La genetica batterica, Appunti di Genetica

Scarica La genetica batterica e più Appunti in PDF di Genetica solo su Docsity! GENETICA LA GENETICA BATTERICA E DEI LORO VIRUS. Da qui in poi non consideriamo i geni indipendenti ma li consideriamo come adiacenti sullo stesso cromosoma circolare. E. coli (Gram -) Theodor Escherich (fine 800 scoprì E. coli). Cromosoma: circolare (unica copia) Genoma: 4.6 Mbp (milioni di nucleotide) Geni: 4000 Plasmidi: svariati (cerchi di DNA piccolo che possono portare funzioni accessorie/addizionali). Diversi modi con cui i batteri possono scambiarsi l’informazione genetica; 1)Trasformazione; cellula può prelevare dall’ambiente esterno pezzi di DNA rilasciati per esempio da un batterio morto che rilascia il DNA nell’ambiente. Il batterio ha un sistema attivo di canali e pori sulla parete batterica per prelevare queste sequenze se possono essere utili, si possono integrare o sostituire segmenti omologhi. 2) Coniugazione; porta all’acquisizione diretta da un individuo che dona a uno che riceve. Il donatore da il plasmide ma può anche dare porzioni del genoma. 3)Trasduzione (non è attivo ma viene subito); infezioni virali dove si può trasferire il genoma virale da un batterio all’altro. I batteri possono essere studiati in genetica infatti si possono far crescere ed avere sospensioni di cellule batteriche, dalla sospensione possono essere piastrati e avere colonie visibili dopo l’incubazione (cloni di batteri). Sono economici i terreni, si possono analizzare milioni di batteri ed è un meccanismo rapido. .Piastra; da qui si può vedere il movimento dell’ansa per seminare piccole quantità di cellule nel terreno. Qui sono state seminate 6 colonie, l’unica fonte di C nel terreno è il 1um Ceppo mutante (auxotrofo per il lattosio) Iac-Ceppo selvatico (prototrofo per il lattosio) Iac+ Quando>107 batteri lattosio nella piastra, se un batterio è mutante quindi incapace di metabolizzare il lattosio allora possiamo scoprire quale colutra era diventata auxotrofa per il lattosio. Le colonie in grado di digerire/assimilare le sostanze presenti sono detti ceppi prototrofo. Se faccio crescere in un terreno minimo un prototrofo sarà in grado di crescere e sintetizzare tutte le molecole di cui ha bisogno, se non riesce diventa un ceppo auxotrofo. Terreno minimo: -Sali -Tampone (pH entro un range definito) -Fonte di carbonio (tipicamente zuccheri). Mutanti nutrizionali auxotrofi incapaci di crescere senza; (se è bio- non cresce senza biotina ecc) bio- incapace di crescere senza aggiunta di biotina arg- incapace di crescere senza aggiunta di arginina met- incapace di crescere senza aggiunta di metionina lac- incapace di crescere con il lattosio come unica fonte di carbonio gal- incapace di crescere con il galattosio come unica fonte di carbonio strr resistente all’antibiotico streptomicina TRASFORMAZIONE BATTERICA; per mappare dei geni (serve per metterli in ordine nel cromosoma fisicamente e per la distanza tra I vari geni). 1. Esperimenti di Frederick Griffith (1928) Effetto polmonite su topi e due ceppi uno S letale e uno R non letale. Il ceppo R mescolato con quello S bollito e lisato faceva si che R diventasse S. Questo porta all’introduzione del concetto di trasformazione batterica. Essa non è stata utilizzata molto dai genisti. (smooth) di Streptococcus pneumoniae (rough) di Streptococcus pneumoniae STABILMENTE VIRULENTI “TRASFORMAZIONE ” BATTERICA (r), le cellule B ……………………………………….sarebbero potute crescere ma non si vedevano le colonie. Ciò significa che non erano le B diventate auxotrofe ma sulla base dell’esperimento precedente che sono le A diventate auxotrofe. Il ceppo di tipo A ha acquisito met+, bio+ e non è il ceppo B che è diventato thr+, leu+ e thi+. Questo portò a capire che la coniugazione è unidirezionale e si ha un donatore e un ricevente. si ha un pilo che proviene dal ceppo donatore. Si ha un ceppo ricevente che acquisisce l’informazione dal donatore. Si studiò la capacità di diventare sterile (non capace di donare) si ha un ceppo A sterile reso resistente a str ed è stato messo in contatto con un ceppo in grado di donare ma str (s), quando si semina la miscela in str si ammazzano quelli sensibili e crescono quelli str (r), poi si valuta la loro possibilità di essere diventati donatori e si vede che circa 1/3 (è tanto) delle colonie erano fertili e str (r). Frequenza oltre il 33% quindi non poteva riguardare una mutazione ma un qualcosa che assomigliava al virus grazie alla grande capacità infettiva. Si postulò l’esistenza di un “fattore F” a carattere infettivo che poteva facilmente essere trasferito I donatori venivano definiti F+, i riceventi F-. Oggi si sa che questa capacità viene data dal plasmide chiamato fattore F che da le info al batterio per formare i pili e di trasferire il proprio DNA verso un eventuale ricevente. Il passaggio viene chiamato replicazione a cerchio rotante dove si trasferisce la singola elica che viene subito trasformata in doppia elica nell’ingresso nel batterio ricevente Successivamente Luca Cavalli-Sforza identificò dei ceppi coniuganti che 1- incrociati con F- producevano un numero di «ricombinanti» 1000 volte superiore a quelli osservati da Lederberg-Tatum 2- Negli incroci gli F- restavano F- Replicazione a cerchio rotante I ceppi furono chiamati Hfr (high frequency recombination). I rari ricombinanti osservati da Lederberg-Tatum erano rari Hfr formatisi spontaneamente. Questa è un’aggiunta vera e propria e non una ricombinazione. ( Il ceppo manterrà la capacità/informazione per formare I pili e per fare la coniugazione ma non è in grado di trasferire F.). I rari ricombinanti sono in grado di trasferire parte del cromosoma batterico, essi avviano la coniugazione e pensavo di avere il fattore F come singolo, iniziano a trasmettere il fattore F ma si portano dietro parte del cromosoma batterico (troppo grande per essere trasferito tutto rispetto al fattore F). In rare situazioni si può trasferire tutto il cromosoma batterico, in questo caso il ricevente diventa fertile. Quindi il fattore F viene trasferito metà per primo e metà per ultimo. Una volta che il passaggio è avvenuto in singola elica si avrà la formazione della doppia elica. Endogenote; DNA residente Esogenote; DNA che viene dall’esterno Dopo che avviene la coniugazione si parla di ex- coniugati. Dopo che il frammento diventa doppia elica si ha la ricombinazione dove si sostituisce una parte di endogenote in esogenote. Il segmento che rimane libero senza essere circolarizzato andrà perso/degradato. Per effettuare queste operazioni occorre che gli eventi di ricombinazione siano due; uno a monte e uno a valle, con uno solo non si può avere la ricombinazione. Tipicamente il ceppo donatore HfrH è strt (s) mentre il ricevente F- è str (r.) questo perché vogliamo studiare cosa succede al ricevente che sarà quello che ha tutte le sensibilità/auxotrofie. Marcatori in studio Esperimento coniugazione interrotta terreni completi senza str per permettere la crescita di tutte e due i ceppi. Nel frullatore si interrompe la coniugazione quindi dal t=0 sarà passato un piccolo frammento di DNA, poi si piastra in terreno con str. Replica plating. La disposizione delle colonie viene studiata in base al terreno che è selettivo. Se voglio vedere se sono diventate lat+ faccio un terreno minimo con solo lattosio ecc. Mappa di cromosoma di E. Coli. Alcuni nomi ricorrono (pyrD,pyrC,pyrB più geni per sintetizzare le purine). Un singolo evento di ricombinazione non è sufficiente per vivere. Il coso in rosso è la direzione Hfr met+ arg+ leu+ strs x F- met- arg- leu- strr Le distanze di misurano come % di ricombinazione che devono essere 2 (uno a valle e uno a monte). Una coppia Hfr e F-, Hfr trasmette i geni in un ordine ben indicato dalla freccia. In un esperimento che sfrutta la coniugazione si deve NON interrompere la coniugazione per far si che la maggioranza dei batteri terminino la coniugazione. Dopo la coniugazione si fa la master plate (?) e si seminano i batteri (terreno con str per eliminare il genoma del donatore ovvero di Hfr??) e si studia il segmento che va da leu a met. Nel primo rigo metterò un terreno senza leu ma con arg e met (e ovviamente glucosio), quindi sono restrittiva per leu e permissiva per arg e met, colonie protofrofe per leu saranno quelle che si osservano. 4% di distanza/% di ricombinazione tra leu e arg, 9% tra arg e met. Quindi la distanza tra arg e met sono 9 unità di mappa/cM (centi morgan). Leu+,arg- e met+  0,04% dovuta al fatto che ci possono essere più eventi di ricombinazione infatti vengono chiamati doppi ricombinanti. Le percentuali sono anche la probabilità di ricombinare (4% p=0,04). I plasmidi F’; Il lac+ si trasferiva facilmente come era noto faceva il fattore F. Si prendono ceppi fertili selvaggi str s e F- con mutazione nel lac- str r, oltre a fare la miscela + terreno con str e lattosio, tante colonie oltre ad essere fertili erano in grado di crescere in lattosio (prototrofi per il lattosio). Si dimostrò che il fattore F’ portava anche lac+  è un fattore di fertilità modificato, in questi esperimenti porta il lac+. F’ sfrutta un sito di inserzione con sequenze di somiglianza, un ceppo F’ può tornare un fattore F scorporato dal cromosoma batterico (rare, 1 su 1M). Con una frequenza ancora più rara questo può portare ad una ricucitura del cromosoma batterico ……. ????. quando viene trasmesso si trasmette anche un pezzo del cromosoma batterio. Il ricevente il fattore fertilità F ricevono anche lac+ e diventavano prototrofi F’ lac+/ lac-  diploide parziale. Ricombinazione dei geni; com’è fatto un virus