Strategie per migliorare sensibilità e selettività in analisi con elettroforesi capillare , Dispense di Analisi Strumentale

Scarica Strategie per migliorare sensibilità e selettività in analisi con elettroforesi capillare e più Dispense in PDF di Analisi Strumentale solo su Docsity! CE ADVANCE (CAPILLARY ELECTROPHORESIS ADVANCE) La tecnica dell’elettroforesi capillare ha come punto forte l’efficienza della separazione ma non la sensibilità. SENSITIVITY = SENSIBILITÀ La sensibilità nelle analisi con elettroforesi capillare non è un punto forte perché il cammino ottico, quindi, lo spessore della cella di flusso del detector UV-Vis, è pari al diametro interno del capillare, quindi è molto corto, quindi nella legge di Lambert-Beer essendo il valore di b basso, l’assorbanza sarà bassa (A = εbC). È possibile utilizzare delle tecniche/modalità/soluzioni tecnologiche che permettano di RECUPERARE SENSIBILITÀ: - MODIFIED CAPILLARY GEOMETRY È possibile utilizzare capillari con geometria modificata in modo tale da aumentare la lunghezza del cammino ottico. Generalmente nelle analisi UV-Vis il cammino ottico ha lunghezza 1cm, ma non è possibile raggiungere questa lunghezza in una cella di flusso per EC perché non sarebbe rispettato il rapporto superficie/volume causando un surriscaldamento che comporta la perdita della linearità della legge di Ohm, questo comporterebbe il generarsi di moti browniani (“come se il sistema bolle”) rendendo il sistema non stabile, quindi le analisi non riproducibili. Nell’immagine si confrontano due elettroferogrammi ottenuti analizzando lo stesso campione alla stessa concentrazione: Rosso = analisi CE con capillare a geometria tradizionale: il rapporto segnale rumore è molto più elevato; Verde = analisi CE con capillare a geometria modificata: a parità di rumore di fondo, il picco=segnale è molto più alto quindi la sensibilità è maggiore. I capillari a geometria modificata vengono chiamati EXTENDED LIGHT PATH CAPILLARIES possono essere: ● CELLA A BOLLA = BUBBLE CELL Due porzioni di un tradizionale capillare vengono montate su una cella che ha forma di una bolla, in questo modo quando il campione passa all’interno della cella si espande radialmente e si contrae longitudinalmente quindi resta in una banda ristretta, la luce incide perpendicolarmente sulla cella quindi cammino ottico aumenta. Il volume della cella a forma di bolla è molto più grande del volume del capillare ma NON avviene la diluzione del campione. ● CELLA A ZETA = ZETA CELL = HIGH SENSITIVITY CELL nel punto in cui sul capillare sarebbe presente la finestra quindi tra le due estremità che sarebbero tagliate si posiziona una CELLA Z = un segmento perpendicolare al capillare con lunghezza pari a 3 volte il diametro del capillare, così si consente alla radiazione perpendicolare al capillare, di percorre un cammino ottico di lunghezza 3 volte superiore (b aumenta) quindi l’assorbanza aumenta e quindi la sensibilità aumenta. - LOW UV DETECTION È possibile impostare il detector a un valore di lunghezza d’onda basso quindi vicino al limite inferiore del range di lunghezze d’onda dell’UV-Vis pari a 200nm. In analisi con strumenti HPLC i detector non vengono mai impostati a lunghezza d’onda intorno al 200nm perché i solventi tipicamente utilizzati assorbono ancora quasi tutti a questa lunghezza d’onda, talvolta i valori più bassi impostati sono 208-214nm; infatti, è molto difficile che in HPLC vengano utilizzati solo tamponi acquosi, solitamente sono addizionati di percentuali variabili di modificatori organici o altre additivi. In analisi CZE = elettroforesi zonale si usano tamponi inorganici, quindi, è possibile, quando necessario, impostare la lunghezza d’onda di rivelazione pari a 200nm. Lo spettro di assorbanza UV-Vis di una sostanza riporta in ascissa il valore di lunghezza d’onda (nm) e in ordinata il valore di assorbanza, molte sostanze hanno massimi di assorbimento a 200nm, quindi se l’assorbanza è molto alta, la sensibilità è elevata, però questi valori vengono evitati in analisi HPLC perché non compatibili con cut off dei solventi usati; quando è necessario in un’analisi CE aumentare la sensibilità è possibile impostare la lunghezza d’onda di rivelazione a 200nm perché il BGE è un tampone inorganico che non assorbe. Viene mostrata la mappa peptidica dell’enzima LISOZIMA: i frammenti peptidici e gli amminoacidi prodotti dalla digestione con tripsina di questo enzima se rivelati a 200nm danno un elettroferogramma molto più sensibile (segnali dei picchi verdi sono più alti) rispetto alla stessa analisi a 214nm. L’uso di BORATO o FOSFATO come tampone migliora il rapporto segnale/rumore a basse lunghezze d’onda. il detector a fluorescenza può essere di vario tipo, poiché in EC nel capillare la finestra è molto piccola, si utilizza il LASER INDUCED FLUORESCENCE DETECTOR È possibile accoppiare l’elettroforesi capillare allo spettrometro di massa, questo accoppiamento è stato studiato per molti anni, fino a che circa 8-10 anni fa è stato commercializzato per la prima volta uno strumento compatto CE-MS. Per accoppiare CE e MS è necessario passare da una fase liquida a una fase gassosa, ma i flussi della CE sono molto bassi perché si utilizza un capillare quindi la vaporizzazione della fase mobile è avvantaggiata rispetto alla cromatografia liquida; però la complicazione è dovuta al fatto che si deve accoppiare il voltaggio elevatissimo 10000-30000 Volt della CE con voltaggio basso della sorgente ESI di MS, quindi l’interfaccia tra i due strumenti ha problemi dal punto vista elettrico e idraulico; inoltre il capillare è verticale. È necessario realizzare un’INTERFACCIA ELETTRICA (contatto elettrico), IDRAULICA (contatto idraulico) e ISOMETRICA, è possibile con due diverse modalità: 1) MODALITÀ SHEATH = con sheath liquid = con liquid guaina 2) MODALITÀ SHEATHLESS = senza sheath liquid = senza liquido guaina Il capillare di separazione arriva dall’EC e ha il ruolo di punta dell’elettrospray. A livello dell’interfaccia sono presenti altri due capillari: - Capillare che fornisce il liquido guaina e deve stabilire il contatto elettrico con ESI di solito è costituito da un modificatore organico: acetonitrile, metanolo e acido formico, metanolo e acido acetico - Capillare che fornisce il gas nebulizzatore esempio azoto Il sistema è concentrico per consentire la nebulizzazione dell’eluato che esce dal capillare di EC (passaggio da liquido a gas). La sorgente ESI è molto adatta ai composti polari e caricati che sono i composti di elezione per l’analisi con tecnica EC. MECHANISMS OF ZONE BROADENING = ALLARGAMENTO DELLA BANDA DI MIGRAZIONE Elettroforesi capillare è una tecnica ad elevatissima efficienza ma è possibile mettere in atto strategie per recuperare efficienza nei casi in cui non c’è efficienza. - LONGITUDINAL DIFFUSION - JOULE HEATING - ELECTRODISPERSION - SOLUTE-WALL INTERACTIONS Le pareti interne del capillare, costituito di silice fusa, sono cariche negativamente perché i gruppi silanolo = OH vengono trattati con NaOH per dissociarli a SiO-  CAPILLARI BARE = CAPILLARI DI SILICE FUSA = CAPILLARI DI SILICE NUDA Se si devono analizzare analiti di grandi dimensioni molto carichi, ad esempio, proteine ricche di cariche positive sulla superficie (le cariche sono presenti nei gruppi laterali degli amminoacidi come arginina e lisina, maggiore è il numero di amminoacidi con gruppi in catena laterale caricabili maggiore è il numero di cariche che la proteina ha) questi analiti possono andare incontro al fenomeno di adesione alle pareti del capillare perché si instaurano interazioni tra le cariche positive dell’analita e le cariche negative della parete, avviene in modo casuale quindi può comportare migrazione al detector distorta oppure migrazione in banda allargata oppure non migrano affatto. Ad esempio: analisi di nanoparticelle di diametro 80nm ricche di cariche positive (elevata carica superficiale perché tante cariche ma diametro piccolo) che vengono iniettate a pH a cui sono cariche positive che non può essere cambiato vanno incontro a questo fenomeno tanto da non migrare, “restano incollate alle pareti”. L’adesione potrebbe avvenire con tutti gli analiti carichi positivi, ma con quelli di piccole dimensioni non accade. È possibile utilizzare, al posto dei tradizionali capillari in silice fusa, i CAPILLARI RICOPERTI = CAPILLARI COATED si tratta di capillari in silice fusa in cui le pareti vengono chimicamente modificate per evitare il fenomeno dell’adesione. La copertura può essere: ● COPERTURA PERMANENTE consiste in una derivatizzazione con legami covalenti ● COPERTURA DINAMICA consiste in una derivatizzazione con legami covalenti Entrambe possono essere realizzate in laboratorio acquistando un capillare in silice fusa e derivatizzandolo, ma è necessario verificare e dimostrare che la preparazione di questi capillari sia riproducibile. Per la copertura dinamica è necessaria la realizzazione in laboratorio ed ha il vantaggio di poter essere rimossa e sostituita. I capillari con copertura permanente possono anche essere acquistati già ricoperti dalle aziende che ne garantiscono implicitamente la riproducibilità, ma il costo è elevato. CAPILLARE CON COPERTURA PERMANENTE: si realizza un capillare con pareti neutre utilizzando un capillare in silice fusa che viene ricoperto con POLIACRILAMIDE LINEARE oppure POLIVINILALCOL, non sarà necessario l’uso di flusso elettrosmotico. CAPILLARE CON COPERTURA DINAMICA: è possibile utilizzare un tensioattivo cationico (= testa carica +) che per attrazione si andrà a disporre con le teste rivolte verso i gruppi SiO- delle pareti; quindi, le pareti del capillare diventano neutre quindi non sarà necessaria la presenza di un flusso elettrosmotico nel lume del capillare. È possibile sul capillare dalle pareti ricoperte con tensioattivo cationico far flussare dell’altro tensioattivo cationico per formare un secondo strato; infatti, si disporrà con le code idrofobiche intercalate a quelle del primo strato e con le teste cationiche verso il lume del capillare, si dovrà utilizzare un BGE = tampone con contro-ioni negativi che instaurino interazioni con le teste cationiche. Il flusso elettrosmotico avrà direzione opposta rispetto al solito. In tutti i casi semplicemente analizzando le dimensioni, la carica e il tipo di EOF è possibile comprendere data una miscela di analiti quali migreranno prima e quali dopo al detector. QUANTITATIVE ANALYSIS = ANALISI QUANTITATIVA Per realizzare un’analisi quantitativa con tecnica di elettroforesi capillare può essere necessario eseguire la NORMALIZZAZIONE DELL’AREA DEL PICCO = PEAK AREA NORMALIZATION (questa procedura non viene mai eseguita con analisi HPLC) Se si analizzano due analiti diversi in HPLC la separazione è basata sulla diversa capacità di interazione (diversa affinità) con la fase stazionaria e con la fase mobile, per questo arriveranno al detector in tempi diversi (tempi di ritenzione diversi) ma la velocità con cui passano nella cella di flusso del detector è la stessa perché corrisponde alla velocità di flusso della fase mobile. La selettività = α è data dalla diversa interazione di un analita con fase mobile e fase stazionaria. Se si analizzano due analiti diversi in elettroforesi capillare, avranno velocità di migrazione diversa perché la velocità dipende dal rapporto massa-carica, quindi, passeranno nella cella di flusso a velocità differente, quindi: ● Analiti più veloci assorbiranno meno luce perché impiegheranno poco tempo ad attraversare la cella di flusso del detector ● Analiti più lenti assorbiranno più luce perché impiegheranno più tempo ad attraversare la cella di flusso del detector  selettività = α è data dalla diversa velocità di migrazione In CE l’area dei picchi è il risultato della differente velocità di migrazione degli analiti, quindi, analiti diversi hanno differenti tempi di residenza nella cella di flusso.