LA TRASDUZIONE BATTERICA, Appunti di Genetica

Scarica LA TRASDUZIONE BATTERICA e più Appunti in PDF di Genetica solo su Docsity! LA TRASDUZIONE Con la trasduzione il trasferimento di dna da una cellula batterica a un'altra avviene attraverso un vettore fagico, anche in questo caso il trasferimento è unidirezionale da una cellula donatrice a una cellula ricevente. Lederberg e Zinder hanno scoperto la trasduzione nel 1951, mentre cercavano di capire se anche nel batterio salmonella typhimurium come in E. coli poteva avvenire la coniugazione. Ripeterono quindi l'esperimento compiuto alcuni anni prima utilizzando questa volta due diversi ceppi auxotrofi di salmonella di cui uno poteva crescere solo se il terreno minimo veniva addizionato con fenilalanina, triptofano e tirosina, mentre l'altro cresceva solo in presenza di metionina e istidina; anche in questo caso i due ceppi non crescevano su terreno minimo ma se venivano prima mescolati e poi messi a crescere su terreno imo allora comparivano dei batteri prototrofi per tutti e 5 i marcatori. Tuttavia, quando poi testarono i due ceppi di salmonella in un tubo a U, ottennero dei risultati diversi e anche in questo caso i due ceppi vennero messi ciascuno in ognuno dei due bracci del tubo, tenuti separati con un filtro poroso che impediva il passaggio dei batteri, dopo un certo periodo di tempo i due ceppi vennero separatamente piastrati su dei terreni minimi, questa volta però da un lato del tubo ottennero prototrofi ed esclusero immediatamente la coniugazione in quanto i batteri non potevano entrare in contatto tra di loro, anche la trasformazione venne esclusa in quanto trattarono i terreni con dnasi al fine di degradare qualsiasi eventuale frammento di dna proveniente da una lisi batterica in uno dei due ceppi e che fosse eventualmente passato da un braccio all'altro del tubo; neanche questo trattamento impedì la comparsa del ceppo prototrofo e capirono che si trattava di una nuova modalità di trasferimento genico tra batteri. Con degli esperimenti successivi si accorsero che uno dei due ceppi era infettato dal batteriofago P22 che è un fago di piccole dimensioni capace quindi di passare attraverso i pori del filtro e conclusero che era stato il fago a funzionare il vettore e a trasportare il dna da un ceppo batterico all'altro e questo processo venne da loro chiamato trasduzione. Esistono due modalità di trasduzione: -trasduzione generalizzata, si realizza quando i fagi sono in grado di trasferire qualsiasi regione del cromosoma batterico; -trasduzione specializzata, quando i fagi possono trasferire solo specifiche parti. La trasduzione generalizzata è associata al ciclo litico e con questa modalità di replicazione il fago infetta il batterio, si replica all'interno di esso e produce numerose nuove particelle fagiche che liberandosi uccidono il batterio. Nella trasduzione generalizzata può accadere che alcune delle nuove particelle fagiche prodotte al termine dell'infezione, contengano nel loro capside materiale genetico proveniente dal cromosoma batterico. | fagi di questo tipo sono detti trasducenti e questi fagi potranno poi infettare altre cellule batteriche che riceveranno in questo modo il dna proveniente dal batterio precedentemente infettato. Tra i fagi trasducenti meglio caratterizzati, ci sono il fago P22 che infetta salmonella e il fago P1 che infetta E.coli. Il fago inizia iniettando il proprio dna all'interno della cellula batterica, il batterio infettato è prototrofo per tre ipotetici geni indicati con a*, b* e c*. Subito dopo il suo ingresso, il fago prende il controllo di tutte le attività metaboliche del batterio, quindi replica il proprio dna, degrada il cromosoma batterico, sintetizza le proprie proteine e assembla le nuove particelle fagiche. Nel capside viene inserito normalmente il dna fagico ma erroneamente durante l'assemblaggio può accadere che nel capside venga inserito un frammento di dna batterico al posto di quello fagico e si genera così un fago trasducente. In figura sono mostrati tre fagi trasducenti dove ciascuno ha incorporato un diverso frammento del cromosoma batterico che sono i tre frammenti relativi ai tre geni a, b e c. La frazione di fagi trasducenti che si può generare in un ciclo di infezione è molto bassa, si parla dell'ordine di un fago trasducente ogni 100.000 fagi normali. Vediamo il percorso di un fago trasducente che ha inglobato nel proprio capside il gene batterico indicato con a*. Questi fagi trasducenti sono esternamente identici ai fagi normali e quindi possono normalmente infettare una cellula batterica, non avendo il cromosoma virale non potranno replicare e quindi produrre una progenie fagica. Il fago trasducente rilascia il gene batterico che aveva contenuto nel proprio capside all'interno del nuovo batterio infettato; il batterio è auxotrofo per il gene a. Il gene a* del donatore, quello trasportato dal fago, può appaiarsi con il gene omologo a del ricevente, ossia quello presente sul nuovo cromosoma batterico ed effettuare la ricombinazione. A seguito di questo doppio evento di crossing- over si sarà così formato un batterio trasdotto stabile detto trasduttante in cui il gene a è stato sostituito dal suo allele a'; il frammento che si è scambiato viene invece degradato. Utilizzando la trasduzione generalizzata, è possibile determinare l'ordine e la distanza tra i geni sul cromosoma batterico e quindi costruire la mappa genetica. Se due geni sul cromosoma batterico sono vicini tra di loro, allora possono trovarsi sullo stesso frammento di dna e quindi essere cotrasdotti ossia essere impaccati nella stessa testa fagica, devono essere vicini perchè il frammento di dna che può essere contenuto all'interno del capside deve necessariamente essere di piccole dimensioni, questo significa che minore è la distanza tra i due geni, maggiore è la loro frequenza di cotrasduzione. Possiamo misurare la frequenza con cui due geni vengono cotrasdotti e questa frequenza si può utilizzare come misura della distanza tra i geni. Supponiamo di voler determinare mediante trasduzione l'ordine dei geni di E.coli, utilizzando il batteriofago P1. Ipotizziamo che il batterio donatore sia prototrofo per leucina e treonina e resistente alla sodio azide, mentre il ceppo ricevente è auxotrofo per questi due amminoacidi e sensibile alla sodio azide. Non conosciamo l'ordine dei tre geni sul cromosoma, nè la loro distanza in quanto è quello che vogliamo stabilire con questo esperimento. II fago Pl viene prima fatto replicare sul batterio donatore e il lisato fagico viene poi trasferito sul batterio ricevente; a infezione avvenuta analizziamo i batteri trasdotti alla ricerca di ricombinanti. Vogliamo vedere tra i batteri ricombinanti con quale frequenza compaiono quelli che hanno ricombinato per 2 dei 3 geni. La tecnica consiste nel selezionare i batteri per uno dei tre marcatori e poi analizzare questi batteri selezionati per vedere in quanti di loro sono presenti anche gli altri due geni. Nell'esperimento 1 i cui risultati sono mostrati in tabella, abbiamo selezionato tutti i batteri ricombinanti per leucina, cioè i batteri che a seguito della trasduzione hanno ricombinato e sono diventati leu+. Questi batteri leu+ vengono poi fatti crescere su terreni selettivi al fine di vedere quanti di loro sono anche diventati prototrofi per