Trasformazione Genetica Batterica: Ciclo Litico, Trasduzione e Vettori di Clonaggio, Appunti di Biologia

Scarica Trasformazione Genetica Batterica: Ciclo Litico, Trasduzione e Vettori di Clonaggio e più Appunti in PDF di Biologia solo su Docsity! Genetica di batteri e virus( 1 Il / il 1 li 1 I / I 1 Il 1 I 1 I l ' La riproduzione può essere→ sessuata→ quando gli organismi usano i GAMETI ( (cellule APLOIDI DASESSUATA→ la cellula si divide e si originano dei cloni Nei batteri la riproduzione è asessuata . Tutte le cellule sono cloni della cellula iniziale , quindi non c'è VARIABILITÀ GENETICA durante la riproduzione . Tuttavia si sono sviluppati dei meccanismi per garantire un minimo di variabilità ; - TRASFORMAZIONE - CONIUGAZIONE - TRASDUZIONE TRASFORMAZIONE → ESPERIMENTO DI GRIFFITH (1928)→ Griffith usa 2 Ceppi di STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE , che genera una polmonite nei topi ; • CEPPO VIRULENTO → se entra in un topo questo muore di polmonite . Questo batterio ha un gene che gli dà una CAPSULA GELATINOSA come rivestimento , quindi il sistema immunitario non riconosce il batterio e non produce una risposta immunitaria • CEPPO AVIRUUENTO→manca il gene della capsula ,il batterio nonè quindi " in incognito " e il sistema immunitario produce anticorpi . Griffith prende alcune cellule virulente e le uccide con il calore-> la cellula va in Disfacimento → mischia poi il materiale ottenuto con una soluzione contenente batteri avirulenti e inietta quello che ottiene nel topo→il topo muore . Dai polmoni di questo topo preleva del liquido e analizzandolo trova alcuni batteri avirulenti , ma anche batteri vivi VIRULENTI CON CAPSULA → questo significa che le cellule avirulente vive hanno inglobato DNA (contenente il ceppo della capsula) dal ceppo virulento distrutto , e quindi c'è stata una TRASFORMAZIONE GENETICA BATTERI→ hanno PARETE CELLULARE che dà RIGIDITÀ e sotto c'è la MEMBRANA CELLULARE. All' interno abbiamo un cromosoma circolare . Alcuni batteri presentano anche un'altra piccola molecola di DNA circolare, con 10 GENI all' incirca , chiamata PLASMIDE . I plasmidi portano delle CARATTERISTICHE ACCESSORIE . Ex→ plasmide Ri dà RESISTENZA AD ANTIBIOTICI CONIUGAZIONE→ PLASMIDE DELLA FERTILITÀ è in grado di far coniugare due batteri→ questo PLASMIDE F porta i geni per la sintesi del Pico sessuale ,un canale filamentoso proteico che mette in comunicazione il citoplasma delle due cellule , e per il TRASFERIMENTO DEL DNA .Con la coniugazione si ha il TRASFERIMENTO DI MATERIALE GENETICO da un ceppo a un altro e una conseguente VARIABILITÀ GENETICA nel ceppo ricevente. Quando la cellula duplica , duplica anche il plasmide → può capitare che il plasmide replichi più velocemente del cromosoma maggiore→ in tal caso la cellula può avere più plasmidi . Episana→ plasmide della fertilità Nella coniugazione abbiamo due cellule→ una F +( BATTERIO DONATORE, hail plasmide, e l'altra F- (batterio ricevente) . Il ceppo Ft produce il Pilo e il plasmide si replica con un meccanismo che LINEARizza una copia, che passa attraverso il Pilo e poi ritorna ciclica . La coniugazione si ha con FREQUENZA Bassa f- + ✗ F-→ f.++ ~> la cellula F-è diventata Ft , è VARIATA GENETICAMENTE può capitare che l'episana si integri nel cromosoma maggiore con un processo di CROSSING-OVER . I geni rimangono gli stessi , ma il nuovo ceppo è HFR→AD ALTA FREQUENZA DI RICOMBINAZIONE . La cellula HFR coniuga un F . _ Anello del DNA ( episana + cromosoma maggiore si rompe in uno dei due punti di attacco dell'episoma . Si forma il pelo e tutto il cromosoma si linearizza . L'estremità che rimane indietro è l'episana. A causa della temperatura le cellule vibrano e il pilo si rompe . È riuscita a passare solo l'estremità e quindi c'è stato solo il trasferimento di una parte del cromosoma maggiore. La cellula F-quindi non ha ricevuto l'episoma , ma solo alcuni dei geni appartenenti all' altro ceppo→ diventa un DIPLOIDE parziale→ di alcuni geni ci sono delle copie . La cellula tiFR ritorna FI Quando l'episoma si stacca dal cromosoma maggiore può sbagliare e portarsi dietro una parte di cromosoma → la cellula ha comunque gli stessi geni , ma può coniugare in modo diverso . L'epidemia è in grado di duplicarsi con il meccanismo del disco rotante, una copia lineari zza e se ne va dall' altra parte . Quello che trasferiamo dall' altra parte è sia l' intero episana , ma anche un gene sottratto al cromosoma dell'altra cellula . Quindi anche questa cellula sarà DIPLOIDE PARZIALE . Clonazione - ( ( l ' l l ' l l ' l ' CLONAZIONE→ serve ad aumentare il numero di copie di un GENE (SEGMENTO DI DNA) . Dobbiamo estrarre un gene→ GENE DI INTERESSE da una cellula umana→ estraiamo il DNA e con gli ENZIMI DI RESTRIZIONE (FORBICI MOLECOLARI) andiamo a tagliare il gene alle due estremità , ad ISOLARLO. In un'altra cellula prendiamo il PLASMIDE ( di solito si usa ESCHERICHIA coli) . Il plasmide deve fungere da VETTORE→ viene tagliato in un solo punto in modo che l'anello si apra e in quel punto viene inserito il GENE Quando taglio due porzioni di DNA con lo stesso enzima, le estremità sono noNOCATENARLE e coesive (hanno Basi COMPLEMENTARI) → queste estremità aderiscono l'una all' altra→ ESTREMITÀ VETTORE aderisce ad ESTREMITÀ GENE → con la LIGASI si realizza un LEGAME COVALENTE→ abbiamo ottenuto un DNA RICOMBINANTE→ questo DNA si chiama VETTORE RICOMBINANTE e il suo scopo è quello di portare il gene in un nuovo organismo . In questo caso prendiamo un UNICELLULARE→ e. con →il DNA può essere inserito ad esempio con un processo di trasformazione → però non tutte le cellule di E.Gli riusciranno ad assorbire il vettore ricombinante , solo alcune lo faranno . Quindi dopo il tentativo di trasformazione bisogna fare una SELEZIONE ARTIFICIALE : gli organismi trasformati verranno conservati ,gli altri eliminati . Il vettore deve avere in sé un GENE REPORTER per poter effettuare la selezione → ad esempio il plasmide utilizzato che è diventato vettore potrebbe essere un plasmide che ha RESISTENZA AD ANTIBIOTICI → prendo le cellule e le metto in un terreno gelatinoso FERTILE (CAPSULA PETRI) , che contiene anche un antibiotico (ex penicillina)→il terreno è selettivo , quindi le cellule trasformate continuano a vivere , le altre ne , in quanto il vettore ricombinante non solo ha il gene di interesse , ma anche quello di RESISTENZA . A questo punto prendo una colonia e la sposto dal terreno selettivo a un BRODO NUTRITIVO→ le cellule si moltiplicano esponenzialmente e anche il plasmide si moltiplica . Poi vado a prelevare le cellule ed estraggo il DNA→ così facendo estraggo il gene . BIBLIOTECA GENOMICA→ batteria di diversi geni clonati BIBLIOTECHE DI ESPRESSIONE > biblioteca di geni attivi di un singolo tessuto . Per far duplicare il DNA il DNA ricombinante serve la DNA Polimerasi . ENZIMI DI RESTRIZIONE→ FORBICI MOLECOLARI Quando nei batteri entra un batteriofago X , questo inietta il DNA virale → la cellula batterica ha degli enzimi di restrizione con i quali può spezzettare il DNA virale in punti specifici su sequenze caratteristiche→ siti di Restrizione→quindi il DNA Virale non può moltiplicarsi → c'è AUTODIFESA . Tuttavia gli enzimi nel citoplasma non riescono a discriminare tra DNA virale e batterico .quindi i batteri sui propri siti di restrizione presentano una metilazione→ hanno GRUPPO METILE (- CH}) → in questo modo gli enzimi non possono attaccare il DNA batterico . Vettori e me!anismi di inserzione Dai vari ceppi batterici estraiamo gli enzimi che ci interessano e✗→ ECORI→ viene da E. CON Gli enzimi , visto che il DNA è bicatenaria , riconoscono sequenze specifiche→ sono PALINDROMICHE e✗→ con enzima SMAI taglio sui due filamenti di DNA corrispondenti → le estremità dei frammenti saranno PIATTE e BKATENARIE Invece con ECORI le sequenze saranno sempre palindromiche ,ma il taglio non è corrispondente→ si formano estremità MONOCATENARIE COMPLEMENTARI→ ESTREMITÀ MONOCATENARIE coesive 1 ' l l ' li ' l ' l l l l l l ' l ' l ' l ' l ' l l ' l ' 1 I VETTORI DI CLONAGGIO → plasmidi→ inseriti nei procarioti → usati come vettori per portare un GENE D' INTERESSE in un'altra cellula → DNA ciclico e BKATENARIO, manipolato geneticamente in modo che possa svolgere la funzione di vettore . Lungo il vettore ci sono tutta una serie di GENI ; • SITO DI CLONAGGIO MULTIPLO → sito in cui sono presenti più SITI DI TAGLIO per gli ENZIMI DI RESTRIZIONE→ si può usare uno qualunque degli enzimi di restrizione→ con lo stesso enzima utilizzato si tagliano le estremità del gene di interesse → il sito di clonaggio multiplo si apre e qui si inserisce il gene , che viene poi legato covalentemente con la LIGAsi → abbiamo creato così il VETTORE RICOMBINANTE • PUNTO ORI→ punto dove comincia duplicazione→ cromosoma si deve duplicare perché il vettore deve entrare in una cellula e questa cellula dovrà duplicarsi→ quando questo accade la cellula figlia deve avere sia una copia del cromosoma maggiore , che del vettore ricombinante . • GENE MARCATORE di selezione→ questo gene a seconda della tecnica di selezione che vogliamo applicare può codificare per più caratteristiche → uno dei più usati è il gene marcatore della RESISTENZA AD ANTIBIOTICO → seminiamo le cellule trasformate e non su una capsula Petri ( terreno gelatinoso NUTRITIVO e selettivo)→ la sostanza seleziona le cellule facendole vivere o morire→ nel caso di resistenza ad antibiotici nel terreno viene inserito l'antibiotico a cui resiste il GENE REPORTER VETTORE YAC→ si usa quando si vuole inserire in una CELLULA EUCARIOTE (ex . Lievito) un gene di interesse→ è VETTORE ARTIFICIALE . Presenta : • PUNTO ORI → ORIGINE DI Replicazione • SITO DI Restrizione → verrà effettuato un taglio usando lo stesso enzima con cui viene tagliato il genedi interesse, che poi verrà legato tramite la ligasi • CENTROMERO→ luogo in cui si attaccano le fibre del Fuso mitotico , che poi trascinano i cromosomi ai due poli opposti ( durante la mitosi • TELOMERI → i cromosomi eucariotici sono LINEARI→ il cromosoma va linearizzato attraverso i telomeri . Il cromosoma va dotato di due telomeri . Ha DUE REGIONI TELOMERI che , in mezzo alle quali c'è un altro sito di RESTRIZIONE , diverso dal primo , in cui va fatto un taglio ,ma non va inserito un gene→ serve a LINEArizzare il cromosoma, che avrà due telomeri alle estremità • GENE REPORTER→ gene che codifica per delle proprietà in grado di selezionare lieviti che hanno inglobato il vettore ricombinante se vogliamo che un gene si esprima nella cellula, ai lati del sito di restrizione dobbiamo inserire altri geni , che consentano la trascrizione in mRNA e poi la traduzione IN PROTEINA VETTORE virale→ usiamo il DNA VIRALE del virus 1 → presenta una regione centrale BKATENARIA , ma le estremità (REGIONI cos) , sono NONOCATENARIE . Nella regione bicatenaria c'è una zona con SITO DI RESTRIZIONE→ possiamo tagliare lì e inserire il gene di interesse . Lo mettiamo in una cellula batterica → le regioni cos sono coesive, si sono legate tra loro → quindi il DNA virale nella cellula diventa ciclico Una volta che si trova nella cellula questo DNA è in grado di integrarsi a quello della cellula batterica → gene esogeno può essere integrato nel genoma della cellula . Il fago ) ha in dotazione l'enzima INTEGRASI , che si avvicina al DNA batterico , lo " afferra" , poi " afferra " il DNA virale e con un'operazione " taglia e cuci " integra il DNA, che è lineare . Le cellule assorbono il materiale genetico con una FREQUENZA BASSA , ma ci sono delle tecniche che aumentano la frequenza di assorbimento del vettore ricombinante, che prendono il nome di MECCANISMI di TRANSFEZLONE . Quando le cellule assorbono questo DNA si dicono GENETICAMENTE MODIFICATE . Se un batterio ingloba il materiale genetico abbiamo una TRASFORMAZIONE . • SHOCK TERMICO → mettiamo in una provetta una soluzione con CLORURO di calcio (Ca (G) , le nostre cellule (ad esempio batteri ) e il vettore ricombinante . Facciamo un lieve Riscaldamento → i fosfolipidi della membrana della cellula si spostano , in quanto si agitano e si creano temporaneamente dei pori , attraverso i quali è facilitato l'ingresso del vettore • ELETTROPORAZIONE→ prendiamo sempre una provetta contenente la soluzione, le cellule e il vettore → si formano dei pori attraverso una LIEVE scarica ELETTRICA • METODO BlowsTico → più usato nei vegetali, in cui c'è la parete cellulare , che deve essere perforata→ si usa un PROIETTILE microscopico , attorno al quale è arrotolato il vettore ricombinante • INSERZIONE virale → tecnica usata nei vaccini a vettore virale → si prende un virus e si elimina il DNA proprio di questo → il capside virale viene caricato con il vettore ricombinante Il virus poi con il capside riconosce la superficie della cellula ospite e inietta il vettore • TRASDUZIONE Clonazione di un individuo PIANTE OGM→ scopo è migliorare colture GALLA DEL COLLETTO→ da questa malattia è stata ricavata tecnica per creare piante transgeniche (OGM → ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI) →è un tumore della radice della pianta dovuto al microrganismo AGROBACTERIUM TUMEFAQENS che quando attacca le piante genera appunto questotumore . Il tumore deriva dal fatto che il batterio oltre al cromosoma maggiore presenta al suo interno un PLASMIDE → contiene un gene chiamato T-DNA . Quando il batterio entra nella pianta questo plasmide entra nelle cellule e si va a integrare nei cromosomi della pianta . La tecnica sta nell'eliminare il gene T- DNA dal plasmide e nell' inserire al posto del gene del tumore un gene di interesse che possa migliorare la coltura vegetale . Un'altra tecnica è l' ELETTROPORAZIONE→ va a generare pori nella membrana, ma la cellula vegetale ha anche una parete → prima dell' elettroporazione si sottopongono le cellule della pianta a un ENZIMA litico → demolisce la parete → si crea cellula vegetale priva di parete, circondata solo da membrana → queste cellule si chiamano PROTOPLASTI e a questo punto vengono sottoposte a elettroporazione . I protoplasti da soli sono in grado di RICOSTRUIRE la parete cellulare (fatta di cellulosa) . L' APPARATO DEL GOLGI accumula cellulosa , che poi viene portata tramite vescicole verso la membrana → per esocitosi il contenuto delle vescicole passa all' esterno . La cellulosa si accumula all'esterno strato dopo strato e il protoplasti si riveste di cellulosa , tornando a essere una cellula vegetale normale . Ultima tecnica → uso di microproiettili rivestiti con il DNA del gene di interesse e spararli con pistola a propulsione sulle foglie→ proiettile attraversa la parete, non c'è necessità di rimuoverla → arriva fino al nucleo → poi proiettile tende a disgregarsi e il DNA a integrarsi nei cromosomi vegetali . ( l ' ' l ' l / I l ' l ' l 1 I 1 I 1 Il 1 I | I 1 Partiamo da due pecore → in una andiamo a prelevare ovocita ( cellula uovo in uno stadio precoce) e lo andiamo a DEENucleare ( togliere il nucleo) . Nel citoplasma di questa cellula troviamo SOSTANZE MORFOGENETKHE → guidano la Formazione DELL' EMBRIONE . abbiamo bisogno di un nucleo , e vogliamo che questo contenga il patrimonio genetico dell' altra pecora ( NOI quella che ha donato ovocita) . Prendiamo una cellula della ghiandola mammaria , la mettiamo in terreno nutritivo → la nutriamo e la facciamo moltiplicare → poi inseriamo il nucleo di questa cellula direttamente nel citoplasma dell' ovocita . A questo punto ho cellula con CORREDO DIPLOIDE . Lo zigote viene trattato con leggere scariche e comincia a proliferare → si formano piccole sfere di cellule , che sono i primi stadi dell' embrione di questa pecora → arrivati al 6° giorno questo embrione viene impiantato nell' utero di un' altra pecora che fa da MADRE SURROGATA , che porta avanti la gravidanza fino a partorire il CLONE , geneticamente identico alla pecora che ha donato la cellula della ghiandola mammaria . Gli individui cloni vivono poco e la ragione si pensa che sia nei TELOMERI . Ogni filamento di DNA alle estremità ha delle sequenze Non codificanti → ogni volta che avviene una divisione cellulare bisogna duplicare il materiale genetico , e il materiale genetico non riesce a duplicare le estremità . Quindi a ogni duplicazione che avviene a ogni divisione cellulare la molecola di DNA si accorcia consumando i telomeri , fino a quando va a intaccare le regioni codificanti . PCR S"s-Cov-2 A quel punto la cellula muore . La pecora clone ha ricevuto una cellula già " vecchia " . Le molecole di DNA in questo clone si sono già duplicate moltissime volte . Quando arrivano nello zigote e nel clone le molecole sono già accorciate . Con tutte le altre divisioni che ci devono essere il materiale genetico diventa troppo corto . Si pensa che sia questa la ragione per cui l' aspettativa di vita di questi cloni sia cosi bassa . ' l ' PCR→ tramite uno strumento che esegue in modo meccanico 3Fasi in continuazione si duplica DNA , fino ad ottenere da poche molecole , miliardi di copie . TAQ POLIMERASI → leggendo una sequenza stampo nel DNA , la DNA Polimerasi costruisce il filamento complementare . Ma in questa tecnica bisogna prima separare le due catene . Per fare questo si alza TEMPERATURA → a queste temperature la DNA polimerasi normale si degrada . Ci serve la polimerasi di un organismo che si è adattato a vivere a temperature elevate. Dall' organismo THERMUS AQUATICUS si estrae TAQ POLIMERASI , che resiste ad alte temperature . 3 FASI ! - DENATURAZIONE → campione di DNA scaldato a 94°C . Tutto questo accade in vitro . Nella nostra soluzione vengono aggiunti i primer→ frammenti di RNA che servono da innesco per costruire filamento di DNA , perché le polimerasi non sanno partire da 0 , devono allungare un frammento già esistente . - ibridazione→ una volta in soluzione i primer vengono attirati dalle basi complementari sia su un filamento che sull'altro . Per far si che ci sia APPAIAMENTO la temperatura va abbassata a 45- 50°C - ALLUNGAMENTO→ si ha fase di costruzione DEL FILAMENTO COMPLEMENTARE . Sul filamento stampo viene costruito il filamento complementare . Poi si ripete tutto . Da 2 molecola ottengo 2 molecole . Se ripeto il cielo da 2 ne ottengo 4, ecc. Questa è una tecnica di sintesi chimica e molto più rapida rispetto a quella di clonazione del gene . ( I l ' ( il / SARS-Cov-2 → il materiale genetico si trova all' interno . Intorno a CORDONE Proteico (PROTEINAN) è avvolto il materiale genetico (una molecola di RNA) . Poi c'è RIVESTIMENTO costituito da MEMBRANA ( DOPPIO STRATO Fosfolipidico), in cui ci sono varie proteine (ex. spine) . La proteina spine determina il contagio→ riconosce la proteina ACEL Che si trova nella membrana delle cellule umane . C'è Riconoscimento A INCASTRO , che consente al virus di entrare nella cellula umana . Le varianti del virus sono MUTAZIONI DELLA PROTEINA SPIKE A livello dei capillari polmonari c'è proteina Acea . Nella membrana della cellula umana ho questa proteina a forma di " Y " → RECETTORE Acea . Il virus con la proteina spille si lega a questo recettore . In questo modo il virus entra e le sue componenti vanno a disgregarsi , ma ciò che rimane è l'RNA virale (filamento MONOCATENARio) . Virus ENDOPARASSITA OBBLIGATO→ sfrutta le componenti della cellula per riprodursi . Da questo RNA VIRALE la cellula crea delle copie . Le copie dell' RNA sono COMPLEMENTARI all' RNA ORIGINALE. A questo punto abbiamo due tipi di attività → una che serve a riformare il materiale genetico originale e un' attività che serve a formare le componenti proteiche del virus . COMPONENTI PROTEICHE→ l'RNA complementare funziona da mRNA→ i ribosomi della cellula si attaccano a questo MRNA e cominciano a produrre tutte le nuove proteine virali . Un'altra copia di RNA viene usata per costruire su di esso un altro filamento di RNA COMPLEMENTARE→ questo è identico all' RNA virale . Vengono prodotti molti RNA Virali . Quindi da una parte abbiamo prodotto un'enorme quantità di PROTEINE VIRALI , dall'altra molto MATERIALE GENETICO VIRALE. A questo punto c'è un primo assemblamento fra RNA virale e PROTEINA N . le altre proteine che fanno parte della membrana virale che si deve ancora formare . La membrana cellulare comincia a formare una sporgenza nella quale si va a nascondere questo primo abbozzo di virus . Le proteine spille vanno a conficcarsi in questa porzione di membrana cellulare che sta sporgendo verso l'esterno . Poi si ha la chiusura di questa membrana che va ad avvolgere completamente il virus e si stacca→ questo processo prende il nome di gemmazione . Sulla superficie della cellula umana si creano queste gemme che contengono il virus annidato all' interno , che poi si strozzano e si staccano . La membrana esterna del virus si forma quindi dalla membrana della cellula umana . La trasmissione del virus avviene prevalentemente attraverso le vie AEREE e possiamo distinguere DROPLET e AEROSOL per le dimensioni→ droplet MAGGIORI , aerosol MINORI . Trasmissione può avvenire DIRETTAMENTE ( più facilmente con aerosol, che tendono a rimanere sospesi nell' ambiente) O INDIRETTAMENTE (droplet tendono a cadere sulle superfici , poi toccate dagli individui ), poi c'è anche Trasmissione fecale cosa succede NELL' AMBIENTE IN DIVERSE situazioni → queste "PALLINE " sono UNITÀ INFETTANTI (contengono MILIARDI di virus) . Unità infettante è la quantità di virus necessaria a creare INFEZIONE CERTA .