale Es. Never Let Monkeys Eat Bananas Iodice Serena UniBS 2 Neutrofili Monociti e macrofagi - Risposta rapida - Emivita breve - Risposta implica riarrangiamento citoscheletro e attività enzimatiche - Cells differenziate - Risposta duratura (fasi tardive) - Emivita lunga - Risposta basata su trascrizione genica - Non terminalmente differenziati (divisione cellulare nel sito di flogosi) Neutrofili in circolo ❖ Popolazione di leucociti più abbondante ❖ Coinvolte in reazioni di infiammazione acuta ❖ Diametro = 12-15 micron, cells tondeggianti ❖ Nucleo diviso in 3-5 lobuli → “leucociti polimorfonucleati” (PMN) ❖ Citoplasma contiene 2 tipi di granuli: • Granuli specifici: con enzimi come lisozima, collagenasi, elastasi → non si colorano • Granuli azzurrofili: con enzimi e sostanze microbicide (defensine, catelicidine) Produzione neutrofili stimolata da:  G-CSF = fattore di stimolazione delle colonie di granulociti (è una citochina)  GM-CSF = fattore di stimolazione delle colonie di granulociti e macrofagi Rimangono in circolo per poche ore o giorni e arrivano al sito di infezione in poche ore. Rimangono attivi nel tessuto infetto 1 o 2 giorni Funzioni:  Fagocitare microrganismi opsonizzati e prodotti di cellule necrotiche → degradati poi nei fagolisosomi  Sintetizzare sostanze nei granuli e molecole microbicide → uccisione microbi extracell (danni tissutali) Fagociti mononucleati Sistema costituito da monociti e macrofagi Monociti si differenziano in risposta a:  M-CSF = fattore di stimolazione delle colonie di monociti o macrofagi Poi monociti migrano nei tessuti e diventano macrofagi Esistenza macrofagi residenti longevi in molti tessuti → derivano da precursori ne sacco vitellino e fegato fetale: - Cells di Kupfer (sinusoidi del fegato) - Macrofagi alveolari (vie aree) - Cells della microglia (cervello) Monociti in circolo ❖ Diametro = 10-15 micron ❖ Nucleo a fagiolo ❖ Presenza lisosomi citoplasmatici con piccole granulazioni, vacuoli fagocitici e filamenti citoscheletro Distinti in base a diversi marcatori e funzioni in: • Monociti classici o infiammatori → reclutati rapidamente nei siti di infezione, producono mediatori infiammatori, sono fagocitici Iodice Serena UniBS 5 Cellule dendritiche classiche epiteli e organi linfoidi Funzione: captazione antigeni microbici di natura proteica, poi presentati a linfociti T (APC) Cells di Langerhans sono DC classiche Divise in due sottopopolazioni:  Una popolazione ha elevata espressione di BDCA-1/CD1c → attivazione risposte linfociti T CD4+  Altra popolazione → presenta antigeni a linfociti T CD8+ e promuove loro differenziazione in CTL Ha elevata espressione di: BDCA-3 nei tessuti linfoidi Integrina CD103 e fattore di trascrizione IRF8 nei tessuti periferici Entrambe le sottopopolazioni esprimono CD11c Cellule dendritiche plasmacitoidi in circolo e (in piccole quantità) negli organi linfoidi Funzioni: attività antivirale e APC Assomigliano a plasmacellule Linfociti = cellule effettrici dell’immunità adattativa. Esprimono in modo clonale i recettori specifici per l’antigene Linfociti B ❖ Producono anticorpi → immunità umorale ❖ Maturano nel midollo osseo Tipi di linfociti B:  Linfociti B follicolari → esprimono anticorpi in mb (recettori per l’antigene) che quando vengono secreti diventano le molecole effettrici dell’immunità umorale adattativa tessuti linfoidi e sangue  Linfociti B della zona marginale mucose e cavità peritoneale e pleurica  Cellule B-1 milza Producono citochina antivirale interferone (INF) di tipo I Milioni di cloni di linfociti in grado di rispondere a milioni di antigeni in ogni individuo 5x1011 linfociti in un individuo: - 2% nel sangue - 4% nell’epidermide - 10% nel midollo osseo - 15% nei tessuti linfoidi associati a mucose (MALT) - 65% negli organi linfoidi Iodice Serena UniBS 6 Linfociti T ❖ Mediatori dell’immunità cellulare ❖ Maturano nel timo Tipi di linfociti T:  Linfociti T CD4+ helper → secernono citochine e agiscono su vari tipi cellulari  Linfociti T CD8+ citotossici (CTL) → riconoscono e uccidono cellule infettate da microrganismi intracellulari (es. virus) e cellule tumorali  Linfociti T CD4+ regolatori → inibiscono funzioni immunitarie  Cellule natural killer (NKT)  MAIT (cellule associate alle mucose con TCR invariante)  Linfociti T γδ → esprimono TCR con diversificazione limitata I linfociti T esprimono in membrana recettori per l’antigene: recettori T (TCR) Popolazioni di linfociti Linfociti naive (vergini) maturano in midollo osseo o timo → migrano negli organi linfoidi secondari → vengono attivati dall’antigene per cui sono specifici → espansione clonale (proliferazione) e differenziazione in cellule effettrici e cellule della memoria Diverse caratteristiche fenotipiche e funzionali tra le diverse popolazioni Linfociti naive = linfociti che non hanno mai incontrato l’antigene (immunologicamente inesperti) in circolo e negli organi linfoidi secondari/periferici ❖ Sono quiescenti (fase G0) → proliferazione e funzioni effettrici ❖ Linfociti piccoli → diametro = 8-10 micron ❖ Nucleo grande e citoplasma sottile ❖ Linfociti B e T naive non distinguibili tra loro ❖ Emivita: 1-3 mesi Sopravvivenza necessita di: ▪ Segnali generati dal recettore per l’antigene ▪ Riconoscimento antigeni self in modo debole (per i linfociti T) ▪ Presenza di citochine - IL-7 - Fattore di attivazione dei linfociti B (BAFF) → appartenente al TNF (tumor necrosis factor) Pool di linfociti naive mantenuto numericamente costante grazie alla PROLIFERAZIONE OMEOSTATICA Linfociti effettori ❖ Linfociti grandi o linfoblasti → diametro = 10-12 micron Helper e citotossici esprimono TCR αβ Equilibrio tra morte spontanea e produzione di nuove cellule Controllata dagli stessi segnali per la sopravvivenza Iodice Serena UniBS 7 Linfociti T effettori:  Linfociti T helper CD4+ → attivano linfociti B, macrofagi, DC Esprimono CD45RA (200kD)  CTL CD8+ → granuli secernono proteine capaci di eliminare cells riconosciute (con virus o tumorali) Entrambi esprimono sulla mb molecole come CD25 e un profilo di molecole coinvolte nella migrazione Linfociti T naive si basano su respirazione mitocondriale per generare energia, mentre linfociti T effettori su glicolisi anaerobia Linfociti B effettori:  Plasmacellule → secernono anticorpi (una plasmacellula secerne migliaia di anticorpi al sec) Nucleo in posizione eccentrica con cromatina a ruota di carro Citoplasma abbondante RER e apparato di Golgi sviluppati (per sintetizzare e assemblare anticorpi)  Plasmablasti → cellule circolanti in grado di produrre anticorpi (simili alle plasmacellule ma in circolo) Basse espressioni di CD19 e CD20 Alte espressioni di CD27 e CD38 In condizioni fisiologiche sono pochi e secernono anticorpi IgA Entro una settimana dall’esposizione secernono IgG Linfociti della memoria ❖ Generati durante le infezioni ❖ Sopravvivono in stato di quiescenza per anni ❖ Identificati in base all’espressione di proteine di membrana: Linfociti T e B memoria hanno livelli elevati del recettore per IL-7 (come i linfociti naive) Linfociti T memoria (e linfociti T attivati) esprimono CD45RO (180kD), mentre i naive esprimono CD45RA Linfociti B memoria esprimono IgG, IgE, IgA e CD27; mentre i B naive esprimono solo IgM e IgD Frequenza cellule della memoria aumenta con l’età → esposizione continua con microrganismi Catena del recettore per IL-2 (fattore di crescita per linfociti T) Selettine, integrine, recettori per chemochine Compensa la riduzione della generazione di linfociti T naive dal timo, che degenera con pubertà Iodice Serena UniBS 10 Integrine aumentano affinità per i ligandi in risposta a segnali intracellulari attivati da chemochine e legame antigene con linfocita T Chemochine determinano aggregazione integrine in punti della mb → aumento concentrazione integrine nelle aree di contatatto con cells endoteliali → ulteriore aumento (avidità) forza di legame di leucociti e cells endoteliali Chemochine Famiglia di citochine in grado di stimolare migrazione leucociti (da sangue a tessuti) Struttura generica: Polipeptidi di 8-10 kD contenenti 2 ponti disolfuro (tramite cisteine) 47 chemochine totali divise in 4 gruppi: a. Chemochine CC (o β) → primi due residui di cisteine adiacenti Nomenclatura da CCL1 a CCL28 b. Chemochine CXC (o α) → due cisteine separate da un aa. Divise in due sottogruppi: - Seq ELR precede la coppia di cys - Altro sottogruppo Nomenclatura da CXCL1 a CXCL17 c. Chemochine C → hanno una sola cisteina d. Chemochine CX3C → due cisteine separate da tre aa CXC-ELR promuovono migrazione neutrofili CXC-non ELR e CC inducono migrazione monociti, linfociti e altri leucociti Chemochine CC e CXC prodotte da leucociti, cells endoteliali, cells epiteliali, macrofagi residenti, fibroblasti… Alcune chemochine aumentano affinità integrine per i loro ligandi Recettori per chemochine Superfamiglia dei recettori GCPR → 7 domini transmembrana associati a proteine G (proteine che legano GTP) Recettori GCPR che promuovono migrazione contengono seq aa “DRYLAIV” → coinvolta nell’attivazione di proteina G → attivazione vie di trasduzione → portano a cambiamenti del citoscheletro → aumento motilità cellulare NB: Recettori per chemochine espressi in combinazioni diverse nelle popolazioni leucocitarie → profilo di migrazione unico per ogni tipo cellulare - Da CCR1 a CCR10: dieci recettori per CC Determinano associazione code citoplasmatiche delle integrine con proteine RAP e proteine che interagiscono con citoscheletro → cambio conformazione dei domini extracell → catene si stendono permettendo interazione con ligando Inside-out signaling Produzione chemochine innescata da riconoscimento microrganismi da parte di cells dell’immunità innata → prodotte in risposta a citochine infiammatorie (IL-1, IL7 e TNF) Chemochine CC prodotte anche da linfociti T stimolati da antigene → ruolo di connessione tra immunità specifica e processo infiammatorio Iodice Serena UniBS 11 - Da CXCR1 a CXCR6 e CXCR8: sette recettori per CXC - XCR1: recettore per chemochine C - CX3CR1: recettore per chemochine CX3C Recettori per chemochine epressi da tutti i tipi cellulari (linfociti T hanno più ampio spettro di espressione) NB: specificità risposta cellulare determinata da profilo di espressione dei recettori Esistenza recettori atipici per chemochine (ACKR) → non attivano proteine G, ma inibiscono chemochine Attività biologiche delle chemochine  Regolano extravasazione e reclutamento tissutale di leucociti circolanti nel PROCESSO INFIAMMATORIO Chemochine si legano a recettori espressi da diverse popolazioni leucocitarie svolgendo 2 funzioni: ▪ Aumento adesione leucociti all’endotelio: Si legano a molecole sulla sup endoteliale delle venule → leucociti già adesi all’endotelio riconoscono chemochine → attivazione recettori per chemochine aumenta affinità integrine → aumento adesione leucociti all’endotelio ▪ Migrazione leucociti attraverso endotelio vascolare verso siti di infezione/danno: chemochine prodotte da tessuti extravascolari → agiscono su leucociti adesi → stimolano movimento leucociti verso sito di produzione (chemiotassi) → migrazione leucociti verso cellule infettate (presenti nei tessuti dove vengono prodotte chemochine)  Sviluppo organi linfoidi indirizzando localizzazione leucociti in aree diverse degli organi linfoidi secondari → chemochine prodotte in modo COSTITUTIVO: “chemochine omeostatiche”  Migrazione DC da focolai di infezione a linfonodi drenanti: DC attivate da microbi nei tessuti periferici → devono migrare nei linfonodi per informare linfociti T dell’infezione (APC) Fasi di reclutamento dei leucociti nei tessuti 1. Rotolamento leucociti Produzione citochine (TNF e IL-1) da parte di macrofagi e DC che hanno incontrato il microbo → citochine stimolano espressione di E-selectina nell’endotelio delle venule Istamina e trombina stimolano espressione di P-selectina nell’endotelio delle venule Nei focolai di infiammazione: vasodilatazione e rallentamento flusso ematico → leucociti si spostano da flusso assiale verso rivestimento vascolare (processo di marginazione) → questo consente a recettori per E e P-selectine su leucociti di legarsi a cellule endoteliali tramite selectine → interazioni a bassa affinità tra leucociti e selectine dell’endotelio → legami a bassa affinità continuano a rompersi per il flusso e poi si riformano → leucociti procedono su superficie endoteliale rotolando → rallentamento leucociti 2. Aumento affinità integrine Rallentamento leucociti permette a chemochine espresse da cells endoteliali di legarsi a recettori sui leucociti → rafforzamento legame leucociti a superficie endotelio 3. Arresto leucocita su endotelio grazie a integrine Grazie a recettore CCR7 espresso da DC dopo incontro con microbo e grazie a produzione di chemochine leganti CCR7 da endotelio linfatico. Anche linfociti naive esprimono CCR7 per presentazione dell’antigene Iodice Serena UniBS 12 Attivazione integrine e aumento espressione ligandi per integrine (grazie a citochine infiammatorie e prodotti microbici) → VCAM-1 lega VLA-4; ICAM-1 lega LFA-1 e Mac-1 → salda adesione e appiattimento leucociti con riorganizzazione citoscheletrica 4. Transmigrazione leucociti attraverso endotelio (DIAPEDESI) Coinvolge integrine leucocitarie, ligandi integrinici e proteina CD31 (espressa sia da leucociti che da cells endoteliali) Interruzione transitoria di giunzioni tra cellule endoteliali (formate da VE-caderina): integrine legano VCAM- 1 e ICAM-1 → attivazione proteine chinasi → fosforilano code citoplasmatiche delle VE-caderina → alterazione della struttura adesiva Cinetica con cui avviene la migrazione diversa tra neutrofili, monociti e linfociti → specificità deriva da espressione di diverse combinazioni di molecole di adesione e recettori di chemochine LAD (sindrome da deficit di adesione leucocitaria) Sono forme di immunodeficienza primaria  LAD-1 = difetto ereditario recessivo del gene CD18, che codifica per catena β di integrine LFA-1 e Mac-1 → difetti di migrazione leucocitaria e di risp immunitarie  LAD-2 = soggetti privi del trasportatore di GDP-fucosio nell’apparato di Golgi → deficit nella sintesi di recettori (carboidrati) per E e P-selectine → difetto reclutamento neutrofili nei siti di infezione → infezioni fungine e batteriche ricorrenti  LAD-3 = mutazioni in elementi della trasduzione del segnale coinvolti nell’attivazione delle integrine Migrazione neutrofili e monociti Si trovano nel torrente ematico, ma funzione di fagocitosi (di microbi e cells danneggiate) avviene nei tessuti Reclutamento neutrofili e monociti segue le tappe degli altri leucociti, ma con diverse cinetiche: Reclutamento neutrofili Sono i primi ad essere reclutati nei focolai infiammatori (ma in alcuni tessuti non vengono reclutati) Esprimono recettori CXCR1 e CXCR2, che legano: • CXCL1 • CXCL8 (IL-8) con motivo ELR → produzione precoce da parte di macrofagi residenti nei siti di infiammazione Reclutamento monociti Reclutati nelle ore successive allo stimolo di flogosi e continua nei giorni successivi (reclutamento neutrofili cessa prima) Esprimono recettori CCR2 che legano chemochine CCL2 (MCP-1) prodotte in risposta a stimoli infettivi da cellule residenti Migrazione e ricircolazione linfociti T Linfocita T naive matura nel timo → esce da timo → entra nel circolo ematico → indirizzato negli organi linfoidi secondari (milza, linfonodi o MALT) → localizzato nelle aree T → se non avviene riconoscimento antigene torna nel circolo ematico → torna negli organi linfoidi secondari Ricircolazione linfocitaria Aumentata probabilità di incontrare l’antigene per cui il linfocita è specifico Iodice Serena UniBS 15 Linfociti T naive esprimono 2 recettori per MadCAM-1: ▪ L-selectina ▪ Integrina α4β7 Invece nella milza sono assenti le HEV! → linfociti T arrivano tramite apporto ematico a polpa bianca (nelle aree T) grazie a gradiente per chemochine che legano CCR7 (selectine e integrine) Migrazione linfociti T effettori verso siti di infiammazione Linfociti T effettori fuoriescono da organi linfoidi secondari → circolo linfatico → circolo sanguigno → tessuto danneggiato Durante differenziazione: • Perdita espressione di CCR7 • Perdita espressione L-selectina e recettori per E e P-selectine • Inizio espressione recettori per chemochine infiammatorie (presenti nei siti di infezione) • Ripristino espressione S1PR1 Questi cambiamenti promuovono fuoriuscita da linfonodo verso vasi linfatici e poi circolo sanguigno Da circolo sanguigno, linfociti T effettori raggiungono tessuti periferici con flogosi grazie a molecole di adesione e recettori per chemochine → homing avviene nelle venule post-capillari (attraverso selectine, integrine e chemochine) NB: migrazione linfociti T effettori nei siti di infezione non dipende dalla presenza di antigene, però solo cellule T che hanno incontrato l’antigene si fermano nel sito di infezione Linfociti T effettori esprimono integrine → integrine si legano a proteine della ECM → favorisce trattenimento linfociti che vengono attivati localmente da presenza antigene Alcuni linfociti T migrano preferenzialmente (diversi profili di migrazione): si localizzano selettivamente in determinati tessuti tramite espressione di diverse molecole di adesione e recettori per chemochine Migrazione linfociti T della memoria Due popolazioni di linfociti T della memoria  Cells della memoria centrale: localizzati negli organi linfoidi secondari → quando stimolati da antigene proliferano originando batteria di cellule per risposte secondarie Esprimono elevati liv di CCR7 e L-selectina Presenti nel sangue come CD45RO+  Cells della memoria effettrice: localizzati nei tessuti periferici → quando incontrano antigene producono rapidamente citochine effettrici Esprimono bassi livelli di CCR7 e L-selectina Esprimono recettori che riconoscono chemochine infiammatorie Alcuni diventano CELLULE RESIDENTI di cute o mucose: grazie a espressione di CD103 e inibizione di CD69 (che permette migrazione nei vasi linfatici) Iodice Serena UniBS 16 Homing dei linfociti B Migrazione linfociti B negli organi linfoidi secondari Stessi meccanismi usati da linfociti T naive per localizzarsi negli organi linfoidi secondari Linfociti B fuoriescono da midollo osseo → circolo ematico → zona marginale della milza → zone periferiche della zona bianca → maturazione e espressione recettore CXCR5 → si lega a chemochina CXCL13 promuovendo migrazione nella polpa bianca → completamento maturazione → rientro in circolo (grazie S1P) → raggiungimento linfonodi e MALT grazie a espressione di CXCR4, CCR7 e CXCR5 da parte dei linfociti B (che si legano a CXCL12, CCL19/CCL21 e CXCL13 sulle HEV) Distribuzione linfociti B negli organi linfoidi secondari Stroma organi linfoidi secondari → migrazione verso i follicoli → attivazione da parte dell’antigene CXCL13 si lega: o Nelle aree T alla superficie della rete di FRC o Nel follicoli sulle FDC Homing linfociti B nelle placche di Peyer necessita anche di integrina α4β7 (oltre che CXCR5) che lega MadCAM-1 Linfociti B devono interagire con linfociti T-helper nella risposta agli antigeni → quindi localizzazione precisa Fuoriuscita linfociti B dagli organi linfoidi secondari Controllata da S1P (come linfociti T) Nella milza: linfociti B follicolari migrano nella zona marginale → trasportati nella polpa rossa dai fluidi → entrano in circolo grazie a S1PR1 Alcuni linfociti B attivati si differenziano in plasmablasti = cells con spiccate capacità migratorie che entrano in circolo e migrano al midollo osseo o tessuti mucosi per differenziarsi in plasmacellule Migrazione selettiva: diverse popolazioni di linfociti B che esprimono classi diverse di anticorpi (isotipi) sono indirizzate in tessuti diversi, dove si differenziano in plasmacellule → diversa migrazione dipende da diverse molecole di adesione e recettori di chemochine, ad esempio: - Plasmacellule nel midollo secernenti IgG esprimono: VLA-4 che si lega a VCAM-1 CXCR4 che si lega a CXCL12 - Plasmacellule nelle mucose sercernenti IgA esprimono: α4β7 che riconosce MadCAM-1 CCR9 che riconosce CCL25 - Plasmacellule che secernono IgG nei siti di infiammazione cronica esprimono: VLA-4 che si lega a VCAM-1 CXCR3 che si lega a CXCL9 e CXCL10 Guidata da chemochina CXCL13 che lega CXCR5 (su linfocita B) Prodotta nei follicoli da cellule dendritiche follicolari (FDC) = cells stromali di origine non ematopoietica Guida movimento direzionale di linfociti B Iodice Serena UniBS 17 Immunità innata I.I. = insieme di meccanismi di difesa dell’ospite prontamente disponibili → barriera difensiva precoce che precede lo sviluppo delle risposte immunitarie adattative Genericità dell’immunità innata Principali componenti: epiteli, cellule sentinella nei tessuti (macrofagi, DC, mastociti), leucociti circolanti (neutrofili, monociti/macrofagi, cellule NK) ❖ Dotato di sistemi di difesa chimico-fisici → barriere epiteliali (cute e mucose) bloccano ingresso microrganismi e possiedono meccanismi intrinseci di difesa Microbi possono colonizzare tessuti solo se riescono a superare la barriera chimico-fisica ❖ Risposta iniziale contro microrganismi → previene, elimina o tiene controllata infezione fino all’arrivo delle risposte adattative (più potenti e specializzate) Eliminazione immunità innata determina suscettibilità a infezioni anche se immunità adattativa funziona ❖ Elimina cellule danneggiate e avvia processo di riparo dei tessuti → attivazione meccanismi innati a seguito di riconoscimento di molecole prodotte da cellule alterate ❖ Stimola e influenza risposta adattativa → invia segnali di pericolo e risponde in modo diverso a diversi patogeni, influenzando la risposta adattativa 2 tipi di risposta principali dell’immunità innata:  Infiammazione: leucociti circolanti e proteine plasmatiche si accumulano nel sito di infezione e vengono attivati per uccidere i patogeni e cellule danneggiate o morte  Difesa antivirale: meccanismi di difesa inibiscono replicazione virus e uccidono cellule infettate (senza reazione infiammatoria) Differenze principali tra immunità innata e adattativa Immunità innata: • Risposta immediata e attivata velocemente, che non richiede pregressa esposizione al microrganismo • Memoria scarsa o assente (eccezione NK a infezioni virali) • Attivata da riconoscimento di un numero limitato di molecole microbiche • Recettori diversi da immunità adattativa • Presente in tutti gli organismi viventi (750 milioni di anni fa) Immunità adattativa: • Si sviluppano lentamente nell’arco di diversi giorni dall’infezione • Memoria: esposizione ripetuta allo stesso antigene ne migliora rapidità, entità e efficacia • Riconosce milioni di diversi antigeni self e non self • Recettori diversi da immunità innata • Presente solo nei vertebrati (350-500 milioni di anni fa) Riconoscimento dei microrganismi I.I. riconosce strutture molecolari prodotte dai patogeni → PAMP = profili molecolari associati a patogeni Esempi di PAMP: o DS-RNA (doppia elica) dei virus o DNA ricco di sequenze CpG ipometilate dei batteri o Proteine microbiche che iniziano con N-formil-metionina dei batteri Condivise da diverse CLASSI di microrganismi (virus, batteri gram+, batteri gram-, funghi) Iodice Serena UniBS 20 TLR sulla membrana citoplasmatica: • TLR1 → lipopeptidi batterici (dimerizzando con TLR2) • TLR2 → peptidoglicani batterici, acido lipoteico • TLR4 → LPS • TLR5 → flagellina batterica • TLR6 → lipopeptidi batterici (dimerizzando con TLR2) TLR sulle membrane intracellulari: • TLR3 → RNA a doppia elica • TLR7 → RNA a singola elica • TLR8 → RNA a singola elica • TLR9 → DNA ricco di motivi CpG non metilati NB: RNA dell’ospite non si trova negli endosomi, mentre quello microbico sì (a seguito di processi di fagocitosi) Avvio della cascata di traduzione del segnale Legame PAMP con TLR → dimerizzazione TLR → avvicinamento dei due domini TIR → reclutamento proteine adattatrici contenenti il dominio TIR → reclutamento e attivazione di proteine chinasi (PK) → PK attivano dei fattori trascrizionali → induzione di geni con ruolo antivirale e infiammatorio Fattori di trascrizione attivati da TLR: ▪ Fattore nucleare kB (NF-kB) ▪ Proteina di attivazione 1 (AP-1) ▪ Fattore di risposta dell’interferone 3 (IRF3) ▪ Fattore di risposta dell’interferone 7 (IRF7) Differenti combinazioni di adattatori e trasduttori del segnale → specificità degli effetti antivirali e infiammatori Adattatori utilizzati da TLR: ▪ MyD88 (utilizzato da tutti i TLR tranne TLR3) → attivazione NF-kB → risposta infiamamtoria ▪ TRIF (utilizzato da TLR3, 4, 7, 9) → attivazione IRF3 → produzione INF di tipo 1 b. Recettori citosolici per PAMP e DAMP Sono recettori per profili molecolari che riconoscono PAMP e DAMP a livello del citoplasma → dove avvengono fasi cruciali del ciclo vitale di alcuni organismi o dove si trovano microbi che sono evasi dall’endosoma 3 categorie principali:  Recettori di tipo NOD (NLR, NOD-like receptors)  Sensori citosolici di DNA  Recettori di tipo RIG (RLR, RIG-like receptors) Recettori citosolici attivano vie di trasduzione che portano a formazione di INF di tipo I (attività antivirale) o alla promozione dell’infiammazione (come i TLR) NOD-like receptors Famiglia di più di 20 proteine citosoliche Struttura: o Estremità C-terminale presenta dominio ricco di residui di leucina o Dominio centrale NOD (o NACHT) → responsabile dell’oligomerizzazione Il loro corretto funzionamento dipende da proteina UNC-93B nel RE Responsabili produzione molecole per risposta infiammatoria (citochine infiammatorie, chemochine, molecole di adesione endoteliali) Responsabili produzione molecole per risposta antivirale (INF-α, INF-β) Iodice Serena UniBS 21 o Estremità N-terminale presenta il dominio effettore → recluta altre proteine per formare complessi di trasduzione Alla famiglia NLRC appartengono:  NOD1 → riconosce DAP (acido diamonopimelico) = tripeptide glicosilato di batteri Gram-  NOD2 → riconosce MDP (muramil dipeptide) = derivato del DAP di batteri Gram+ e Gram- Espresso dalle cells di Paneth del piccolo intestino dove stimola produzione di defensine Riconoscono peptidoglicani della parete batterica → modificazione conformazionale → domini effettori CARD reclutano copie della chinasi RIP2 con formazione complesso attivatorio “segnalosoma di NOD” → chinasi RIP2 attivano NF-kB → produzione citochine e altre molecole coinvolte nel processo infiammatorio (similmente a TLR) NOD1 e 2 permettono risp innata a batteri patogeni del tratto gastrointestinale (E. Pylori, L. monocytogenes) Patologie associate a NOD2: Malattia di Crohn = polimorfismi del gene NOD2 generano varianti incapaci di percepire presenza di prodotti microbici → malattia infiammatoria dell’intestino crasso con risposte innate difettose contro organismi commensali e patogeni Sindrome di Blau = mutazioni attivatorie di NOD2 generano varianti con maggiore funzionalità e capacità di attivare NF-kB → insorgenza malattia infiammatoria sistemica Sensori citosolici del DNA Riconoscono DS-DNA microbico nel citosol → attivazione vie di trasduzione del segnale → risposta antimicrobica, produzione INF di tipo 1 e autofagia Distinzione ds-DNA ospite da quello microbico grazie ai sensori di DNA nel citosol (DNA microbico nel citosol) Via di STING (stimulator of INF genes) Promuove risposta INF di tipo I in seguito a riconoscimento di ds-DNA microbico: ds-DNA attiva enzimi cGAS (cyclic GMP-AMP synthase) → formazione cGAMP (sensore citosolico) → STING nel RE si lega a cGAMP → attiva kinasi TBK1 → fosforila e attiva fattore di trascrizione IRF3 → induce espressione geni di INF di tipo 1 STING utilizzato anche da altri sensori citosolici (oltre cGAMP): DAI e IFI16 Inoltre STING promuove autofagia = degradazione organelli cellulari da parte della cellula stessa, sequestrandoli in vescicole che si fondono a lisosomi → per relegare microbi nei lisosomi ed eliminarli con enzimi proteolitici Vie diverse da STING utilizzate da altri sensori citosolici di DNA  RNA-pol 3 trascrive sd-DNA microbico ricco di AT in RNA → attivazione via di RIG-1 → induzione INF di tipo 1  AIM2 riconosce ds-DNA nel citosol → formazione INFLAMMASOMA → attiva IL-1β (citochina infiammatoria) 3 famiglie formate da un diverso dominio effettore: • NLRB utilizzano dominio effettore BIR • NLRC con dominio effettore CARD • NLRP con dominio effettore delle Pirina (coinvolte nella febbre) Iodice Serena UniBS 22 RIG-like receptors Riconoscono RNA virale → attivazione trasduzione del segnale → produzione INF di tipo I Inoltre bloccano direttamente replicazione virale inibendo interazioni RNA-proteina RLR principali:  RIG-1 → riconosce RNA che presenta estremità 5’ trifosfato  MDA5 (melanoma differentiation associated gene 5) → riconosce porzioni lunghe di ds-RNA Sono espressi da numerose cellule (come leucociti e cells tissutali) che possono dare una risposta innata Struttura RLR: o Due domini N-terminali → reclutamento caspasi o Dominio RNA-elicasi o Dominio C-terminale Legame con RNA → RLR reclutati sulla mb esterna dei mitocondri ad opera di proteina MAVS → formazione filamenti → inizio trasduzione segnale con fosforilazione e attivazione IRF3, IRF7 e NF-kB → produzione interferoni di tipo I Inflammasomi = complessi multiproteici che si formano nel citosol in risposta a DAMP e PAMP Funzione: generare forme attive di citochine infiammatorie IL-1β e IL-18, che svolgono funz proinfiammatorie Struttura inflammasomi: Sono oligomeri formati da: o Sensore o Caspasi-1 o Adattatore → unisce le altre due strutture Diversi tipi di sensori, esempio: - Sensori della famiglia NLR comprendono NLRB, NLRC4 e sei NLRP - Sensori della famiglia AIM2 comprendono AIM2 e IFI16 Queste proteine (i sensori?) contengono: ▪ Dominio di riconoscimento del DNA ▪ Dominio della pirina = sensore proteico che partecipa alla formazione di un inflammasoma Formazione inflammasoma: Sensori citosolici riconoscono prodotti microbici → sensori si legano ad altre proteine → formazione inflammasoma. Esempio: Più proteine NLRP3 interagiscono tra loro → formano oligomero → ogni proteina NLP3 dell’oligomero si lega a proteina adattatrice ASC → legame induce modificazione conformazionale di NLP3 → provoca modifica conformazionale di altre proteine ASC nel citosol (meccanismo simil-prionico) → formazione filamenti di proteine ASC → filamenti si raggruppano e reclutano precursore inattivo della caspasi-1 (pro-caspasi-1) → attivazione caspasi-1 → tagliano precursore citochine → attivazione e secrezione IL-1β e IL-18 → infiammazione RNA a doppia elica e eteroduplex RNA-DNA Riconoscimento RNA Iodice Serena UniBS 25 Recettori scavenger Insieme di proteine di mb con diverse caratteristiche strutturali e funzionali → accomunate perché legano lipoproteine ossidate • SR-A: espressa da macrofagi (fagocitosi microrganismi) • CD36: espressa da macrofagi ed è corecettore per eterodimero TLR-2/6 (risposta a acidi lipoteicoici e lipopeptidi diacetilati) Fattori di virulenza microbici agiscono bloccando riconoscimento e fagocitosi mediata dai recettori scavenger (ne fa capire la loro importanza) Recettori per peptidi formilati FPR1 espresso da leucociti Funzioni:  Riconosce peptidi batterici contenenti residui di N-formilmetionina → tutte le proteine batteriche iniziano con N-formilmetionina (e poche proteine di mammiferi)  Stimola movimento direzionale delle cellule (chemiotassi) → FPR1 lega fattori chemiotattici potenti Segnali chemiotattici comprendono diversi tipi di molecole che: si diffondono dai siti di infezione → legano recettori specifici sulle cells bersaglio → dirigono movimento cells verso sito di produzione FPR1 appartengono a superfamiglia di recettori a 7 domini transmembrana accoppiati a proteine G che legano GTP (GPCR) → iniziano trasduzione segnale tramite proteine G eterotrimeriche a esse associate → stimolano molte risposte cellulari (es. modificazioni citoscheletro che determinano movimento) Cellule dell’immunità innata Funzioni generiche:  Barriere  Sentinelle: esprimono PRR con cui riconoscono PAMP e DAMP → produzione citochine infiammatorie e proteine antivirali  Stimolazione risposte adattative Barriere epiteliali Principali barriere sono: o Cute o Mucose: respiratoria, gastrointestinale e genitourinaria Funzioni:  Barriera fisica tra patogeni nell’ambiente e tessuti dell’ospite: ▪ Strette connessioni tra cells epiteliali ▪ Strato esterno di cheratina nella cute ▪ Muco = secrezione viscosa con mucine (glicoproteine) prodotto da cells epiteliali delle mucose ▪ Ciglia dell’albero bronchiale e peristalsi intestinale → facilitano eliminazione microbi  Producono sostanze antimicrobiche (ulteriore contrasto all’ingresso di patogeni): ▪ Defensine ▪ Catelicidine Iodice Serena UniBS 26 Defensine Struttura generica: Sono piccoli peptidi con - Regioni cationiche - Regioni idrofobiche - Tre legami solfuro intracatena 2 famiglie: α e β → diversa posizione dei legami solfuro Prodotte da: • Cells epiteliali delle mucose e cute • Neutrofili • Cells NK • Linfociti T citotossici Defensine α (cripticidine) prodotte da cells di Paneth In alcuni tessuti sono espresse costitutivamente, ma aumentano in risposta a citochine infiammatorie e prodotti microbici Azioni:  Tossicità diretta contro i microbi (virus, funghi, batteri)  Attivazione cellule coinvolte nelle risposte antimicrobiche Catelicidine Prodotte da: • Neutrofili • Cells epiteliali di cute e mucose (gastrointestinale e respiratoria) Stimoli di citochine infiammatorie e prodotti microbici → Produzione precursore con due domini → taglio proteolitico in due peptidi funzionanti Azioni:  Tossicità diretta  Attivazione di risposte da parte di leucociti NB: frammento C-terminale (LL-37) lega e neutralizza LPS (riconosciuto da TLR4) Linfociti T intraepiteliali Barriere epiteliali (epidermide e epiteli mucose) contengono linfociti T intraepiteliali in proporzioni diverse Limitata diversificazione del recettore per l’antigene ➔ riconoscimento di limitate strutture microbiche Attivati da citochine prodotte in risposta allo stress (non attivati in seguito a riconoscimento antigene) Contribuiscono a difesa ospite: secrezione citochine, attivazione fagociti, uccisione cells infettate Limitano quantità di microrganismi presenti nel lume delle cripte dell’intestino tenue Distinti in base a tipo di recettore espresso: - Alcuni esprimono forma classica TCR αβ - Altri esprimono TCR γδ → riconosce antigeni peptidici e non Iodice Serena UniBS 27 Fagociti Prima linea di difesa contro microbi che superano barriere epiteliali Individui con < numero neutrofili (per chemio, tumori o difetti genetici) → elevata incidenza di infezioni letali • Macrofagi risiedono nella maggior parte dei tessuti → funzione sentinella • Neutrofili e monociti reclutati nella sede di infezione (in risposta a microrganismi o segnali da sentinelle) Cellule dendritiche Localizzate nei tessuti, riconoscono rapidamente microrganismi grazie a vasta gamma di PRR espressi Riconoscimento microbi → secrezione citochine pro-infiammatorie → reclutamento leucociti dal sangue CD plasmacitoidi = fonte principale di INF di tipo I in risposta a infezioni virali Funzioni:  Riconoscimento microbi e secrezione citochine  Attivazione linfociti T per risposta adattativa  Determinano differenziazione linfociti T naive verso un tipo effettore Es. linfociti TH1 producono INF-γ Cellule linfoidi innate (ILC) = cells di derivazione midollare con morfologia linfoide capaci di produrre citochine Localizzate nelle barriere epiteliali Funzione: prima risposta ai microrganismi nei tessuti, ruolo poi assunto da linfociti T effettori (più specifici) NB: NON esprimono TCR (per questo chiamate linfoidi e non linfociti) Da progenitore linfoide comune si ha biforcazione:  3 popolazioni ILC con funzione helper → producono citochine (similmente a linfociti T CD4 helper) a. ILC1 b. ILC2 c. ILC3  Linfociti Natural Killer → funzione citotossica e producono INF-γ (come linfociti T CD8 citotossici) ILC che producono citochine Diverse ILC producono diverse citochine e esprimono diversi fattori di trascrizione a. ILC1 producono INF-γ e esprimono fattore di trascrizione T-bet (come linfociti TH1) Difesa contro i virus b. ILC2 producono IL-5, IL-9 e IL-13 e esprimono fdt GATA-3 (come linfociti TH2) Risposta a elminti e patogenesi malattie allergiche Esprimono abbondantemente TLR endosomiali specifici per acidi nucleici (TLR 3, 7, 8, 9) e sensori citosolici di DNA e RNA → riconoscimento acidi nucleici virali nelle cells Alcune ILC originano da stesso progenitore linfoide comune da cui originano linfociti T e B Determinano ruolo che svolgeranno ILC Necessari per differenziazione e funzione di ILC Iodice Serena UniBS 30 Linfociti B a limitata diversificazione: ▪ Linfociti splenici della zona marginale ▪ Linfociti B-1 Mastociti Cells sentinella nella cute, mucose e tessuto connettivo. Presentano granuli citoplasmatici contenenti: • Amine vasoattive: es. Istamina → vasodilatazione e aumento permeabilità capillare • Mediatori lipidici: es. Prostaglandine • Citochine: es. TNF • Enzimi proteolitici → uccidono batteri e inattivano tossine microbiche localizzati accanto ai vasi sanguigni → degranulazione determina rapidi cambiamento vascolari che promuovono risposta infiammatoria acuta Esprimono TLR (i cui ligandi possono causare degranulazione) Molecole effettrici solubili dell’immunità innata Sangue e fluidi extracellulari → componente UMORALE dell’immunità innata Funzione generica: difesa precoce contro patogeni con localizzazione extracellulare o in circolo Meccanismi di funzionamento:  Funzionano da opsonine legandosi ai microbi favorendo fagocitosi (neutrofili e macrofagi)  Legano microbi e promuovono risposte infiammatorie che richiamano fagociti nel tessuto sede di infezione Possono provocare direttamente la morte dei microrganismi Principali componenti dell’immunità innata umorale: a. Sistema del complemento b. Anticorpi naturali c. Collectine d. Pentrassine e. Ficoline Sistema del complemento Comprende proteine plasmatiche che collaborano tra loro Triplice scopo:  Opsonizzazione microrganismi  Promuovere reclutamento fagociti  Uccidere direttamente microrganismi Attivazione sistema del complemento: cascata proteolitica porta a attivazione zimogeno (precursore enzimatico inattivo) → diventa proteasi attiva → taglia proteina successiva della cascata inducendone attività proteolitica → amplificazione prodotti proteolitici → funzioni effettrici del sistema del complemento Attivazione in diverse fasi: 1. Fase iniziale → riconoscimento molecole sulla sup microbica (assenti nell’ospite) 2. Fasi precoci 3. Fasi tardive Iodice Serena UniBS 31 Prima fase può avvenire in 3 vie distinte  Via classica: proteina plasmatica C1q identifica anticorpi sulla sup microbica → si lega alla porzione Fc degli anticorpi → attivazione C1r e C1s (serinproteasi associate a C1q) → inizio cascata proteolitica. Principale meccanismo effettore del ramo umorale adattativo (anche pentrassine possono legarsi a C1q e avviare via classica)  Via alternativa: proteina del complemento C3 riconosce direttamente strutture microbiche di sup (come LPS batterico). C3 si attiva costitutivamente a bassi livelli ma non si lega alle cellule SELF per presenza di proteine inibitorie  Via lectinica: MBL (lectina legante mannosio. È una collectina) riconosce residui terminali di mannosio su glicoproteine e glicolipidi microbici → MASP1 e MASP2 (zimogeni con funzione simile a C1r e C1s) si associano a MBL → inizio cascata proteolitica uguale alla via classica Riconoscimento microbi porta a assemblaggio proteine del complemento in complessi ad attività proteasica: Complesso C3 convertasi taglia C3 → formazione frammenti C3a e C3b: - C3a agisce da fattore chemiotattico per neutrofili inducendo infiammazione e degranulazione mastociti e aumentando permeabilità vascolare (così proteine plasmatiche escono nel tessuto) - C3b funge da opsonina legandosi covalentemente alla sup microbica e promuovendo fagocitosi C3b si lega a altre proteine del complemento → formazione complesso C5 convertasi → scissione proteina C5 in C5a e C5b: - C5a ha stessa funzione di C3a ma più potente - C5b innesca formazione complesso di C6, C7, C8 e C9 “complesso di attacco alla membrana (MAC)” Proteine MAC formano poro su mb plasmatica → lisi cells su cui è stato attivato il complemento Sistema del complemento verrà trattato più avanti Pentrassine Proteine pentameriche omologhe che attivano il complemento legandosi a C1q → inizio via classica • Pentrassine corte: o PCR (proteina C reattiva) o SAP (sieroamiloide P) • Pentrassina lunga o PTX3 → prodotta da DC, cells endoteliali e macrofagi in risposta a citochine proinfiammatorie Riconosce funghi, virus, batteri e cells apoptotiche Sono proteine di fase acuta: concentrazioni molto basse negli individui sani, ma che aumentano di molto durante le infezioni Es. PCR (e altre proteine di fase acuta) aumenta fino a 1000 volte per aumento sintesi epatica (causata da citochine IL-1 e IL-6 e DC nel corso della risposta innata Collectine Proteine trimeriche o esameriche che fungono da molecole effettrici solubili e riconoscono PAMP Ogni subunità contiene: ▪ Dominio collegeno-simile ▪ Dominio lectinico → lega carboidrati in modo calcio-dipendente ▪ Regione colletto collega i due domini Iodice Serena UniBS 32 3 membri delle collectine:  MBL: funziona da opsonina legando carbs con mannosio e fucosio terminali (via lectinica del complemento)  SP-A  SP-D Funzioni proteine surfactanti:  Mantenimento capacità polmonare di espansione grazie a riduzione tensione superficiale dei fluidi alveolari  Risposta immunitaria innata locale → fungono da opsonine per i macrofagi alveolari  Inibizione diretta della crescita batterica tramite attivazione macrofagi Ficoline Proteine plasmatiche simili a collectine: ▪ Dominio collageno-simile ▪ Dominio fibrogeno-simile (lectinico) → riconoscimento carbs (N-acetilglucosamina, acido lipoeicoico) Legano e opsonizzano tipi batterici diversi e attivano complemento (in modo simile a MBL) Risposta infiammatoria È uno dei meccanismi dell’imm. innata per combattere infezioni e danni tissutali, tramite accumulo di leucociti e proteine plasmatiche nel tessuto infettato o danneggiato Afflusso di cells e proteine nel sito infiammatorio dipende da cambiamenti dei vasi sanguigni: 1. Dilatazione arteriolare → aumento flusso sanguigno 2. Aumento adesività leucociti circolanti all’endotelio di venule 3. Aumento permeabilità capillari e venule Infiammazione acuta si sviluppa in minuti/ore e persiste per giorni Se danno tissutale permane: infiammazione cronica → rimodellamento tissutale (angiogenesi e fibrosi) Prima risposta dell’immunità innata all’infezione: secrezione di citochine → innescano risp infiammatoria acuta Proprietà generiche delle citochine: ❖ Prodotte principalmente da macrofagi cellulari e DC (ma anche da mastociti, cells endoteliali e epiteliali) ❖ Azione paracrina (su cells vicine) → ma se infezione grave produzione aumenta fino a azione ormonale ❖ Citochina può stimolare produzione di altre citochine innescando cascate che amplificazione reazione o inducendo nuove reazioni ❖ Molte citochine prodotte anche nel corso di risposte adattative da linfociti T Proteine surfactanti negli alveoli polmonari con proprietà lipofiliche Neutrofili sono i primi ad arrivare, mentre monociti prevalgono in fasi tardive Proteine del complemento, anticorpi e proteine di fase acuta Provocati da citochine (prodotte in risposta a stimolazione di DAMP e PAMP) Ruolo chiave dell’immunità innata nel suo sviluppo (coinvolta anche immunità adattativa per citochine prodotte da linfociti T) Iodice Serena UniBS 35  IL-25 (TSLP) e IL-33 (allarmina) Funzioni:  stimolano ILC2, linfociti Th2 e mastociti a produrre IL-4, IL-5 e IL-13 (difesa contro elminti)  contribuiscono a patogenesi di malattie allergiche IL-33 espressa costitutivamente da cells epiteliali da cui viene rilasciata rapidamente se sono danneggiate, stimolando immunità Reclutamento leucociti nei siti di infezione Già trattato precedentemente Richiamo di neutrofili e monociti nei tessuti infetti/danneggiati grazie a TNF, IL-1, IL-6 e chemochine → che hanno effetti su endotelio vascolare, leucociti e midollo osseo • TNF e IL-1 promuovono espressione di E-selectina e ligandi di integrine leucocitarie su endotelio delle venule postcapillari • TNF e IL-1 stimolano produzione di chemochine CXCL8 e CCL2 → stimolano movimento direzionale leucociti e aumentano affinità integrine → aum adesione neutrofili e monociti a cells endoteliali → trasmigrazione attraverso parete del vaso → accumulo leucociti nei tessuti che formano infiltrato infiamamtorio • TNF, IL-1 e IL-6 entrano in circolo → vanno nel midollo osseo → agiscono insieme a CSF (fattori di stimolazione delle colonie) incrementando produzione di neutrofili → aumento disponibilità cells infiammatorie e ripristino del pool di leucociti Ingestione e uccisione microbi da parte di fagociti attivati FAGOCITOSI = processo attivo che permette di inglobare grosse particelle (diametro > o,5 micron) all’interno di vescicole → meccanismi di uccisione separati dal resto della cellula per non danneggiarla Inizio fagocitosi: quando recettore si lega a microrganismo Fagocitosi anticorpo-dipendente (con opsonizzazione) = collegamento tra immunità innata e adattativa Microrganismo si lega a recettore → formazione protusione dela mb in cui si trova il recettore → protusione si espande → formazione fagosoma (vescicola intracell con molecola microbica) → si distacca da membrana → si fonde al lisosoma → formazione fagolisosoma NB: Contemporaneamente a uccisione microbo fagocitato vengono generati peptidi microbici da presentare a linfociti T per risposta adattativa Nel fagolisosoma sono presenti molecole microbicide:  ROS (specie reattive dell’ossigeno) = agenti ossidanti ad alta reattività con radicali liberi che uccidono microrganismi Prodotti in neutrofili attivati e macrofagi da ossidasi fagocitica (attivata da INF-γ e attivatori di TLR) che riduce ossigeno molecolare in ROS utilizzando NADPH (e produce superossido e perossido di idrogeno) → burst respiratorio = processo con cui vengono prodotti i ROS, che richiede consumo di ossigeno Malattia granulomatosa cronica = sindrome da deficit ereditario di una componente della ossidasi fagocitica → compromessa capacità di uccidere batteri  Monossido di azoto = specie reattiva dell’azoto Prodotto da enzima iNOS (sintasi inducibile del NO): enzima citoplasmatico attivato in risposta a prodotti microbici che attivano TLR in combinazione con INF- γ Ad esempio un PRR (però legano solo microbi con particolari microrganismi molecolari), oppure recettori per opsonine Iodice Serena UniBS 36 Può combinarsi con superossido o perossido di idrogeno a formare perossinitrito (radicale altamente reattivo) → azione cooperativa e ridondante di NO e ROS  Enzimi proteolitici - Elastasi (serinproteasi ad ampio spettro) - Catepsina G NETosi Neutrofili uccidono microbi anche con la formazione di NET (trappole extracellulari neutrofile) a seguito di estrusione di cromatina (DNA + istoni) e del contenuto dei granuli L’estrusione di DNA porta a morte dei neutrofili (NETosi) → contribuisce a patogenesi di malattie autoimmuni e infiammatorie Effetti sistemici e patologici dell’infiammazione Citochine proinfiammatorie hanno effetti sistemici che contribuiscono a difesa ospite → responsabili di manifestazioni cliniche di infezioni e infiammazioni  TNF e IL-1 causano febbre (aum temp corporea) agendo sull’ipotalamo e aumentando la sintesi di prostaglandine → chiamati pirogeni endogeni Ruolo febbre (ipotesi):  Aumento metabolismo cells del sistema immunitario  Diminuzione metabolismo microbico  Modificazioni del comportamento dell’ospite che riducono il rischio di peggiorare il danno Inibitori della sintesi di prostaglandine (acido acetilsalicilico) riducono febbre bloccando azione citochine  IL-1 e IL-6 stimolano epatociti a produrre proteine di fase acuta (vanno in circolo): o PCR o SAP o Fibrinogeno → contribuisce a emostasi e riparo tissutale Nelle infezioni gravi, TNF prodotto in grandi quantità, entra in circolo e determina anomalie sistemiche: • Inibisce contrattilità miocardio e tono muscolatura dei vasi → diminuzione pressione arteriosa e shock • Compromette normali proprietà anticoagulanti → causa trombosi (accentuata da attivazione neutrofili che causano ostruzione capillari) • Causa cachessia (= pronunciato deperimento fisico dovuto a mancanza di appetito) e inibizione sintesi di lipoprotein-lipasi Sepsi e shock settico Condizioni patologiche gravi causate da elevati livelli di TNF Sepsi = complicazione sistemica delle infezioni gravi, caratterizzata da febbre, aumento FC e FR, anomalie metaboliche e disturbi mentali (può esserci batteriemia, cioè batteri nel sangue) Causata da LPS di batteri Gram+ o da acido lipotecoico di batteri Gram- → si legano a TLR di molte cells nei tessuti → determinano produzione massiva di TNF e altre citochine (IL-12, INF-γ, IL-1) Shock settico = forma più grave di sepsi caratterizzata da collasso cardio-circolatorio e coagulazione intravascolare disseminata Dosaggio della concentrazione sierica di TNF può predire esito di forme gravi di sepsi Indispensabili nell’uccisione di batteri Enzima PAD4 permette citrullinazione istoni Ruolo protettivo Iodice Serena UniBS 37 SIRS = sindrome da risposta infiammatoria sistemica, simile allo shock settico ma causata da malattie NON infettive (ustioni, traumi, pancreatiti ecc) [Nei topi, antagonisti di TNF prevengono morte dell’animale per sepsi, nell’uomo non funzionano] Danno tissutale Infiammazione acuta può causare danno tissutale perché meccanismi effettori (ROS e enzimi proteolitici) dei fagociti sono tossici anche per le cells dell’ospite, soprattutto se patogeno resiste Parte delle patologie associate alle infezioni dipendono più dalle risp infiammatorie che dal diretto effetto tossico dei microrganismi Risposta antivirale Vari PRR (TLR, NLR, RLR e CDS) stimolano espressioni di INF di tipo I che:  Inibiscono replicazione virale  Agiscono su altre cells per prevenire diffusione dell’infezione INF di tipo 1 = famiglia di citochine codificati da cluster di geni su cromosoma 9 - INF-α (13 diverse proteine) prodotti da DC plasmacitoidi e fagociti mononucleati - INF-β prodotto da diversi tipi cellulari Via di trasduzione JAK-STAT: RIG, sensori di DNA e TLR a localizzazione endosomiale riconoscono acidi nucleici virali → attivazione fattori di trascrizione della famiglia IRF → espressione geni che codificano per INF di tipo 1 → INF legano recettore per INF di tipo I (recettore eterodimerico formato da catene IFNAR1 e IFNAR2) → attivazione fattori di trascrizione STAT1, STAT2 e IRF9 → trascrizione geni coinvolti in diversi meccanismi antivirali: a. Conferimento dello stato antivirale: INF di tipo I induce produzione di - PKR (serina/treonina chinasi) blocca trascrizione e traduzione virale - 2’,5’ olidoadenilato sintetasi e Rnasi L favoriscono degradazione RNA virale Inoltre INF ha due meccanismi: ▪ Paracrino: INF prodotto da cellula infettata agisce su cells limitrofe non ancora infettate rendendole resistenti ▪ Autocrino: INF inibisce replicazione virale nella cellula che l’ha prodotto b. Segregazione di linfociti nei linfonodi per aumentare probabilità di incontro con antigene: avviene grazie a proteina CD69 che forma complesso con recettore S1PR1 riducendone l’espressione → questo trattiene linfociti negli organi linfoidi c. Aumento citotossicità NK e linfociti CD8 citotossici, e aumento differenziamento linfociti T naive in T helper1 d. Aumento espressione molecole MHC di classe I per aumentare probabilità che cells infettate siano riconosciute da linfociti CD8 citotossici INF di tipo I aumentano indirettamente num di complessi peptide virale-MHC classe 1 riconoscibili da linfociti T CD8 INF-α usato nel trattamento di epatite virale e alcuni tumori INF-β usato nel trattamento di sclerosi multipla Protezione contro i virus può essere dovuta anche a fenomeni apoptotici di cells infettate, più sensibili a apoptosi causata da TNF → NB: recettore di tipo I di TNF attiva sia vie proinfiammatorie che proapoptotiche! Infezioni virali possono quindi spostare equilibrio verso apoptosi Iodice Serena UniBS 40 Anticorpi e antigeni Anticorpi = proteine circolanti prodotte nei vertebrati in seguito a esposizione ad antigeni. Mediatori dell’immunità adattativa umorale Prodotti solo dai linfociti B, in 2 forme: • Anticorpi associati alla sup dei linfociti B → recettori per antigene • Anticorpi secreti → protezione organismo da microrganismo riconosciuto (da quelli sulla mb) Localizzati: nel plasma nelle secrezioni mucose nei fluidi interstiziali Riconoscimento antigene (da parte di anticorpi sui linfociti B naive) → attivazione linfociti B → diventano plasmacellule → secernono anticorpi (con stessa specificità di quelli sulla mb) Anticorpi policlonali = diversi anticorpi che riconoscono epitopi diversi dello stesso antigene NB: Interazione tra anticorpi e componenti immunità innata! (proteine del complemento, fagociti, mastociti) Funzioni degli anticorpi:  Neutralizzazione microbi e loro tossine  Attivazione sistema del complemento  Opsonizzazione antigeni → fagocitosi  Citotossicità mediata da anticorpi → eliminazione cells infettate  Attivazione eosinofili → eliminazione elminti e parassiti Sierologia Siero = fase fluida che rimane del sangue prelevato dopo la coagulazione (fattori delle coagulazione nel siero) Antisiero = siero che contiene quantità rilevabile di anticorpi Sierologia = studio degli anticorpi e loro legame con antigeni → concentrazione anticorpi sierici specifici (titolo) calcolata sul numero di diluizioni del siero necessarie affinché legame anticorpo con antigene non più rilevabile Più diluizioni necessarie  maggiore titolo di anticorpi specifici Struttura degli anticorpi Scoperta che cells di mieloma multiplo producono anticorpi monoclonali (identici, prodotti da un clone neoplastico) → conseguenze: - Studio dettagliato struttura anticorpi - Clonaggio di geni che codificano per anticorpi specifici Caratteristiche strutturali generali Proteine plasmatiche divise in base a diversa solubilità in:  Albumine  Globuline Poi ulteriormente divise in base a carica elettrica (elettroforesi):  Gammaglobuline → comprendono tutti gli anticorpi (o immunoglobuline) Iodice Serena UniBS 41 Struttura simmetrica formata da • 2 catene leggere (L) • 2 catene pesanti (H) Dominio Ig: Formato da 2 foglietti β-planari → ognuno formato da 3-5 nastri polipeptidici antiparalleli (formazione di anse) Catene pesanti e leggere presentano: o Regione variabile (V) amminoterminale → riconoscimento e legame antigene (alta variabilità) Seq aa variano tra anticorpi prodotti da diversi cloni di linfociti B o Regione costante (C) carbossiterminale → da cui dipendono funzioni effettrici e proprietà chimico- fisiche di anticorpi Regione VH + regione VL = sito di legame per antigene → 2 siti di legame per antigene in ogni anticorpo Nelle catene pesanti (H): • Regione V formata da 1 dominio Ig • Regione C formata da 3-4 domini Ig Nelle catene leggere (L): • Regione V formata da 1 dominio Ig • Regione C formata da 1 dominio Ig Catene leggere e pesanti unite da ponti disolfuro tra residui di cisteina C-terminale della catena leggera e dominio CH1 della catena pesante. Anche le due catene pesanti dell’anticorpo legate da ponti disolfuro Classi o isotipi = diverse categorie di anticorpi formate da diverse catene pesanti, con ponti SS in posiz diverse Regioni Fab e Fc Organizzazione comune a tutte le Ig Taglio proteolitico con enzima papaina a livello della regione cerniera non ripiegata tra CH1 e CH2 → 3 frammenti:  2 Fab (fragment antigen binding) → mantengono capacità di legare antigene grazie a VH e VL Formati da catene leggere intere (VL e CL) + VH e CH1 (delle catene pesanti)  Fc (frammento cristallizzabile) → si aggregano e cristallizzano formando un reticolo Formato da due polipeptidi (ognuno con CH2 e CH3) uniti da ponti disolfuro Taglio proteolitico con pepsina avviene nella regione più distale della regione cerniera → frammento F(ab’)2 NB: altre proteine utilizzano domini strutturali simili a Ig → superfamiglia delle Ig (es. ICAM, VCAM-1, KIR, TCR) Regioni variabili Maggiori differenze tra anticorpi concentrate in 3 segmenti di VL e 3 segmenti di VH (da 10 aa l’uno) Contengono unità strutturali omologhe ripetute (formate da 110 aa) ripiegate in una struttura globulare → dominio Ig Tenuti insieme da ponte disolfuro Due forme di regione CH a liv del C-terminale: ▪ Una lega anticorpo a mb plasmatica di linfociti B ▪ Una guida secrezione di anticorpi Regioni ipervariabili = le 3 anse che fuoriescono dalla struttura e connettono i nastri adiacenti dei foglietti β Si associano in una struttura tridimensionale che costituisce sito di legame con antigene Iodice Serena UniBS 42 Regioni ipervariabili anche chiamate CDR (regioni che determinano complementarietà con antigene) Dall’estremità N-terminale: • CDR1 • CDR2 • CDR3 → maggior grado di variabilità (per particolari meccanismi genetici) Capacità della regione V di ripiegarsi dovuta a sequenze altamente conservate dei tratti adiacenti alle CDR Residui aa delle CDR formano contatti multipli con antigeni (soprattutto CDR3) NB: CDR possono anche non partecipare a legame con antigene, collocandosi fuori da regione di contatto Regioni costanti Anticorpi divisi in classi (isotipi) e sottoclassi in base a differenze nelle struttura delle regioni CH:  IgA → immunità mucose ▪ IgA1 ▪ IgA2  IgD → recettore per antigene dei linfociti B  IgE → ipersentibilità immediata, difesa contro elminti  IgG → opsonizzazione, attivazione complemento, citotossicità, immunità neonatale, feedback inibitorio ▪ IgG1 ▪ IgG2 ▪ IgG3 ▪ IgG4  IgM → recettore per antigene dei linfociti B naive (forma monomerica), attivazione complemento IgA, IgD e IgG contengono regioni C con 3 domini Ig IgE e IgM contengono regioni C con 4 domini Ig Diverse classi e sottoclassi svolgono funzioni effettrici diverse → per legami con diversi recettori per Fc (FcR) presenti sui diversi tipi cellulari Anticorpi sono molecole flessibili: possono orientare i due siti di legame per antigene in modo da legare due antigeni contemporaneamente → flessibilità grazie a regione cerniera (10-60 aa, diverse nelle sottoclassi) Flessibilità dovuta anche a capacità di ciascun dominio VH di ruotare rispetto a CH1 adiacente Esistono 2 isotopi di catene leggere: → differenze funzionali o Catene leggere κ (60% degli anticorpi nell’uomo) o Catene leggere λ (40%) Un anticorpo formato o da 2κ o da 2λ (mai mischiate) Predominanza di una o l’altra catena leggera è indice di linfoma delle cells B (perché cells neoplastiche derivano da stesso clone di linfociti B che quindi producono unico tipo di catena leggera) Struttura comune per tutte le Ig, ma con altissimo grado di diversificazione Capacità di legare antigene non dipende solo da regione ipervariabile ma anche da residui aa delle regioni conservate Regioni C delle catene pesanti di uno stesso isotopo/sottoclasse hanno stessa seq aa. Catene pesanti indicate con lettere greche corrispondenti all’isotopo (αγδεμ) Porzioni delle regioni cerniera assumo conformazione non ripiegata e flessibile che permette torsione tra regioni CH1 e CH2 Iodice Serena UniBS 45 Sottoclasse IgG3 ha emivita più breve di IgG1 e IgG2 perché si lega debolmente a FcRn Produzione proteine di fusione formate da Fc delle IgG (che lega FcRn e quindi ha emivita più lunga) + parte biologicamente attiva della proteina di interesse (di cui si vuole sfruttare la funzione e allungarne l’emivita) Es: TNRF-Ig = dominio extracell del recettore di tipo II per TNF + Fc di IgG → blocca azione pro- infiammatoria di TNF (usata nel trattamento di artrite reumatoide, malattia infiammatoria conica intestinale e psoriasi) Es: CTLA4-Ig = dominio extracell del recettore CTLA-4 + Fc di IgG → blocca costimolatore B7 (usata per artrite reumatoide e prevenzione rigetto di trapianto renale) Legame anticorpi ad antigeni Antigene = sostanza che può legarsi in modo specifico a un anticorpo o a un TCR Non tutti gli antigeni riconosciuti da anticorpi sono in grado di promuovere attività dei linfociti → solo molecole immunogene innescano risposta immunitaria Macromolecole (definite CARRIER) riescono a iniziare risposta immunitaria umorale perché si ha aggregazione (cross-linking) di più recettori per l’antigene Piccole molecole (definite APTENE) non sono invece di per sé immunogeni → devono legarsi a macromolecole (complesso aptene-carrier) per generare risposta immunitaria agendo da immunogeni Macromolecole sono più grandi del sito di legame di anticorpi → anticorpo si lega solo ad una porzione dell’antigene, chiamata determinante o EPITOPO = porzione antigene riconosciuta dall’anticorpo Polivalenza/multivalenza = presenza più epitopi identici in uno stesso antigene → attivazione + efficiente cells B Disposizione spaziale degli epitopi su stesso antigene influenza in modi diversi il legame con anticorpi: ▪ Epitopi non sovrapposti: ben separati, più Ig possono legarsi a epitopi dell’antigene senza ostacolarsi ▪ Epitopi sovrapposti: vicini → legame Ig con primo epitopo crea ingombro per legame del secondo anticorpo con il secondo epitopo ▪ Epitopi con effetto allosterico: legame epitopo con anticorpo causa modifica conformazionale della struttura antigene influenzando legame del secondo anticorpo Ogni forma o struttura riconoscibile da anticorpi è un epitopo antigenico Nel caso di proteine, in alcuni casi riconosciuta struttura primaria, in altri terziaria (conformazionale): o Epitopi lineari = formati da una sequenza di aa (struttura primaria) → accessibili all’anticorpo solo se sulla sup dell’antigene Se sono inaccessibili, vengono smascherati solo quando proteina denaturata o Epitopi conformazionali = aa in sequenza, formati da giustapposizione spaziale di regioni distanti o Epitopi neoantigenici = proteine che hanno subito modifiche post-traduzionali (metilazione, fosforilazione, glicosilazione…) → riconosciuti da anticorpi specifici NB: Per capire se proteina è degradata o è nella sua conformazione nativa, si possono usare anticorpi specifici Basi strutturali e chimiche del legame con antigene Le sei CDR possono allargarsi formando superficie planare. In alcuni casi (molecole piccole), antigene viene legato in una tasca formato da domini VL e VH Riconoscimento antigene: legami non covalenti reversibili Affinità anticorpo = forza di legame tra sito combinatorio di un Ig e epitopo di un antigene Polisaccaridi e acidi nucleici sono spesso polivalenti, proteine globulari no Iodice Serena UniBS 46 Affinità espressa come costante di dissociazione (Kd) → minore Kd, maggiore affinità (Kd = 10-7 – 10-11 M) Si ha un legame per ogni Fab (es. IgM possono legare fino a 10 epitopi) Avidità = forza complessiva di legame dell’anticorpo all’antigene, derivante da tutti i siti combinatori con tutti gli epitopi disponibili sull’antigene polivalente Antigeni polivalenti importanti per attivazione di linfociti B: molte funzioni effettrici innescate in maniera ottimale solo quando più Ig sono strettamente ravvicinati in seguito a legame di un antigene polivalente Immunocomplessi Se antigene polivalente messo in provetta con Ig specifica → si associano formando immunocomplesso Alla zona di equivalenza Ig e antigene formano fitto reticolo molecolare in cui tutte le molecole di antigene e di anticorpi sono complessate Immunocomplessi possono essere dissociati in due modi • Zona di eccesso di antigene: aumentando concentrazione antigene → molecole di antigene libero spazzano via quelle legate all’anticorpo • Zona di eccesso di anticorpo: aumento concentrazione anticorpo → anticorpo libero spiazza quello legato a determinanti antigenici (epitopi) Se zona di equivalenza si forma in vivo → formazione immunocomplessi di grandi dimensioni che rimangono intrappolati nella parete dei vasi sanguigni → reazioni infiammatorie: malattie da immunocomplessi Rapporto struttura – funzione anticorpi Caratteristiche strutturali degli anticorpi necessarie per: riconoscimento antigene e compiere funzioni effettrici Caratteristiche correlate al riconoscimento degli antigeni Capacità di riconoscere in modo specifico ampia varietà di antigeni con diversa affinità dovuta a regioni V ❖ Specificità: capacità di distinguere minime differenze nella struttura chimica → per evitare che Ig generate contro molecole microbiche attacchino molecole self con struttura simile Fenomeno di cross-reattività = anticorpi prodotti per una molecole cross-reagiscono con antigeni autologhi (strutturalmente simili) → malattie immunitarie ❖ Diversificazione: presenza di un elevato num di Ig che si legano ad antigeni differenti Fenomeno reso possibile da ricombinazione casuale di seq DNA nei geni che codificano per regioni V ❖ Maturazione dell’affinità: piccole modifiche nella struttura delle regioni V genera anticorpi con affinità maggiore rispetto ai domini V originari → modifiche consistono in mutaz somatica che produce nuovi domini V. Quelli con maggiore affinità hanno vantaggio selettivo e diventano popolazione dominante Caratteristiche correlate alle funzioni effettrici Funzioni effettrici dovute a porzioni Fc (regioni CH)  IgG lega simultaneamente microbo (regione Fab) e specifici recettori espressi da leucociti (regione Fc)  Attivazione via classica del complemento: innescata da legame C1q con Fc delle IgG o IgM + antigene  Funzioni effettrici innescate solo da Ig legate ad antigene (non da anticorpi liberi)  Intervento di diversi isotipi di Ig condiziona modo in cui antigeni vengono eliminati → cells attivate possono fare switching isotipico: varia regione CH (quindi isotipo) ma non regione V (specificità rimane)  Regioni CH condizionano distribuzione tissutale degli anticorpi → passaggio da forma di membrana a forma secreta dopo attivazione permette cambio funzione da recettore a anticorpo effettore Iodice Serena UniBS 47 Presentazione antigene ai linfociti T e MHC Funzioni generiche linfociti T:  Eliminazione microrganismi intracellulari  Attivazione di altre cells (macrofagi, linfociti B) Antigeni catturati e concentrati in organi linfoidi secondari → dove linfociti T naive ricircolano NB: linfociti T NON rispondono ad antigeni liberi in sospensione, ma solo ad antigeni associati alla sup di una cell Riconoscimento antigeni associati alle cells da parte di linfociti T CD4+ e CD8+ attraverso proteine specializzate espresse su superficie cells ospite: complesso maggiore di istocompatibilità o MHC Caratteristiche antigeni riconosciuti da linfociti T Forme chimico-fisiche di antigeni riconosciuti da linfociti T ≠ da quelle riconosciute da linfociti B Quindi: risp immunitarie linfociti T attivate da antigeni di natura proteica, linfociti B sia natura proteica che non Recettori dei linfociti T sono specifici per antigeni peptidici presentati da molecole MHC Restrizione per MHC = ogni singolo linfocita T riconosce uno specifico peptide presentato da una sola delle molecole MHC disponibili Due classi di MHC:  MHC di classe I → legano antigeni peptidici riconosciuti da linfociti T CD8+  MHC di classe II → legano peptidi riconosciuti da linfociti T CD4+ Cattura antigene e funzioni APC Presentazione antigene a linfociti T da parte di cells di origine non linfoide indispensabile per attivazione risp T [Termine APC usato per indicare cells specializzate a presentare antigene a linfociti T CD4+. Tutte le cells nucleate possono invece presentare antigene a linfociti T CD8+, ma non tutte sono APC] APC professionali: → APC in grado di attivare linfociti T CD4+ grazie a espressione di MHC di classe II • DC: sono le più efficaci ad attivare linfociti T naive (a volte sono considerate solo le DC come APC professionali) • Macrofagi • Linfociti B Stimoli necessari per attivazione completa di linfociti T: o Primo segnale: complesso MHC-peptide (antigene) espresso in membrana da APC o Secondi segnali (più impo per attivazione linfociti T naive) → molecole costimolatorie, citochine prodotte da APC APC (antigen presenting cells) catturano e presentano antigeni ai linfociti T naive - Discriminano antigeni presenti in diversi compartimenti e li presentano ai diversi tipi di linfociti T in modo che il linfocita corretto per quell’antigene lo riconosca - Discriminano antigeni internalizzati da ambiente extracell da antigeni prodotti all’interno della cellula Maggior parte di linfociti T riconosce solo piccoli peptidi (poche eccezioni riconoscono antigeni non proteici Possono legare solo peptidi Altamente polimorfe: variazioni molecole MHC in diversi individui influiscono su riconoscimento e legame con antigeni peptidici Attivano linfociti T CD4+ helper già attivati Iodice Serena UniBS 50 Fenomeno della restrizione per MHC Studio di CTL prelevati da topi infettati in vitro: CTL esprimono e uccidono cells infettate solo se cells infettate esprimono molecole MHC identiche a quelle dell’animale da cui CTL sono stati prelevati Significato: linfociti T specifici non solo per antigene, ma anche per molecole MHC → riconoscimento antigene da parte di linfociti T è ristretto/limitato dalle molecole MHC che linfocita incontra Successivamente dimostrato che: - Riconoscimento antigeni da parte di linfociti CTL CD8+ ristretto a MHC di classe I - Riconoscimento antigeni da parte di linfociti T CD4+ helper ristretto a MHC di classe II Geni MHC Locus MHC contiene: • 2 tipi di geni polimorfi → strutturalmente distinte ma omologhe. Funzione di presentare antigene o Geni per la classe I o Geni per la classe II • Altri geni non polimorfi → prodotti non svolgono funzione di presentare antigene, ma coinvolti Polimorfismo = differenze tra individui di una stessa popolazione presenti in un gene Geni MHC sono i geni più polimorfi presenti nel genoma dei mammiferi: Differenze nelle molecole di MHC derivano da distinte seq di DNA ereditate (e ricombinazione genica). Diversi alleli legano diversi peptidi → individui di una stessa popolazione possono presentare peptidi diversi dello stesso antigene Polimorfismo MHC evoluto per coprire il più possibile la popolazione da diversi microbi Inoltre geni MHC espressi in modo codominante in ogni individuo → massimizza num molecole MHC disponibili Loci MHC Localizzato su braccio corto del cromosoma 6 Ci sono tre geni MHC di classe I: → codificano per tre molecole MHC di classe I ▪ HLA-A ▪ HLA-B ▪ HLA-C Ci sono tre loci dei geni HLA di classe II: → ogni molecole MHC classe II = eterodimero αβ ▪ HLA-DP ▪ HLA-DQ ▪ HLA-DR Aplotipo MHC = serie di alleli MHC in ciascun cromosoma → soggetti eterozigoti hanno 2 aplotipi HLA Geni MHC sono strettamente legati: certi aplotipi ereditati in blocco Espressione molecole MHC  MHC di classe I espresse su tutte cells nucleate → sistema di esposizione degli antigeni intracellulari a riconoscimento e uccisione da parte dei CTL  MHC di classe II espresse su DC, macrofagi, linfociti B, cells epiteliali timiche → espresso su meno cellule perché linfociti T helper svolgono funzioni che prevedono riconoscimento dell’antigene presentato da tipi cellulari limitati Iodice Serena UniBS 51 Espressione molecole MHC aumentata da citochine prodotte durante le risposte immunitarie:  Aumento espressione molecole MHC di classe I (già espresse costitutivamente da cells nucleate) grz a: o Interferoni di tipo I (INF-α e INF-β) o INF-γ (prodotto da cells NK e linf T)  Aumento espressione molecole MHC di classe II grazie a: o INF-γ o Toll-like receptors o Riconoscimento antigene o Citochine prodotte da linfociti T helper Velocità di trascrizione genica determina entità di sintesi e espressione di molecole MHC: Citochine potenziano espressione MHC tramite stimolazione velocità di trascrizione dei geni → grazie a legami dei FdT (fattori di trascrizione) attivati da citochine con seq di DNA nelle regioni promotrici dei geni MHC: Molti FdT legano proteina CIITA (induttore di trascrizione della classe II) → complesso poi si lega a promotori dei geni della classe II → promozione trascrizione Mutazione CIITA causa immunodeficienze associate a mancata espressione di molecole MHC Es. sindrome del linfocita nudo Struttura molecole MHC Caratteristiche generali (classe I e II): ❖ Presenza tasca extracellulare per legare peptidi, seguita da coppia di domini Ig ancorati alla cellula ❖ Residui amminoacidici polimorfi localizzati nella tasca: su pavimento e pareti della tasca ❖ Domini non polimorfi di tipo Ig contengono siti di legame per recettori CD4 (classe II) e CD8 (classe I) espressi dai linfociti T Struttura tasca: ripiegamento porzioni N-terminali, formata da doppie α-eliche (formano parete) che poggiano su foglietto β di 8 filamenti (pavimento) Molecole MHC di classe I Formate da 2 catene polipeptidiche legate non covalentemente: • Catena α (catena pensante) → codificata dall’MHC Per ¾ extracellulare, breve segmento idrofobico transmembrana e C-terminale intracellulare (30 aa) • Subunità β2-microglobulina (catena leggera) → codificata da MHC Segmenti N-terminali α1 e α2 (90 residui aa) + foglietto β (antiparallelo) = tasca legante peptidi Sito di legame per CD8 formato invece da: ▪ Segmento α3 collocato in un dominio Ig → seq aa conservata ▪ Dominio della β2-microglobulina → omologa a un dominio Ig (come segmento α3) ▪ C-terminale non polimorfo del dominio α2 Molecola MHC di classe I è un complesso trimerico: catena α + β2-microglobulina + peptide → interazione catena α e β2-microglobulina stabilizzano legame antigene peptidico alla tasca e viceversa Meccanismi con cui immunità innata stimola immunità specifica Aum espressione sui linfociti B Larghezza sufficiente per legare peptidi di 8-11 aa Estremità tasca sono chiuse (non possono legarsi peptidi + grandi) → proteine native globulari devono essere frammentate per potersi legare a molecole MHC Residui aa polimorfi: contribuiscono a variabilità alleli di classe I Incluso cluster di aa basici che interagiscono con gruppi fosfolipidici per fissare MHC alla mb Iodice Serena UniBS 52 NB: solo molecole MHC trimeriche (con peptide legato) esposte sulla sup cellulare [Maggior parte di individui è eterozigote: esprime in ogni cellula 6 diverse molecole MHC di classe I] Molecole MHC di classe II Formate da 2 catene polipeptidiche legate non covalentemente: • Catena α • Catena β Sementi N-terminali α1 e β1 (con residui polimorfi) = tasca legante antigene (simile a tasca di MHC di classe I) NB: Polimorfismo maggiore si ha nella catena β Sito di legame per CD4 formato da: ▪ Segmento α2 ▪ Segmento β2 Estremità C-terminali di α2 e β2 proseguono con residui transmembrana e terminano con residui basici intracell Anche molecola MHC di classe II è complesso trimerico: catena α + catena β + peptide → espressione stabile richiede presenza di tutte e tre le componenti del complesso [Ogni individui eterozigote esprime 6 o 8 coppie di MHC di classe II] Legami peptidi alle molecole MHC Singolo allele MHC può presentare uno o più peptidi diversi a linfocita T, ma linfocita riconoscerà solo uno dei possibili complessi MHC-peptide possibili Caratteristiche importanti delle interazioni: ❖ Molecole MHC presentano una sola tasca → possibilità di legare un solo peptide alla volta, anche se molecola MHC può legare più peptidi in tempi diversi (anche perché sono solo 12 le molecole MHC in un individuo, mentre ci sono mooolti più peptidi da presentare ai linfociti T) ❖ Peptidi che si legano alle molecole MHC condividono caratteristiche strutturali: - MHC classe I lega peptidi da 8-12 aa - MHC classe II lega peptidi da 10-30 aa Residui aa di un peptide che si lega a MHC sono diversi da residui a riconosciuti da linfociti T ❖ MHC legano peptide durante la loro sintesi, all’interno della cellula → permettono a linfociti T di riconoscere microbi che infettano o sono ingeriti dalle cells - MHC di classe I legano peptidi derivanti da proteine citoplasmatiche (digerite da enzimi) - MHC di classe II legano peptidi derivanti da proteine extracell (digerite da vescicole endocitiche) ❖ Interazione saturabile con velocità di dissociazione lenta → complessi MHC-peptide molto stabili per permettere esposizione per un tempo sufficientemente lungo per favorire riconoscimento da linfocita T ❖ Quantità molto piccole di complessi MHC-peptide in grado di attivare linfociti T specifici ❖ MHC legano sia peptidi derivanti da antigeni non self, sia da antigeni self (non discriminano) → MA complessi MHC-peptidi self NON inducono risposta immunitaria perché linfociti T sono tolleranti verso i self! Entrambe codificate da geni polimorfi nel locus MHC 4 stringhe del pavimento e una delle 2 α-eliche formate da α1 Altre 4 stringhe e altra α-elica formate da β1 Estremità tasca sono aperte → peptidi con >30 aa possono legarsi Ripiegati in domini Ig non polimorfi Iodice Serena UniBS 55 Alcuni microbi (es. leishmania) sono in grado di replicarsi in endosomi o fagosomi Autofagia Proteine citoplasmatiche o di mb possono essere processate e presentate su MHC di classe II → processo di turnover del contenuto citoplasmatico Proteine intrappolate in autofagosomi legati alla mb → autofagosomi + lisosomi → autofagolisosomi → degradazione per via proteolitica → riciclo componenti come fonte di nutrimento durante stress Autofagia partecipa a degradazione intracell dei microbi, chiusi in vescicole e portati ai lisosomi Cross-presentazione Capacità di alcune specifiche DC di ingerire cells infettate da virus o cells tumorali e presentarne gli antigeni a linfociti T CD8+ naive Antigeni ingeriti →internalizzati nei fagosomi → poi trasportati da vescicole endocitiche al citosol → via di presentazione di classe I (quindi degradazione nei proteasomi) Contemporaneamente: DC che fanno cross-presentazione presentano anche antigeni ingeriti attraverso via di classe II a linfociti T helper CD4+ → necessari per attivare completamente risposta di linfociti T CD4+ Funzione cross-presentazione: importante per risposte di linfociti T CD8+ a virus e cells tumorali → cross presentazione permette a DC di presentare antigeni prodotti in tutti i tipi cellulari ai linfociti T CD8+ → risposta più efficace! Natura delle risposte T Presentazione di proteine - Endosomiali dalla via di classe II - Citosoliche dalla via di classe I È legata a funzioni diverse dei linfociti T  Antigeni sintetizzati endogenamente (proteine virali o tumorali) localizzati nel citosol: riconosciuti da CTL CD8+ ristretti per MHC di classe I → linfociti citotossici uccidono cells che hanno prodotto antigeni intracellulari  Antigeni extracell finiscono nel pool endosomiale: riconosciuti da linfociti T CD4+ ristretti per MHC di classe II → cells helper che stimolano linfociti B (produzione anticorpi) e macrofagi (funzione fagocitica) per eliminazione antigeni extracellulari Quindi antigeni che risiedono in compartimenti diversi stimolano selettivamente risposte cellulari T più efficaci! NB: Importante perché TCR per antigeni non sono in grado di distinguere tra microbi intracell e extracell Immunogenicità antigeni proteici Immunogenicità = capacità posseduta da una sostanza di indurre una risposta immunitaria Molecole MHC determinano immunogenicità di antigeni proteici in 2 modi: • Epitopi immunodominanti = epitopi delle proteine complesse maggiormente capaci di provocare risposte T, che si legano con maggiore avidità a molecole MHC Proteasi coinvolte nella processazione antigene generano ampia varietà di peptidi → MA solo alcuni hanno caratteristiche necessarie per legarsi a molecole di MHC di ogni individuo Iodice Serena UniBS 56 Importanza epitopi immunodominanti: progettazione vaccini → proteina virale analizzata (con modelli informatici) per presenza di seq amminoacidiche che formino epitopi immunodominanti capaci di legarsi con alta affinità a MHC → peptidi sintetici contenenti epitopi usati come vaccini efficaci per provocare risposta T verso peptide virale espresso da cells infettate • Espressione di particolari alleli MHC di classe II determina possibilità di rispondere ad un determinato antigene Geni Ir che controllano risposta anticorpale sono geni MHC di tipo II → diverse forme di molecole MHC di classe II prodotte da diversi alleli legano diversi antigeni peptidici Ereditando o meno un certo allele MHC di classe II si avrà o meno la capacità di legare un certo antigene peptidico sull’MHC (es. predisposizione genetica a sviluppare allergie al polline dovuta a eredità di alleli MHC che producono molecole MHC di classe II capaci di legare peptide proveniente dal polline) Conseguenza: alcuni soggetti non rispondono a vaccini perché le loro molecole MHC non sono in grado di legare (e presentare) i peptidi principali dell’antigene Presentazione di antigeni non-proteici ai linfociti T Linfociti T possono attivarsi in risposta anche a piccole molecole e ioni metallo (es. esposizione a nichel può provocare risposte T patologiche) Diversi modi attraverso cui antigeni possono essere riconosciuti da linfociti T ristretti da MHC: o Alcuni agenti chimici modificano covalentemente peptide self o molecole MHC → creano molecole riconosciute come non-self → attivazione risposte T o Altri composti legano non covalentemente molecole MHC modificando struttura tasca → MHC legano peptidi che normalmente non sono presentati → attivazione risposte T Altre popolazioni di linfociti T (≠ CD4 e CD8) riconoscono antigeni non-proteici senza coinvolgimento MHC:  Cells natural killer T (NKT): esprimono marcatori di cells NK e cells T e recettori αβ dei linfociti T, ma con diversificazione limitata Riconoscono lipidi e glicolipidi espressi da CD1 (MHC non-classica) → CD1 legano lipidi → li portano alla sup cellulare → complessi CD1-lipide endocitati in endosomi o lisosomi → nuovi complessi CD1-lipidi tornano sulla superficie Ruolo NKT che riconoscono antigeni lipidici: difesa contro micobatteri (ricchi di componenti lipidiche)  Linfociti T γδ: esprimono recettori simili a quelli dei linfociti T CD4+ e CD8+ Riconoscono molti tipi di antigeni (proteine, lipidi, molecole fosforilate e alchilamine), non presentati su molecole MHC ? Iodice Serena UniBS 57 Recettori e vie di trasduzione del sistema immunitario Caratteristiche generali trasduzione del segnale: Cascata di trasduzione inizia con fase citosolica: modificazione porzione citoplasmatica recettore → attivazione o traslocazione nucleare di fattori trascrizionali (FdT) Segue fase nucleare: FdT modulano trascrizione di geni bersaglio Conseguenze trasduzione del segnale per la cellula: • Acquisizione nuove funzioni • Stimolazione differenziazione • Protezione da morte cellulare • Proliferazione e crescita • Arresto del ciclo cellulare e apoptosi Trasduzione segnale inizia grazie a:  Recettori di membrana (proteine integrali di mb) → domini extracell riconoscono ligandi  Recettori nucleari (fattori trascrizionali intracell) → attivati da ligandi liposolubili che oltrepassano mb Recettore riconosce ligando → aggregazione proteine recettoriali (cross-linking) o modificazione conformazionale recettore → modificazione conformazione porzione intracitoplasmatica del recettore → promozione interazioni con molecole responsabili della trasduzione segnale Classificazione recettori (in base a tipo di trasduzione utilizzato): a. Recettori che utilizzano tirosine chinasi non recettoriali: code citoplasmatiche non hanno attività enzimatica intrinseca quindi attivazione recettore dipende da tirosine chinasi distinte che fosforilano residui del recettore Es.: - Recettori del sistema immunitario - Recettori per citochine e integrine b. Recettori tirosinchinasici (RTK): proteine integrali di mb che attivano domini tirosinchinasici nelle code citoplasmatiche Es.: - Recettore c-Kit (ematopoiesi e linfopoiesi) - Recettore per insulina - Recettore per fattore di crescita epidermico - Recettore per fattore di crescita derivato da piastrine c. Recettori nucleari: sono nel nucleo o migrano nel nucleo per fungere da FdT Si associano a ligandi liposolubili → attivano o reprimono trascrizione genica Es.: - Recettori nucleari per ormoni - Recettori per glucoroticoidi d. Recettori accoppiati a proteine G (GPCR) o recettori a sette domini transmembrana: attivano proteine G (leganti GTP). Riconoscimento ligando → cambio conformazionale → attivazione proteine g eterotrimerica → scambio GDP con GTP → avvio cascata di trasduzione (attivazione enzimi adenilato ciclasi e fosfolipasi C) Es.: - Recettori per leucotrieni, prostaglandine e istamina - Recettori per frammenti del complemento C3a e C5 e chemochine e. Proteine della famiglia Notch: coinvolte nello sviluppo delle specie e determinazione destino linfociti in via di sviluppo e attivazione linfociti maturi. Iodice Serena UniBS 60 • Catena α • Catena β [Ogni catena del TCR codificata da molteplici segmenti genici uniti durante maturazione linfociti T] Esistenza linfociti T γδ (con catene γ e δ, più rari) Porzione extracell eterodimero TCR αβ strutturalmente simile a frammento Fab (anticorpi) → regioni V e C  Regioni V (delle catene α e β) contengono brevi seq che determinano variabilità tra diversi TCR → regioni ipervariabili, dette CDR (regioni che determinano complementarietà) 3 CDR in α + 3 CDR in β → costituiscono porzione che riconosce in modo specifico complessi MHC- peptide Dominio V di catena β presenta 4^ CDR, ma non partecipa a riconoscimento antigene  Regioni C si estendono in una regione cerniera → contiene residui di cisteina che formano S-S Regione cerniera seguita da porzione idrofobica transmembrana → con aa con carica positiva: - Lisina nella catena α - Lisina e arginina nella catena β Infine presenza brevi code citoplasmatiche C-terminali (5-2 aa) → troppo corte per trasdurre segnali Complesso del TCR Eterodimero αβ + eterodimero CD3 δε + eterodimero CD3γε + omodimero ϚϚ Proteine CD3 e Ϛ associate non covalentemente a eterodimeri αβ → funzione: trasduzione segnale Complesso CD3 formato da 3 proteine omologhe: γ, δ, e ε Catena Ϛ presenta: • Breve regione extracell • Acido aspartico nella regione transmembrana (come CD3) • Lungo dominio citoplasmatico con 3 sequenze ITAM Trasduzione segnale da parte del complesso del TCR TCR lega complesso MHC-peptide → corecettori si aggregano a TCR + cambiamento conformazionale espone motivi ITAM (di CD3 e Ϛ) → fosforilazione tirosine delle seq ITAM di CD3 e Ϛ Corecettori CD4 e CD8 Glicoproteine transmb (famiglia delle Ig) che legano regioni non polimorfe delle MHC e facilitano trasduz segnale Sono i responsabili della restrizione per MHC Unite da ponte disolfuro tra cisteine extracell Linfociti T αβ Interagiscono con aa di carica opposta presenti nella porz transmembrana di altre proteine che fanno parte del complesso TCR: complesso CD3 e catene Ϛ (stigma) Funz svolta da altre catene associate a TCR: complesso CD3 e catene Ϛ Per questo sono identiche in tutti i linfociti T (riconoscimento antigene) Ognuna contiene: • Dominio Ig nella regione N-terminale extracell • Residuo di acido aspartico (carico neg) nella regione transmembrana → interagisce con aa carichi positivamente dei domini transmb delle catene αβ del TCR • Dominio ITAM nella regione citoplasmatica Iodice Serena UniBS 61  CD4: monomero espresso da linfociti T periferici e timociti. Si lega a MHC di classe II Formato da - 4 domini Ig extracell → i 2 domini Ig N-terminali legano domini non polimorfi α2 e β2 delle MHC di classe II - Regione idrofobica transmembrana - Coda citoplasmatica altamente basica  CD8: eterodimero (ponti S-S) espresso dalla maggior parte delle cells. Si lega a MHC di classe I 2 catene CD8α e CD8β presentano: - Singolo dominio Ig extracell → si lega a dominio non polimorfo α3 di molecola MHC di classe I. interagisce anche con porzioni del dominio α2 e con β2-microglobulina - Regione idrofobica transmb - Coda citoplasmatica altamente basica Chinasi Lck (famiglia Src) si associa a coda citoplasmatica di CD4 e CD8 → questo avvicina chinasi a domini ITAM → li fosforila → permette reclutamento e attivazione tirosin-chinasi ZAP-70 Quindi corecettore fornisce iniziale attività enzimatica per iniziare trasduzione! Ruolo chinasi [Anche in assenza di attivazione del TCR presente livello basale di fosforilazione ITAM] Seq ITAM della catena Ϛ fosforilate formano siti di ancoraggio per ZAP-70 (tirosin-chinasi della fam. Syk) → ZAP- 70 contiene 2 domini SH2 in grado di legare fosfotorisine di ITAM → ZAP-70 ancorata a catena Ϛ diventa substrato per Lkc → innesco attività chinasica di ZAP-70 → forsforilazione di substrati coinvolti nella via di trasduzione del segnale, tra cui proteine adattatrici SLP-76 e LAT Necessità di superare soglia di attivazione reclutando molteplici ZAP-70 Altra via di trasduzione: attivazione chinasi PI3 → si associa a proteine adattatrici → fosforila PIP2 in PIP3 → proteine con domini PH si legano a sup interna della mb NB: Solo riconoscimento antigene innesca vie trasduzione segnale che portano a risp funzionale di linfociti T Formazione sinapsi immunologica Riconoscimento complessi peptide-MHC da parte di TCR causa reclutamento di diverse proteine nel sito di contatto tra linfociti T e APC = sinapsi immunologica (SMAC)  c-SMAC (centrale) comprende o Complesso del TCR o Corecettori CD8 e CD4 o Recettori per molecole costimolatorie (CD28) o Enzimi (PKC-θ) o Proteine adattatrici citoplasmatiche Distanza tra le due mb = 15 nm  p-SMAC (periferico) contiene integrine → stabilizzano legame di linfocita T a APC Distanza tra le due mb = 40 nm Molecole coinvolte nella trasduzione localizzate in rafts lipidici → microdomini lipidici in cui ha inizio attivazione del TCR e di recettori costimolatori → riarrangiamento citoscheletro → permette ai rafts di unirsi a formare sinapsi immunologica Proteine con domini PH: - Itk nei linfociti T - Btk nei linfociti B - PDK1 → attiva Atk che fosforila bersagli importanti per sopravvivenza cellulare Iodice Serena UniBS 62 Funzioni sinapsi immunologica:  Punto di contatto stabile tra linfocita T e APC → regione preferenziale per attivazione TCR (anche se trasduzione segnale inizia prima della formazione della sinapsi) in cui ingaggio ripetuto di TCR da parte di complessi peptide-MHC sulla mb dell’APC è facilitato  Permette rilascio direzionato di contenuto granuli secretori e citochine da linfocita T a APC → rilascio vettoriale granuli con perforina e granzimi da parte di CTL per uccidere cells bersaglio Anche interazioni CD40L-CD40 facilitate da accumulo di queste due proteine a liv di SMAC  Sito preferenziale di degradazione delle molecole coinvolte nella trasduzione segnale tramite ubiquitinazione → spegnimento attivazione del linfocita T MAP-chinasi Riconoscimento antigene → attivazione proteine G a basso peso molecolare → stimolano MAP-chinasi (Mitogen-activated protein) → attivano diversi fattori trascrizionali  Via di Ras (proteina G) porta ad attivazione di ERK (della fam MAP-chinasi): Attivazione recettori (TCR) → GDP sostituito con GTP → cambiamento conformazionale di Ras: ZAP-70 fosforila LAT → fa da sito di ancoraggio per dominio SH2 di Grb-2 → Grb-2 reclutata da LAT recluta fattore SOS (fattore di scambio Ras GTP/GDP) → formazione Ras legato a GTP → Cascata di MAP-chinasi: Ras- GTP attiva prima chinasi Raf → che fosforila e attiva seconda chinasi MEK-1 → attiva terza chinasi ERK → ERK va nel nucleo → fosforila chinasi Elk → stimola trascrizione di c-Fos (componente del fattore trascrizionale AP-1)  Via di Rac porta ad attivazione di JNK (della fam MAP-chinasi): Parallelamente molecole adattatrici fosforilate reclutano proteina Vav → agisce su Rac → complesso Rac-GTP innesca cascata di MAP-chinasi → porta attivazione JNK (o SAP) → JNK fosforila c-Jun (secondo componente del fattore di trascrizione AP-1) Anche p38 (fam MAP) attivata da Rac-GTP e attiva fattori trascrizionali Attività di ERK e JNK e attivazione linfociti T termina con meccanismo a feedback negativo (azione fosfatasi) Fosfolipasi C-γ1 (PLCγ1) Trasduzione segnale del TCR porta a attivazione PLC-γ1 (reclutata da LAT e fosforilata da ZAP-70 e Itk) → catalizza idrolisi di PIP2 (fosfolipide di membrana) in: • Inositolo trifosfato (IP3): diffonde da membrana a reticolo endoplasmatico → si lega al suo recettore (canale per il calcio) → stimola rilascio calcio immagazzinato nel RE → aum concentrazione citosolica di Ca2+ → Calcio citoplasmatico agisce da secondo messaggero → si lega a calmodulina → complesso calcio-calmodulina attiva enzimi → attivano fattori trascrizionali • Diacil-glicerolo (DAG): attiva proteina chinasi C (PKC-θ) → partecipa ad attivazione di FdT Attivazione fattori di trascrizione che regolano espressione genica nei linfociti T Enzimi generati a seguito di trasmissione segnale attivano FdT che si legano a regioni regolatrici di geni, determinandone aumento della trascrizione Diverse vie di trasmissione del segnale attivano diversi fattori di trascrizione Fattori di trascrizione fondamentali per le risposte T:  NFAT (fattore nucleare delle cells T): necessario per espressione geni che codificano per IL-2, IL-4 e TNF Esistono 4 tipi, ognuno codificato da un gene diverso. NFAT1 e NFAT2 = forme espresse nei linf T. Iodice Serena UniBS 65 Recettori inibitori di linfociti B:  FcγRIIB (anche in macrofagi e DC): lega immunocomplessi contenenti IgG tramite i suoi domini Ig extracell. Recluta SHIP → spegne attivazione linfociti B dopo produzione di anticorpi Ubiquitina Ubiquitina = proteina di 76 aa attivata in modo ATP-dipendente da enzima E1 → ubiquitina poi trasferita a enzima E2 → attacca ubiquitina attivata su substrato → riconosciuto da ubiquitina-ligasi E3 Diversi tipi di ubiquitinazione: alcuni inibiscono, altri attivano linfociti T Generazione di catene di poliubiquitina → varia in base a residuo Lys usato per legame con molecola successiva: - Catena con lisina-48 riconosciuta e degradata da proteasoma - Altra catena forma struttura che aggancia proteina ad altre prot specifiche → impo per attivaz NF-kB Diverse ligasi E3 nei linfociti T: ▪ Cbl-b: determina monoubiquitinazione, endocitosi e degradazione endosomiale di complesso TCR (mancanza di Cbl-b causa produzione eccessiva di IL-2 e fenomeni di autoimmunità) Segnali provenienti da CD28 bloccano attività inibitoria di Cblb-b → costimolazione e attivazione linfociti T Recettori per le citochine Recettori per citochine = proteine transmembrana formate da: o Porzione extracell → lega citochina o Porzione citoplasmatica → trasduce segnale Recettori classificati in base a omologia strutturale dei domini extracell:  Recettori per citochine di tipo I → famiglia del recettore dell’ematopoietina  Recettori per citochine di tipo II → famiglia del recettore dell’interferone  Famiglia recettore per TNF  Famiglia recettori per IL-1  Famiglia recettori per IL-17 Recettori per citochine di tipo I Dimeri o trimeri formati da catene che riconoscono ligando e catene che trasducono segnale Ogni catena ha 1 o 2 domini conservati → contenenti cisteine e seq aa WSXWS (W = triptofano, S = serina) Divisi in sottogruppi: • Gruppo contenente catena γ-comune (γC) → recettori per IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21 • Gruppo con catena gp130 → recettori per IL-6, IL-11, IL-27 Tutti i recettori per citochine di tipo I usano vie di trasduzione JAK-STAT Recettori per citochine di tipo II Possiedono domini extracell con domini conservati → ma seq WSXWS Recettori per: INF di tipo I, INF di tipo II, IL-10, IL-20, IL-22 Usano tutti vie di trasduzione JAK-STAT Formano strutture tridimensionali che legano citochine con 4 α-eliche (citochine di tipo I) Ma specificità per singola citochina dipende da aa caratteristici di ogni recettore Iodice Serena UniBS 66 Famiglia di recettori per TNF Trimeri preformati con domini extracell conservati ricchi di cisteina Recettori per: TNF (TNFR1 e TNFR2), prot CD40, prot Fas, linfotossina, BAFF (fattore di attivazione cells B) Recettori trimerici riconoscono ligandi (trimerici) → cambio conformazione → reclutamento proteine adattatrici → reclutamento chinasi → inizio trasduzione segnale Recettore per il TNF recluta proteina adattatrice TRADD → recluta proteine TRAF con attività di ligasi E3 Meccanismi di trasduzione portano a:  Stimolazione espressione genica  Apoptosi → nel caso di TNFR1 e proteina Fas, che reclutano adattatori che attivano caspasi-8 Famiglia di recettori per IL-1 Presentano dominio citoplasmatico conservato TIR → inizia vie di trasduzione Ingaggio IL-1R e TLR (vedi paragrafo Toll like receptors) → dimerizzazione recettore e reclutamento proteine adattatrici contenenti TIR → prot adattatrici collegano recettori a chinasi IRAK → collegamento con proteina TRAF6 (ubiquitina ligasi E3) → attivazione NF-kB Famiglia di recettori per IL-17 Oligomeri preformati, composti da diverse combinazioni di catene A, B, C, D, E dell’IL-17R Motivo SERIF si lega a adattatore ACT-1 (contenente motivo SERIF) → reclutamento TRAF6 → attivazione NF-kB Famiglia IL-17 formata da diverse citochine: IL-17A, IL-17F, IL-17B,C,C (poco caratterizzate) e IL-17E (o IL25, promuove risposte TH2) Trasduzione segnale tramite JAK/STAT Recettori per citochine di tipo I e II attivano vie di trasduzione che coinvolgono JAK (chinasi Janus, 4 tipi) e fattori di trasrizione STAT (7 tipi) Legame citochina-recettore → aggregazione catene recettoriali → attivazione molecole JAK → fosforilano residui di tirosina nella porz citoplasmatica del recettore → residui fosforilati riconosciuti e legati da SH2 delle proteine STAT (monomeri nel citoplasma) → STAT fosforilate da JAK → formazione dimero di due STAT → trasloca nel nucleo → si lega a seq di DNA su geni delle citochine → avvio trascrizione NB: Diversi recettori attivano diverse combinazioni di JAK e STAT → ogni catena del recettore lega JAK diverse ▪ Citochine di tipo I usano chinasi JAK3: espresso solo su cells del sist immunitario (ubiquitaria) ed è attivata da recettori che usano catena comune γc → mutazioni JAK3 o catena γC causano immunodeficienza grave combinata (vista più avanti) ▪ Recettori per citochine di tipo I della fam IL-6 usano JAK2 per attivare STAT3 → mutazioni JAK2 causano sindrome mielodisplastica, anemia aplastica, policitemia vera Antagonisti di JAK: trattamento leucemia mieloide acuta, neoplasie mieloidi e malattie infiammatorie croniche Ogni catena è una prot integrale di mb con due domini di fibronectina III e un motivo SERIF intracellulare (omologia con motivo TIR) Iodice Serena UniBS 67 Altre vie di trasduzione segnale: Catena β recettore per IL-2 attiva via RAS/MAPK → si combina con via di JAK/STAT determinando specificità delle risposte biologiche Inibizione vie JAK/STAT: Prot SOCS: adattatori per attività ligasi E3 → E3 si associa a STAT e JAK attive → ubiquitinazione e degradazione Proteine inibitorie SHP-1 e SHP-2 → inattivano proteine JAK mediante defosforilazione Famiglia degli inibitori di STAT (PIAS) → si legano a STAT fosforilate impedendone legame con DNA Inibiscono anche altri FdT, come NF-kB, IRF e SMAD Vie di attivazione di NF-kB Gruppo di FdT (5 proteine), con funzioni:  Infiammazione  Attivazione linfociti  Formazione organi linfatici secondari NF-kB attivato da: ▪ IL-1, IL-17, TNF ▪ Stimolazione TLR ▪ Riconoscimento antigene da parte di linfociti Struttura: o Dominio di omologia Rel → lega DNA o Dominio di attivazione → attiva trascrizione Solo 3 membri della fam possiedono entrambi i domini:  P65/RelA  RelB  C-Rel Mentre NF-kB1/p50 e NF-kB2/p52 hanno solo dominio Rel Due vie di attivazione di NF-kB:  Via canonica → attivata da recettori in grado di promuovere risposta infiammatoria (TLR, IL-R1, TNFR1)  Via non canonica → attivata da recettore per linfotossina-β e recettore BAFFR Via canonica Eterodimeri NF-kB1/p1 localizzati nel citosol legati a inibitore IkBα che impedisce accesso al nucleo → attivazione di NF-kB causa degradazione IkBα (tramite ubiquitinazione) → eterodimero migra nel nucleo Via non canonica Precursore p100 legato a RelB → complesso p100/RelB incapace di entrare nel nucleo → attivazione NF-kB porta conversione p100 in p52 → NF-kB2/p52 entra nel nucleo Agiscono da regolatori a feedback negativo della stimolazione cellulare Forma eterodimeri con p65/relA o c-Rel Forma eterodimeri con RelB Iodice Serena UniBS 70 All’estremità 5’ di ogni locus per Ig si trova cluster di geni V (300 bp) All’estremità 5’ di ogni segmento V si trova esone leader → codifica per 20-30 residui N-terminali e rappresenta la seq segnale: guida polipeptidi da ribosoma a RE (poi seq segnale rimossa) A monte di ogni esone leader si trova promotore del gene V → dove inizia trascrizione In posizione 3’ rispetto a geni V si trovano segmenti genici J (30-50 bp), separati da seq non codificanti Nel locus H (catena pesante): tra geni V e J presenti seq codificanti aggiuntive, segmenti diversità (D) In posizione 3’ rispetto a segmenti J ci sono geni per regioni costanti C Locus per catena pesante ha 9 geni C → codificano per i 9 diversi tipi e sottotipi delle Ig Segmenti genici V, J (e D) riuniti a formare seq codificante per la regione variabile Nella catene leggere: dominio V codificato da segmenti genici V e J riarrangiati Nelle catene pesanti: dominio V codificato da segmenti genici V, D e J riarrangiati CDR3 codificati da residui giunzionali non germinativi e posti a cavallo tra segmenti V e D o D e J riarrangiati CDR1 e CDR2 codificati solo da segmento genico V Nella configurazione completa: catene leggere e pesanti di una Ig contengono dominio V codificato da esone V(D)J ricombinato, fuso a uno o più domini C → fusione domini V e C avviene per splicing alternativo [Seq non codificanti svolgono ruolo nella ricombinazione e espressione dei loci genici] Organizzazione loci genici per TCR Struttura simile a loci per Ig: segmenti V, segmenti D (solo nei loci β e δ), cluster di segmenti J, geni per regione C Nella catene β e δ: dominio V codificato da segmenti genici V, D e J Nelle catene α e γ: dominio V codificato da segmenti genici V e J CDR1 e CDR1 dei domini V, codificati da seq contenute nei segmenti genici V della linea germinativa; CDR3 delle catene β e δ codificato da segmento genico D e segmento J insieme a seq giunzionali non germinative CDR3 delle catene α e γ codificato da seq giunzionali di segmenti V e J non geminativi e dal segmento J Nei loci per TCRβ e TCRδ presenti 2 geni C Nei loci per TCRα e TCRγ solo un gene C Ricombinazione V(D)J Recettori per antigeni funzionati prodotti in linfociti B e T in seguito a riarrangiamento DNA → fusione casuale di segmenti genici V, D e J → formazione specifico esone V(D)J → codificherà per specifica regione variabile dei recettori per antigene Nei loci in cui segmento D: un solo riarrangiamento per unire casualmente segmento V e segmento J Nei loci con segmento D: due riarrangiamenti, prima si uniscono J e D, poi DJ si unisce a segmento V Sequenza di reazioni: a) Apertura cromatina per rendere accessibili segmenti genici codificanti recettori b) Avvicinamento segmenti genici scelti per ricombinazione c) Tagli alla doppia elica di DNA d) Inserimento nucleotidi e) Ricongiungimento terminazioni a formare gene per recettore di quel particolare clone f) Trascrizione in RNA di esone riarrangiato g) Splicing dell’RNA: unione esone leader, esone V(D)J e esone per regione C → mRNA h) Traduzione mRNA in una catena del recettore per antigene Geni regione C formata da 4 esoni codificanti per dominio Ig di regione extracell C, regione cerniera, segmento transmb e coda citoplasmatica Iodice Serena UniBS 71 Sequenze che orchestrano ricombinazione V(D)J Proteine responsabili della ricombinazione V(D)J riconoscono sequenze segnale di ricombinazione (RSS), presenti: All’estremità 5’ di ogni segmento J All’estremità 3’ di ogni segmento V A fianco di ogni segmento genico D RSS formate da sequenze altamente conservate di 7 nt (eptamero), seguita da spaziatore di 12 o 23 nt (giri eliche) non conservati e seconda seq altamente conservata di 9 nt (nonamero) Durante ricombinazione: tagli nella doppia elica tra eptamero di RSS e seq V, D o J adiacenti → frammento DS- DNA tagliato (che contiene parti terminali dei segnali) viene rimosso sotto forma di anello → estremità dei segmenti genici codificanti per V e J possono congiungersi NB: maggior parte dei riarrangiamenti per Ig e TCR avviene per delezione Inversione avviene <50% dei casi solo nel locus delle catene κ delle Ig Condizione: Ricombinazione si verifica tra due segmenti genici solo se uno dei due segmenti affiancato a spaziatore di 12 nucleotidi, e altro segmento affiancato a spaziatore di 23 nucleotidi (“regola 12/23”) Conseguenze ricombinazione: Seq promotrici al 5’ dei geni V vengono portate in contiguità a seq enhancer a valle degli introni tra segmenti J e C e in posizione 3’ rispetto a geni per regione C → seq enhancer hanno ruolo essenziale nella trascrizione ad alta velocità dei geni V riarrangiati nei linfociti Fattori eziologici dello sviluppo tumorale: geni appartenenti ad altri loci possono essere traslocati nelle seq per recettori per antigeni e trascritti in modo abnorme → aumento trascrizione oncogeni Meccanismi di ricombinazione V(D)J Quattro eventi distinti avvengono in ordine sequenziale durante ricombinazione V(D)J 1. SINAPSI Parti del cromosoma rese accessibili ai componenti del processo di ricombinazione (tramite ripiegamento) → per facilitare reclutamento degli enzimi di ricombinazione. Sequenze codificanti e RSS adiacenti messe in contatto tra loro (e mantenute così per successivi eventi) 2. TAGLIO Tagli della doppia elica DNA tra RSS e seq codificanti grazie a reazione enzimatica: proteine RAG1 (funz catalitica) e RAG2 (funz attivatoria di RAG1) si assemblano a formare complesso ricombinasi V(D)J → RAG1 taglia seq di congiunzione tra eptameri e segmenti genici codificanti: Terminazione 3’-OH dell’estremità codificante si lega a altro filamento di DNA (legame fosfodiesterico) → formazione struttura a forcina (harpin). Altra estremità rimane tronca e non viene processata NB: geni RAG attivati solo durante maturazione cells linfoidi (silenti durante fase replicativa) per minimizzare rischio di rotture DNA durante mitosi Mutazioni geni RAG1 o RAG2 causano SCID (immunodeficienza grave combinata) 3. APERTURA HARPIN E PROCESSAMENTO Harpin vengono linearizzate a liv delle giunzioni delle seq codificanti → per permettere aggiunta nucleotidi (aumenta la diversificazione!) Enzima Artemis apre le harpin → mutazioni o assenza di Artemis sono causa di SCID Iodice Serena UniBS 72 4. UNIONE Unione tra estremità codificanti tagliate e estremità segnale → processo: unione delle estremità non omologhe (presente in tutte le cells) Proteine Ku70 e Ku80 ricongiungono terminazioni di DNA e reclutano enzima DNA-PK → ripara doppia elica Mutazioni o assenza di DNA-PK (fosfochinasi) causano SCID Diversificazione linfociti B e T Si crea durante maturazione attraverso ricombinazione casuale → contribuiscono diversi meccanismi genetici  Diversità combinatoriale = diverse combinazioni di segmenti genici V(D)J portano a produzione di diversi recettori per antigene Non tutte le possibili combinazioni hanno stessa probabilità di realizzarsi: num max possibile di combinazioni va a 1 a 3 milioni  Diversità giunzionale = rimozione o aggiunta nucleotidi tra terminazioni dei segmenti V, D e J al momento della loro ricongiunzione, aumentando notevolmente diversificazione! Enzima transferasi terminale di deossinucleotidi (enzima TdT) aggiunge max 20 nucleotidi N, soprattutto nelle catena pesante delle Ig e nelle catene β e γ del TCR In topi knockout per TnT diversificazione molto più limitata 107 recettori per antigene espressi da linfociti Clinica: determinando seq delle regioni giunzionali dei geni per Ig o TCR si può stabilire se si tratta dell’espansione di un singolo clone (neoplasia) o di cloni diversi (proliferazione non neoplastica) → questo perché ogni clone linfocitario esprime un’unica regione CDR3 (seq nt nel sito di ricombinazione fa da marcatore specifico) Sviluppo dei linfociti B Sviluppo linfocita B maturo a partire da precursore linfoide impiega 2-3 giorni Stadi dello sviluppo dei linfociti B Ogni stadio caratterizzato da specifici marcatori di superficie e espressione di uno specifico profilo Ig 1. Stadio pro-B Primo progenitore midollare orientato verso linea B è chiamato pro-B → non producono Ig, ma esprimono molecole di superficie CD10 e CD19 (tipiche di linfociti B). Espresse in questa fase anche Rag-1 e Rag-2 In questa fase: Formazione esone VDJ riarrangiato (catena pesante) Enzima TdT espresso più abbondantemente durante stadio pro-B, ovvero durante ricombinazione VDJ al locus delle Ig pesanti → livelli TdT si riducono prima che ricombinazione VJ del gene per catena leggera sia completata Gene per catena pesante riarrangiato vien trascritto per produrre trascritto primario che include: ▪ Esone VDJ riarrangiato ▪ Esoni Cμ Trascritto primario va incontro a splicing → mRNA processato per la catena μ NB: affinché riarrangiamento sia produttivo, nucleotidi aggiunti o rimossi a liv delle giunzioni devono essere multipli di 3 → solo 1/2 di linfociti pro-B porta a termine riarrangiamento del locus per catena H produttivo! Diversità giunzionale è la causa della max variabilità in corrispondenza delle giunzioni delle regioni V e C che formano la terza regione ipervariabile (CDR3) → ha maggiore variabilità rispetto a CDR1 e 2 Iodice Serena UniBS 75 NB: solo linfociti che esprimono Ig di mb funzionanti ricevono segnali da parte di BCR per sopravvivenza Linfociti B immaturi che riconoscono con alta affinità antigeni self indotti a modificare la loro specificità tramite EDITING RECETTORIALE = riconoscimento antigeni self causa riattivazione geni RAG → riarrangiamento → produzione nuova catena leggera → ora linfociti esprimono nuovo recettore revisionato non autoreattivo SE editing non riesce a generare riarrangiamento di catena leggera κ produttiva in-frame su entrambi i cromosomi → riarrangiamento di catena leggera λ (prima su un cromosoma, se fallisce si prova sull’altro) Linfociti B che esprimono catene λ spesso derivano da linfociti B immaturi che erano autoreattivi SE editing non ha successo (neanche su catena λ): SELEZIONE NEGATIVA e morte per apoptosi Editing recettoriale e selezione negativa responsabili di mantenimento tolleranza verso antigeni self nel midollo Quando linfocita B immaturo diventa linfocita B maturo (ha passato selezione) → riconoscimento antigene induce proliferazione e differenziazione (non più apoptosi o editing recettoriale) Sviluppo dei linfociti T Sviluppo linfociti T maturi a partire da progenitori specifici avviene grazie a: ▪ Riarrangiamento e espressione geni per TCR ▪ Proliferazione cellulare ▪ Selezione ▪ Acquisizione capacità funzionali Ruolo del timo Involuzione timo → graduale riduzione produzione linfociti T maturi (maturazione continua anche in adulto) Precursori dei linfociti T = progenitori multipotenti che arrivano al timo dal circolo ematico - Timociti più immaturi non esprimono TCR o corecettori CD8 o CD4 → Si trovano nel seno sottocapsulare e corticale esterna - Timociti nella corticale maturano e esprimono TCR αβ o γδ - Linfociti T αβ migrano nella midollare, maturano a linfociti T CD4+ o CD8+ e diventano ristretti per MHC di classe II o I - Linfociti maturi escono da timo e riversano nel torrente circolatorio Ambiente timico fornisce stimoli necessari a proliferazione e maturazione → stimoli derivano da altre cells: • Cells timiche epiteliali: formano reticolo di prolungamenti citoplasmatici attraverso cui passano timociti per raggiungere la midollare • Cells epiteliali timiche midollari: presentano antigeni self per selezione negativa • Cells dendritiche midollari: all’interfaccia corticomidollare e all’interno della midollare • Macrofagi: nella midollare Cells epiteliali e dendritiche timiche esprimono MHC di classe I e II Arrivo cells al timo e spostamenti nel timo guidati da chemochine e recettori per chemochine: o CCR9 espresso da progenitori di linfociti T → interagisce con CCL25 prodotta nella corticale timica o CCR7 su timociti lega chemochine CCL21 e CCL29 → guida spostamento da corticale a midollare o Linfociti T di nuova generazione esprimono recettore di sfingosina-1-fosfato → escono da midollo seguendo gradiente sfingosina-1-fosfato per entrare in circolo Cells timiche stromali (cells epiteliali incluse) secernono IL-7 Ritmo elevato di proliferazione nella corticale → singolo precursore origina ampia progenie, ma 95% muore per apoptosi (perché non supera i checkpoint o la selezione) Processi simili a quelli per linfociti B Iodice Serena UniBS 76 Stadi della maturazione dei linfociti T Nel timo umano fetale vengono espressi TCR γδ alla nona settimana, TCR αβ (<90%) alla decima. 1. Timociti doppio-negativi Timociti doppio-negativi = timociti corticali più immaturi appena giunti dal midollo osseo, contenenti geni per TCR ma NON esprimono TCR, CD4 o CD4, CD3 e catena Ϛ → chiamati anche linfociti pro-T Nei linfociti T αβ: prima si verifica riarrangiamento D-J al locus di catena β. Riarrangiamento da V a DJ β avvengono durante transizione linfociti T αβ da pro-T a pre-T → traduzione mRNA porta a origine catena β Vicinanza promoter a enhancer responsabile dell’elevata trascrizione del gene per catena β del TCR riarrangiato Aggiunta o eliminazione Nt: circa metà dei linfociti pre-T contengono multipli di 3 nt nel gene per catena β Cells che esprimono correttamente prima catena (β) del TCR hanno superato il primo checkpoint 2. Recettore pre-T Complesso pre-TCR = catena β + catena invariante (pre-Tα) + catena CD3 + proteina Ϛ Funzioni segnali (simili a recettore pre-B):  Segnali del pre-TCR responsabili di sopravvivenza di linfociti pre-T  Contribuiscono a espansione proliferativa  Promuovono ricombinazione locus per catena α  Guidano passaggio timociti da stadio doppio-negativo a doppio-positivo  Inibiscono ulteriori riarrangiamenti locus per catena β su allele non riarrangiato → esclusione allelica Ipotesi: segnali trasdotti da pre-TCR generati in modo antigene-indipendente dopo suo corretto assemblaggio (come i pre-BCR) Trasmissione segnale da parte di pre-TCR grazie a tirosin-chinasi citosoliche e proteine adattatrici Mutazione e mancanza componenti del complesso pre-TCR (sopratt gene CD3ε) causa SCID Mutazioni gene per Lck causano assenza solo di linfociti CD4+ → necessitano segnali Lck più forti dei CD8+ 3. Timociti doppio-positivi Timociti doppio-positivi = linfociti che esprimono sia CD4 sia CD8 → espressione essenziale per successiva maturazione e riarrangiamento geni per catena α del TCR Nel locus per catena α esclusione allelica scarsa → riarrangiamento produttivi di TCR α possono verificarsi su entrambi i cromosomi → linfocita esprimerà due catene α → linfocita con 2 TCR (2 diverse catene α ma stessa β) Riarrangiamento gene catena α provoca delezione locus per catena δ → direzionamento irreversibile verso αβ Espressione TCR α in mb porta a formazione TCR αβ completo: espresso in associazione con CD3 e catena Ϛ 4. Timociti singolo-positivi Linfociti doppio-positivi con TCR αβ completo maturano in linfociti T CD4+ o CD8+ (timociti singolo-positivi) In risposta a successive stimolazioni da parte di antigene durante maturazione, linfociti T CD4+ e CD8+ acquisiscono proprietà funzionali Solo metà dei linfociti esprimerà catena β Grazie a picco di espressione tardiva di RAG → riarrangiamento segmenti V e J (segmento D) A questo punto espressione geni RAG cessa Iodice Serena UniBS 77 Timociti in grado di riconoscere MHC di classe II diventano linfociti T CD4+:  Capacità di produrre citochine in risp a stimolazione antigene  Espressione molecole effettrici (es. ligando CD40) responsabili di attivazione linfociti B, DC e macrofagi Timociti in grado di riconoscere MHC di classe I diventano linfociti CD8+:  Capacità di produrre molecole in grado di uccidere altre cellule Timociti maturi singolo-positivi vanno nella midollare del timo e poi nei tessuti linfoidi secondari Selezione di linfociti T αβ ristretti per MHC Selezione dipende da riconoscimento di antigeni (complesso MHC-antigene) nel timo Repertorio immaturo (non selezionato) = cells T dotate di TCR che riconoscono qualsiasi antigene proteico presentato da molecole MHC (proprie o estranee) → T effettori utili sono solo quelli specifici per peptidi non-self presentati da molecole MHC self Selezione positiva: repertorio linfociti T ristretti per MHC Selezione positiva = timociti con TCR che legano a bassa affinità complesso MHC-peptidi self stimolati a sopravvivere e differenziarsi Morte per deprivazione = timociti con recettore che non riconosce MHC self, indotti a morte per apoptosi Teorie per spiegare corretto accoppiamento corecettori con TCR che riconoscono appropriata molecola MHC:  Modello stocastico: cells che riconosce molecola MHC di classe I (self) può casualmente differenziarsi in: - Linfocita CD8+ → esprimendo corecettori corretti può sopravvivere - Oppure linfocita CD4+ → non essendo corecettore corretto non riceve segnali di sopravvivenza  Teoria educativa: TCR forniscono segnali che promuovono attivamente espressione corecettore appropriato, interrompendo espressione dell’altro corecettore. Dimostrato che linfocita doppio-positivo esprime elevati livelli di CD4 e bassi livelli di CD8. - TCR ristretto per MHC di classe I: riconoscimento specifico antigene self provoca segnale debole (per bassi livelli di CD8) → segnali deboli attivano FdT (Runx3) che mantengono fenotipo CD8+ regolando positivamente espressione gene per CD8 e negativamente del gene per CD4 - TCR ristretto per MHC di classe II: riconoscimento antigene self provoca segnale forte → segnali forti attivano FdT GATA3 che spinge differenziazione verso CD4+ e repressore ThPoK che impedisce espressione geni CD8 Peptidi associati a MHC su cells epiteliali timiche→ duplice ruolo nella selezione positiva:  Stabilizzano espressione molecole MHC su sup cellulare  Influenzano specificità di linfociti T selezionati Selezione positiva guidata da debole riconoscimento antigeni self permette produzione repertorio linfociti T maturi specifici per antigeni non-self perché permette a cloni T che riconosco debolmente self di sopravvivere → molti di questi linfociti una volta maturi riconosceranno casualmente anche peptidi estranei con suff affinità Selezione negativa: tolleranza centrale Selezione negativa = recettori che riconoscono con elevata affinità complesso MHC-recettore vengono uccisi Anche riconoscimento antigene ha ruolo nella selezione positiva, infatti anche linfociti T maturi hanno capacità di riconoscere peptidi self Iodice Serena UniBS 80 Antigene presentato principalmente a linfociti T da DC: • Antigeni che superano barriere epiteliali o prodotte da tessuti → catturati da DC e trasportati a linfonodi • Antigeni che entrano in circolo → catturati da DC nella milza DC migrano negli organi linfoidi secondari (nelle aree T) grazie a chemochine e recettore CCR7 Altre cellule possono presentare antigeni a linfociti T: - Linfociti B, nelle risposte umorali presentano antigeni ai T helper - Macrofagi, nelle risposte cellulo-mediate presentano antigeni a linfociti T helper - Qualunque cell nucleata può presentare antigeni a linfociti CTL Costimolazione Segnali costimolatori forniti da molecole espresse dalle APC → collaborano a indurre attivazione linfociti T In assenza di costimolazione: linfociti T che riconoscono antigene non si attivano o entrano in una condizione di prolungata incapacità di rispondere all’antigene Molecole costimolatorie B7 Recettore CD28 lega molecole costimolatorie B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) espresse su sup delle APC attivate Nell’uomo, CD28 epresso da 90% linfociti T CD4 e metà dei linfociti T CD8 Espressione molecole costimolatorie B7 aumentata da prodotti microbici e incrementata da rispi imm innate! → in modo che linfociti T vengano attivati solo quando necessario B7 espresse da APC attivate da prodotti microbici che legano TLR o da citochine (INF-γ) → ruolo immunità innata nel potenziamento di risposte adattative Feedback positivo: linfociti T CD4+ attivati stimolano espressione molecole costimolatorie B7 su APC tramite via di amplificazione segnale (dipendente da CD40) → potenziamento risposte linfociti T Adiuvanti = prodotti microbici o molecole prodotte da antigeni microbici che stimolano azione immunità innata; funzionano stimolando espressione di molecole costimolatorie sulle APC [APC non attivate possono presentare antigeni self a linfociti T potenzialmente autoreattivi, ma questi in presenza di bassi liv di molecole costimolatorie non vengono attivati] Anche mantenimento linfociti Treg dipende da costimolazione B7:CD28 Amplificazione vie di trasduzione del segnale: Segnali innescati da attivazione CD28 agiscono in cooperazione con riconoscimento antigene per promuovere sopravvivenza, proliferazione e differenziazione → segnali costimolatori amplificano vie di trasduz segnale: Attivazione PI3k nella coda citoplasmatica di CD28 → attiva chinasi Akt → permette sopravvivenza linfociti T e stimola enzimi Itk e PLCγ → provocano aum concentrazione calcio intracell CD28 contribuisce anche a attivazione chinasi JNK MAP → potenziamento attivazione NF-kB Attivazione di questi segnali determina: a. Espressione molecole antiapoptotiche (Bcl-2 e Bcl-XL)→ aumentano sopravvivenza cellulare b. Stimolazione attività metabolica Dove presentano peptidi associati alle loro MHC e esprimono molecole costimolatorie Glicoproteine (omologhe) integrali di mb con 2 domini Ig extracell Omodimero (catene unite da S-S) con un dominio Ig extracell. Porzione citoplasmatica contiene residui di tirosina e prolina → legano proteine adattatrici e secondi messaggeri Iodice Serena UniBS 81 c. Produzione citochine (IL-2, IL-4) d. Differenziazione linfociti T naive in cells effettrici e di memoria Altri costimolatori e coinibitori  Recettori costimolatori → stessa funzione di CD28 o ICOS (ligando ICOS-L): espresso da DC, linfociti B e altre cells. Necessario per sviluppo e attivazione linfociti T helper follicolari  Recettori inibitori → espressi in seguito a attivazione linfociti T, ne limitano la risposta o CTLA-4: inibitore competitivo di CD28, si lega a B7 con maggiore affinità o PD-1: attiva segnali che bloccano segnali di attivazione generati da TCR e da CD28 Altre vie di costimolazione ▪ Proteine della fam CD2 ▪ Integrine ▪ Famiglia del recettore per TNF (TNFR), es: - OX40 (espresso da linfociti T CD4 e CD8) → promuove sopravvivenza cellulare e prolunga risposta immunitaria. Ligando OX40-L espresso da APC attivate - 4-1BB e CD27 (espressi da linfociti T memoria e regolatori) - CD40 (espresso da macrofagi, linfociti B e DC) lega CD40-L (espresso da linfociti T attivati) → aumento espressione molecole B7 su APC e secrezione citochine (come IL-12) Licensing = fenomeno in cui linfociti T attivati rendono capaci le APC di stimolare in modo più efficace le risposte immunitarie → CD40 non funziona direttamente da molecola costimolatoria per linfociti T, ma la sua attivazione amplifica indirettamente risposte T Utilizzi terapeutici della costimolazione Proteina di fusione CTLA-4-Ig = dominio extracell di CTLA-4 + porzione Fc di IgG umane Anticorpi che bloccano recettori inibitori CTLA-4 e PD-1 → riducono signaling inibitorio e esaltano attivazione linfociti T permettendo efficienti risposte contro il tumore (utilizzo immunoterapico contro alcuni tumori) Risposte funzionali dei linfociti T Dopo riconoscimento antigene, linfociti T vanno incontro a: a. Modificazioni espressione molecole di membrana b. Secrezione citochine c. Proliferazione (espansione clonale) d. Differenziamento in linfociti T effettori e della memoria Modificazioni espressione molecole di membrana Sono meglio definite nei linfociti T CD4+ e comprendono: • CD69: si lega a recettore per sfingosina-1-fosfato (S1PR1), riducendone espressione → ritenzione linfociti T attivati negli organi linfoidi, finché linfocita T è attivato e espressione CD69 diminuisce Meno dipendenti da costimolazione da parte di B7:CD28 → possono rispondere a antigeni su APC nei tessuti non linfoidi che esprimono bassi o nulli liv di B7 Lega con alta affinità molecole B7 bloccandone interazione con CD28 Per aumentare emivita proteina in vivo Trattamento artrite reumatoide e rigetto Iodice Serena UniBS 82 • CD25 (IL-2Rα) = una delle catene del recettore di IL-2 (fattore di crescita di linfociti T) → espressione CD25 permette a linfociti T di rispondere a IL-2 • CD40L: consente a linfociti T CD4+ di esercitare la loro funzioni effettrici (coadiuvare azione macrofagi e linfociti B). Permette anche amplificazione risposte T con meccanismo a feedback positivo che stimola DC a diventare APC più efficaci • CTLA-4 descritto più avanti • Molecole di adesione e recettori per chemochine: necessarie per migrazione linfociti T nelle sedi periferiche di infezione o danno (es. integrine LFA-1, VLA-4, ligandi per E e P-selectina) • CD44: recettore per acido ialuronico → contribuisce a trattenere linfociti T effettori nei tessuti periferici Citochine nelle risposte immunitarie adattative Principalmente prodotte da linfociti T CD4+, ma anche linfociti T CD8+ e APC - Azione autocrina → prototipo di citochine prodotte da linfociti T autocrine è IL-2 - Azione paracrina Secrezione IL-2 e espressione IL-2R IL-2 = fattore di crescita importante per sopravvivenza, proliferazione e differenziazione linfociti T (CD4+ sopratt) Inizialmente infatti chiamata TCGF (fattore di crescita delle cells T) Produzione IL-2 rapida e transitoria: o Inizio entro 1-2 ore da riconoscimento antigene o Picco a 8-12 ore o Esaurimento entro 24 ore Liberata nella sinapsi immunitaria → dove si trova anche IL-2R Struttura IL-2: Glicoproteina globulare formata da 4 α-eliche Recettori IL-2R espressi:  In modo transitorio su sup linfociti T naive e attivati  In modo costitutivo sui Treg Struttura IL-2R: 3 proteine associate (non covalentemente) ▪ IL-2Rα (CD25) → specifica solo per IL-2 ▪ IL-2/15Rβ → si trova nei recettori per IL-2 e IL-15 ▪ γC → comune a diverse citochine (IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21) Linfociti T non attivati esprimono bassi livelli IL-2R → in forma dimerica (catene β e γ) → in seguito a attivazione aumenta espressione catena α → formazione complesso IL-2Rαβγ ad alta affinità Meccanismo a feedback positivo: IL-2 prodotta in risposta a riconoscimento antigene stimola espressione di IL- 2Rα → risposta T si autoamplifica In seguito a stimolazione continuata, IL-2Rα si distacca da mb e aumenta la sua concentrazione sierica → marker di stimolazione potente e continuata Funzioni di IL-2  Stimola sopravvivenza, proliferazione e differenziamento linfociti T attivati da antigene: Da essi prodotta in seguito a riconoscimento antigene e legame con molecole costimolatorie Trasducono segnale attraverso via JAK-STAT Linfociti T attivati da antigene stimolati da concentrazioni molto più basse di IL-2 e proliferano più efficientemente (rispetto a quelli che non hanno riconosciuto antigene) Iodice Serena UniBS 85 Differenziazione e funzione linfociti T CD4+ effettori Caratteristiche generali Sequenza di eventi delle risposte CD4+: 1. Attivazione iniziale in organi linfoidi secondari → formazione linfociti effettori e della memoria 2. Migrazione linfociti effettori ai siti di infezione 3. Eliminazione patogeni nei tessuti periferici Migrazione grazie a molecole di adesione e recettori per chemochine Linfociti T helper follicolari (TFH)= una parte di linfociti T CD4+ migrano nei follicoli senza uscire da organo linfoide secondario → azione di supporto a linfociti per produzione anticorpi NB: linfociti T CD4+ effettori = collegamento tra riconoscimento specifico di microbi e attivazione di altri leucociti (es. macrofagi) preposti alla loro eliminazione! Fagocitosi e eliminazione microbi sono azioni dell’immunità innata, ma linfociti T aumentano significativamente questa funzione dei fagociti → linfociti CD4+ attivano fagociti tramite molecole sulla sup cellulare (CD40L) e citochine → permettono eradicazione di microbi che resistono a meccanismi di immunità innata (es. microbi che si replicano nei macrofagi) Ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) = quando risposta T provoca lesione, poiché infiammazione (reclutamento e attivazione leucociti) può causare danni a tessuti normali Tipi di linfociti T CD4+ (effettori)  TH1  TH2  TH17  TFH (T helper follicolari) trattati più avanti  Treg → effettori, ma controllano e regolano risposte contro self e non self (trattati più avanti) Proprietà dei linfociti TH1, TH2 e TH17 Diverse popolazioni di linfociti T CD4+ effettori producono citochine diverse, stimolano reazioni diverse contro patogeni diversi e sono coinvolti in patogenesi di malattie immunomediate diverse! Diverse citochine prodotte dipendono dai FdT che vengono espressi → citochine distintive:  TH1 produce INF-γ  TH2 produce IL-4, IL-5 e IL-13  TH17 produce IL-17 e IL-22 Polarizzazione = alcune citochine stimolano sviluppo e espansione della popolazione che le produce, e inibisce sviluppo delle altre popolazioni effettrici → amplificazione risposta Diverse popolazioni hanno diverse caratteristiche di homing → espressione di diversi recettori per chemochine:  TH1 esprimono recettori CXCR3 e CCR5: abbondanti in focolai di infezione dove agente infettivo ha evocato forte risposta immunitaria innata (batteri e virus) Esprimono anche ligandi di E-selectina e P-selectina  TH2 esprimono recettori CCR3, CCR4 e CCR8: riconoscono chemochine espresse dalle mucose durante infezioni da elminti o reazioni allergiche VLA-4, VLA-5, CD44 Solo linfociti che nel tessuto periferico incontrano antigene presentato da APC selettivamente trattenuti nei siti extravascolari Tre principali linfociti T CD4+ effettori → responsabili difesa contro agenti patogeni e coinvolti nei danni tissutali Iodice Serena UniBS 86  TH17 esprimono recettore CCR6: lega chemochina CCL20 prodotta da cells tissutali e macrofagi durante infezioni batteriche e fungine Diverse malattie infiammatorie causate da reazioni eccessive di popolazioni di linfociti T helper: ▪ TH1 e TH17 → ruolo in malattie autoimmuni caratterizzate da infiammazione ▪ TH2 → coinvolti in reazioni allergiche [Profili citochinici: Molti effettori T CD4+ producono citochine diverse da quelle che caratterizzano una sola popolazione, oppure ne producono solo alcune → espansione nomenclatura (es. TH9, TH22)] Possibilità che linfociti T CD4+ passino da un profilo citochinico ad un altro tramite modifiche epigenetiche Sviluppo dei linfociti TH1, TH2 e TH17 Caratteristiche principali del differenziamento: ❖ Citochine che guidano lo sviluppo prodotte da APC e altre cells immunitarie (NK e mastociti) nell’organo linfoide secondario. Microbi diversi causano produzione di citochine diverse ❖ Anche stimoli diversi da citochine influenzano differenziamento: affinità del recettore, quantità antigene, natura APC e patrimonio genetico ❖ Diversi profili di citochine controllati da fattori di trascrizione, attivati da stimoli che originano in seguito a attivazione → polarizzazione: loci genetici delle citochine vanno incontro a modificazioni epigenetiche (ereditate dalla progenie) di rimodellamento della cromatina, rendendo loci accessibili a RNA polimerasi e FdT (mentre loci delle altre citochine diventano inaccessibili) ❖ Polarizzazione: ogni popolazione produce citochine che promuovono il proprio sviluppo e inibiscono sviluppo di altre popolazioni → meccanismo di amplificazione Polarizzazione massima durante infezioni croniche in cui stimolazione è prolungata ❖ Differenziamento popolazioni promosso da microbi che sono bersaglio di quella popolazione: o Differenziamento in TH1 promosso da microbi intracellulari o In TH2 da parassiti elmintici o TH17 da batteri e funghi Linfociti TH1 Si generano in risposta a microbi ingeriti che si sono evoluti per replicarsi all’interno dei fagociti Sviluppo linfociti TH1 Differenziamento in TH1 guidato da citochine IL-12 e INF-γ in risposta a microbi che attivano DC, macrofagi e NK Microbi stimolano NK a produrre INF-γ → induce produzione TH1 e agisce su DC e macrofagi aumentando secrezione IL-12 → differenziamento in TH1 → TH1 secernono INF-γ → amplificazione differenziamento e inibizione differenziamento in TH1 e TH17 (polarizzazione) Potenziamento produzione IL-12 grazie a legame CD40L (sui linfociti T attivati) con CD40 (su APC) INF-γ e IL-12 stimolano differenziamento attivando FdT T-bet, STAT1 e STAT4: Linfociti T CD4+ naive riconoscono antigene e INF-γ → attivazione STAT1 → stimola espressione T-bet → promuove produzione INF-γ → amplificazione Batteri intracellulari, parassiti, virus Stimolano reazioni innate associate a produzione di IL-12, IL-18 e INF di tipo I Promuovono sviluppo di linfociti TH1: Iodice Serena UniBS 87 IL-12 si lega a recettori espressi da linfociti T CD4+ attivati → stimola produzione STAT4 → aumenta ulteriormente produzione INF-γ → amplificazione Funzioni linfociti TH1 Funzione principale: attivare macrofagi a fagocitare e eliminare microbi Coinvolti nella reazione DTH → manifestazioni infiammatorie e sviluppo granulomi Linfociti TH1 producono: • INF-γ • TNF e varie chemochine → reclutamento leucociti e risposta immunitaria • IL-10 → inibiscono DC e macrofagi: regolazione a feedback negativo delle risposte T INF-γ o INF di tipo II Citochina principale responsabile di attivazione macrofagi (non ha molto in comune con INF di tipo I) Struttura: proteina omodimerica della famiglia delle citochine di tipo II Prodotto da: ▪ Linfociti TH1 → in risp a riconoscimento antigene e potenziato da IL-12 e IL-18 (immunità adattativa) ▪ Cells NK → in risposta a molecole sulla sup di cells infettate o in risposta a IL-12 (immunità innata) ▪ Linfociti T CD8+ Recettore per INF-γ: due catene polipeptidiche omologhe INFγR1 e INFγR2 INF-γ lega le due catene del recettore → dimerizzano → attivazione PK JAK1 e JAK2, associate a catene recettoriali → fosforilazione STAT1 → induce trascrizioni diversi geni → produzione proteine viste più avanti Funzioni INF-γ:  Attiva macrofagi a eliminare microbi fagocitati → attivazione classica macrofagi (attivazione alternativa)  Promuove differenziazione linfociti CD4+ in TH1 e inibisce sviluppo verso TH2 e TH17 → amplificazione  Stimola espressione proteine che contribuiscono a migliore presentazione antigene e attivazione linfociti T (molecole MHC, proteasoma, molecole costimolatorie B7)  Agisce su linfociti B, promuovendo scambio isotipico verso IgG → IgG legano recettori Fcγ espressi da fagociti e attivano complemento → favoriscono fagocitosi di microbi opsonizzati Mutazioni recettore INF-γR: maggiore suscettibilità a infezioni Attivazione classica dei macrofagi Macrofagi attivati con via classica definiti M1 Linfociti TH1 stimolati da antigene esprimono CD40L e secernono INF-γ → CD40L si lega a CD40 → attivazione FdT NF-kB e AP-1, mentre INF-γ attiva FdT STAT1 → FdT stimolano espressione enzimi nei fagolisosomi: iNOS (NO sintasi inducibile) e ossidasi fagocitica → produzione NO, ROS e enzimi lisosomiali (microbicidi) Sindrome da iper-IgM legata a cromosoma X causata da mutazioni ereditari di CD40L Macrofagi attivati coinvolti in diverse reazioni di difesa: stimolano infiammazione attraverso secrezione citochine, chemochine e mediatori lipidici (fattore di attivazione piastrinica, prostaglandine e leucotrieni) → potenziano ulteriormente reclutamento monociti per favore eliminazione agente patogeno Possono essere rilasciate nel tessuto circostante → danni tissutali (in condizioni normali il danno è limitato) Iodice Serena UniBS 90 Linfociti TH17 Coinvolti nel reclutamento di neutrofili e monociti nei siti di infezione e infiammazione → eliminazione batteri e funghi (e altri microbi uccisi da fagociti). Ruolo nelle malattie infiammatorie Sviluppo linfociti TH17 Batteri e funghi agiscono su DC → riconoscimento glucani fungini da parte di Dect-1 (espresso su DC) → produzione citochine proinfiammatorie IL-6, IL-1, IL-23 → stimolano differenziamento linfociti TH17 Citochina antinfiammatoria TGF-β promuove sviluppo linfociti TH17 se secreta in presenza di mediatori IL-6, IL-1 Differenziamento TH17 inibito da INF-γ e IL-4 → soppresso in presenza di risposte TH1 e TH2 TGF-β, IL-1 e IL-6 inducono produzione FdT RORγt (codificato da gene RORC) e STAT3 → collaborano per originare risposta TH17 Linfociti TH17 abbondanti nelle mucose, soprattutto del tratto gastrointestinale Funzioni linfociti TH17 Funzione generale: reclutamento neutrofili nei siti di infezione Azioni proinfiammatorie dipendono principalmente da produzione di IL-17 IL-17 Famiglia di 6 citochine atipiche → non mostrano elevati livelli di omologia con le alte citochine (né i recettori) IL-17A prodotta da: • Linfociti TH17 • Cells linfoidi innate • Alcuni linfociti T γδ CD8+ Recettori per IL-17: complessi multimerici espressi da ampio spettro di tipi cellulari Funzioni IL-17:  Promuove infiammazione da parte di neutrofili → ingeriscono e uccidono batteri e funghi - Stimolando produzione chemochine e altre citochine che reclutano neutrofili nel sito di attivaz - Aumentando sinesi di G-CSF → aum produzione neutrofili  Stimola produzione sostanze antimicrobiche (es. defensine) da parte di diversi tipi cellulari IL-22 Famiglia di citochine di tipo II (come IL-10) Prodotta da: • Linfociti TH17 • Cells NK • Cells linfoidi innate Promuovono fasi iniziali differenziamento Ruolo in proliferazione e mantenimento linfociti TH17 effettori Combatte infezioni intestinali, anche grazie a microambiente microbico locale (batteri commensali) Funzioni immunologiche dovute principalmente a IL-17A Prodotta nei tessuti epiteliali (cute e tratto gastrointestinale) Iodice Serena UniBS 91 Funzioni IL-22:  Mantiene integrità epiteliale o Promuovendo funzioni di barriera meccanica degli epiteli o Stimolando riparazione o Inducendo produzione peptidi antimicrobici  Contribuisce a infiammazione stimolando produzione chemochine → coinvolta nel danno tissutale IL-21 Prodotta da: • Linfociti T CD4+ (compresi TH17) • Linfociti TFH Recettore di IL-21: recettore per citochine di tipo I formato da catena specifica + subunità γC Attiva via di traduzione JAK/STAT (STAT3) Funzioni IL-21:  Generazione linfociti TFH  Attivazione linfociti B nei centri germinativi  Differenziazione linfociti TH17 → meccanismo autocrino di amplificazione delle risposte TH17  Amplificazione risposte di proliferazione e differenziazione cells NK e linfociti T CD8+ Ruolo linfociti TH17 nella difesa dell’ospite  Promuovono infiammazione caratterizzata da infiltrato neutrofilico → neutrofili fagocitano e eliminano batteri extracellulari Sindrome di Giobbe (o sindrome da iper IgE) = mutazioni gene che codifica per STAT3 e conseguente deficit sviluppo linfociti TH17 → aumentata sensibilità alle infezioni cutanee causate da funghi e batteri  Patogenesi di molte malattie infiammatorie: psoriasi, patologie infiammatorie dell’intestino, artrite reumatoide, sclerosi multipla Trattamento con anticorpi bloccanti di linfociti TH17 funziona solo per psoriasi ma non per le altre  Aiutano a mantenere integrità barriere epiteliali, tramite: o Stimolazione peptidi antimicrobici che limitano passaggio dei microbi attraverso barriere o IL-22 promuove rigenerazione epiteli Altri tipi di linfociti T  Linfociti T γδ  Cells natural killer T (NKT)  Cells T invarianti associate a mucose (MAIT) Caratteristiche comuni: ❖ Riconoscono num limitato di antigeni ❖ Antigeni riconosciuti sono spesso di natura non proteica ❖ Possono rispondere anche a citochine prodotte nei siti di infezione Funzioni comuni:  Difesa precoce contro microbi che infestano tessuti epiteliali  Monitoraggio e eliminazione cells danneggiate o infettate  Produzione citochine che regolano risposte immunitarie adattative Sono il crocevia tra immunità innata e adattativa! Iodice Serena UniBS 92 Linfociti T γδ Struttura: eterodimero formato da catene γ e δ (omologhe a catene α e β) Si associa a CD3 e a proteina Ϛ e trasducono stessi segnali di eterodimeri αβ Abbondanza nei tessuti epiteliali di alcune specie → es. nei topi >50% linfociti della mucosa intestinale sono γδ Linfociti γδ negli organi linfoidi presentano differenziazione maggiore di quelli negli epiteli Caratteristiche generali: ❖ Non sono ristretti per MHC ❖ Non riconoscono antigeni di nauta proteica ❖ Alcuni riconoscono molecole fosforilate di microbi presentati da MHC classe I “non convenzionali” ❖ Altri riconoscono proteine o antigeni non proteici che non richiedono presentazione da parte di APC ❖ Molti sono stimolati da heat shock proteins di origine batterica Funzioni biologiche:  Secrezione citochine (es. IL-17 per primi)  Eliminazione cells infettate Cells natural killer T = linfociti T che esprimono proteine caratteristiche delle cells NK (es. CD56). Presentano TCRαβ Alcuni NKT hanno limitata variabilità → chiamati iNKT (invarianti) Tutti TCR di NKT riconoscono lipidi associati a molecole CD1 (simili a MHC di classe I) Funzioni:  Produzione citochine (come IL-4 e INF-γ) → regolano risposte adattative  Aiutare linfociti B della zona marginale a produrre anticorpi diretti contro antigeni lipidici  Azione protettiva contro micobatteri Cells MAIT Esprimono TCRαβ invariante Rappresentano il 50% dei linfociti T presenti nel fegato → seconda importante barriera nei confronti della flora intestinale che ha superato barriera epiteliale intestinale ed è entrata in circolo Attivate da:  derivati della riboflavina microbica presentati su molecola MR1 (simile a MHC di classe I)  direttamente da citochine IL-12, IL-18 Funzioni:  Riconoscono metaboliti fungini e batterici della via di sintesi della riboflavina → presentati da MR1  Secrezione citochine infiammatorie (INF-γ, TNF)  Citotossicità verso cells infettate MA topi privi di γδ non hanno immunodeficienze Iodice Serena UniBS 95 Uccisione dettata da specificità per l’antigene (legato a MHC di classe I) → per proteggere cells adiacenti che non esprimono antigene Processo di uccisione: → passaggi controllati da specifiche interazioni molecolari 1. Riconoscimento antigene 2. Attivazione CTL 3. Rilascio del corpo letale che uccide cellula bersaglio 4. Distacco CTL da cellula bersaglio Fasi 1 e 2: riconoscimento antigene e attivazione CTL Per essere riconosciuti da CTL, cells bersaglio devono esprimere molecole MHC di classe I associate a antigene peptidico → si lega a TCR e a corecettore CD8 → formazione sinapsi immunologica: forma un anello chiusp Formazione sinapsi immunologica stabilizzata da integrine LFA-1 (CTL) che legano ICAM-1 (su sup cells bersaglio) Distinguibili 2 regioni all’interno dell’anello: ▪ Regione contenente molecole deputate a trasduzione segnale (include TCR, PKC-θ e Lck) ▪ Regione laterale secretoria Interazioni determinano avvio sequenza di segnali biochimici che portano ad attivazione CTL CTL CD8+ esprimono anche altri recettori oltre a TCR, normalmente espressi da NK: • Recettori KIR: riconoscono MHC di classe I su cells bersaglio (ma non sono specifici per nessun complesso MHC-antigene) e trasducono segnali inibitori → impediscono a CTL di uccidere cells normali • Recettore NKG2D: riconoscono molecole MIC-A, MIC-B e ULBP (prot simili a MHC di classe I) espresse in seguito a danno cellulare Fasi 3 e 4: uccisione cells bersaglio e distacco Proteine dei granuli penetrano nella cellula bersaglio e ne causano morte in 2-6 ore (anche se CTL si stacca) CTL riconosce antigene → TCR generano segnali che portano a riorganizzazione citoscheletro → granuli citoplasmatici trasportati lungo i microtubuli → granuli concentrati nella regione della sinapsi → mb granuli si fonde con mb plasmatica → esocitosi nell’anello sinaptico Proteine contenute nei granuli:  Perforina: facilita rilascio granzimi nel citosol di cell bersaglio Può polimerizzare formando pori nella mb bersaglio → internalizzazione granzimi  Granzimi (A, B e C) = serin-proteasi: attivano con taglio proteolitico le caspasi → apoptosi cell bersaglio  Serglicina: mantiene in stato inattivo perforine e granzimi  Granulisina: altera permeabilità mb bersaglio → contribuisce a uccisione cells tumorali o infette CTL usano meccanismo di uccisione indipendente da granuli: interazione tra molecole su mb CTL e su cells bersaglio Dopo aver sferrato il “colpo letale” CTL si allontana prima di inizio processo di morte cell bersaglio NB: CTL non vengono danneggiati perché:  Esocitosi granuli diretta contro cell bersaglio  Granuli contengono catepsina B → degrada perforine nelle vicinanze dei CTL Selettività d’azione: dovuta a secrezione localizzata molecole citotossiche nella sinapsi immunologica CTL attivati esprimono proteina ligando del Fas (FasL) → si legano a recettore di morte Fas → attivazione caspasi → apoptosi cells bersaglio Iodice Serena UniBS 96 Linfociti T CD8+ producono INF-γ → citochina responsabile dell’attivazione di macrofagi Responsabili reazioni infiammatorie, es: reazioni cutanee di ipersensibilità causate da sostanze chimiche ambientali → linfociti T CD8+ che producono INF-γ reclutati a livello tissutale in num maggiore e più velocemente di linfociti T CD4+ Oppure causa di malattie infiammatorie croniche della pelle, es: psoriasi Ruolo linfociti T CD8+ CTL nella difesa dell’ospite Eradicazione infezioni da microbi intracellulari, quando:  Virus si replica in cells prive di capacità microbicide (es. epatite che infetta cells epatiche)  Nei fagociti, microbi escono da fagolisosoma e vanno nel citosol (es. batteri Mycobacterium Tubercolosis e Listeria Monocytogenes) In alcune malattie infettive, uccisione di cells infettate da parte di CTL causa danno tissutale → es. nelle infezioni da epatite C e B cells epatiche uccise dai CTL e virus CTL possono contribuire a immunopatologia associata a infezioni virali comuni (es. influenza) Altri coinvolgimenti CTL: o Effettori nell’immunità contro tumori o Coinvolti nel danno tissutale o Malattie autoimmuni o Rigetto tessuti trapiantati Mutazioni gene della perforina: forma familiare di linfoistocitosi emofagocitica (malattia rara) → CTL non riescono a sferrare colpo letale → persistenza antigene → cronicizzazione produzione INF-γ → abnorme attivazione macrofagi → manifestazioni della malattia: splenomegalia causata da linfoitocitosi (aum macrofagi attivati) che fagocitano globuli rossi Iodice Serena UniBS 97 Attivazione linfociti B e produzione anticorpi Risposte umorali iniziano quando linfocita B riconosce antigene per cui è specifico in organi linfoidi secondari: Antigene lega IgM e IgD su sup linfociti B maturi → cascata segnali → proliferazione e differenziazione in plasmacellule → secrezione anticorpi con stessa specificità di quelli che hanno svolto la funz di recettore In una settimana: produzione fino a 5000 cells che producono fino a 1012 anticorpi/gg Risposte anticorpali: → in base a tipo di antigene  T-dipendenti: antigeni proteici → T helper aiutano produzione anticorpi e stimolano linfociti B della memoria. Risposte più lente ma più potenti e specifiche Linfociti B attivati producono anticorpi diversi da IgM: scambio isotipico della catena pesante Con il progredire della risposta, linfociti B attivati producono anticorpi con maggiore affinità per antigene: maturazione dell’affinità  T-indipendenti: antigeni multivalenti con seq ripetute (polisaccaridi) Risposte rapide e essenziali. si limitano ad anticorpi IgM a bassa affinità Diverse popolazioni di linfociti B rispondono a diversi antigeni: • Linfociti B follicolari risp ad antigeni proteici → risposte T-dipendenti • Linfociti B della zona marginale e B-1 (di mucose e peritoneo) riconoscono antigeni multivalenti con strutture antigeniche ripetute → risposte T-indipendenti Differenze non assolute Riconoscimento antigene e attivazione linfociti B Antigene catturato → trasportato in aree B di organi linfoidi secondari → inizio processo attivazione linfociti B Cattura e localizzazione antigene Antigeni possono entrare in contatto con linfociti B tramite vie diverse (caratteristiche diverse antigeni):  Maggior parte antigeni trasportata in linfonodi da vasi linfatici afferenti  Antigeni solubili <70kD raggiungono aree B grazie a condotti sottocapsulari  Microbi di grandi dimensioni e complessi antigene-anticorpo catturati da macrofagi nel seno sottocapsulare  Antigeni troppo grandi catturati nella regione midollare da DC residenti e trasportati nei follicoli  Antigeni che fanno parte di immunocomplessi legano recettori del complemento (CR2) espresso da linfociti B della zona marginale → poi trasferiti ai linfociti B follicolari  Antigeni polisaccaridici catturati da macrofagi della zona marginale della milza → poi presentati a linfociti B presenti in quest’area Antigene presentato a linfociti B integro (conformazione nativa): processamento da cells che lo presentano! Attivazione linfociti B Complesso BCR = Ig di mb associate a proteine Igα e Igβ Ruoli di BCR nell’attivazione: a. Aggregazione BCR (grazie a legame con antigene) genera segnali per attivazione cellula Trasduzione segnale: PK Src fosforilano tirosine dei domini ITAM delle catene Igα e Igβ → reclutamento e attivazione Syk Principale differenza con linfociti T